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Bioengineering

Fabricação da Interface Nervosa Periférica Regenerativa Composta (C-RPNI) no Rato Adulto

Published: February 25, 2020 doi: 10.3791/60841
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

O manuscrito a seguir descreve um novo método para desenvolver um sistema de feedback neural de loop fechado biológico chamado interface nervosa periférica regenerativa composta (C-RPNI). Esta construção tem a capacidade de se integrar com nervos periféricos para amplificar sinais motores efélios, ao mesmo tempo em que fornece feedback sensorial afável.

Abstract

Os recentes avanços nas neuropróteses permitiram que aqueles que vivem com perda de extremidade reproduzissem para reproduzir muitas funções nativas da extremidade ausente, e isso é frequentemente realizado através da integração com o sistema nervoso periférico. Infelizmente, os métodos atualmente empregados estão frequentemente associados a danos significativos no tecido que previne o uso prolongado. Além disso, esses dispositivos muitas vezes não possuem qualquer grau significativo de feedback sensorial, pois sua construção complexa amortece quaisquer vibrações ou outras sensações que um usuário pode ter previamente dependido ao usar próteses mais simples. A interface nervosa periférica regenerativa composta (C-RPNI) foi desenvolvida como uma construção estável e biológica com a capacidade de amplificar sinais nervosos motores efíferos, proporcionando feedback sensorial afsidiário. O C-RPNI consiste em um segmento de enxerto dérmico e muscular livre protegido em torno de um nervo sensorial misto, com reinnervação preferencial do nervo motor do enxerto muscular e reineza nervosa sensorial do enxerto dérmico. Em ratos, esta construção demonstrou a geração de potenciais de ação muscular composto (CMAPs), amplificando o sinal do nervo alvo do nível de micro-milivolts, com índices de sinal para ruído em média aproximadamente 30-50. A estimulação do componente dérmico da construção gera potenciais compostos de ação nervosa sensorial (CSNAPs) no nervo proximal. Como tal, essa construção tem utilidade futura promissora para a realização da prótese ideal e intuitiva.

Introduction

As amputações de extremidade afetam quase 1 em cada 190 americanos1, e sua prevalência deve aumentar de 1,6 milhão hoje para mais de 3,6 milhões até 20502. Apesar do uso documentado há mais de um milênio, a prótese ideal ainda não foi realizada3. Atualmente, existem próteses complexas capazes de múltiplas manipulações articulares com potencial para reproduzir muitas funções motoras da extremidade nativa4,5. No entanto, esses dispositivos não são considerados intuitivos, pois o movimento protético desejado é tipicamente funcionalmente separado do sinal de controle de entrada. Os usuários normalmente consideram essas "próteses avançadas" difíceis de aprender e, portanto, não são adequadas para uso diário1,6. Além disso, próteses complexas atualmente no mercado não fornecem nenhum grau apreciável de feedback sensorial sutil para controle adequado. A sensação de toque e propriocepção são vitais para a realização de tarefas diárias, e sem essas, atos simples como pegar uma xícara de café se tornam pesados, pois depende inteiramente de pistas visuais7,8,9. Por essas razões, próteses avançadas estão associadas a um grau significativo de fadiga mental e muitas vezes são descritas como pesadas e insatisfatórias5,10,11. Para resolver isso, alguns laboratórios de pesquisa desenvolveram próteses capazes de fornecer um grau limitado de feedback sensorial via interação neural direta12,13,14,15, mas o feedback é muitas vezes limitado a pequenas áreas espalhadas nas mãos e dedos12,13, e as sensações foram notadas como dolorosas e não naturais às vezes15. Muitos desses estudos infelizmente não têm qualquer acompanhamento apreciável a longo prazo e histologia nervosa para delinear os efeitos do tecido local, ao mesmo tempo em que notam a falha na interface na escala de semanas a meses16.

Para essa população, o dispositivo protético ideal forneceria um controle motor de alta fidelidade, juntamente com um feedback somatosensorial significativo do ambiente do indivíduo ao longo de sua vida. Crítico para o design da referida prótese ideal é o desenvolvimento de uma interface estável e confiável que permitiria a transmissão simultânea de informações somatossensoriais afívelmente com sinais motores efferent. As mais promissoras interfaces humanos-máquinas atuais são aquelas que interagem diretamente com o sistema nervoso periférico, e os desenvolvimentos recentes no campo das próteses neurointegradas têm trabalhado para fazer a ponte entre sinais bioelétricos e mecânicos17. As interfaces atuais utilizadas incluem: placas nervosas flexíveis14,15,18, eletrodos de punho extra-neural13,19,20,21,22,23, eletrodos penetrantes de tecido24,25,31,32, e eletrodos intrafasciculares26,27 ,28. No entanto, cada um desses métodos tem demonstrado limitações em relação à especificidade nervosa, lesão tecidual, degeneração axonal, esgotamento da mielina e/ou formação de tecido cicatricial associado à resposta crônica do corpo estranho16,17,18,19. Mais recentemente, foi postulada que um motorista por trás de eventual falha de eletrodo implantado é a diferença significativa no moduli de Young entre material eletrônico e tecido neural nativo. O tecido cerebral está sujeito a micromo significativo diariamente, e tem sido teorizado que o estresse da tesoura induzido por diferenças no moduli de Young causa inflamação e eventual cicatriz permanente30,31,32. Esse efeito é frequentemente agravado nas extremidades, onde os nervos periféricos estão sujeitos tanto ao micromovimento fisiológico quanto ao macromovimento da extremidade intencional. Devido a esse movimento constante, é razoável concluir que a utilização de uma interface nervosa periférica completamente abiótica não é ideal, e uma interface com um componente biológico seria mais adequada.

Para atender a essa necessidade de um componente biológico, nosso laboratório desenvolveu uma interface nervosa biótica denominada Interface Nervosa Periférica Regenerativa (RPNI) para integrar nervos periféricos transseccionados em um membro residual com um dispositivo protético. A fabricação de RPNI envolve implantar cirurgicamente um nervo periférico em um enxerto muscular livre autólogo, que posteriormente revasculariza e reinfeta. Nosso laboratório desenvolveu essa interface nervosa biológica na última década, com sucesso em amplificar e transmitir sinais motores quando combinado com eletrodos implantados em ensaios em animais e humanos, permitindo um controle protético adequado com múltiplos graus de liberdade2,34. Além disso, demonstramos separadamente feedback sensorial através do uso de nervos periféricos embutidos em enxertos dérmicos, denominados Dermal Sensory Interface (DSI)3,35. Em amputações mais distais, usar essas construções simultaneamente é viável, pois os fáscicos motores e sensoriais dentro do nervo periférico alvo podem ser separados cirurgicamente. No entanto, para amputações de nível mais proximômicos, isso não é viável devido à mistura de fibras motoras e sensoriais. A Interface Nervosa Periférica Regenerativa Composta (C-RPNI) foi desenvolvida para amputações mais proximômicas, e envolve implantar um nervo sensorial misto em uma construção composta por enxerto muscular livre fixado a um segmento de enxerto dérmico(Figura 1). Os nervos periféricos demonstram reinnervação preferencial direcionada, assim as fibras sensoriais reinternarão o enxerto dérmico e as fibras motoras, o enxerto muscular. Essa construção tem, assim, a capacidade de amplificar simultaneamente os sinais motores, proporcionando feedback somatosensorial36 (Figura 2),permitindo a realização da prótese ideal, intuitiva e complexa.

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Protocol

Todos os experimentos em animais são realizados a aprovação do Comitê de Uso e Cuidado dos Animais da Universidade de Michigan.

NOTA: Os ratos doadores têm acesso gratuito a alimentos e água antes dos procedimentos de doação de pele e músculos. A eutanásia é realizada anestesia profunda seguida de injeção de cloreto de potássio intra-cardíaco com um método secundário de pneumotórax bilateral. Qualquer variedade de rato pode teoricamente ser utilizada com este experimento; no entanto, nosso laboratório alcançou resultados consistentes em ratos Fischer F344 masculino e feminino (~200-250 g) aos dois a quatro meses de idade. Os ratos doadores devem ser isogênicos para os ratos experimentais.

1. Preparação do enxerto dérmico

  1. Anestesia roube rato doador em uma câmara de indução utilizando uma solução de 5% isoflurane em oxigênio a 0,8-1 L/min. Uma vez anestesiado o rato, retire da câmara de indução e coloque em um cone de nariz rerespirando, reduzindo o isoflurano para 2-2,5% para manutenção da anestesia.
  2. Administre uma solução de 0,02-0,03 mL Carprofen (50 mg/mL) em 0,2 mL de salina estéril subcutânea entre as omoplatas para analgesia.
  3. Aplique a pomada artificial às lágrimas em ambos os olhos para evitar úlceras córneas.
  4. Usando cortadores, raspe todo o retromembro inferior, região do tornozelo e laterais de pata.
  5. Limpe o retromembro escolhido e a superfície plantar da pata com álcool, seguida pela solução iodopovida, terminando com uma limpeza final com álcool para remover iodopovida residual.
  6. Usando uma broca de alta velocidade micro motor portátil com uma pedra de polimento de grão fino removível (4000 rpm), rebarba a superfície plantar da pata para remover a epiderme. Ao rebarba, aplique gotas de salino para não queimar a pele. A derme subjacente terá uma aparência brilhante com sangramento.
  7. Aplique um torniquete à extremidade inferior para retardar o fluxo sanguíneo.
  8. Remova a pele plantar bruscamente com um bisturi #15 e coloque em gaze salina-umedecida para evitar a dessecação. Alguns tecidos tendinosos e conjuntivos serão inerentemente removidos com a pele nesta etapa e serão removidos mais tarde.
  9. Aplique o envoltório de gaze no pé sangrando para retardar a hemorragia. Repita os passos 1.5-1.9 se fizer duas construções.
  10. um microscópio (ampliação de 20x), remova o tecido tendinoso e conjuntivo da camada profunda do enxerto de pele usando micro-tesouras. Tome cuidado para não fazer buracos no enxerto. O enxerto dérmico diluído deve ser ligeiramente opaco contendo apenas derme, medindo aproximadamente 0,5 cm x 1,0cm de tamanho.
  11. Coloque em gaze salina-umedecida até estar pronto para a fabricação de construção C-RPNI. Os enxertos devem ser utilizados dentro de 2 horas após a colheita.

2. Preparação do enxerto muscular

  1. Faça uma incisão longitudinal ao longo do aspecto anterior do retromembro inferior de logo acima do tornozelo para logo abaixo do joelho com um bisturi #15. Dissecaatravés através de tecido subcutâneo para expor a musculatura subjacente.
  2. No aspecto distal da incisão, exponha as inserções tendinosas da musculatura dos membros inferiores. Tibialis anterior (TA) é tipicamente o maior e mais anterior dos músculos, e apenas por baixo e posterior a este músculo está o extensor digitorum longus (EDL). Isolar o tendão distal EDL dos outros tendões da área, tomando cuidado para não incisão de sua inserção neste momento.
  3. Certifique-se de isolamento do tendão correto inserindo ambas as estanas de um fórceps o tendão e exercendo pressão ascendente abrindo os fórceps para causar excursão tendinosa. A manipulação desse tendão deve fazer com que todos os dedos se estendam simultaneamente.
  4. Realize uma tenotomia distal com uma tesoura de íris afiada e separe o músculo dos tecidos circundantes sem rodeios com tenotomias (ou outra tesoura de ponta cega) trabalhando proximamente para encontrar a origem tendinosa.
  5. Uma vez que o tendão proximal é visualizado, novamente realize uma tenotomia utilizando tesouras de íris afiadas. Coloque o enxerto muscular em uma gaze salina-umedecida para evitar a dessecação.
  6. Uma vez que todos os enxertos desejados tenham sido removidos de um rato doador, eutanize principalmente por injeção intra-cardíaca de KCl (1-2 mEq K+/kg) seguida de eutanásia secundária com pneumotórax de punção bilateral com uma lâmina #15.

3. Isolamento e preparação do nervo peroneal comum

  1. Anestesiar e fornecer analgesia ao rato experimental de acordo com o protocolo descrito nas etapas 1.1-1.3.
  2. Raspe a coxa desejada e limpe com álcool, betadine, terminando com álcool para remover vestígios de betadina.
  3. Mova o animal da mesa de preparação cirúrgica para a mesa de microscópio cirúrgico e coloque na plataforma de aquecimento com sonda de temperatura para manutenção da temperatura corporal. Mantenha o isoflurano em 2-2,5% e o oxigênio em 0,8-1 L/min.
  4. Marque a incisão, estendendo-se de apenas distal a entalhe ciático à porção inferior do joelho. Esta marcação deve ser inferior a, e angulou longe do fêmur. Faça a incisão com uma lâmina #15 incisiva através do bíceps femoris fascia subjacente.
  5. Dissecem cuidadosamente através do músculo femoris de femore bíceps com uma micro-tesoura de hemostat ou ponta sem cortes para o espaço subjacente bíceps femoris.
    NOTA: O nervo ciático viaja aproximadamente na mesma direção que a incisão inicial que foi feita. Existem três ramos, tipicamente com nervo sural posterior e nervo peroneal comum e tíbia viajando superficial e profundo para o joelho, respectivamente.
  6. Após a identificação do nervo peroneal comum (CP), usando um par de ceps micro, finos e micro-tesouras, isolar cuidadosamente o nervo CP dos outros ramos ciáticos e remover qualquer tecido conjuntivo persistente distally.
  7. No ponto onde o nervo cruza a superfície do joelho, tranque fortemente o nervo com um par de micro-tesouras.
    NOTA: O uso de tesouras afiadas é extremamente importante nesta etapa, pois causar traumas significativos no nervo poderia aumentar o risco de formação de neuroma.
  8. Liberte cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo restante do nervo CP e trabalhe proximamente para libertar o nervo a um comprimento de aproximadamente 2 cm.

4. Fabricação de construção C-RPNI

  1. Remova o enxerto muscular da gaze salina e remova todo o tecido tendinoso central, bem como um pequeno segmento central de epísio. Deixe as extremidades tendinosas intactas.
  2. Usando um 8-0 Sutura de nylon, proteja o epineúrio da extremidade transseccionada do nervo CP à área do enxerto muscular desprovido de epísium com dois pontos interrompidos em ambos os lados do nervo.
  3. Segure o enxerto muscular no periosteum fêmur com um único ponto de nylon 6-0 interrompido tanto proximal quanto distally com a junção músculo-nervoso voltada para longe do fêmur.
    NOTA: Proteja o músculo para que ele esteja em comprimento relaxado normal. Tente não esticar o músculo significativamente ou deixar muita frouxidão ao garantir.
  4. Coloque um 8-0 Ponto de nylon na margem inferior e central do epísium do enxerto muscular, garantindo-o ao epineúrio nervoso CP de forma a criar frouxidão no nervo dentro do enxerto muscular e ajudar a aliviar qualquer tensão futura a que possa ser exposto com ambulation posterior.
  5. Remova o enxerto de pele da gaze salina e organize-o no enxerto muscular de tal forma a cobrir completamente o nervo e a maioria do músculo. Certifique-se de que a margem profunda da derme está apoiada no músculo. Apare qualquer derme que se estenda além da borda do músculo.
  6. Segure o enxerto de pele ao enxerto muscular circunferentemente usando 8-0 suturas interrompidas de nylon. Normalmente, 4-8 suturas totais são usadas dependendo do tamanho da construção.
  7. Feche o bíceps femoris fascia sobre a construção de forma corrida com sutura cromômica 5-0.
  8. Feche a pele sobreposta com sutura cromômica 4-0 em forma de corrida.
  9. Cotonete a área cirúrgica com uma almofada de álcool e aplique pomada antibiótica.
  10. Cessar anestésico inalational e permitir que os ratos se recuperem com fontes de alimentos e água separadas dos companheiros de gaiola.

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Representative Results

A fabricação de construção é considerada mal sucedida se os ratos desenvolverem uma infecção ou não sobreviverem à anestesia cirúrgica. Pesquisas anteriores indicaram que essas construções requerem aproximadamente três meses para revascularizar e reinnervate2,3,17,36. Após o período de recuperação de três meses, testes de construção podem ser realizados para examinar a viabilidade. A exposição cirúrgica das construções após três meses revelará músculo e pele revascularizados se for bem sucedido (Figura 3). Às vezes, os enxertos musculares livres e dérmicos podem consistir apenas de tecido cicatricial, e/ou o nervo não será ligado à construção; esses achados indicam uma tentativa mal sucedida. No entanto, se bem sucedido, o aperto suave do nervo peroneal comum com fórceps proximal à construção resultará em contração muscular visível(Vídeo 1). A análise histológica das construções deve demonstrar pele, nervo e músculo viáveis(Figura 4). A imunocoloração também revelará reinserção do nervo motor e sensorial às suas junções neuromusculares e órgãos finais sensoriais, respectivamente(Figura 5). Se o nervo peroneal comum não reinforme esses tecidos, a imunocoloração não demonstrará nenhuma fibra nervosa individual dentro da construção, com exceção do próprio nervo implantado.

Testes eletrofisiônicos podem ser realizados nessas construções in vivo (Figura 6); pesquisas anteriores foram realizadas aos 3 e 9 meses após a fabricação c-RPNI36 (Tabela 1). Após estimulação máxima com um eletrodo de gancho no nervo peroneal comum proximal apenas distal à sua decolagem do nervo ciático, potenciais de ação muscular composto (CMAPs) podem ser medidos no componente muscular com contração muscular visível. O tipo de eletrodo usado no músculo pode variar de acordo com a preferência, mas patch epimisial, almofada epimística e eletrodos de sonda bipolar têm sido usados com sucesso nesta pesquisa. A amplitude média do CMAP registrada no músculo foi de 8,7 ± 1,6 mV aos 3 meses e 10,2 ± 2,1 mV aos 9 meses. A velocidade média de condução foi de 10 ± 1,2 m/s em 3 meses e 9,5 ± 0,6 m/s aos 9 meses. Em comparação, os CMAPs gerados pelo músculo EDL fisiológico normalmente variam de 10-18 mV37. Após a estimulação no componente dérmico do C-RPNI, os potenciais de ação nervosa sensorial composto (CSNAPs) foram produzidos no nervo peroneal comum proximal, com amplitude média de CSNAP medindo 113,7 ± 35,1 μV em 3 meses e 142,9 ± 63,7 μV aos 9 meses. A Figura 7 ilustra sinais CMAP e CSNAP de soma única e somados obtidos durante testes eletrofisiônicos em um formato gráfico.

O C-RPNI serve para amplificar o sinal microvolt inerente a um nervo, e pesquisas anteriores demonstraram amplificação suficiente do microvolt ao nível38de milivolt . Portanto, se uma construção não proporciona esse nível de amplificação, não é considerado bem sucedido. Se o dérmico, músculo ou ambos os componentes do C-RPNI falharem, os testes resultariam em gravações que imitam o sinal de estimulação utilizado. Especificamente para o componente muscular, um resultado subótimo (mas que ainda é considerado operacional) seria aquele que tem amplitude CMAP e velocidade de condução na faixa que fica entre o valor da estimulação de sinal e o músculo EDL fisiológico. Além disso, esses sinais podem ficar atenuados e não possuem a forma de onda CMAP característica (Figura 8A). Resultados subideais ao nível do componente dérmico podem ocorrer, mas são difíceis de quantificar, dado que os ratos não podem expressar a qualidade da sensação que experimentam. Esses resultados subideais geralmente envolvem amortecimento da forma de onda com ruído de fundo significativo (Figura 8B). No entanto, se houver cicatrizes significativas ou callusing do enxerto de pele, ou enxerto mínimo sobreviveu, nenhum CSNAPs será apreciado no nervo peroneal comum proximal, independentemente do valor da estimulação.

Figure 1
Figura 1: Esquema ilustrativo da construção C-RPNI. O nervo peroneal comum pode ser visto preso entre a camada dérmica superior e a camada muscular inferior. Esta construção é protegida ao periosteum fêmur proxima e distalmente através das junções tendinosas do EDL. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Uma representação pictórica do C-RPNI em um paciente com amputação trans-radial. O usuário forma uma intenção motora desejada no nível cerebral (por exemplo, a compreensão do pincer), que é transmitida como um sinal motor eférquio para o C-RPNI através do nervo periférico implantado. Este sinal gera um potencial de ação muscular composto (CMAP) no componente muscular, que é registrado por eletrodos implantados e reconhecido pelo dispositivo protético, gerando o movimento desejado. Sensores nas pontas dos dedos do dispositivo reconhecem a quantidade de pressão gerada e retransmitem essa informação para um eletrodo implantado no componente dérmico do C-RPNI. Esses sinais ativam os órgãos finais sensoriais correspondentes, gerando um afável composto sensoriador de ação nervosa (CSNAP) transmitido através do nervo periférico para o córtex sensorial. Um sinal de exemplo gerado em cada componente é retratado dentro das caixas azuis retratadas ao lado de cada componente. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: C-RPNI in vivo. (A)Um C-RPNI imediatamente após a fabricação e em(B)3 meses após a construção no momento dos testes eletrofisiônicos. O componente muscular é a camada profunda da construção e o dérmico, o superficial. O tecido muscular é marcado por (M), derme (D) e nervo peroneal comum (N). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Histologia C-RPNI 6 meses. C-RPNI H&E aos 6 meses em (A) seção transversal e (B) seção longitudinal. Músculo observado por (M), derme (D) e nervo (N). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 5
Figura 5: Imunocoloração do C-RPNI. (A)Exemplo representativo de uma seção transversal de tecido muscular, com setas vermelhas identificando junções neuromusculares. Uma maior ampliação da junção neuromuscular central (NMJ) é retratada na parte inferior direita. (B)Close-up de uma junção neuromuscular observada na amostra. Pois (A) e(B),a coloração vermelha (alfa-bungarotoxina) indica presença de receptores colinérgicos no tecido muscular; azul (neurofilamento 200) especifica presença de neurofilamentos dentro do tecido neuronal; e notas verdes (acetiltransferase de colina) especificamente presença do neurônio motor. (C) Exemplo representativo de uma imagem iDISCO com foco na junção dérmica, com setas vermelhas marcando neurônios sensoriais (branco) entrando na derme. (D) Visão geral do iDISCO demonstrando múltiplos neurônios sensoriais (branco, neurofilament 200). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 6
Figura 6: Testes eletrofisiáticos. A imagem superior é uma ilustração do arranjo de eletrodos padrão para testar as construções C-RPNI. Há um eletrodo de remendo e/ou sonda colocado nos componentes musculares e dérmicos do C-RPNI, com um eletrodo de gancho duplo colocado no nervo peroneal comum proximal. A imagem inferior é um exemplo in vivo do arranjo de teste em um sujeito de rato. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 7
Figura 7: Sinalização eletrofisiologtípica C-RPNI. (A)Um único sinal CMAP registrado no componente muscular após um sinal de 5,00 mA aplicado ao nervo CP. (B) 24 CMAPs gerados por 5,00 mA estimulação no nervo. (C) Um único sinal CSNAP registrado a partir do nervo PROximal CP após estimulação de componente dérmico a 900 μA.(D) Uma série de CSNAPs registrados a partir do nervo PROximal CP após estimulação crescente no componente dérmico de 500 μA a 1000 μA. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 8
Figura 8: Sinalização C-RPNI anormal. (A) Uma série de CMAPs obtidos ao aumentar a estimulação do nervo CP de 0,2 a 4 mA. As formas de onda atingem o pico em diferentes pontos e não retornam à linha de base, possivelmente indicando eletrodos defeituosos ou função de construção global inadequada. (B) Somação de CSNAPs obtidos ao estimular componente escármico, rampando de 0,1 a 5 mA. Esses achados podem ocorrer por uma infinidade de razões, incluindo eletrodos defeituosos, cicatrizes de enxerto dérmico e/ou danos nos nervos. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Dados de 3 meses Dados do CMAP (Estimular o nervo CP e o registro do enxerto muscular) Dados de CSNAP (Estimular enxerto de pele e registro do nervo CP)
Número de id de rato Peso de construção (g) Amplitude de estimulação (mA) Velocidade de condução (m/s) V Peak-to-Peak (mV) Amplitude de estimulação (mA) Velocidade de condução (m/s) V Peak-to-Peak (μV)
4607 0.087 4.17 11.3 10.3 18 11.1 121
4608 0.15 1.65 11.1 17.1 7.7 6.5 136
4611 0.113 8.3 9.6 11.2 10 10 121
4613 0.116 3.18 10 9.6 1.44 8.3 134
4614 0.189 3 10.8 9.6 7.39 9 151
4616 0.122 5.2 9.4 14.9 1.8 9.1 100
4620 0.118 2.91 7.6 7.4 8.7 10 219
Dados de 9 meses Dados do CMAP (Estimular o nervo CP e o registro do enxerto muscular) Dados de CSNAP (Estimular enxerto de pele e registro do nervo CP)
Número de id de rato Peso de construção (g) Amplitude de estimulação (mA) Velocidade de condução (m/s) V Peak-to-Peak (mV) Amplitude de estimulação (mA) Velocidade de condução (m/s) V Peak-to-Peak (μV)
4687 0.238 1.35 9.6 18.2 0.99 11 181
4688 0.131 1.08 10 8.8 1.11 8 132
4689 0.26 1.26 9.6 21.8 1.9 8.6 237
4690 0.192 4.2 8.3 12.8 n/a n/a n/a
4691 0.213 1.38 10 18.6 6.6 8 153
4693 0.178 1.11 9.6 15.1 8.7 8.3 306

Tabela 1: Testes eletrofisiônicos de C-RPNIs em 3 e 9 meses após a construção. Para obter CMAPs, um eletrodo de gravação foi colocado no músculo com um eletrodo estimulante no nervo peroneal comum proximal. Uma série de estímulos aumentando a amplitude foi aplicada ao nervo até que os valores máximos do CMAP foram obtidos e os resultados registrados. Uma metodologia semelhante foi aplicada ao componente dérmico, mas com o eletrodo de gravação colocado no nervo e eletrodo estimulante no derme. Para a avaliação sensorial do rato 4690 aos 9 meses, o enxerto dérmico foi encontrado muito marcado para permitir testes.

Video 1
Vídeo 1: Contração muscular dentro de um C-RPNI. Um par de fórceps pode ser visto à esquerda do vídeo apertando suavemente o nervo peroneal comum proximal. Isso resulta na contração do componente muscular de um C-RPNI de 3 meses de idade que é visível para o espectador. Clique aqui para ver este vídeo (Clique para baixar).

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Discussion

O C-RPNI é uma nova construção que fornece amplificação simultânea dos sinais aférficos motores de um nervo alvo com o fornecimento de feedback sensorial afável. Em particular, o C-RPNI tem utilidade única para aqueles que vivem com amputações proximal, pois seus fascicles motores e sensoriais não podem ser facilmente separados mecanicamente durante a cirurgia. Em vez disso, o C-RPNI utiliza as propriedades inerentes de reineza preferencial do próprio nervo para incentivar a reinneração de fibras sensoriais a órgãos finais sensoriais dérmicos e fibras motoras para junções neuromusculares.

Como a fabricação C-RPNI depende das habilidades de reinneração do nervo alvo, o manuseio cuidadoso do nervo é primordial durante o procedimento. Durante a dissecção, evite manipulação direta e trauma para o nervo alvo. Se o nervo deve ser manuseado, recomenda-se manipular epineurium ou tecido conjuntivo circundante. Embora nosso laboratório não tenha encontrado formação de neuroma dentro desta construção, teoricamente, traumas nervosos significativos poderiam aumentar o risco. Um passo chave adicional no processo é a colheita dos enxertos dérmicos. Todo tecido epidérmico deve ser removido do enxerto de pata traseira, pois a epiderme retida pode aumentar o risco de infecção e inclusão de cistos durante o processo de cura. Além disso, o enxerto dérmico deve ser adequadamente diluído para promover a imbibição e a revascularização em todo o enxerto e evitar isquemia e necrose significativas.

Embora a maioria dos estudos realizados com o C-RPNI tenha sido realizado no nervo peroneal comum, qualquer nervo sensorial misto poderia ser substituído. Um nervo motor puro ou sensoriado puro poderia ser utilizado, mas os resultados são difíceis de prever e provavelmente resultariam em reinnerzação muscular ou dérmica, respectivamente. No que diz respeito ao enxerto muscular, desde que o epísium seja removido da porção que entre em contato com o nervo, qualquer enxerto muscular semelhante em tamanho poderia ser utilizado desde que contivesse tecido tendinoso ou fascial em ambos os lados adequado para ancorar para periosteum próximo. Para o enxerto dérmico, o tecido glabrous é especificamente usado devido ao potencial de crescimento capilar após o enxerto. A pele não glabroso foi previamente tentada, mas devido à dificuldade de remover folículos capilares individuais, todas as construções resultantes apresentaram crescimento capilar significativo, inflamação e cicatrizes após o período de maturação de três meses. Além disso, outras espécies de ratos podem ser empregadas, mas os ratos de Lewis e Fischer são recomendados para este experimento, já que muitas outras espécies de ratos se auto-mutilarão secundária sem estria39,40.

Dado o atraso entre procedimento e resultados, é difícil saber com antecedência se alguma alteração deve ser feita ao método. A infecção é um risco teórico raramente encontrado pelo nosso laboratório, mas se a infecção ocorre, é tipicamente responsiva aos antibióticos. Ocasionalmente, os ratos mastigam suas incisões causando dehiscência, e isso pode ser tratado com lavagem, desbridação e re-fechamento. Se, após três meses de exposição, a construção é considerada não funcional e/ou cicatrizada, há várias causas potenciais. Às vezes, se o nervo não estiver fixado corretamente à construção com pelo menos três suturas, o nervo pode arrancar da construção com ambulação. Além disso, os enxertos musculares e/ou dérmicos podem necrose, causando falha. Normalmente, isso é resultado de uma infecção repetida, o enxerto dérmico sendo muito grosso, ou o músculo muito danificado na colheita para se recuperar adequadamente. Além disso, se o músculo não estiver protegido ao periosteum em comprimento de repouso, a contração pode ser prejudicada causando sinais inadequados durante os testes. Às vezes, a construção parecerá viável, mas não produzirá CMAPs/CSNAPs adequados em testes (5-10% das construções, em média). Isso pode ser secundário à falha no equipamento, impulso elevado de eletrodos ou uso significativo de chamadas de pele. O uso de chamadas da pele pode amortecer e bloquear completamente a transdução do sinal se a derme não for diluída adequadamente durante a fabricação. Se algum dos eventos descritos anteriores for visto com frequência durante o processo de teste, deve-se retornar ao protocolo e fazer alterações apropriadas. Na experiência do nosso laboratório com mais de 90 construções c-RPNI bem sucedidas, nossa taxa de falha é <5% e tipicamente atribuída a erro cirúrgico durante a fabricação.

Métodos comumente empregados para amplificar ou registrar sinais nervosos incluem placas nervosas flexíveis18, eletrodos de punho extra-neural19,20,21,22,23, eletrodos penetrantes de tecido24,25,31,32, e eletrodos intrafasciculares26,27,28, todos associados com lesão tecidual, degeneração axonal e/ou formação de tecido cicatricial. Esta cicatriz é frequentemente atribuída à resposta crônica do corpo estranho29 e ao estresse de cisalhamento induzido por diferenças no moduli30de Young . O C-RPNI, no entanto, é uma construção biológica e, portanto, não induz a resposta corporal estrangeira no tecido neural. Além disso, suas propriedades mecânicas são vários fatores mais próximos do tecido neural do que os eletrodos. A análise histológica dessas amostras não demonstrou nenhum grau significativo de formação de tecido cicatricial no nervo com uso crônico, permitindo assim que o C-RPNI interface com o nervo por longos períodos em comparação com os métodos listados acima. Embora este método seja altamente eficaz na amplificação de sinais motores efferent, ele é limitado em relação à produção sensorial de sinais afíferos. Medimos e caracterizamos transdução de sinal produzida com estimulação mecânica e elétrica do componente dérmico do C-RPNI36; no entanto, esses sujeitos de ratos não podem qualificar o tipo ou grau de sensações provocadas a partir da estimulação desta construção. Como tal, neste momento é impossível saber que tipo de efeito o C-RPNI está produzindo no que diz respeito à sensação. As direções futuras para esta construção incluirão caracterização de sinais produzidos no nervo proximal seguindo estímulos específicos fornecidos (por exemplo, calor, dor, pressão, etc.) bem como correlação com potenciais somatosensoriais e evocados gerados no córtex sensorial do cérebro roedor. É o objetivo do nosso laboratório estabelecer uma base abrangente para C-RPNIs que abrirá caminho para a tradução clínica para os seres humanos.

O antecessor do C-RPNI, o RPNI (interface nervo periférico regenerativo), consiste em um enxerto muscular livre ligado a um nervo transsecado, com fibras motoras reinsercionando junções neuromusculares anteriormente denervated. O RPNI demonstrou utilidade em indivíduos humanos, com vários pacientes controlando próteses avançadas a partir de sinais amplificados por-e registrados a partir desses RPNIs34. Além disso, esses RPNIs têm demonstrado efeitos benéficos no tratamento além do controle protético, com vários estudos retrospectivos e prospectivos preliminares mostrando diminuição da formação de neuroma, dor crônica e dor de membros fantasmas naqueles pacientes com amputações de extremidade. Apesar desses sucessos, uma reclamação comum para quem utiliza essas próteses avançadas, no entanto, é a necessidade de visualizar a prótese durante o uso, pois essas próteses carecem de propriocepção e fornecem feedback sensorial mínimo. O C-RPNI poderia ser uma solução para essa crítica comum, fornecendo uma maneira de fornecer feedback sensorial através do componente dérmico, levando à realização da tão desejada e ideal prótese.

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Disclosures

Os autores não têm divulgações.

Acknowledgments

Os autores desejam agradecer jana Moon por assistência técnica especializada. Os estudos apresentados neste artigo foram financiados por meio de uma subvenção R21 (R21NS104584) à SK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scalpel Aspen Surgical, Inc Ref 371115 Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15)
4-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 1654G P-3 Reverse Cutting Needle
5-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 687G P-3 Reverse Cutting Needle
6-0 Ethilon Suture Ethicon SKU# 697G P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture)
8-0 Monofilament Suture AROSurgical T06A08N14-13 Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle
Experimental Rats Envigo F344-NH-sd Rats are Fischer F344 Strain
Fluriso (Isofluorane) VetOne 13985-528-40 Inhalational Anesthetic
Micro Motor High Speed Drill with Stone Master Mechanic Model 151369 Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones
Oxygen Cryogenic Gases UN1072 Standard medical grade oxygen canisters
Potassium Chloride APP Pharmaceuticals 63323-965-20 Injectable form, 2 mEq/mL
Povidone Iodine USP MediChoice 65517-0009-1 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps
Puralube Vet Opthalmic Ointment Dechra 17033-211-38 Corneal protective ointment for use during procedure
Rimadyl (Caprofen) Zoetis, Inc. NADA# 141-199 Injectable form, 50 mg/mL
Stereo Microscope Leica Model M60 User can adjust magnification to their preference
Surgical Instruments Fine Science Tools Various User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab
Triple Antibiotic Ointment MediChoice 39892-0830-2 Ointment comes in sterile, disposable packets
VaporStick 3 Surgivet V7015 Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister
Webcol Alcohol Prep Coviden Ref 6818 Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep

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References

  1. Biddiss, E. A., Chau, T. T. Upper limb prosthesis use and abandonment: A survey of the last 25 years. Prosthetics and Orthotics International. 31 (3), 236-257 (2007).
  2. Kung, T. A., et al. Regenerative peripheralnerve interface viability and signal transduction with an implanted electrode. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1380-1394 (2014).
  3. Larson, J. V., et al. Prototype Sensory Regenerative Peripheral Nerve Interface for Artificial Limb Somatosensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3 Suppl), 26-27 (2014).
  4. Hijjawi, J. B., et al. Improved myoelectric prosthesis control accomplished using multiple nerve transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (7), 1573-1578 (2006).
  5. Pylatiuk, C., Schulz, S., Döderlein, L. Results of an Internet survey of myoelectric prosthetic hand users. Prosthetics and Orthotics International. 31 (4), 362-370 (2007).
  6. Baghmanli, Z., et al. Biological and electrophysiologic effects of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) on regenerating peripheral nerve fibers. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (2), 374-385 (2013).
  7. Dhillon, G. S., Horch, K. W. Direct neural sensory feedback and control of a prosthetic arm. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 13 (4), 468-472 (2005).
  8. Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinos, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
  9. O'Doherty, J., et al. Active tactile exploration using a brain-machine-brain interface. Nature. 479, 228-231 (2011).
  10. Stein, R. B., Walley, M. Functional comparison of upper extremity amputees using myoelectric and conventional prostheses. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 64 (6), 243-248 (1983).
  11. Millstein, S. G., Heger, H., Hunter, G. A. Prosthetic Use in Adult Upper Limb Amputees: A Comparison of the Body Powered and Electrically Powered Prostheses. Prosthetics and Orthotics International. 10 (1), 27-34 (1986).
  12. Zollo, L., et al. Restoring tactile sensations via neural interfaces for real-time force-and-slippage closed-loop control of bionic hands. Science Robotics. 4 (27), eaau9924 (2019).
  13. Tan, D. W., et al. A neural interface provides long-term stable natural touch perception. Science Translational Medicine. 6 (257), 257ra138 (2014).
  14. Stieglitz, T., et al. On Biocompatibility and Stability of Transversal Intrafascicular Multichannel Electrodes-TIME. Converging Clinical and Engineering Research on Neurorehabilitation II. 15, 731-735 (2017).
  15. Petrini, F. M., et al. Six-months assessment of a hand prosthesis with intraneural tactile feedback. Annals of Neurology. 85 (1), 137-154 (2019).
  16. Jung, R., Abbas, J., Kuntaegowdanahalli, S., Thota, A. Bionic intrafascicular interfaces for recording and stimulating peripheral nerve fibers. Bioelectronics in Medicine. 1 (1), 55-69 (2018).
  17. Micera, S., Navarro, X., Yoshida, K. Interfacing With the Peripheral Nervous System to Develop Innovative Neuroprostheses. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (5), 417-419 (2009).
  18. Stieglitz, T., Schuettler, M., Schneider, A., Valderrama, E., Navarro, X. Noninvasive measurement of torque development in the rat foot: measurement setup and results from stimulation of the sciatic nerve with polyimide-based cuff electrodes. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 11 (4), 427-437 (2003).
  19. Polasek, K. H., Hoyen, H. A., Keith, M. W., Tyler, D. J. Human nerve stimulation thresholds and selectivity using a multi-contact nerve cuff electrode. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 15 (1), 76-82 (2007).
  20. Nielson, K. D., Watts, C., Clark, W. K. Peripheral nerve injury from implantation of chronic stimulating electrodes for pain control. Surgical Neurology. 5 (1), 51-53 (1976).
  21. Waters, R. L., McNeal, D. R., Faloon, W., Clifford, B. Functional electrical stimulation of the peroneal nerve for hemiplegia. Long-term clinical follow-up. Journal of Bone and Joint Surgery. 67 (5), 792-793 (1985).
  22. Larsen, J. O., Thomsen, M., Haugland, M., Sinkjaer, T. Degeneration and regeneration in rabbit peripheral nerve with long-term nerve cuff electrode implant: a stereological study of myelinated and unmyelinated axons. Acta Neuropathologica. 96 (4), 365-378 (1998).
  23. Krarup, C., Loeb, G. E., Pezeshkpour, G. H. Conduction studies in peripheral cat nerve using implanted electrodes: III. The effects of prolonged constriction on the distal nerve segment. Muscle Nerve. 12 (11), 915-928 (1989).
  24. Micera, S., Navarro, X. Bidirectional interfaces with the peripheral nervous system. International Review of Neurobiology. 86, 23-38 (2009).
  25. Urbanchek, M. G., et al. Microscale Electrode Implantation during Nerve Repair: Effects on Nerve Morphology, Electromyography, and Recovery of Muscle Contractile Function. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (4), 270e-278e (2011).
  26. Yoshida, K., Horch, K. Selective stimulation of peripheral nerve fibers using dual intrafascicular electrodes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (5), 492-494 (1993).
  27. Branner, A., Stein, R. B., Normann, R. A. Selective stimulation of cat sciatic nerve using an array of varying length microelectrodes. Journal of Neurophysiology. 85 (4), 1585-1594 (2001).
  28. Zheng, X. J., Zhang, J., Chen, T., Chen, Z. Longitudinally implanted intrascicular electrodes for stimulating and recording fascicular physioelectrical signals in the sciatic nerve of rabbits. Microsurgery. 23, 268-273 (2003).
  29. del Valle, J., Navarro, X. Interfaces with the peripheral nerve for the control of neuroprostheses. International Review of Neurobiology. 109, 63-83 (2013).
  30. Stiller, A. M., et al. A Meta-Analysis of Intracortical Device Stiffness and Its Correlation with Histological Outcomes. Micromachines. 9 (9), 443 (2018).
  31. Hanson, T., Diaz-Botia, C., Kharazia, V., Maharbiz, M., Sabes, P. The "sewing machine" for minimally invasive neural recording. bioRxiv. , Published online (2019).
  32. Yang, X., et al. Bioinspired neuron-like electronics. Nature Materials. 18, 510-517 (2019).
  33. Irwin, Z. T., et al. Chronic recording of hand prosthesis control signals via a regenerative peripheral nerve interface in a rhesus macaque. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046007 (2016).
  34. Kubiak, C. A., et al. Abstract 24: Successful Control of Virtual and Robotic Hands using Neuroprosthetic Signals from Regenerative Peripheral Nerve Interfaces in a Human Subject. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (4), 19-20 (2018).
  35. Sando, I. C., et al. Dermal-Based Peripheral Nerve Interface for Transduction of Sensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4 Suppl), 19-20 (2015).
  36. Kubiak, C. A., et al. Abstract 36: Viability and Signal Transduction with the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI). Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4), 26-27 (2019).
  37. Kubiak, C. A., et al. Abstract QS18: Neural Signal Transduction with the Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4 Suppl), 114 (2019).
  38. Woo, S. L., et al. Utilizing nonvascularized partial skeletal muscle grafts in peripheral nerve interfaces for prosthetic control. Journal of the American College of Surgeons. 219 (4), e136-e137 (2014).
  39. Sporel-Özakat, R. E., Edwards, P. M., Hepgul, K. T., Savas, A., Gispen, W. H. A simple method for reducing autotomy in rats after peripheral nerve lesions. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 263-265 (1991).
  40. Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).

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Bioengenharia Edição 156 interface nervosa periférica controle protético C-RPNI sistema de feedback neural
Fabricação da Interface Nervosa Periférica Regenerativa Composta (C-RPNI) no Rato Adulto
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Svientek, S. R., Ursu, D. C.,… More

Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (156), e60841, doi:10.3791/60841 (2020).

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