Summary
В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышечной дистрофии мышц Дюшенна с использованием MYOD1-преобразованныхмочевых клеток для оценки восстановления дистрофин мРНК и уровня белка после пропуска экзона.
Abstract
Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD), прогрессирующее и смертельное заболевание мышц, вызвана мутациями в гене DMD, которые приводят к отсутствию белка дистрофина. На сегодняшний день мы завершили исследование, инициированное исследователем в Национальном центре неврологии и психиатрии, основанное на системной инъекции морфолино олигонуклеотидов, которые склонны к пропуску экзон-53. Для эффективного лечения DMD, в пробирке тестирования с myoblasts, полученных из DMD пациентов для проверки наркотиков и оценки права пациента до проведения клинических испытаний считается необходимым. Совсем недавно мы сообщили о новой MYOD1-преобразованноймочи полученных клеток (UDC) лечение ингибитором гистон метилтрансферазы (3-деазанепланоцин гидрохлорид), как клеточная модель DMD. Новый аутологичный УДК может показать фенокопию специфических фенотипов ДМД, что приводит к применению высокоточной медицины при различных заболеваний, связанных с мышцами. В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышечных клеток DMD с использованием MYOD1-преобразованныхUDCs вместе с обратной транскриптазной полимеразной цепной реакцией (RT-PCR), западной блоттингом и иммуноцитохимией для оценки восстановления дистрофина мРНК и уровней белка после пропуска экзона.
Introduction
Мышечная дистрофия Дюшенна (DMD), прогрессирующее, смертельное заболевание мышц, вызвано перестановками в гене DMD, которые приводят к отсутствию белка дистрофина1. Антисмысловая олигонуклеотидная экзонная терапия, как полагают, является многообещающей для DMD. Эта терапия основана на преобразовании более тяжелого фенотипа DMD в более мягкий беккер мышечной дистрофии, как фенотип путем изменения пре-мРНК сращивания для восстановления DMD чтениякадра 2. Недавно мы завершили первое в человеке исследование, основанное на повторном внутривенном введении фосфородиамидат морфолино олигомер (PMO) viltolarsen, который может вызвать экзон 53 пропуск в DMD, и продемонстрировали отличный профиль безопасности, перспективные эффективности,3и приемлемые фармакокинетические параметры (зарегистрирован как UMIN: 000010964 и ClinicalTrials.gov0000.
Однако, чтобы разработать экономически эффективные и эффективные методы лечения болезни, в пробирке тесты с использованием первичных мышечных клеток, полученных от пациентов DMD имеют важное значение для скрининга наркотиков и проверки права пациента до проведения клинических испытаний, а также биомаркеры, которые отражают эффективность экзон пропуска терапии во время испытаний на людях4. Совсем недавно мы сообщили о новой технологии для разработки пациентов конкретных MYOD1-преобразованныхмочи полученных клеток (UDCs)5,6 в качестве основной модели миобласт DMD7. Таким образом, для генерации миобластов требуется только сбор мочи у пациентов и не требуется инвазивная процедура. В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышц DMD с использованием MYOD1-преобразованныхУДК, обработанных гидрохлоридом 3-деазанепланоцин а для оценки восстановленного дистрофина мРНК и белка после пропуска экзона.
Protocol
Комитет по этике Национального центра неврологии и психиатрии одобрил это исследование (идентификатор одобрения: A2017-018, A2018-029). Все люди дали информированное согласие, прежде чем предоставить мочу. Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и положениями.
1. Изоляция и первичная культура УДК
ПРИМЕЧАНИЕ: UDCs были изолированы в соответствии с ранее опубликованным протоколом8,9,10 с некоторыми изменениями.
- Сбор образцов мочи во время спонтанного миктурации в стерилизованных пластиковых бутылках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизация внешнего уретры не требуется. Моча среднего течения желательно снизить риск вирусного заражения. Если запас времени до следующей процедуры составляет 1 ч, образцы мочи должны быть переданы на 4 кВ, чтобы сохранить жизнеспособность клетки. Тем не менее, следует избегать температуры lt;4 c, так как могут появиться нерастворимые осадки. - Centrifuge весь образец мочи на 400 х г в течение 10 минут при комнатной температуре.
- Аспирируй супернатанта, оставляя 1 мл в трубке.
- Приготовьграйте гранулы индивидуально в оставшиеся 1 мл мочи, а затем соберите их в одной трубке 50 мл.
- Добавьте 10 мл стирального буфера, состоящего из 99 мл PBS без кальция и магния, 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), 0,5 мкг/мл амфотерицина В, и центрифугу образцы при температуре 200 х г на 10 мин при комнатной температуре.
- Призадыхать супернатант, оставляя 0,2 мл в трубке.
- Приостановить действие клеточных гранул в 4,5 мл первичной среды, состоящей из смеси 1:1 модификации высокой глюкозы Dulbecco Eagle medium (DMEM) без пирувата натрия и питательной смеси Фарма Фарма, дополненной рекомбинантным человеческим эпидермальным фактором роста (EGF), инсулином, гидрокортизон, эпинефрин, Т3, трансферрин, 10% тетрациклин без сыворотки для крупного рогатого скота (FBS), 1% P/S, и 0,5 мкг/мл амфотерицин B.
- Семя клеток в трех колодцах желатина покрытием шесть скважин (общий объем каждой скважины, 1,5 мл). Культура увлажняет при 37 градусах Цельсия и 5% CO2 на 24 ч.
- Добавить 1,5 мл первичной среды ежедневно в течение следующих 3 дней.
- На 4-й день замените среду 1,5 мл среды роста, дополненной рекомбинантным ЧЕЛОВЕЧЕСКИм EGF, инсулин, гидрокортизон, эпинефрин, T3, трансферрин, 15% тетрациклин без FBS, 0,5% L-аланин-L-глютамин, 0,5% несущественные аминокислоты, и 2,5 нг/мЛ фибробластный фактор роста-основной (bFGF), рекомбинантный человеческий платок-производный фактор роста (PDGF).
- Изменение среды роста через день.
ПРИМЕЧАНИЕ: колонии UDC появляются в течение недели. - Когда культура UDC становится 80-90% слияния, удалить средних и мыть клетки с PBS, разделить все клетки, используя 0,25% трипсин-EDTA и семян на 3000-5000 клеток / см2 на новый желатина покрытием 60 мм блюдо (проход 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: UdCs может храниться в жидком азоте. UDCs обычно разделены на 60'70% confluency в тарелке культуры 60 mm в 3 пробки штока.
2. Ретровирная конструкция
- Усиль область кодирования MYOD1 (NM_002478.4) плазмидса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь для усиления MYOD1 и условия для теплового циклизатора показаны в таблице 1 и таблице 2,соответственно. - Обнаружить одну полосу около 1000 bp размер на 0,7% агарозного геля электрофорусс с использованием 1 Зл из усиленного продукта ПЦР, чтобы подтвердить, что myOD1 последовательность усиливается успешно.
- Очистите продукт ПЦР с помощью комплекта очистки и определите его концентрацию с помощью спектрофотометра.
- Инкубировать смесь, как показано в таблице 3 на 37 градусов по Цельсию на ночь переварить ретровирусный вектор с тет-на системы и пуромицин устойчивый ген при ограничении ферментцелевых регионов в множественном месте клонирования.
- Обнаружить одну полосу на 0,7% агарозного геля электрофоресиса с использованием 1 Зл переваренный продукт, чтобы подтвердить, что ретровирусный вектор был успешно переварен.
- Очистите переваренный продукт с помощью комплекта очистки и определите его концентрацию с помощью спектрофотометра.
- Для клонирования усиленного фрагмента MYOD1 (произведенного шагами 2.1-2.3) в переваренный ретровирусный вектор (произведенный шагами 2,4–2,6) выполняется реакция клонирования синтеза. Настройте реакцию, как показано в таблице 4,инкубировать реакцию в течение 15 минут при 50 градусах Цельсия, а затем поместите на лед.
- Выполните трансформацию с использованием компетентных ячеек E. coli в соответствии с инструкциями производителя(Таблица материалов).
- Выберите преобразованные компетентные клетки, культивируя на пластине культуры LB, состоящей из 10 г/л бактеритто триптона, 5 г/л экстракта дрожжей bacto, 5 г/l NaCl, 15 г/l бакто агара и 50 мг/l ампициллин.
- Возьмите выбранную колонию и культуру в среде культуры LB без бакто агара при 200 об/мин при 37 градусах Цельсия на ночь.
- Очистите MYOD1-вставленныеретровирусные векторы с помощью плазмидного комплекта очистки(Таблица материалов)и количественно с помощью спектрофотометра.
- Подтвердите, что MYOD1 правильно вставляется в ретровирусный вектор путем прямого секвенирования продукта ПЦР, усиленного вперед и обратными грунтовками, ориентированными соответственно с обеих сторон по вставленной последовательности MYOD1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность MYOD1 может быть обнаружена зажатой между ретровирусными векторными последовательностями, когда клонирование в синтезе успешно. - Для ретровирусного производства, семена упаковочных клеток на 50000 клеток / см2 на 10 см коллагена покрытием пластин и культуры в DMEM с 10% FBS увлажнена при 37 КС и 5% CO2 на 24 ч.
- Когда упаковочные клетки размножаются до 80% сплава, смешайте 30 мкг ретровирусных векторов MYOD1,30 мкг упаковочных векторов и трансфекционный реагент, содержащий клеточный пептид(Таблица материалов) путем вихря, и инкубировать их в течение 10 мин.
- Добавьте инкубированную смесь к среде упаковочных клеток и культуры увлажненных при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
ПРИМЕЧАНИЕ: Коллагеновое покрытие необходимо. Трансфекция может быть лучше на 24 ч или более после посева, потому что упаковочные клетки легко отделиться от культуры пластины. - После 4 ч или на ночь, изменить среднюю на свежую среду роста.
- Соберите вирусный супернатант и заменить свежей среде на 24 и 48 ч после котрансфекции и объединить супернатант.
- Чтобы сконцентрировать вирусный супернатант, смешайте его с реагентом концентратора и инкубируйте при 37 градусах Цельсия на ночь, затем центрифуге при 1500 х г в течение 45 мин при 4 градусах Цельсия.
- Фильтр ретровирус супернатант через фильтр PVDF с 0,45 мкм поры.
- Проверьте титр ретровирусного вектора с помощью количественного комплекта ПЦР и системы теплового цикла в соответствии с инструкциями производителя.
- Разделите вирусный супернатант на мелкие аликуты и запасите их при -80 градусах Цельсия.
3. Инфекция MYOD1-ретровирусным вектором в УДК
- Семя UDCs на 3000-5000 клеток / см2 на желатине покрытием 60 мм блюдо.
- После 24 ч посева, заразить размороженный ретровирус (шаг 2.21) на множественность инфекции 200, добавив гексадиметрин бромид в концентрации 8 мкг/мл.
- После 24 ч инкубации увлажненный при 37 КС и 5% CO2, заменить среду культуры со свежим ирост среды, содержащей 1 мкг/мл пуромицин, чтобы выбрать MYOD1-трансумированных клеток. MYOD1 Изменение среды через день.
ПРИМЕЧАНИЕ: При выборе для MYOD1-положительныхклеток, 1 мкг/мл пуромицин обычно используется для выбора. Соответствующая доза должна быть определена. Используйте тарелку, содержащую нетрансинфицированные клетки, и выберите дозу, которая убивает все клетки в течение 3-5 дней. MYOD1-положительныеклетки должны быть выбраны в течение 7-10 дней после добавления пуромицицина. MYOD1-трансумированные УДК могут храниться в жидком азоте. MYOD1
4. Миогенная дифференциация МИОД1-трансумированныхУДК, обработанных гидрохлоридом 3-деазанепланоцина А (ДЗНеп)
ПРИМЕЧАНИЕ: В последнее время было сообщено, что Дзнеп, ингибитор гистон метилтрансферазы, может значительно способствовать выражению MYOGENIN, один из поздних факторов регулирования мышц, а также привести к дифференциации миотубетуса7.
- Плита MYOD1-трансумированные УДК в колонадистых колодцах при плотности 3,5 х 104 клетки/см2. Культура увлажнена при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
- После 24 ч, изменить среду роста к дифференциации среды, состоящей из высокой глюкозы DMEM с L-аланин-L-глютамин, 5% лошади сыворотки, ITS дополнения, 1 мкг /мл доксициклин, и 5 ММ ДЗНеп.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор 10 мМ Дзнеп может храниться при -80 градусов по Цельсию в течение 3 месяцев. Используйте морозильник для размораживания и избегайте повторных циклов замораживания-оттепели. Оба MYOD1 активированы доксициклина и Дзнеп подавляют пролиферацию и способствуют миогенной дифференциации УДК. Поэтому рекомендуется добавлять доксициклин и Дзнеп после индукции миогенной дифференциации. ДЗНеп способствует миогенной дифференциации MYOD1-UDCsв зависимости от дозы образом. С другой стороны, он показывает цитотоксичность при высокой концентрации. Таким образом, определить соответствующую концентрацию ДЗНеп, начиная от 1'10 мкм в зависимости от его воздействия на миогенной дифференциации и клеточной биодоступности. - Через 3 дня измените среднюю дифференциацию на свежую среду дифференциации без ДЗНеп. Затем, изменить среду каждые 3 дня.
ПРИМЕЧАНИЕ: UDCs предприимчивы друг к другу и образуют миотубевы в течение 1-2 недель после дифференциации.
5. Exon пропуск в MYOD1-преобразованных UDCs
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь описаны три протокола для оценки пропуска экзона в клетках, полученных из числа пациентов: 1) обратная транскриптаза полимеразной цепной реакции (РТ-ПЦР) дистрофина мРНК; 2) полуколичественное восстановление восстановленного сигнала белка дистрофина западным пятном; и 3) полуколичественное образование восстановленного сигнала флуоресценции дистрофина с помощью иммуноцитохимии. Все методы могут обнаружить экзон пропуск в дозе-зависимым образом.
- Оценка эффективности пропуска экзона ПО RT-PCR
- Для трансфекта антисмыслового олигонуклеотида (ASO) в MYOD1-преобразованныеUDCs, полученные от пациентов DMD на 7 день после дифференциации, смешайте ASO, трансфекционный реагент(Таблица материалов),и дифференциация средняя до конечной концентрации от 1'10 qM. Культура увлажненной при 37 C и 5% CO2.
- После 72 ч инкубации с ASO, изменить среднюю на свежую среду дифференциации без ASO.
- От 3 до 7 дней после трансфекции ASO, удалить дифференциации среды и мыть 1x с PBS. Добавьте буфер лиза клетки, лисите UDCs и собирайте полную РНК с помощью комплекта экстракции РНК.
- Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра.
- Объедините необходимые реагенты для одноступенчатой реакции РТ-ПЦР в пЦР-трубках в соответствии со таблицей 5.
- Поместите пЦР трубки со смесью в термоциклер. Выполнить термоцикл, в соответствии с таблицей 6.
- Выполните микрочип электрофорекс и рассчитать экзон пропуская эффективность с помощью молярной концентрации, как ниже.
Exon пропуская эффективность (%) - пропущенная полоса / (пропущенная полоса , непропущенная полоса) x 100
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните продукт ПЦР в холодильнике при 4 градусах По кв/ для кратковременного хранения или -20 градусов для длительного хранения.
- Обнаружение дистрофина после пропуска экзона западным блоттингом
- Трансфект ASO и культура MYOD1-UDCs в соответствии со шагами 5.1.1 и 5.1.2.
- Изменение среды каждые 3 дня.
- После 2 недель дифференциации, извлечь общий белок из культивированных клеток с помощью радиоиммунопреционных анализ (RIPA) буфер, содержащий ингибиторы протеазы.
- Сножате лисаты на льду и центрифуге при 14 000 х г в течение 15 мин при 4 градусах Цельсия.
- Соберите супернатант и определить концентрации белка с помощью комплекта анализ овак протеина BCA.
- Добавьте 15 мкг общего белка в трубку 0,5 мл и разбавьте, добавив буфер RIPA, содержащий ингибиторы протеазы, в общий объем 10 л. Выполнить 15 мкг общего белка на полосу.
- Добавьте образец буфера, уменьшая агент, и деионизированной воды, как показано в таблице 7. Денатурная клетка лисатируетпри при 70 градусах по Цельсию в течение 10 мин.
- Подготовьте трехацетатный бегущий буфер, содержащий 8,95 г/л трицина, 6,06 г/л трис базы, 1,0 г/л натрия додецил сульфат (SDS).
- Загрузите образец (20 л) на трис-ацетат 3-8% геля и выполните электрофорус при 150 В в течение 75 мин.
- Приготовьте буфер для промотирования без метанола.
- Замочите мембрану PVDF на 20 с метанола, а затем в буфере для промокать до использования (не менее 10 мин). Вырежьте мембрану PVDF размером 6 х 8 см с помощью мини-гелей и 8 х 12 см с помощью миди гелей.
- Вырезать промокать бумаги до того же размера, что и мембраны PVDF и впитать те, в буфере blotting до использования.
- После электрофореза разрежьте гель до того же размера, что и мембраны PVDF, и замочите гель в дистиллированной воде.
- Поместите блохитые бумаги, мембрану PVDF и гель на полусухом переносном аппарате(рисунок 1). Передача на 4 мА/см2 за 30 мин.
- Промыть мембрану 2x дистиллированной водой.
- Приготовьте антидистрофин (1:500) и анти-тубулин (1:1,200) в качестве основных антител.
- Подготовка HRP-конъюгированных анти-мышь антитела (1:100) в качестве вторичного антитела.
- Инкубировать мембраны с первичными антителами, мыть с буфером мытья, затем инкубировать с вторичными антителами с помощью автоматизированного устройства западной обработки(Таблица материалов) при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анти-я-тубулин антитела, как правило, используется в качестве контроля нагрузки. Смешанные первичные антитела, в том числе 1:500 антидистрофина и 1:1,200 анти-тубулин антитела хорошо работают, когда реакция антител выполняется одновременно. - Промыть мембрану в дистиллированной воде.
- Обнаружить белки с помощью химикуминенового обнаружения реагента и заряда-связанных устройств (CCD) камеры на основе изображения.
- Анализ данных с помощью соответствующего программного обеспечения.
- Обнаружение дистрофина после пропуска экзона иммуноцитохимией
- Непосредственно перепрограммировать UDCs в миотубебы в коллагена покрытием 96 хорошо пластины в соответствии с шагами 4.1'4.3.
- ТрансфектИровать ASO и культуры MYOD1-UDCs в соответствии с шагами 5.1.2 и 5.1.3.
- После 2 недель дифференциации, мыть клетки с PBS и исправить их в 4% параформальдегида в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия.
- Permeabilize MYOD1-UDCs в 0,1% неионического моющего средства в течение 10 мин при комнатной температуре и блокировать тех, с 10% козьей сыворотки в течение 15 мин при температуре 37 градусов по Цельсию.
- Инкубировать клетки с первичным антителом на ночь при 4 градусах Цельсия.
- Вымойте клетки с PBS и инкубировать те, со вторичным антителом в течение 30 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь мышь анти-дистрофина (1:30) используется в качестве основного антитела, анти-мышь IgG используется в качестве вторичного антитела, и Hoechst (1:10000) используется для окрашивания ядер. - Изображение пластин с помощью флуоресцентного микроскопа и использовать анализатор для полуколичественной флуоресценции сигнала автоматически в каждом колодце при том же состоянии.
Representative Results
Мы могли бы собирать UDCs легко и неинвазивно. UDCs сформировали колонии в течение недели после начала первичной культуры клеток мы наблюдали заметной пролиферативной способности. Культура UdCs была проста, и бактериальное или грибковое загрязнение было редким, когда процедура была выполнена правильно.
На рисунке 2 показаны репрезентативные фазово-контрастные изображения колонии УДК через неделю после первичной культуры(рисунок 2А)и MYOD1-UDCs через неделю после дифференциации(рисунок 2B). На рисунке 3 показано успешное обнаружение экзона пропуска в UDCs, полученных от пациентов DMD RT-PCR. Рисунок 3показывает RT-PCR анализ дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида лечения в ДЗНеп-обработанных MYOD1-UDCs,полученных от 6-летнего мужчины с экзоном 45-54 удаление в гене DMD. Открытая рамка чтения была восстановлена пропуском exon 44. На 14 день после дифференциации, мы подтвердили индукции экзона пропуска в дозе зависимым образом(Рисунок 3B). Верхние полосы обозначают родные продукты, а нижние полосы обозначают экзон 44-пропущенные продукты, которые восстановили открытую рамку чтения.
Рисунок 4 показывает успешное обнаружение дистрофина после пропуска экзона в UdCs, полученных от пациентов DMD западным изависимым от дозы образом. Мы также обнаружили восстановленное экспрессию дистрофина с помощью иммуноцитохимии(рисунок 5). Мы измерили интенсивность дистрофина флуоресцентным микроскопом через неделю после переклификации антисмыслового олигонуклеотида (ASO) на 96 хорошо пластины(рисунок 5А). Заметно более высокие флуоресцентные сигналы наблюдались в MYOD1-UDCs, обработанных ASO, чем в MYOD1-UDCs, обработанных с контролем ASO(рисунок 5B).
Эти результаты показывают, что наш новый анализ может оценить экзон пропуска эффективно в MYOD1-UDCs,полученных от пациентов DMD на уровне мРНК и белка.
Рисунок 1: Схематическое представление стека передачи для полусухого западного поместья. Две бумаги, пропитанные буфером сближания, были заложены на отрицательном терминале, и две бумаги, пропитанные буфером, были уложены поверх этого. Гель, который был пропитан в буфере, был аккуратно заложен над мембраной PVDF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения УДК. (A)Фазово-контрастное изображение УДК через неделю после первичной культуры. Шкала бар 200 мкм. Всет: увеличенное изображение области в белом прямоугольнике. (B) Фазовое контрастное изображение MYOD1-UDCs через неделю после дифференциации. Шкала бар 50 мкм. Эта цифра была изменена с Takizawa и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Успешная оценка пропуска экзона в клетках, полученных от мочи (UDCs), полученных от пациентов DMD RT-PCR. ()RT-PCR анализ дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида лечения в 3-деазанепланоцин гидрохлорид (ДЗНеп) лечение MYOD1-UDCs,полученных от мышечной дистрофии Дюшенна (DMD) пациента с экзон45-54 удаления. Дзнеп-обработанный MYOD1-UDCsтакже были обработаны с антисмыслом управления на 1-10 мкм концентрации в качестве контроля. Верхние полосы были непропущенными продуктами (Удаление Ex 45-54), которые остались вне рамки для чтения. Нижние полосы были экзон 44-пропущенных продуктов (Ex 44-54 удаления и Ex 44 пропустил), которые восстановили открытый кадр чтения. (B) Пропуск эффективность была рассчитана как (экзон 44-пропущенный протокол моляритство)/(родной й экзон 44-пропущенный протокол моляристость »отмечена стрелками) х 100% с помощью системы электрофорасиса микрочипа. Для сравнения эффективности пропускающих (n- 3 для каждой группы) использовался односторонний ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Bonferroni(n) no 3 для каждой группы, «P »lt; 0.0001). Данные выражаются в виде среднего значения SEM. Эта цифра была изменена с Takizawa и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Успешная оценка экзона пропуска в мочеклеток (UDCs) от пациентов DMD западной подьеносец. (A) Представитель Западной пятно для дистрофина в ДЗНеп лечение MYOD1-UDCsот пациента DMD с экзон45-54 удаления после экзона 44 пропуска. Для обнаружения дистрофина использовался антидистрофин (против C-терминала). (B) Относительная интенсивность полос нормализованы до экспрессии з-тубулин были сравнены в пациента полученных клеток с и без антисмыслового олигонуклеотида лечения, выполняя одностороннее ANOVA следуют Bonferroni после hoc тест (n No 3 для каждой группы, "P lt; 0,01, Эта цифра была изменена с Takizawa и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Тепловые карты иммуноцитохимии для дистрофина после антисмыслового олигонуклеотида в ЛЕЧЕНИи ДЗНеп MYOD1-UDCs, полученные от пациента DMD с удалением экзона 45-54. (A) Удаление экзона 45-54 восстановил открытый кадр чтения на основе экзона пропуска экзона 44. (B) Интенсивность сигнала была количественно с помощью флуоресцентного микроскопа после 1 недели антисмыслового олигонуклеотида трансфекции на 96 хорошо пластины. Для сравнения использовался односторонний ANOVA, за которым следовал пост-специальный тест Bonferroni (n No 3-4 для каждой группы, qs p slt; 0.0001). Эта цифра была изменена с Takizawa и др.7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Реагента | Объем | Окончательная концентрация |
| 2x пЦР-премикс | 12,5 л | 1x |
| Передняя грунтовка | 5 рмоль | 0,2 мкм |
| Обратная грунтовка | 5 рмоль | 0,2 мкм |
| Шаблон | 80 нг | |
| Стерилизована дистиллированная вода | до 25 л л | |
| Общий объем на одну реакцию | 25 зл. |
Таблица 1: Смесь для усиления MYOD1 по РТ-ПЦР.
| 98 кв. c | 10 с | |
| 55 кк с | 10 с | 35 циклов |
| 72 кк с | 10 с |
Таблица 2: Условия для теплового цикла для усиления MYOD1.
| Реагента | Объем |
| 10x K буфер | 2 л |
| Ретровирусный вектор (500 нг/л) | 2 л |
| Фермент ограничения 1 (2–15 U) | 1 зл |
| Фермент ограничения 2 (2–15 U) | 1 зл |
| Стерилизована дистиллированная вода | 14 зл. |
| Общий объем | 20 зл |
Таблица 3: Смесь для трубки для переваривания ретровирусного вектора.
| Реагента | Объем |
| Очищенный фрагмент MYOD1 | 100 нг |
| Усваиваемый ретровирусный вектор | 100 нг |
| 5x Фермент ный премикс | 4 л |
| Стерилизована дистиллированная вода | до 20 л |
| Общий объем | 20 зл |
Таблица 4: Смесь для реакции клонирования синтеза.
| Решение | Объем/реакция (КЛ) | Окончательная концентрация |
| Безrза | Переменной | - |
| Одноступенчатый буфер РТ-ПЦР | 4 | 1x |
| смесь dNTP (содержащая 10 мМ каждого dNTP) | 0.8 | 400 мМ каждого dNTP |
| Передняя грунтовка (10 мМ) | 1.2 | 0,6 мМ |
| Обратная грунтовка (10 мМ) | 1.2 | 0,6 мМ |
| Одноступенчатая ферментная смесь RT-PCR | 0.8 | - |
| Ингибитор RNase (по желанию) | Переменной | 5–10 единиц/реакция |
| Шаблон РНК | 50-400 нг | |
| Общий объем | 20 |
Таблица 5: Необходимые соединения для одной реакции одноступенчатой РТ-ПЦР.
| 1 цикл | Обратная транскрипция | 30 мин. | 50 кв. c |
| 1 цикл | Первоначальный шаг активации ПЦР | 15 мин. | 95 кв. c |
| 1 цикл | Денатурация | 1 мин. | 94 кК |
| Отжига | 1 мин. | 60 кк | |
| Расширение | 1 мин. | 72 кк с | |
| 1 цикл | Окончательное расширение | 7 мин. | 72 кк с |
| Держать | ∞ | 4 кк с |
Таблица 6: Тепловое состояние циклизатора для одноступенчатой РТ-ПЦР.
| Реагента | Объем |
| Белок (15 мкг) | 10 зл |
| Образец буфера (4x) | 5 зл |
| Уменьшающий агент (10x) | 2 л |
| Деионизированная вода | 3 зл |
| Общий объем | 20 зл |
Таблица 7: Приготовление образцов для натрия додецил сульфат полиакриламида гель электрофорес (SDS-PAGE).
Discussion
Здесь мы описываем подробный протокол пропуска экзона в MYOD1-преобразованныхUDCs, полученных от пациентов DMD. Используя систему ассс, мы эффективно проверяли оптимальные антисмысловые последовательности. Мы предполагаем, что MYOD1-преобразованныеУДК могут быть полезны для исследования патофизиологии заболевания.
Оценка пропуска экзона с использованием клеток, полученных из числа пациентов на уровне мРНК, необходима для скрининга новых препаратов и оценки права пациента до проведения клинических испытаний. Расчет эффективности пропуска экзона может быть оценен только на уровне мРНК.
Оценка экзона пропуска на уровне белка также важно, потому что восстановление дистрофина имеет важное значение в качестве суррогатного биомаркера, чтобы предсказать преимущества экзона пропуска. На сегодняшний день скрининг антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей часто выполняется с использованием первичных линий мышечных клеток или увековечил линии клеток миобласта, включая клетки рабдомиосаркомы человека (РД), но мы не можем измерить восстановление уровня дистрофина с помощью линий мышечных клеток или RD-клеточных линий, потому что они выражают этот белок негодуродно. Мы можем четко обнаружить восстановление дистрофина в DMD пациента производных MYOD1-UDCsв дозе зависимым образом. В нашем новом анализе мы считаем, что оценка восстановленного белка западным испугом превосходит по количественной оценке. С другой стороны, оценка иммуноцитохимии с использованием 96 скважин ных пластин идеально подходит для скрининга многих соединений кандидата одновременно.
В этой статье мы описываем подробный протокол для эффективного моделирования мышц ЫМД с использованием MYOD1-преобразованныхUDCs вместе с RT-PCR, Западным блоттингом и иммуноцитохимией для оценки восстановленного дистрофина на мРНК и уровня белка после пропуска экзона. UDCs могут быть собраны неинвазивно и легко. Таким образом, мы предполагаем, что совершенно новый анализ in vitro может быть применен к широкому спектру основных и трансляционных исследований независимо от типа мышечных расстройств.
Disclosures
Национальный центр неврологии и психиатрии в настоящее время разрабатывает NS-065/NCNP-01, экзон 53 пропуск наркотиков для DMD, с Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Японским обществом содействия научным грантам для научных исследований (C) «Грант No 18K07544 до Y.A.», Гранты-в-помощь для исследований по нервным и психическим расстройствам (грант No 28-6 до Y.A.) и Японское агентство медицинских исследований и разработок (grant nos. 18ek0109239h002), 18lm0203066h0001, и 18lm0203069h001 к Y.A.A.A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% P/S Solution Stabilized | Thermo Fisher | 15070-063 | Cell culture |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942 | |
| Anti-dystrophin | Abcam | ab15277 | Western blot (WB) |
| Anti-dystrophin | Leica | NCL-DYS1 | Immunocytochemistry(ICC) |
| Anti-mouse IgG, Dylight 488 | Vector Laboratories | DK-2488 | ICC |
| Anti-α-tubulin | Sigma | T6199 | Western bot and ICC |
| BZ-X800 | KEYENCE | BZ-800 | Fluorescent microscope |
| CELLBANKER | ZENOAQ | CB011 | Cell stock in liquid nitrogen |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | 170-8280J1 | WB |
| CloneAmp HiFi PCR premix | Clontech | 639298 | Retroviral production |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693116001 | Protein extraction for WB |
| E.coli DH5 α Competent Cells | TAKARA | 9057 | |
| ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE healthcare | RPN2232 | WB |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | Cell culture |
| Endo-Porter | GeneTools | 2922498000 | ASO transfection |
| Extra Thick Blot Filter Paper | Bio-Rad | 1703965 | WB |
| EzFastBlot HMW | Atto | AE-1460 | WB |
| fibroblast growth factor-basic | Sigma-Aldrich | F0291 | Cell culture |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | Cell culture |
| GP2-293 packaging cells | Clontech | 631458 | Retroviral production |
| Ham's F-12 Nutrient Mix | Thermo Fisher Scientific | 11765-054 | Cell culture |
| High glucose DMEM with GlutaMAX-I | Thermo Fisher Scientific | 10569-010 | Cell culture |
| High glucose DMEM without sodium pyruvate | GE Healthcare | SH30022.01 | Cell culture |
| HiSpeed Plasmid Purification Kit | QIAGEN | 12643 | Retroviral production |
| Histofine Simple Stain MAX PO | NICHIREI BIOSCIENCE INC. | 424151 | WB |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | ICC |
| Human PDGF-AB | Peprotech | 100-00AB-10UG | Cell culture |
| iBind Flex Solution | Thermo Fisher Scientific | SLF2020 | WB |
| iBind Flex Western Device | Thermo Fisher Scientific | SLF2000 | WB (Automated mestern-processing device) |
| Immobilon-P Transfer Membrane (PVDF) | MERCK | IPVH304F0 | WB |
| In-Fusion HD cloning Kit | Clontech | 639648 | Retroviral production |
| ITS Liquid Media Supplement | Sigma-Aldrich | I3146 | Cell culture |
| MILTEX HV 0.45 μm filter | MERCK | SLHV033RS | Retroviral production |
| MultiNA | SHIMADZU | MCE-202 | Microchip electrophoresis |
| MYOD1 (GFP-tagged) | ORIGENE | RG209108 | Retroviral production |
| NanoDrop | Thermo Fisher | ND-ONE-W | Spectrophotometer |
| Nonessential amino acids | Thermo Fisher | 11140-050 | Cell culture |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Clontech | 740986.20 | PCR clean up |
| NuPAGE 3-8% Tris-Acetate Protein Gels | Invitrogen | EA03785BOX | WB |
| NuPAGE Antioxidant | Invitrogen | NP0005 | WB |
| NuPAGE LDS Sample Buffer | Invitrogen | NP0007 | WB |
| NuPAGE Sample Reducing Agent | Invitrogen | NP0009 | WB |
| NuPAGE Tris-Acetate SDS Running Buffer | Invitrogen | LA0041 | WB |
| One Step TB Green PrimeScript RT-PCR Kit | TAKARA | RR066A | Titer check of retroviral vector |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-250 | Cell culture |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | WB |
| Polybrene Infection / Transfection Reagent | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Retroviral infection |
| pRetroX-TetOne-Puro Vector | Clontech | 634307 | Retroviral vecor |
| Puromycin | Clontech | 631305 | Cell culture |
| QIAGEN OneStep RT-PCR Kit | Qiagen | 210212 | PCR |
| REGM Bullet Kit | Lonza | CC-3190 | Material for growth medium of UDCs |
| REGM SingleQuots | Lonza | CC-4127 | Material for primary medium of UDCs |
| Retrovirus Titer Set | TAKARA | 6166 | Titer check of retroviral vector |
| Retro-X Concentrator | Clontech | 631455 | Retroviral production |
| RIPA buffer | Thermo Fisher Scientific | 89901 | WB |
| RNeasy kit | Qiagen | 74104 | RNA extraction for PCR |
| Tetracycline-free foetal bovine serum | Clontech | 631106 | Cell culture |
| Triton-X | MP Biomedicals | 9002-93-1 | ICC |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | WB |
| Xfect transfection reagent | Clontech | 631317 | Transfection of plasmids into packaging cells |
References
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Cirak, S., et al. Exon skipping and dystrophin restoration in patients with Duchenne muscular dystrophy after systemic phosphorodiamidate morpholino oligomer treatment: an open-label, phase 2, dose-escalation study. Lancet. 378, 595-605 (2011).
- Komaki, H., et al. Systemic administration of the antisense oligonucleotide NS-065/NCNP-01 for skipping of exon 53 in patients with Duchenne muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 10 (437), (2018).
- Antoury, L., et al. Analysis of extracellular mRNA in human urine reveals splice variant biomarkers of muscular dystrophies. Nature Communications. 9, 3906 (2018).
- Rahmoune, H., et al. Glucose transporters in human renal proximal tubular cells isolated from the urine of patients with non-insulin-dependent diabetes. Diabetes. 54, 3427-3434 (2005).
- Zhang, Y., et al. Urine derived cells are a potential source for urological tissue reconstruction. The Journal of Urology. 180, 2226-2233 (2008).
- Takizawa, H., et al. Modelling Duchenne muscular dystrophy in MYOD1-converted urine-derived cells treated with 3-deazaneplanocin A hydrochloride. Scientific Reports. 9, 3807 (2019).
- Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7, 2080-2089 (2012).
- Chen, W., et al. Skeletal myogenic differentiation of human urine-derived cells as a potential source for skeletal muscle regeneration. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 11, 334-341 (2017).
- Kim, E. Y., Page, P., Dellefave-Castillo, L. M., McNally, E. M., Wyatt, E. J. Direct reprogramming of urine-derived cells with inducible MyoD for modeling human muscle disease. Skeletal Muscle. 6, 32 (2016).
