Summary
In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato per la modellazione efficiente del muscolo della distrofia muscolare di Duchenne utilizzando cellule derivate da urina convertite a MYOD1per valutare il ripristino dei livelli di mRNA e proteine della distrofina dopo aver saltato l'esodio.
Abstract
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD), una malattia muscolare progressiva e fatale, è causata da mutazioni nel gene DMD che provocano l'assenza di proteine della distrofina. Ad oggi, abbiamo completato uno studio di prima mano dell'umanità avviato dagli sperimentatori presso il National Center of Neurology and Psychiatry sulla base dell'iniezione sistemica degli oligonucleotidi morfono che sono inclini all'eson-53 skipping. Per un trattamento efficace della DMD, si ritiene che sia essenziale effettuare test in vitro con mioblasti derivati da pazienti affetti da DMD per vagliare farmaci e valutare l'ammissibilità dei pazienti prima di intraprendere sperimentazioni cliniche. Recentemente, abbiamo segnalato una nuova cellula derivata da urina (UDC) convertita da MYOD1trattata con l'inibitore della metiltransferasi (3-deazaneplanocin A hydrocloror), come modello cellulare di DMD. Il nuovo UDC autologo potrebbe mostrare fenocopia dei fenotipi specifici della malattia della DMD, che porta all'applicazione della medicina di precisione in una varietà di malattie legate al muscolo. In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per la modellazione efficiente delle cellule muscolari DMD utilizzando UDC convertiti a MYOD1insieme alla reazione a catena della trascrizione inversa (RT-PCR), gonfiore occidentale e immunocitochimica per valutare il ripristino di mRNA e livelli proteici della distrofina dopo lo skipping dell'esone.
Introduction
La distrofia muscolare di Duchenne (DMD), una malattia muscolare progressiva e fatale, è causata da mutazioni frame-shift nel gene DMD che provocano l'assenza di proteina distrofina1. Si ritiene che la terapia di salto di esalto a base di oligonucleotidi antisenso sia promettente per la DMD. Questa terapia si basa sulla conversione del fenotipo più grave della DMD al fenotipo più mite didistrofia muscolare di Becker alterando lo splicing pre-mRNA per ripristinare il frame di lettura DMD 2. Abbiamo recentemente completato uno studio first-in-human basato sulla ripetuta somministrazione endovevenosa del morsofodiamidate morpholino oligomero (PMO) viltolarsen, che può indurre l'esone 53 saltare in DMD, e ha dimostrato un eccellente profilo di sicurezza, un'efficacia promettente e parametri farmacocinetici accettabili (registrati come UMIN: 000010964 e ClinicalTrials.gov: NCT02081625)3.
Tuttavia, per sviluppare trattamenti convenienti ed efficienti per la malattia, i test in vitro che utilizzano cellule muscolari primarie ottenute da pazienti affetti da DMD sono essenziali per lo screening farmacologico e la verifica dell'idoneità dei pazienti prima di intraprendere studi clinici, nonché biomarcatori che riflettono l'efficacia delle terapie di salto dell'esone durante le sperimentazioni umane4. Recentemente, abbiamo segnalato una nuova tecnologia per sviluppare cellule derivate dalle urine (UDC) convertitedal paziente ,5,, 6 come modello primario di mioblasto del DMD7. Così, per generare i mioblasti, è necessaria solo la raccolta di urina dai pazienti e non è necessaria alcuna procedura invasiva. In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per la modellazione efficiente del muscolo DMD utilizzando UDC convertiti a MYOD1trattati con 3-deazaneplanocin Un idrocloruro per valutare l'mRNA di distrofina e la proteina ripristinati dopo lo skipping dell'esone.
Protocol
Il Comitato Etico del Centro Nazionale di Neurologia e Psichiatria ha approvato questo studio (ID approvazione: A2017-018, A2018-029). Tutti gli individui hanno dato il consenso informato prima di fornire urina. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in base alle pertinenti linee guida e regolamenti.
1. Isolamento e cultura primaria degli UDC
NOTA: gli UDC sono stati isolati in base a un protocollo pubblicato in precedenza8,9,10 con alcune modifiche.
- Raccogliere campioni di urina durante la micorizzazione spontanea in bottiglie di plastica sterilizzate.
NOTA: la sterilizzazione dell'orifizio uretrale esterno non è necessaria. L'urina midstream è auspicabile per ridurre il rischio di contaminazione virale. Se il tempo di magazzino prima della procedura successiva è >1 h, i campioni di urina devono essere trasferiti a 4 gradi centigradi per preservare la vitalità cellulare. Tuttavia, è necessario evitare una temperatura di <4 gradi centigradi perché possono comparire precipitamenti insolubili. - Centrifugare l'intero campione di urina a 400 x g per 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante, lasciando 1 mL nel tubo.
- Risospendere i pellet singolarmente nei restanti 1 mL di urina e quindi raccoglierli in un unico tubo da 50 mL.
- Aggiungere 10 mL di buffer di lavaggio composto da 99 mL di PBS senza calcio e magnesio, 1% penicillina/streptomicina (P/S), 0,5 g/mL amphotericin B, e centrifugare i campioni a 200 x g per 10 min a temperatura ambiente.
- Aspirare il supernatante, lasciando 0,2 mL nel tubo.
- Risospendere i pellet cellulari in 4,5 mL di mezzo primario composto da una miscela 1:1 di medio Eagle (DMEM) modificato di Un ipoalore ad alto glucosio (DMEM) senza pirova di sodio e nutriente F-12 di Ham mescolato con fattore di crescita epidermale umano ricombinante (EGF), insulina, idrocortisone, epinefrina, T3, transferrina, 10% siero bovino fetale senza tetraciclina (FBS), 1% P/S, e 0,5 zg/mL amphotericin B.
- Semina le cellule in tre pozze di lastre di gelatina rivestite sei pozze (volume totale di ogni pozzo, 1,5 mL). Cultura umidizzata a 37 gradi centigradi e 5% CO2 per 24 h.
- Aggiungere 1,5 mL del mezzo primario al giorno per i prossimi 3 giorni.
- Il giorno 4, sostituire il mezzo con 1,5 mL di mezzo di crescita integrato con EGF umano ricombinante, insulina, idrocortisone, epinefrina, T3, transferrina, 15% FBS senza tetraciclina, 0,5% L-alanina-L-glutamina, 0.5% aminoacidi non essenziali, e 2.5 ng/mL fattore di crescita fibroblasto-base (bFGF), recelldio di crescita ricombinante di piastre umane (PDGF), EGF e 1/S.
- Cambiare il mezzo di crescita a giorni alterni.
NOTA: le colonie UDC vengono visualizzate entro una settimana. - Quando la coltura UDC diventa confluente dell'80-90%, rimuovete il mezzo e lavate le cellule con PBS, dividete tutte le cellule utilizzando 0,25% trypsin-EDTA e semi a 3.000-5.000 cellule/cm2 su un nuovo piatto da 60 mm rivestito di gelatina (passaggio 1).
NOTA: gli UDC possono essere conservati in azoto liquido. Gli UDC sono di solito divisi al 60-70% di confluenza in 60 mm piatto di coltura in tre tubi di stock.
2. Costrutto retrovirale
- Amplifica l'area di codifica del plasmide MYOD1 (NM_002478.4) mediante reazione a catena di polimerasi (PCR).
NOTA: la miscela per l'amplificazione MYOD1 e le condizioni per il ciclore termico sono mostrate rispettivamente nella Tabella 1 e nella Tabella 2. - Rilevare una singola banda di circa 1.000 bp di circa 1.000 bp di circa 1.000 bp di circa 1.000 bp di circa 1.7% di elettroforesi gel agarose utilizzando 1 -L del prodotto PCR amplificato per confermare che la sequenza MYOD1 è amplificata con successo.
- Pulire il prodotto PCR utilizzando il kit di pulizia e determinarne la concentrazione con uno spettrofotometro.
- Incubare la miscela come mostrato nella tabella 3 a 37 gradi centigradi per digerire il vettore retrovirale con un sistema Tet-on e un gene resistente alla puromiccina nelle regioni di restrizione enzimatica nel sito di clonazione multipla.
- Rilevare una singola banda dello 0,7% di elettroforesi gel di agarose utilizzando 1 L del prodotto digerito per confermare che il vettore retrovirale è stato digerito con successo.
- Pulire il prodotto digerito utilizzando il kit di pulizia e determinarne la concentrazione mediante spettrofotometro.
- Per clonare il frammento di MYOD1 amplificato (prodotto dai passaggi 2.1-2.3) nel vettore retrovirale digerito (prodotto dai passi 2.4,2.6), eseguire una reazione di clonazione in fusione. Impostare la reazione come mostrato nella tabella 4, incubare la reazione per 15 min a 50 gradi centigradi, quindi posizionare sul ghiaccio.
- Eseguire la trasformazione utilizzando cellule competenti di E. coli secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali).
- Selezionare le cellule competenti trasformate colticcendo su una piastra di coltura LB composta da 10 g/L bacto tryptone, 5 g/L di lievito di bacto, 5 g/L NaCl, 15 g/l di bacto agar e 50 mg/L di ampicillina.
- Raccogliere la colonia e la coltura selezionate nel mezzo di coltura LB senza bacchea agar a 200 rpm a 37 gradi durante la notte.
- Purificare i vettori retrovirali inseriti da MYOD1utilizzando un kit di purificazione plasmide (Tabella dei materiali) e quantificare utilizzando uno spettrofotometro.
- Verificare che MYOD1 sia inserito correttamente nel vettore retrovirale mediante sequenziamento diretto del prodotto PCR amplificato dai primer in avanti e inverso mirati rispettivamente su entrambi i lati attraverso la sequenza MYOD1 inserita.
NOTA: La sequenza MYOD1 può essere rilevata inserita tra sequenze vettoriali retrovirali quando la clonazione in fusione ha esito positivo. - Per la produzione retrovirale, semina le celle di imballaggio a 50.000 cellule/cm2 su piastre rivestite di collagene da 10 cm e coltura in DMEM con il 10% di FBS umidizzato a 37 gradi centigradi e il 5% di CO2 per 24 h.
- Quando le cellule di imballaggio proliferano all'80% di confluenza, mescolate 30 g di vettori retrovirali inseriti da MYOD1,30 g di vettori di imballaggio e reagente di trasfezione contenente peptide penetrante nelle cellule (Tabella dei materiali)mediante vortice e incubarli per 10 min.
- Aggiungere la miscela incubata al mezzo di imballaggio delle cellule e della coltura umidificata a 37 e 5% di CO2.
NOTA: il rivestimento del collagene è necessario. La trasfezione può essere migliore a 24 ore o più dopo la semina perché le cellule di imballaggio si staccano facilmente dalla piastra di coltura. - Dopo 4 h o durante la notte, cambiare il mezzo di crescita medio-fresco.
- Raccogliere il supernatante virale e sostituire con un mezzo fresco a 24 e 48 h dopo la cotransfezione e combinare il supernatante.
- Per concentrare il supernatante virale, mescolare con il reagente concentratore e incubare a 37 gradi centigradi, quindi centrifugare a 1.500 x g per 45 min a 4 gradi centigradi.
- Filtrare il supernatante retrovirus attraverso un filtro PVDF con 0,45 m pori.
- Controllare il titolo del vettore retrovirale utilizzando un kit PCR quantitativo e un sistema di ciclori termico secondo le istruzioni del produttore.
- Dividere il supernatante virale in piccole aliquote e immagazzinarle a -80 gradi centigradi.
3. Infezione con vettore MYOD1-retrovirale in UDC
- Semina gli UDC a 3.000-5.000 cellule/cm2 su un piatto da 60 mm rivestito di gelatina.
- Dopo 24 h di seminamento, infettare il retrovirus scongelato (passaggio 2.21) ad una molteplicità di infezione di 200 aggiungendo bromuro di esadimetingina ad una concentrazione di 8 g/mL.
- Dopo un'incubazione di 24 h umidificata a 37 e 5% di CO2, sostituire il mezzo di coltura con un nuovo mezzo di crescita contenente 1 g/mL puromycin per selezionare le cellule trasdotte MYOD1. Cambiare il supporto ogni due giorni.
NOTA: Quando si selezionano le celle -positive MYOD1,per la selezione viene in genere utilizzato 1 g/mLmycin. La dose appropriata deve essere determinata. Utilizzare una piastra contenente cellule non trastrascanti e scegliere la dose che uccide tutte le cellule in 3/5 giorni. Le cellule positive MYOD1devono essere selezionate entro 7-10 giorni dopo l'aggiunta della pancina. Gli UDC trasdotti MYOD1possono essere conservati in azoto liquido.
4. Differenziazione miogenica degli UDC trasdotti da MYOD1trattati con 3-deazaneplanocin A hydrocloride (D-Nep)
NOTA: Recentemente, è stato riferito che il linguaggio istirico metiltransferase, potrebbe promuovere significativamente l'espressione di MYOGENIN, uno dei fattori regolatori muscolari tardivi, e anche portare alla differenziazione del miotube7.
- Piatto MYOD1-tradusse gli UDC nei pozzi rivestiti di collagene ad una densità di 3,5 x 104 cellule/cm2. Cultura umidizzata a 37 gradi centigradi e 5% di CO2.
- Dopo 24 h, cambiare il mezzo di crescita in mezzo di differenziazione composto da DMEM ad alto glucosio con L-alanina-L-glutamina, 5% siero di cavallo, supplemento ITS, 1 doxycycline g/mL, e 5M - D -Nep.
N.D.A.: La soluzione da 10 mM è da conservare per 3 mesi. Utilizzare un congelatore di scongelamento ed evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento. Sia MYOD1 attivato da doxycycline che da DaNep sopprimono la proliferazione e promuovono la differenziazione miogenica degli UDC. Pertanto, si raccomanda di aggiungere doxycycline e D-Nep dopo l'induzione della differenziazione miogenica. La dinep promuove la differenziazione miogenica dei MYOD1-UDCs in modo dipendente dalla dose. D'altra parte, mostra citotossicità ad alta concentrazione. Pertanto, determinare l'appropriata concentrazione di Netip, che va da 1/10 M a seconda dei suoi effetti sulla differenziazione miogenica e sulla biodisponibilità cellulare. - Dopo 3 giorni, cambiare il mezzo di differenziazione in un nuovo mezzo di differenziazione senza D.Nep. Quindi, modificare il supporto ogni 3 giorni.
NOTA: gli UDC si fondono tra loro e formano miotubi entro 1/2 settimane dalla differenziazione.
5. Exon saltando in MYOD1-convertito UDCs
NOTA: Qui, tre protocolli sono descritti per valutare l'esone saltando nelle cellule derivate dal paziente: 1) la reazione a catena della trancilazione inversa (RT-PCR) dell'mRNA distrofina; 2) semiquantificazione del segnale di proteina distrofina restaurata da macchia occidentale; e 3) semiquantificazione del segnale di fluorescenza distrofina restaurato per immunocitochimica. Tutti i metodi in grado di rilevare eson saltare in modo dose-dipendente.
- Valutazione dell'efficienza di salto dell'esone da parte di RT-PCR
- Per trasfecare l'oligonucleotide antisenso (ASO) in UDC convertiti a MYOD1,ottenuti da pazienti Affetti da DMD il giorno 7 dopo la differenziazione, mescolare L'ASO, la reagente di trasfezione (Tabella dei materiali) e il mezzo di differenziazione a una concentrazione finale di 1/10 -M. Cultura umidificata a 37 gradi centigradi e 5% CO2.
- Dopo 72 h di incubazione con ASO, cambiare il mezzo al nuovo mezzo di differenziazione senza ASO.
- A partire dai 3/7 giorni dopo la trasfezione ASO, rimuovere il mezzo di differenziazione e lavare 1x con PBS. Aggiungere il buffer di lisi cellulare, lisire gli UDC e raccogliere l'RNA totale utilizzando un kit di estrazione dell'RNA.
- Misurare la concentrazione di RNA con uno spettrofotometro.
- Combinare i reagenti necessari per una reazione RT-PCR in un solo passaggio nei tubi PCR secondo la tabella 5.
- Posizionare i tubi PCR con la miscela in un termociclore. Eseguire il termociclore, secondo la tabella 6.
- Eseguire l'elettroforesi microchip e calcolare l'efficienza di saltare l'esone utilizzando la concentrazione molare come di seguito.
Efficienza di salto di Exon (%) - banda saltata / (banda saltata - banda non saltata) x 100
NOTA: Conservare il prodotto PCR in frigorifero a 4 gradi centigradi per una conservazione a breve termine o -20 gradi centigradi per lo stoccaggio a lungo termine.
- Rilevamento di distrofina dopo l'eson esalto saltando da gonfiore occidentale
- Transfect ASO e cultura MYOD1-UDCs secondo i passaggi 5.1.1 e 5.1.2.
- Cambiare il mezzo ogni 3 giorni.
- Dopo 2 settimane di differenziazione, estrarre la proteina totale dalle cellule coltivate utilizzando buffer di analisi radioimmunoprecipitazione (RIPA) contenente inibitori della proteasi.
- Sonicare i lisati sul ghiaccio e centrifugare a 14.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
- Raccogliere il supernatante e determinare le concentrazioni di proteine utilizzando un kit di prova di proteine BCA.
- Aggiungere 15 g di proteine totali in un tubo da 0,5 mL e diluire aggiungendo il tampone RIPA contenente inibitori della proteasi ad un volume totale di 10 .L. Run 15 g di proteina totale per corsia.
- Aggiungere buffer di esempio, agente di riduzione e acqua deionizzata, come illustrato nella tabella 7. Denaturare la cellula lisa a 70 gradi centigradi per 10 min.
- Preparare il buffer di trisato con 8,95 g/L di tricine, 6,06 g/L tris base, 1,0 g/L di solfato di sodio (SDS).
- Caricare il campione (20 l) su gel tris-acetato 3-8% ed eseguire l'elettroforesi a 150 V per 75 min.
- Preparare il buffer di battente senza metanolo.
- Immergere la membrana PVDF per 20 s in metanolo e poi nel buffer di gonfiore fino all'uso (almeno 10 min). Tagliare la membrana PVDF a una dimensione di 6 x 8 cm con mini gel e 8 x 12 cm con gel midi.
- Tagliare le carte gonfiore alla stessa dimensione della membrana PVDF e immergerle nel tampone di battente fino all'uso.
- Dopo l'elettroforesi, tagliare il gel alla stessa dimensione della membrana PVDF e immergere il gel in acqua distillata.
- Posizionare le carte di scarico, la membrana PVDF e il gel sull'apparato di trasferimento semiassido (Figura 1). Trasferire a 4 mA/cm2 per 30 min.
- Sciacquare la membrana 2x con acqua distillata.
- Preparare come anticorpi anti-distrofina (1:500) e anti-tubulina (1:1,200) anticorpi.
- Preparare l'anticorpo anti-topo coniugato HRP (1:100) come anticorpo secondario.
- Incubare le membrane con gli anticorpi primari, lavare con il buffer di lavaggio, quindi incubare con l'anticorpo secondario utilizzando un dispositivo di lavorazione occidentale automatizzato (Tabella dei materiali) a temperatura ambiente.
NOTA: L'anticorpo anti-z-tubulina è di solito usato come controllo di carico. Le soluzioni miste anticorpali primarie, tra cui 1:500 anti-distrofina e 1:1.200 anticorpi anti-zbulina funzionano bene quando la reazione degli anticorpi viene eseguita contemporaneamente. - Sciacquare la membrana in acqua distillata.
- Rileva le proteine usando il reagente di rilevamento chemiluminescente e un imager basato su fotocamera CCD (charge-coupled device).
- Analizzare i dati utilizzando un software appropriato.
- Rilevamento di distrofina dopo l'esonforo saltando per immunocitochimica
- Riprogrammare direttamente gli UDC nei miotubi in 96 piastra rivestita di collagene secondo i passi 4.1.4.3.
- Trasfecare l'ASO e la cultura MYOD1-UDCs secondo i passaggi 5.1.2 e 5.1.3.
- Dopo 2 settimane di differenziazione, lavare le cellule con PBS e fissarle in 4% paraformaldeide per 10 min a 4 gradi centigradi.
- Permeabilize MYOD1-UDCs in detergente nonionico 0,1% per 10 min a temperatura ambiente e bloccare quelli con 10% siero di capra per 15 min a 37 gradi centigradi.
- Incubare le cellule con un anticorpo primario durante la notte a 4 gradi centigradi.
- Lavare le cellule con PBS e incubare quelle con l'anticorpo secondario per 30 min a temperatura ambiente.
NOTA: Qui, l'anti-distrofina per topi (1:30) viene utilizzata come anticorpo primario, l'IgG antito-tono viene utilizzato come anticorpo secondario e Hoechst (1:10,000) viene utilizzato per la colorazione dei nuclei. - Immagini delle lastre utilizzando un microscopio fluorescente e utilizzare un analizzatore per semiquantificare automaticamente il segnale di fluorescenza in ogni pozzo sotto le stesse condizioni.
Representative Results
Potremmo raccogliere gli UDC facilmente e in modo non invasivo. Gli UDC formarono colonie entro una settimana dopo aver iniziato la coltura cellulare primaria, abbiamo osservato una marcata capacità proliferale. La coltura degli UDC era semplice e la contaminazione batterica o fungina era rara quando la procedura è stata eseguita correttamente.
Nella figura 2 sono illustrate le immagini rappresentative a contrasto di fase della colonia UDC una settimana dopo la cultura primaria (Figura 2A) e gli UDC MYOD1una settimana dopo la differenziazione ( Figura2B). La figura 3 mostra il corretto rilevamento del salto dell'esone negli UDC ottenuti dai pazienti affetti da DMD da RT-PCR. La figura 3A mostra l'analisi RT-PCR della distrofina dopo il trattamento con oligonucleotidi antisenso negli AMC trattati con D-Nep trattati con MYOD1-UDC derivati da un maschio di 6 anni con un'eliminazione di eson 45-54 nel gene DMD. Il frame di lettura aperto è stato ripristinato da eson 44 saltando. Il giorno 14 dopo la differenziazione, abbiamo confermato l'induzione di eson saltare in modo dipendente dalla dose (Figura 3B). Le bande superiori denotano prodotti nativi, e le bande inferiori denotano prodotti eson 44 saltati che ripristinano la cornice di lettura aperta.
La figura 4 mostra il corretto rilevamento della distrofina dopo che l'esone saltava negli UDC ottenuti dai pazienti affetti da DMD da gonfiore occidentale in modo dipendente dalla dose. Abbiamo anche rilevato l'espressione di distrofina ripristinata utilizzando l'immunocitochimica (Figura 5). Abbiamo misurato le intensità della distrofina con un microscopio fluorescente 1 settimana dopo la trasfezione dell'oligonucleotide antisenso (ASO) su una piastra di 96 pozze (Figura 5A). Sono stati osservati segnali fluorescenti notevolmente più elevati in MYOD1-UDCs trattati con ASO rispetto ai MYOD1-UDC trattati con controllo ASO (Figura 5B).
Questi risultati suggeriscono che il nostro nuovo saggio può valutare l'esone saltando in modo efficiente in MYOD1-UDCs ottenuti da pazienti DMD a livello di mRNA e proteine.
Figura 1: Rappresentazione schematica dello stack di trasferimento per macchie occidentali semisecche. Due fogli imbevuti nel cuscinetto di battesimo sono stati posati al terminale negativo, e due carte imbevute nel buffer sono state impilate su questo. Il gel, che è stato imbevuto nel tampone, è stato posato delicatamente sopra la membrana PVDF. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative degli UDC. (A) Immagine a contrasto di fase degli UDC una settimana dopo la cultura primaria. Barra di scala - 200 m. Inset: Un'immagine ingrandita dell'area nel rettangolo bianco. (B) Immagine a contrasto di fase di MYOD1-UDCs una settimana dopo la differenziazione. Barra della scala: 50 m. Questa cifra è stata modificata da Takizawa et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Valutazione positiva del salto di eson nelle cellule derivate dalle urine (UDC) ottenute dai pazienti affetti da DMD da RT-PCR. (A) Analisi RT-PCR della distrofina dopo il trattamento con oligonucleotide antisenso in 3-deazaneplanocin A hydrocloruro (D-Nep)-trattato MYOD1-UDC derivato dal paziente distrofia muscolare di Duchenne (DMD) con una delezione esul 45-54. Anche l'antissiate del controllo è stato trattato con l'antisensesio da 1 a 1-10 M come controlli. MYOD1 Le bande superiori erano prodotti senza salto (eliminazione Ex 45-54) che rimanevano fuori dalla cornice di lettura. Le bande inferiori erano i prodotti exon 44-skipped (Eliminazione Ex 44-54 ed Ex 44 saltato) che ha ripristinato il frame di lettura aperto. (B) L'efficienza di skipping è stata calcolata come (molarità trascrizione ignorata a 44 caratteri)/(nativa - molarità trascrizione saltata a 44 salti [contrassegnata con frecce]) x 100% utilizzando un sistema di elettroforesi a microchip. ANOVA di sola andata, seguito dal post-hoc test di Bonferroni, è stato utilizzato per confrontare le efficienze saltate (n - 3 per ogni gruppo, " P < 0.0001). I dati sono espressi come la media - SEM. Questa cifra è stata modificata da Takizawa et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Valutazione positiva dell'eson saltare nelle cellule derivate dalle urine (UDC) dai pazienti affetti da DMD da macchie occidentali. (A) Rappresentante macchia occidentale per la distrofina in MYOD1-UDCs trattati con DMD trattati con un'espulsione di esoni 45-54 dopo che l'esone 44 salta. Per il rilevamento della distrofina, è stato utilizzato l'anti-distrofina (contro il terminale C). (B) Le intensità relative delle bande normalizzate all'espressione di z-tubulina sono state confrontate nelle cellule di derivazione del paziente con e senza antisenso trattamento con oligonucleotide eseguendo ANOVA unidirezionale seguito dal test post hoc di Bonferroni (n - 3 per ogni gruppo, "P < 0,01", "P < 0,001" ( Questa cifra è stata modificata da Takizawa et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Mappe di calore dell'immunocitochimica per la distrofina dopo il trattamento con oligonucleotide antisenso nei MYOD1-UDC trattati con D'Nep ottenuti dal paziente DMD con eliminazione di eson i 45-54. (A) L'eliminazione di exon 45-54 ha ripristinato il frame di lettura aperto in base al salto dell'esone 44. (B) L'intensità del segnale è stata quantificata utilizzando un microscopio fluorescente dopo 1 settimana di trasfezione oligonucleotide antisenso su una piastra di 96 pozze. Per il confronto è stato utilizzato ANOVA unidirezionale seguito dal post hoc test di Bonferroni (n - 3-4 per ogni gruppo, . Questa cifra è stata modificata da Takizawa et al.7. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Reagente | Volume | Concentrazione finale |
| 2x premiscela PCR | 12,5 ll | 1x (in modo non il |
| Primer in avanti | 17.00 | 0,2 M |
| Primer inverso | 17.00 | 0,2 M |
| Modello | 80 ng | |
| Acqua distillata sterilizzata | fino a 25 ll | |
| Volume totale per reazione | 25 ll |
Tabella 1: Miscela per amplificazione MYOD1 di RT-PCR.
| 98 gradi centigradi | 10 s | |
| 55 gradi centigradi | 10 s | 35 cicli |
| 72 gradi centigradi | 10 s |
Tabella 2: Condizioni per il ciclore termico per l'amplificazione MYOD1.
| Reagente | Volume |
| Buffer 10x K | 2 ll |
| Vettore retrovirale (500 ng/L) | 2 ll |
| Enzima di restrizione 1 (2-15 U) | 1 ll |
| Enzima di restrizione 2 (2-15 U) | 1 ll |
| Acqua distillata sterilizzata | 14 l l |
| Volume totale | 20 l l |
Tabella 3: Miscela per un tubo per digerire il vettore retrovirale.
| Reagente | Volume |
| Frammento MYOD1 purificato | 100 ng |
| Vettore retrovirale digerito | 100 ng |
| Premix enzimatica 5x | 4 ll |
| Acqua distillata sterilizzata | fino a 20 l |
| Volume totale | 20 l l |
Tabella 4: Miscela per la reazione di clonazione in fusione.
| Soluzione | Volume/Reazione (L) | Concentrazione finale |
| Acqua senza RNani | Variabile | - |
| Buffer RT-PCR in un passaggio | 4 | 1x (in modo non il |
| miscela dNTP (contenente 10 mM di ciascun dNTP) | 0.8 | 400 mM di ogni dNTP |
| Primer in avanti (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Primer inverso (10 mM) | 1.2 | 0,6 mM |
| Miscela di enzimi RT-PCR in un solo passaggio | 0.8 | - |
| Inibitore di RNase (opzionale) | Variabile | Unità/reazione da 5/10 unità |
| MODELLO RNA | 50-400 ng | |
| Volume totale | 20 |
Tabella 5: Composti necessari per una reazione del RT-PCR in un solo passaggio.
| 1 ciclo | Trascrizione inversa | 30 min | 50 gradi centigradi |
| 1 ciclo | Passaggio di attivazione PCR iniziale | 15 min | 95 gradi centigradi |
| 1 ciclo | Denaturazione | 1 min | 94 gradi centigradi |
| Ricottura | 1 min | 60 gradi centigradi | |
| Estensione | 1 min | 72 gradi centigradi | |
| 1 ciclo | Estensione finale | 7 min | 72 gradi centigradi |
| Tenere | ∞ | 4 gradi centigradi |
Tabella 6: Condizione del ciclore termico per RT-PCR in un solo passaggio.
| Reagente | Volume |
| Proteine (15 g) | 10 ll |
| Buffer di esempio (4x) | 5 ll |
| Agente di riduzione (10x) | 2 ll |
| Acqua deionizzata | 3 l l |
| Volume totale | 20 l l |
Tabella 7: Preparazione di campioni per elettroforesi del gel di poliacrilamazione di sodio dodecyl (SDS-PAGE).
Discussion
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato di esone salto in MYOD1-convertito UDCs ottenuti da pazienti DMD. Utilizzando il sistema di analisi, abbiamo esaminato le sequenze antisense ottimali in modo efficiente. Partiamo dal presupposto che gli UDC convertiti da MYOD1possano essere utili per lo studio della fisiopatologia della malattia.
La valutazione dello salto dell'esone utilizzando cellule derivate dal paziente a livello di mRNA è indispensabile per lo screening di nuovi farmaci e la valutazione dell'ammissibilità del paziente prima di intraprendere sperimentazioni cliniche. Il calcolo dell'efficienza di saltare l'esone può essere valutato solo a livello di mRNA.
La valutazione del salto dell'esone a livello proteico è importante anche perché il ripristino della distrofina è importante come biomarcatore surrogato per prevedere i benefici del salto dell'esone. Ad oggi, lo screening delle sequenze di oligonucleotidi antisenso viene spesso eseguito utilizzando linee cellulari muscolari primarie o linee cellulari myoblasti immortalate tra cui cellule rhabdomyosarcoma (RD) umane, ma non possiamo misurare il recupero dei livelli di distrofina utilizzando linee cellulari muscolari o linee cellulari RD perché esprimono questa proteina endogenamente. Siamo in grado di rilevare chiaramente il ripristino della distrofina in DMD cocente MYOD1-UDCs derivante dalla dose in modo dipendente dalla dose. Nel nostro nuovo assaggio, riteniamo che la valutazione delle proteine restaurate dal gonfiore occidentale sia superiore in quantificabilità. D'altra parte, la valutazione per immunocitochimica utilizzando 96 piastre di pozzi è ideale per lo screening simultaneo di molti composti candidati.
In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per un muscolo DMD di modellazione efficiente utilizzando UDC convertiti a MYOD1insieme a RT-PCR, gonfiore occidentale e immunocitochimica per valutare la distrofina ripristinata a livello di mRNA e proteine dopo lo skipping dell'esone. Gli UDC possono essere raccolti in modo non invasivo e facile. Pertanto, assumiamo che il nuovo saggio in vitro possa essere applicato a una vasta gamma di studi di base e traslazionali indipendentemente dal tipo di disturbi muscolari.
Disclosures
Il National Center of Neurology and Psychiatry sta ora sviluppando NS-065/NCNP-01, un farmaco di salto di 53 esoni per DMD, con Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Japan Society for the Promotion of Science Grant-in-Aid for Scientific Research (C) [grant n. 18K07544 a Y.A.], Grants-in-Aid for Research on Nervous and Mental Disorders [grant no. 28-6 a Y.A.], e l'Agenzia Giapponese per la Ricerca e lo Sviluppo Medico [grant 18ek0109239h0002, 18lm0203066h0001 e 18l0203069h0001 a Y.A.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
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