Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Fabrikation af den sammensatte regenerative perifere nervegrænseflade (C-RPNI) i voksenrotten

Published: February 25, 2020 doi: 10.3791/60841
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Følgende manuskript beskriver en ny metode til udvikling af et biologisk, lukket kredsløb neurale feedback system kaldes den sammensatte regenerative perifere nerve interface (C-RPNI). Denne konstruktion har evnen til at integrere med perifere nerver til at forstærke brusende motorsignaler og samtidig give afferent sensorisk feedback.

Abstract

Nylige fremskridt inden for neuroproteser har gjort det muligt for dem, der lever med ekstremitettab, at gengive mange funktioner, der er hjemmehørende i den fraværende ende, og dette opnås ofte gennem integration med det perifere nervesystem. Desværre, metoder i øjeblikket anvendes er ofte forbundet med betydelige vævsskader, som forhindrer langvarig brug. Derudover mangler disse enheder ofte nogen meningsfuld grad af sensorisk feedback, da deres komplekse konstruktion dæmper eventuelle vibrationer eller andre fornemmelser, som en bruger tidligere har været afhængig af, når du bruger mere enkle proteser. Den sammensatte regenerative perifere nerveinterface (C-RPNI) blev udviklet som en stabil, biologisk konstruktion med evnen til at forstærke brusende motornervesignaler, samtidig med at den giver samtidig afferent sensorisk feedback. C-RPNI består af et segment af fri dermal og muskeltransplantation sikret omkring et mål blandet sensorimotor nerve, med præferencemotor nerve reinnervation af muskeltransplantatet og sensorisk nerve reinnervation af den afhuden graft. Hos rotter har denne konstruktion vist, at der er opstået et multikolalt muskelfremtonspotentiale, hvilket forstærker målnervens signal fra mikro- til milli-volt-niveauet med et signal til støjforhold i gennemsnit ca. 30-50. Stimulering af den dermale komponent i konstruktionen genererer sammensatte sensoriske nerveactionpotentialer (CsNAPs) ved den proksimale nerve. Som sådan har denne konstruktion lovende fremtidige nytte mod realiseringen af den ideelle, intuitive protese.

Introduction

Ekstremitetsamputationer påvirker næsten 1 ud af 190 amerikanere1, og deres udbredelse forventes at stige fra 1,6 millioner i dag til over 3,6 millioner i 20502. På trods af dokumenteret brug i over et årtusinde, den ideelle protese er endnu ikke realiseret3. I øjeblikket findes der komplekse proteser i stand til flere fælles manipulationer med potentiale til at reproducere mange motoriske funktioner i den indfødte ende4,5. Disse enheder betragtes dog ikke som intuitive, da den ønskede protesebevægelse typisk er funktionelt adskilt fra indgangskontrolsignalet. Brugerne typisk overveje disse "avancerede proteser" vanskeligt at lære og derfor ikke egnet til daglig brug1,6. Derudover giver komplekse proteser, der i øjeblikket er på markedet, ikke nogen nævneværdig grad af subtil sensorisk feedback for tilstrækkelig kontrol. Følelsen af berøring og proprioception er afgørende for at udføre daglige opgaver, og uden disse, simple handlinger såsom picking up en kop kaffe bliver byrdefuld, da det er helt afhængig af visuelle signaler7,8,9. Af disse grunde er avancerede proteser forbundet med en betydelig grad af mental træthed og beskrives ofte som byrdefulde og utilfredsstillende5,10,11. For at løse dette, nogle forskningslaboratorier har udviklet proteser i stand til at give en begrænset grad af sensorisk feedback via direkte neurale interaktion12,13,14,15, men feedback er ofte begrænset til små, spredte områder på hænder og fingre12,13, og fornemmelser blev bemærket at være smertefulde og unaturlige til tider15. Mange af disse undersøgelser mangler desværre enhver mærkbar langsigtet opfølgning og nervehistologi til at afgrænse lokale vævseffekter, samtidig med at der bemærkes interface svigt på omfanget af uger til måneder16.

For denne population, ville den ideelle protese enhed give high fidelity motor kontrol sammen med meningsfuld somatosensorisk feedback fra den enkeltes miljø i hele deres levetid. Afgørende for udformningen af nævnte ideelle protese er udviklingen af en stabil, pålidelig grænseflade, der ville give mulighed for samtidig transmission af afferent somatosensoriske oplysninger med brusende motorsignaler. Den mest lovende af de nuværende menneske-maskine grænseflader er dem, der interagerer med det perifere nervesystem direkte, og den seneste udvikling inden for neuro-integrerede proteser har arbejdet hen imod at bygge bro over kløften mellem bioelektriske og mekaniske signaler17. Nuværende grænseflader udnyttet omfatter: fleksible nerveplader14,15,18, ekstra-neurale manchet elektroder13,19,20,21,22,23, væv gennemtrængende elektroder24,25,31,32, og intrafascicular elektroder26,27 ,28. Men hver af disse metoder har vist begrænsninger med hensyn til nerve specificitet, vævskade, axonal degeneration, myelin udtynding, og / eller arvæv dannelse forbundet med kronisk iboende fremmedlegeme respons16,17,18,19. For nylig, Det er blevet postuleret, at en driver bag eventuel implanteret elektrode fiasko er den betydelige forskel i Young's moduli mellem elektronisk materiale og indfødte neurale væv. Hjernevæv er genstand for betydelig mikromotion på daglig basis, og det er blevet toretiseret, at forskydningsstress forårsaget af forskelle i Young's moduli forårsager betændelse og eventuel permanent ardannelse30,31,32. Denne effekt er ofte forværret i ekstremiteterne, hvor perifere nerver er underlagt både fysiologiske mikrograder og forsætlig ekstremitet makromotion. På grund af denne konstante bevægelse, er det rimeligt at konkludere, at udnyttelsen af en helt abiotisk perifer nerve interface ikke er ideel, og en grænseflade med en biologisk komponent ville være mere egnet.

For at løse dette behov for en biologisk komponent, vores laboratorium udviklet en biotisk nerve interface kaldet Regenerative Perifernerve Interface (RPNI) til at integrere transected perifere nerver i en resterende lemmer med en protese enhed. RPNI fabrikation indebærer kirurgisk implantering af en perifer nerve i en autolog fri muskeltransplantation, som efterfølgende revaskuulariserer og reinnervates. Vores laboratorium har udviklet denne biologiske nerve interface i løbet af det seneste årti, med succes med at forstærke og sende motorsignaler, når det kombineres med implanterede elektroder i både dyre-og menneskelige forsøg, giver mulighed for passende protese kontrol med flere grader af frihed2,34. Derudover har vi separat demonstreret sensorisk feedback gennem brug af perifere nerver indlejret i dermal grafts, benævnt Dermal Sensory Interface (DSI)3,35. I mere distale amputationer, ved hjælp af disse konstruktioner samtidig er muligt som motor og sensoriske fascicles inden for målet perifere nerve kan kirurgisk adskilt. Men for mere proksimale niveau amputationer, dette er ikke muligt på grund af sammenblanding af motor iske og sensoriske fibre. Den sammensatte regenerative perifere nerveinterface (C-RPNI) blev udviklet til mere proksimale amputationer, og det indebærer implantering af en blandet sensorimotor nerve i en konstruktion bestående af gratis muskeltransplantation fastgjort til et segment af dermal graft (Figur 1). Perifere nerver demonstrere præference målrettet reinnervation, således sensoriske fibre vil re-innervate den dermal graft og motorfibre, muskeltransplantatet. Denne konstruktion har således evnen til samtidig at forstærke motorsignaler og samtidig give somatosensorisk feedback36 (Figur 2), der giver mulighed for realiseringen af den ideelle, intuitive, komplekse protese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg udføres under godkendelse fra University of Michigan's Udvalg om brug og pleje af dyr.

BEMÆRK: Donorrotter har gratis adgang til mad og vand før hud- og muskeldonation. Eutanasi udføres under dyb anæstesi efterfulgt af intra-hjerte kaliumchlorid injektion med en sekundær metode til bilateral pneumothorax. Enhver stamme af rotte kan teoretisk udnyttes med dette eksperiment; vores laboratorium har dog opnået ensartede resultater hos både mandlige og kvindelige Fischer F344 rotter (~ 200-250 g) ved to til fire måneders alderen. Donorrotter skal være isogene for forsøgsrotterne.

1. Fremstilling af det dermale transplantat

  1. Bedøve donor rotte i en induktion kammer udnytte en opløsning på 5% isofluran i ilt på 0,8-1 L/ min. Når rotten er blevet besaltet, fjerne fra induktion kammer og sted på en åndedrætsnæsekegle, sænke isofluran til 2-2,5% for vedligeholdelse af anæstesi.
  2. Der administreres en opløsning på 0,02-0,03 ml Carprofen (50 mg/ml) i 0,2 ml steril saltvand subkutant mellem skulderbladene til analgesi.
  3. Påfør kunstige tårer salve til begge øjne for at forhindre hornhinde sår.
  4. Brug klippere, barbere hele nedre bagben(r), ankel region, og sider af pote (r).
  5. Rens valgt bagben og plantar overflade af pote med alkohol, efterfulgt af iodopovidone løsning, slutter med en endelig rense med alkohol for at fjerne resterende iodopovidone.
  6. Ved hjælp af en håndholdt mikromotor høj hastighed bore maskine med en aftagelig rund fin grus polering sten (4000 rpm), burr plantar overfladen af poten for at fjerne epidermis. Mens burring, anvende drypper af saltvand, at ikke brænde huden. Den underliggende dermis vil have en skinnende udseende med lokalisere blødning.
  7. Påfør en årepresse til den nedre ende for at bremse blodgennemstrømningen.
  8. Fjern plantar huden skarpt med en #15 skalpel og sted i saltvand-fugtet gaze for at forhindre udtørring. Nogle tendinous og bindevæv vil i sagens natur blive fjernet med huden i dette trin og vil blive fjernet senere.
  9. Påfør gaze wrap til den blødende fod til langsom blødning. Gentag trin 1.5-1.9, hvis du laver to konstruktioner.
  10. Under et mikroskop (20x forstørrelse), fjerne tendinous og bindevæv fra det dybe lag af hudtransplantation ved hjælp af mikro-saks. Pas på ikke at lave huller i transplantatet. Det fortyndede dermaltransplantat skal være let uigennemsigtigt, der kun indeholder dermis, og måle ca. 0,5 cm x 1,0 cm i størrelse.
  11. Placer i saltvand-fugtet gaze indtil klar til C-RPNI konstruere fabrikation. Grafts bør anvendes inden for 2 timer efter høsten.

2. Forberedelse af muskeltransplantatet

  1. Lav en langsgående snit langs den anterior aspekt af underekstremiteten fra lige over anklen til lige under knæet med en #15 skalpel. Dissekere gennem subkutanvæv for at afsløre den underliggende muskulatur.
  2. På det distale aspekt af snittet, udsætte seninøs indsættelser af underekstremiteten muskulatur. Tibialis forreste (TA) er typisk den største og mest forreste af musklerne, og lige under og posterior til denne muskel ligger extensor digitorum longus (EDL). Isoler den distale EDL senen fra de andre sener i området, idet man sørger for ikke at indsnitie på dette punkt.
  3. Sørg for isolering af den korrekte senen ved at indsætte begge tænder af en pincet under senen og udøve opadgående tryk ved at åbne pincet til at forårsage senen udflugt. Manipulation af denne sene bør forårsage alle tæerne til at udvide samtidigt.
  4. Udfør en distal tenotomi med skarpe iris saks og adskille musklen fra det omgivende væv rent ud med tenotomies (eller andre stumpe-tippet saks) arbejder proksimally at finde den sene oprindelse.
  5. Når den proksimale senen er visualiseret, igen udføre en tenotomy udnytte skarpe iris saks. Placer muskeltransplantatet i en saltvandsfugtet gaze for at forhindre udtørring.
  6. Når alle ønskede grafts er blevet fjernet fra en donor rotte, euthanize primært ved intra-hjerte KCl injektion (1-2 mEq K + / kg) efterfulgt af sekundær dødshjælp med bilaterale punktering pneumothorax med en #15 klinge.

3. Almindelig peroneal nerve isolation og forberedelse

  1. Bedøve og give analgesi til den eksperimentelle rotte i henhold til protokollen skitseret i trin 1.1-1.3.
  2. Barber det ønskede lår og rense med alkohol, betadine, slutter med alkohol for at fjerne spor af betadine.
  3. Flyt dyret fra kirurgisk prep bord til kirurgisk mikroskop bord og sted på varmepude med temperatur sonde til kropstemperatur vedligeholdelse. Vedligehold isofluran på 2-2,5% og ilt på 0,8-1 L/min.
  4. Mark snittet, strækker sig fra bare distale til iskias hak til ringere del af knæet. Denne markering bør være ringere end, og vinklet væk fra, lårbenet. Gør snittet med en #15 klinge incising gennem den underliggende biceps femoris fascia.
  5. Omhyggeligt dissekere gennem biceps femoris muskel med enten en hemostat eller stump-tippet mikro-saks til det rum, der ligger til grund biceps femoris.
    BEMÆRK: Den iskitiske nerve bevæger sig omtrent i samme retning som det oprindelige snit, der blev foretaget. Der er tre grene, typisk med sural nerve posterior og fælles peroneal og tibial nerve rejser overfladisk og dybt til knæet, henholdsvis.
  6. Efter identifikation af den fælles peroneal (CP) nerve, ved hjælp af et par mikro-, fin-tippet pincet og mikro-saks, omhyggeligt isolere CP nerve fra de andre iskiasiske grene og fjerne enhver dvælende bindevæv distalt.
  7. På det punkt, hvor nerven krydser overfladen af knæet, skarpt transect nerven med en par mikro-saks.
    BEMÆRK: Brug af skarpe saks er yderst vigtigt i dette trin som forårsager betydelige traumer til nerven kan øge risikoen for neuroma dannelse.
  8. Frigør omhyggeligt ethvert resterende bindevæv fra CP-nerven og arbejd proksirisk for at frigøre nerven til en længde på ca. 2 cm.

4. C-RPNI konstruktion fabrikation

  1. Fjern muskeltransplantatet fra saltvandsfugtet gaze og fjern alle centrale tendinous væv samt et lille centralt segment af epimysium. Lad de sene ender intakt.
  2. Brug af en 8-0 nylon sutur, sikre epineurium af den translede ende af CP nerve til det område af muskeltransplantat et blottet for epimysium med to afbrudte sting på hver side af nerven.
  3. Fastgør muskeltransplantatet til lårbenet periosteum med en enkelt 6-0 nylon afbrudt søm både proximally og distally med nerve-muskel krydset vender væk fra lårbenet.
    BEMÆRK: Fastgør musklen, så den er ved normal afslappet længde. Prøv ikke at strække musklen betydeligt eller efterlade for meget slaphed, når sikring.
  4. Placer en 8-0 nylon søm på ringere, centrale margen af muskelgraft epimysium, sikre det til CP nerve epineurium på en måde, at skabe slaphed i nerven i muskeltransplantatet og bidrage til at lindre eventuelle fremtidige spændinger det kan blive udsat for med senere ambulation.
  5. Fjern hudtransplantatet fra saltvand-fugtet gaze og arrangere det på muskeltransplantatet på en sådan måde helt at dække nerven og størstedelen af musklen. Sørg for, at den dybe margen af dermis hviler på musklen. Trim enhver dermis, der strækker sig ud over kanten af musklen.
  6. Fastgør hudtransplantatet til muskeltransplantatet circumferentially ved hjælp af 8-0 nylon afbrudt suturer. Typisk bruges 4-8 samlede suturer afhængigt af konstruktionens størrelse.
  7. Luk biceps femoris fascia over konstruktionen på en kørende måde med 5-0 kromatisk sutur.
  8. Luk den overliggende hud med 4-0 kromatisk sutur i kørende mode.
  9. Podepin det kirurgiske område med en alkohol pude og anvende antibiotika salve.
  10. Ophøre inhalationsbedøvelse og lad rotten komme sig med mad og vand kilder adskilt fra bur hjælpere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Konstruktion fabrikation anses for mislykket, hvis rotter udvikle en infektion eller ikke overlever kirurgisk anæstesi. Tidligere forskning har vist, at disse konstruktioner kræver ca. tre måneder at revaskulær og reinnervere2,3,17,36. Efter tilbagebetalingsperioden på tre måneder kan der udføres konstruktionstest for at undersøge levedygtigheden. Kirurgisk eksponering af konstruktioner efter tre måneder vil afsløre revaskulærde muskler og hud, hvis det lykkes (Figur 3). Til tider kan den frie muskel og dermal grafts udelukkende bestå af arvæv, og / eller nerven vil ikke blive knyttet til konstruktionen; disse resultater viser et mislykket forsøg. Men hvis det lykkes, blid klemme af den fælles peroneal nerve med pincet proksimale til konstruktionen vil resultere i synlige muskelsammentrækning (Video 1). Histologisk analyse af konstruktioner bør påvise levedygtig hud, nerve og muskler (Figur 4). Immunfarvning vil også afsløre motor- og sensorisk nervereinnervation til deres neuromuskulære vejkryds og sensoriske endeorganer, henholdsvis (Figur 5). Hvis den almindelige peroneal nerve ikke reinnervate disse væv, immunfarvning vil ikke påvise nogen individuelle nervefibre i konstruktionen med undtagelse af den implanterede nerve selv.

Elektrofysiologisk e-test kan udføres på disse konstruktioner in vivo (figur 6); tidligere forskning er blevet udført efter 3 og 9 måneder efter C-RPNI fabrikation36 (tabel 1). Efter maksimal stimulation med en krog elektrode på proksimale fælles peroneal nerve bare distale til sin start fra iskiasnerven, sammensatte muskel virkning potentialer (CMAPs) kan måles på muskel komponent med synlige muskelsammentrækning. Den type elektrode, der anvendes på musklen kan variere efter præference, men epimysial patch, epimysial pad, og bipolar sonde elektroder er blevet brugt med succes i denne forskning. Den gennemsnitlige CMAP amplitude, der blev registreret ved musklen, var 8,7 ± 1,6 mV ved 3 måneder og 10,2 ± 2,1 mV ved 9 måneder. Den gennemsnitlige ledningshastighed var 10 ± 1,2 m/s ved 3 måneder og 9,5 ± 0,6 m/s ved 9 måneder. Til sammenligning spænder CMAPs genereret af fysiologiske EDL muskel typisk fra 10-18 mV37. Efter stimulering ved den dermale komponent i C-RPNI blev der ved den proksimale fælles peronealnerve fremstillet med gennemsnitlig csnapamplitude på 113,7 ± 35,1 μV ved 3 måneder og 142,9 ± 63,7 μV ved 9 måneder. Figur 7 illustrerer enkelt- og summation CMAP- og CSNAP-signaler, der opnås under elektrofysiologisk test i grafisk format.

C-RPNI tjener til at forstærke en nerve iboende mikrovolt signal, og tidligere forskning har vist tilstrækkelig forstærkning fra mikrovolt til millivolt niveau38. Hvis en konstruktion ikke fastsætter dette forstærkningsniveau, anses den derfor ikke for at være vellykket. Hvis enten dermal, muskel, eller begge komponenter i C-RPNI mislykkes, test ville resultere i optagelser, der efterligner stimulation signal udnyttet. For muskelkomponenten specifikt, en suboptimalresultat (men en, der stadig betragtes som operationelle) ville være en, der har CMAP amplitude og ledning hastighed i det område, der falder mellem signalstimulation værdi og fysiolske EDL muskel. Derudover kan disse signaler blive svækket og mangler den karakteristiske CMAP bølgeform (Figur 8A). Suboptimale resultater på niveauet for den dermale komponent kan forekomme, men er vanskelige at kvantificere, da rotter ikke kan udtrykke kvaliteten af den fornemmelse, de oplever. Disse suboptimale resultater indebærer normalt dæmpning af bølgeformen med betydelig baggrundsstøj (figur 8B). Men hvis der er betydelige ardannelse eller callusing af hudtransplantation, eller minimal graft overlevede, ingen CsNAPs vil blive værdsat på proksimale fælles peroneal nerve uanset stimulation værdi.

Figure 1
Figur 1: Illustrativ skematik af C-RPNI-konstruktionen. Den fælles peroneal nerve kan ses sikret mellem den øverste dermal lag og bunden muskel lag. Denne konstruktion er fastgjort til lårbenet periosteum proximally og distalt via EDL's sene vejkryds. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: En billedlig repræsentation af C-RPNI hos en patient med en transradial amputation. Brugeren danner en ønsket motorhensigt på cerebralt niveau (f.eks pincer greb), som overføres som et brusende motorsignal til C-RPNI via implanteret perifer nerve. Dette signal genererer en sammensat muskel virkning potentiale (CMAP) på muskel komponent, som registreres af implanterede elektroder og anerkendt af protesen enhed, genererer den ønskede bevægelse. Sensorer på enhedens fingerspidser genkender mængden af tryk, der genereres, og videresender disse oplysninger til en elektrode, der er implanteret i den dermale komponent i C-RPNI. Disse signaler aktivere de tilsvarende sensoriske ende organer, genererer en afferent sammensat sensorisk nerve virkning potentiale (CSNAP) overføres gennem den perifere nerve til den sensoriske cortex. Et eksempelsignal, der genereres ved hver komponent, er afbilledet i de blå bokse, der er afbilledet ved siden af hver komponent. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: C-RPNI in vivo. A) C-RPNI umiddelbart efter fabrikationen ogvedb ) 3 måneder efter konstruktionen ved elektrofysiologisk testning. Musklen komponent er det dybe lag af konstruktionen og dermal, den overfladiske. Muskelvæv er præget af (M), dermis (D), og fælles peroneal nerve (N). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: C-RPNI histologi 6 måneder. C-RPNI H&E ved 6 måneder i (A) tværsnit og (B) langsgående sektion. Muskel noteret af (M), dermis (D), og nerve (N). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Immunfarvning af C-RPNI. (A) Repræsentativt eksempel på et tværsnit af muskelvæv med røde pile, der identificerer neuromuskulære vejkryds. En højere forstørrelse af den centrale neuro-muskulære kryds (NMJ) er afbilledet nederst til højre. B) Nærbillede af et neuromuskulært kryds, der er anført i prøven. For (A) og(B)indikerer rød farvning (alfabungarotoxin) tilstedeværelsen af kolinerge receptorer i muskelvæv; blå (neurofilament 200) specificerer tilstedeværelsen af neurofilamenter i neuronalvæv; og grøn (cholin acetyltransferase) bemærker specifikt motor neuron tilstedeværelse. (C) Repræsentativt eksempel på et iDISCO-billede med fokus på dermalkrydset med røde pile, der markerer sensoriske neuroner (hvid), der kommer ind i dermis. (D) On-lay visning af iDISCO demonstrere flere sensoriske neuroner (hvid, neurofilament 200). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Elektrofysiologiske test skematisk. Det øverste billede er en illustration af standard elektrode arrangement til test af C-RPNI konstruktioner. Der er en patch og / eller sonde elektrode placeret på både muskel og dermal komponenter i C-RPNI, med en dobbelt krog elektrode placeret på den fælles peroneal nerve proksimally. Det nederste billede er et in vivo eksempel på testarrangement på en rotte emne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Typisk C-RPNI elektrofysiologisk signalering. (A) Et enkelt CMAP-signal, der registreres ved muskelkomponenten efter et 5,00 mA-signal, der påføres CP-nerven. (B) 24 CMAPs genereret af 5,00 mA stimulation ved nerven. (C)Et enkelt CSNAP-signal, der er optaget fra den proksimale CP-nerve efter dermal komponentstimulation ved 900 μA. (D) En række CNAPs, der er registreret fra den proksimale CP-nerve efter stigende stimulering ved den dermale komponent fra 500 μA til 1000 μA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Unormal C-RPNI signalering. (A) En række CMAP'er opnået under ramping CP nerve stimulation fra 0,2 til 4 mA. Bølgeformer topper på forskellige punkter og vender ikke tilbage til baseline, hvilket muligvis indikerer defekte elektroder eller utilstrækkelig samlet konstruktionsfunktion. (B) Sammenfatning af csp'er opnået, samtidig med at dermal komponent stimuleres, og ramping 0,1 til 5 mA. Disse fund kan forekomme af en lang række årsager, herunder funktionssvigt elektrode (r), dermal graft ardannelse, og / eller nerveskader. Klik her for at se en større version af denne figur.

3 måneders data CMAP-data (Stimulere CP nerve og rekord fra muskeltransplantation) CSNAP Data (Stimulere hudtransplantation og optage fra CP nerve)
Rotte-id-nummer Konstruktionvægt (g) Stimulering amplitude (mA) Ledningshastighed (m/s) V Peak-to-Peak (mV) Stimulering amplitude (mA) Ledningshastighed (m/s) V Peak-to-Peak (μV)
4607 0.087 4.17 11.3 10.3 18 11.1 121
4608 0.15 1.65 11.1 17.1 7.7 6.5 136
4611 0.113 8.3 9.6 11.2 10 10 121
4613 0.116 3.18 10 9.6 1.44 8.3 134
4614 0.189 3 10.8 9.6 7.39 9 151
4616 0.122 5.2 9.4 14.9 1.8 9.1 100
4620 0.118 2.91 7.6 7.4 8.7 10 219
9 måneders data CMAP-data (Stimulere CP nerve og rekord fra muskeltransplantation) CSNAP Data (Stimulere hudtransplantation og optage fra CP nerve)
Rotte-id-nummer Konstruktionvægt (g) Stimulering amplitude (mA) Ledningshastighed (m/s) V Peak-to-Peak (mV) Stimulering amplitude (mA) Ledningshastighed (m/s) V Peak-to-Peak (μV)
4687 0.238 1.35 9.6 18.2 0.99 11 181
4688 0.131 1.08 10 8.8 1.11 8 132
4689 0.26 1.26 9.6 21.8 1.9 8.6 237
4690 0.192 4.2 8.3 12.8 Nielsen Nielsen Nielsen
4691 0.213 1.38 10 18.6 6.6 8 153
4693 0.178 1.11 9.6 15.1 8.7 8.3 306

Tabel 1: Elektrofysiologisk test af C-RPNI'er ved 3- og 9-måneders efterkonstruktion. For at opnå CMAPs, en optagelse elektrode blev placeret på musklen med en stimulerende elektrode på proksimale fælles peroneal nerve. En række stimuleringer, der steg i amplitude, blev anvendt på nerven, indtil maksimal CMAP-værdier blev opnået og resultater registreret. En lignende metode blev anvendt på den dermale komponent, men med optagelsen elektrode placeret på nerven og stimulere elektrode på dermis. Til den sensoriske vurdering af rotte 4690 ved 9 måneder, den dermal graft blev anset for at være for arret til at give mulighed for test.

Video 1
Video 1: Muskelsammentrækning inden for en C-RPNI. Et par pincet kan ses til venstre for videoen forsigtigt klemme proksimale fælles peroneal nerve. Dette resulterer i sammentrækning af muskelkomponenten i en 3 måneder gammel C-RPNI, der er synlig for seeren. Klik her for at se denne video (højreklik for at downloade).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

C-RPNI er en ny konstruktion, der giver samtidig forstærkning af et mål nerve motor brusende signaler med levering af afferent sensorisk feedback. Især C-RPNI har unikke nytte for dem, der lever med proksimale amputationer som deres motor og sensoriske fascicles kan ikke let adskilles mekanisk under operationen. I stedet c-RPNI udnytter den iboende præference reinnervation egenskaber af nerven selv at tilskynde sensoriskfiber reinnervation til afhuden sensoriske ende organer og motorfibre til neuromuskulære vejkryds.

Som C-RPNI fabrikation er afhængig af reinnervation evner målnerven, omhyggelig håndtering af nerven er altafgørende under proceduren. Under dissektion, undgå direkte manipulation af, og traumer til, målet nerve. Hvis nerven skal håndteres, anbefales det at manipulere epineurium eller omgivende bindevæv i stedet. Selv om vores laboratorium ikke er stødt neuroma dannelse i denne konstruktion, teoretisk, betydelige nerve traumer kan øge risikoen. Et yderligere vigtigt skridt i processen er høsten af de dermal grafts. Alle epidermale væv skal fjernes fra bagpote transplantatet som bevaret epidermis kan øge risikoen for infektion og inklusion cyster under helingsprocessen. Desuden skal den dermale graft være tilstrækkeligt fortyndet til at fremme imbibition og revaskularisering i hele transplantatet og undgå signifikant iskæmi og nekrose.

Selv om de fleste undersøgelser udført med C-RPNI er blevet udført på den fælles peroneal nerve, enhver blandet sensorisk nerve kunne erstattes. En ren motor eller ren sensorisk nerve kunne udnyttes, men resultaterne er vanskelige at forudsige og vil sandsynligvis resultere i enten stort set muskel eller afhuden reinnervation, henholdsvis. Med hensyn til muskeltransplantation, så længe epimysium er fjernet fra den del, der kontakter nerven, enhver muskeltransplantation lignende i størrelse kunne udnyttes, så længe det indeholdt tendinous eller fascial væv i begge ender egnet til forankring til nærliggende periosteum. For dermal graft, glabrous væv er specielt brugt på grund af potentialet for hårvækst efter podning. Ikke-glabrous hud blev tidligere forsøgt, men på grund af vanskeligheden ved at fjerne individuelle hårsækkene, alle resulterende konstruktioner havde betydelig hårvækst, betændelse, og ardannelse efter de tre-måneders modning periode. Derudover kan andre rottearter anvendes, men Lewis og Fischer rotter anbefales til dette eksperiment, da mange andre rottearter vil selvlemlæste sekundære til nerve transektion39,40.

I betragtning af forsinkelsen mellem procedure og resultater er det vanskeligt at vide på forhånd, om der skal foretages ændringer af metoden. Infektion er en teoretisk risiko sjældent stødt på vores laboratorium, men hvis infektion opstår, det er typisk lydhøre over for antibiotika. Lejlighedsvis, rotter tygge på deres snit forårsager dehiscence, og dette kan behandles med udvaskning, debridering, og re-lukning. Hvis konstruktionen efter tre måneder på eksponeringstidspunktet viser sig at være ikke-funktionel og/eller arret, er der flere potentielle årsager. Til tider, hvis nerven ikke er fastgjort korrekt til konstruktionen med mindst tre suturer, kan nerven rive fra konstruktionen med ambulation. Derudover kan musklen og/eller dermal grafts necrose, forårsager fiasko. Typisk, Dette er et resultat af enten gentagen infektion, den dermal graft er for tyk, eller musklen for beskadiget ved høsten til at inddrive ordentligt. Derudover, hvis musklen ikke er sikret til periosteum på hvilelængde, kan sammentrækning være nedsat forårsager utilstrækkelige signaler under test. Til tider vil konstruktionen synes levedygtig, men undlader at producere tilstrækkelige CMAPs / CsNAPs på test (5-10% af konstruktioner, i gennemsnit). Dette kunne være sekundært til svigt i udstyr, forhøjet elektrode impedans, eller betydelig hud callusing. Hud opkald kan dæmpe og helt blokere signal transduktion, hvis dermis ikke er fortyndet ordentligt under fabrikation. Hvis nogen af de foregående beskrevne hændelser ses hyppigt under testprocessen, skal man vende tilbage til protokollen og foretage passende ændringer. I vores laboratoriums erfaring med over 90 succesfulde C-RPNI konstruktioner er vores fejlprocent <5% og tilskrives typisk kirurgiske fejl under fabrikation.

Metoder, der almindeligvis anvendes til at forstærke eller registrere nervesignaler omfatter fleksible nerveplader18, ekstra-neurale manchetelektroder19,20,21,22,23, vævgennemtrængende elektroder24,25,31,32, og intrafascicular elektroder26,27,28, som alle er blevet tilknyttet vævsskade, axonal degeneration og/eller arvævsdannelse. Denne ardannelse er ofte tilskrives kronisk iboende fremmedlegeme respons29 og forskydning stress forårsaget af forskelle i Young's moduli30. C-RPNI, dog, er en biologisk konstruktion og dermed ikke fremkalde fremmedlegemerespons i neurale væv. Derudover, dens mekaniske egenskaber er flere faktorer tættere på neurale væv end elektroder. Histologisk analyse af disse prøver har ikke påvist nogen signifikant grad af arvæv dannelse i nerven med kronisk brug, således at C-RPNI at interface med nerven i længere perioder i forhold til de metoder, der er anført ovenfor. Selv om denne metode er yderst effektiv til forstærkning af brusende motorsignaler, er den begrænset med hensyn til sensorisk afferent signalproduktion. Vi har målt og karakteriseret signaltransduktion produceret med mekanisk og elektrisk stimulering af den dermale komponent i C-RPNI36; Disse rotteemner kan dog ikke kvalificere den type eller grad af fornemmelser, der fremkaldes ved stimulering af denne konstruktion. Som sådan, på dette tidspunkt er det umuligt at vide, hvilken slags virkning C-RPNI producerer med hensyn til sensation. Fremtidige retninger for denne konstruktion vil omfatte karakterisering af signaler, der produceres i den proksimale nerve efter specifikke forudsat stimuli (f.eks varme, smerte, tryk, osv.) samt korrelation med somatosensoriske fremkaldte potentialer genereret i den sensoriske cortex af gnaver hjernen. Det er vores laboratoriums mål at etablere et omfattende fundament for C-RPNI'er, der vil bane vejen for klinisk oversættelse til forsøgspersoner.

Forgængeren til C-RPNI, RPNI (regenerativ perifer nerve interface), består af en gratis muskeltransplantation knyttet til en transected nerve, med motorfibre reinnervating tidligere denervated neuromuskulære vejkryds. RPNI har vist nytte hos forsøgspersoner, med flere patienter, der kontrollerer avancerede proteser fra signaler forstærket by-og registreres fra-disse RPNIs34. Desuden har disse RPNI'er vist gavnlige behandlingseffekter uden protesekontrol, med flere indledende retrospektive og prospektive undersøgelser, der viser nedsat neuromadannelse, kroniske smerter og smerter i fantomlemmer hos patienter med ekstremitetsamputationer. På trods af disse succeser, en fælles klage for dem, der udnytter disse avancerede proteser, er imidlertid behovet for at visualisere protesen under brug, da disse proteser mangler proprioception og give minimal sensorisk feedback. C-RPNI kunne være en løsning på denne fælles kritik ved at give en måde at levere sensorisk feedback via dermal komponent, hvilket fører til realiseringen af den meget ønskede, ideelle protese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen oplysninger.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Jana Moon for ekspert teknisk bistand. Undersøgelser fremlagt i dette dokument blev finansieret gennem et R21 (R21NS104584) tilskud til SK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scalpel Aspen Surgical, Inc Ref 371115 Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15)
4-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 1654G P-3 Reverse Cutting Needle
5-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 687G P-3 Reverse Cutting Needle
6-0 Ethilon Suture Ethicon SKU# 697G P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture)
8-0 Monofilament Suture AROSurgical T06A08N14-13 Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle
Experimental Rats Envigo F344-NH-sd Rats are Fischer F344 Strain
Fluriso (Isofluorane) VetOne 13985-528-40 Inhalational Anesthetic
Micro Motor High Speed Drill with Stone Master Mechanic Model 151369 Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones
Oxygen Cryogenic Gases UN1072 Standard medical grade oxygen canisters
Potassium Chloride APP Pharmaceuticals 63323-965-20 Injectable form, 2 mEq/mL
Povidone Iodine USP MediChoice 65517-0009-1 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps
Puralube Vet Opthalmic Ointment Dechra 17033-211-38 Corneal protective ointment for use during procedure
Rimadyl (Caprofen) Zoetis, Inc. NADA# 141-199 Injectable form, 50 mg/mL
Stereo Microscope Leica Model M60 User can adjust magnification to their preference
Surgical Instruments Fine Science Tools Various User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab
Triple Antibiotic Ointment MediChoice 39892-0830-2 Ointment comes in sterile, disposable packets
VaporStick 3 Surgivet V7015 Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister
Webcol Alcohol Prep Coviden Ref 6818 Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Biddiss, E. A., Chau, T. T. Upper limb prosthesis use and abandonment: A survey of the last 25 years. Prosthetics and Orthotics International. 31 (3), 236-257 (2007).
  2. Kung, T. A., et al. Regenerative peripheralnerve interface viability and signal transduction with an implanted electrode. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1380-1394 (2014).
  3. Larson, J. V., et al. Prototype Sensory Regenerative Peripheral Nerve Interface for Artificial Limb Somatosensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3 Suppl), 26-27 (2014).
  4. Hijjawi, J. B., et al. Improved myoelectric prosthesis control accomplished using multiple nerve transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (7), 1573-1578 (2006).
  5. Pylatiuk, C., Schulz, S., Döderlein, L. Results of an Internet survey of myoelectric prosthetic hand users. Prosthetics and Orthotics International. 31 (4), 362-370 (2007).
  6. Baghmanli, Z., et al. Biological and electrophysiologic effects of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) on regenerating peripheral nerve fibers. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (2), 374-385 (2013).
  7. Dhillon, G. S., Horch, K. W. Direct neural sensory feedback and control of a prosthetic arm. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 13 (4), 468-472 (2005).
  8. Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinos, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
  9. O'Doherty, J., et al. Active tactile exploration using a brain-machine-brain interface. Nature. 479, 228-231 (2011).
  10. Stein, R. B., Walley, M. Functional comparison of upper extremity amputees using myoelectric and conventional prostheses. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 64 (6), 243-248 (1983).
  11. Millstein, S. G., Heger, H., Hunter, G. A. Prosthetic Use in Adult Upper Limb Amputees: A Comparison of the Body Powered and Electrically Powered Prostheses. Prosthetics and Orthotics International. 10 (1), 27-34 (1986).
  12. Zollo, L., et al. Restoring tactile sensations via neural interfaces for real-time force-and-slippage closed-loop control of bionic hands. Science Robotics. 4 (27), eaau9924 (2019).
  13. Tan, D. W., et al. A neural interface provides long-term stable natural touch perception. Science Translational Medicine. 6 (257), 257ra138 (2014).
  14. Stieglitz, T., et al. On Biocompatibility and Stability of Transversal Intrafascicular Multichannel Electrodes-TIME. Converging Clinical and Engineering Research on Neurorehabilitation II. 15, 731-735 (2017).
  15. Petrini, F. M., et al. Six-months assessment of a hand prosthesis with intraneural tactile feedback. Annals of Neurology. 85 (1), 137-154 (2019).
  16. Jung, R., Abbas, J., Kuntaegowdanahalli, S., Thota, A. Bionic intrafascicular interfaces for recording and stimulating peripheral nerve fibers. Bioelectronics in Medicine. 1 (1), 55-69 (2018).
  17. Micera, S., Navarro, X., Yoshida, K. Interfacing With the Peripheral Nervous System to Develop Innovative Neuroprostheses. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (5), 417-419 (2009).
  18. Stieglitz, T., Schuettler, M., Schneider, A., Valderrama, E., Navarro, X. Noninvasive measurement of torque development in the rat foot: measurement setup and results from stimulation of the sciatic nerve with polyimide-based cuff electrodes. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 11 (4), 427-437 (2003).
  19. Polasek, K. H., Hoyen, H. A., Keith, M. W., Tyler, D. J. Human nerve stimulation thresholds and selectivity using a multi-contact nerve cuff electrode. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 15 (1), 76-82 (2007).
  20. Nielson, K. D., Watts, C., Clark, W. K. Peripheral nerve injury from implantation of chronic stimulating electrodes for pain control. Surgical Neurology. 5 (1), 51-53 (1976).
  21. Waters, R. L., McNeal, D. R., Faloon, W., Clifford, B. Functional electrical stimulation of the peroneal nerve for hemiplegia. Long-term clinical follow-up. Journal of Bone and Joint Surgery. 67 (5), 792-793 (1985).
  22. Larsen, J. O., Thomsen, M., Haugland, M., Sinkjaer, T. Degeneration and regeneration in rabbit peripheral nerve with long-term nerve cuff electrode implant: a stereological study of myelinated and unmyelinated axons. Acta Neuropathologica. 96 (4), 365-378 (1998).
  23. Krarup, C., Loeb, G. E., Pezeshkpour, G. H. Conduction studies in peripheral cat nerve using implanted electrodes: III. The effects of prolonged constriction on the distal nerve segment. Muscle Nerve. 12 (11), 915-928 (1989).
  24. Micera, S., Navarro, X. Bidirectional interfaces with the peripheral nervous system. International Review of Neurobiology. 86, 23-38 (2009).
  25. Urbanchek, M. G., et al. Microscale Electrode Implantation during Nerve Repair: Effects on Nerve Morphology, Electromyography, and Recovery of Muscle Contractile Function. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (4), 270e-278e (2011).
  26. Yoshida, K., Horch, K. Selective stimulation of peripheral nerve fibers using dual intrafascicular electrodes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (5), 492-494 (1993).
  27. Branner, A., Stein, R. B., Normann, R. A. Selective stimulation of cat sciatic nerve using an array of varying length microelectrodes. Journal of Neurophysiology. 85 (4), 1585-1594 (2001).
  28. Zheng, X. J., Zhang, J., Chen, T., Chen, Z. Longitudinally implanted intrascicular electrodes for stimulating and recording fascicular physioelectrical signals in the sciatic nerve of rabbits. Microsurgery. 23, 268-273 (2003).
  29. del Valle, J., Navarro, X. Interfaces with the peripheral nerve for the control of neuroprostheses. International Review of Neurobiology. 109, 63-83 (2013).
  30. Stiller, A. M., et al. A Meta-Analysis of Intracortical Device Stiffness and Its Correlation with Histological Outcomes. Micromachines. 9 (9), 443 (2018).
  31. Hanson, T., Diaz-Botia, C., Kharazia, V., Maharbiz, M., Sabes, P. The "sewing machine" for minimally invasive neural recording. bioRxiv. , Published online (2019).
  32. Yang, X., et al. Bioinspired neuron-like electronics. Nature Materials. 18, 510-517 (2019).
  33. Irwin, Z. T., et al. Chronic recording of hand prosthesis control signals via a regenerative peripheral nerve interface in a rhesus macaque. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046007 (2016).
  34. Kubiak, C. A., et al. Abstract 24: Successful Control of Virtual and Robotic Hands using Neuroprosthetic Signals from Regenerative Peripheral Nerve Interfaces in a Human Subject. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (4), 19-20 (2018).
  35. Sando, I. C., et al. Dermal-Based Peripheral Nerve Interface for Transduction of Sensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4 Suppl), 19-20 (2015).
  36. Kubiak, C. A., et al. Abstract 36: Viability and Signal Transduction with the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI). Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4), 26-27 (2019).
  37. Kubiak, C. A., et al. Abstract QS18: Neural Signal Transduction with the Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4 Suppl), 114 (2019).
  38. Woo, S. L., et al. Utilizing nonvascularized partial skeletal muscle grafts in peripheral nerve interfaces for prosthetic control. Journal of the American College of Surgeons. 219 (4), e136-e137 (2014).
  39. Sporel-Özakat, R. E., Edwards, P. M., Hepgul, K. T., Savas, A., Gispen, W. H. A simple method for reducing autotomy in rats after peripheral nerve lesions. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 263-265 (1991).
  40. Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).

Tags

Bioengineering perifer nerve interface protese kontrol C-RPNI neurale feedback system
Fabrikation af den sammensatte regenerative perifere nervegrænseflade (C-RPNI) i voksenrotten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Svientek, S. R., Ursu, D. C.,… More

Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (156), e60841, doi:10.3791/60841 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter