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Bioengineering

Fabrication de l’interface nerveuse périphérique régénératrice composite (C-RPNI) chez le rat adulte

Published: February 25, 2020 doi: 10.3791/60841
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,2
1Department of Surgery, Division of Plastic Surgery, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor

Summary

Le manuscrit suivant décrit une nouvelle méthode pour développer un système biologique de rétroaction neuronale en boucle fermée appelé interface nerveuse périphérique régénérative composite (C-RPNI). Cette construction a la capacité d’intégrer avec les nerfs périphériques pour amplifier les signaux moteurs efferent tout en fournissant simultanément une rétroaction sensorielle afférente.

Abstract

Les progrès récents dans les neuroprothèses ont permis à ceux qui vivent avec la perte d’extrémité de reproduire beaucoup de fonctions indigènes à l’extrémité absente, et ceci est souvent accompli par l’intégration avec le système nerveux périphérique. Malheureusement, les méthodes actuellement employées sont souvent associées à des dommages importants de tissu qui empêchent l’utilisation prolongée. En outre, ces dispositifs manquent souvent de tout degré significatif de rétroaction sensorielle que leur construction complexe amortit toutes les vibrations ou d’autres sensations d’un utilisateur peut avoir déjà dépendu lors de l’utilisation de prothèses plus simples. L’interface nerveuse périphérique régénératrice composite (C-RPNI) a été développée comme une construction stable et biologique avec la capacité d’amplifier les signaux efferents de nerf moteur tout en fournissant la rétroaction sensorielle afferent simultanée. Le C-RPNI se compose d’un segment de greffe cutanée et musculaire libre fixée autour d’un nerf sensorimoteur mixte cible, avec la réinnervation préférentielle de nerf moteur de la greffe de muscle et de la réinnervation sensorielle de nerf de la greffe cutanée. Chez les rats, cette construction a démontré la génération de potentiels d’action musculaire composé (CMAPs), amplifiant le signal du nerf cible du niveau micro-à milli-volt, avec des rapports signal-bruit en moyenne d’environ 30-50. La stimulation de la composante cutanée de la construction génère des potentiels d’action sensorielle composé de nerf (CSNAPs) au nerf proximal. En tant que tel, cette construction a une utilité future prometteuse vers la réalisation de l’idéal, prothèse intuitive.

Introduction

Les amputations d’extrémité affectent près d’un Américain sur 1901, et leur prévalence devrait augmenter de 1,6 million aujourd’hui à plus de 3,6 millions d’ici 20502. Malgré une utilisation documentée depuis plus d’un millénaire, la prothèse idéale n’a pas encore été réalisée3. Actuellement, il existe des prothèses complexes capables de multiples manipulations articulaires avec le potentiel de reproduire de nombreuses fonctions motrices de l’extrémité indigène4,5. Cependant, ces dispositifs ne sont pas considérés comme intuitifs car le mouvement prothétique désiré est généralement fonctionnellement séparé du signal de commande d’entrée. Les utilisateurs considèrent généralement ces «prothèses avancées» difficile à apprendre et donc pas adapté à une utilisation quotidienne1,6. En outre, les prothèses complexes actuellement sur le marché ne fournissent aucun degré appréciable de rétroaction sensorielle subtile pour un contrôle adéquat. Le sens du toucher et de la proprioception sont essentiels à l’exécution des tâches quotidiennes, et sans ceux-ci, des actes simples tels que ramasser une tasse de café deviennent lourds car il repose entièrement sur des indices visuels7,8,9. Pour ces raisons, les prothèses avancées sont associées à un degré important de fatigue mentale et sont souvent décrites comme lourdes et insatisfaisantes5,10,11. Pour remédier à cette situation, certains laboratoires de recherche ont mis au point des prothèses capables de fournir un degré limité de rétroaction sensorielle par l’interaction neuronale directe12,13,14,15, mais la rétroaction est souvent limitée à de petites zones dispersées sur les mains et les doigts12,13, et les sensations ont été notées pour être douloureux et contre nature à certains moments15. Beaucoup de ces études manquent malheureusement de suivi à long terme appréciable et d’histologie nerveuse pour délimiter les effets des tissus locaux, tout en notant l’échec de l’interface sur l’échelle des semaines aux mois16.

Pour cette population, le dispositif prothétique idéal fournirait le contrôle moteur de haute fidélité à côté de la rétroaction somatosensory significative de l’environnement de l’individu tout au long de leur vie. Critique à la conception de ladite prothèse idéale est le développement d’une interface stable et fiable qui permettrait la transmission simultanée d’informations somatosensorielles afférentes avec des signaux moteurs efferents. Les interfaces humaines-machines actuelles sont celles qui interagissent directement avec le système nerveux périphérique, et les développements récents dans le domaine des prothèses neuro-intégrées ont travaillé à combler le fossé entre les signaux bioélectriques et mécaniques17. Les interfaces actuelles utilisées incluent : plaques nerveuses flexibles14,15,18, électrodes de manchette extra-neurales13,19,20,21,22,23, tissus pénétrant des électrodes24,25,31,32, et électrodes intrafascicular26,27 ,28. Cependant, chacune de ces méthodes a démontré des limitations en ce qui concerne la spécificité de nerf, les dommages de tissu, la dégénérescence axonale, l’épuisement de myéline, et/ou la formation de tissu de cicatrice s’est associée à la réponse étrangère chronique de corps16,17,18,19. Plus récemment, il a été postulé qu’un conducteur derrière l’échec éventuel d’électrode implantée est la différence significative dans le moduli de Young entre le matériel électronique et le tissu neural indigène. Le tissu cérébral est sujet à une micromotion significative sur une base quotidienne, et il a été théorisé que le stress de cisaillement induit par les différences dans le moduli de Young provoque l’inflammation et les cicatrices permanentes éventuelles30,31,32. Cet effet est souvent aggravé dans les extrémités, où les nerfs périphériques sont soumis à la fois à la micromotion physiologique et à la macromotion intentionnelle des extrémités. En raison de ce mouvement constant, il est raisonnable de conclure que l’utilisation d’une interface nerveuse périphérique complètement abiotique n’est pas idéale, et une interface avec un composant biologique serait plus approprié.

Pour répondre à ce besoin d’un composant biologique, notre laboratoire a développé une interface de nerf biotique appelée l’interface périphérique régénérative de nerf (RPNI) pour intégrer les nerfs périphériques transectés dans un membre résiduel avec un dispositif prosthétique. La fabrication de RPNI implique chirurgicalement l’implantation d’un nerf périphérique dans une greffe musculaire libre autologue, qui se revascularise et réinnervate par la suite. Notre laboratoire a développé cette interface neurologique de nerf au cours de la dernière décennie, avec le succès en amplifiant et en transmettant des signaux moteurs une fois combinés avec des électrodes implantées dans les essais animaux et humains, permettant le contrôle prosthétique approprié avec de multiples degrés de liberté2,34. En outre, nous avons démontré séparément la rétroaction sensorielle par l’utilisation des nerfs périphériques incorporés dans les greffes cutanées, appelées l’interface sensorielle dermique (DSI)3,35. Dans les amputations plus distales, l’utilisation simultanée de ces constructions est faisable car les fascicles moteurs et sensoriels dans le nerf périphérique cible peuvent être chirurgicalement séparés. Cependant, pour des amputations de niveau plus proximales, ce n’est pas faisable en raison de l’entremêlement des fibres motrices et sensorielles. L’interface nerveuse périphérique régénérative composite (C-RPNI) a été développée pour des amputations plus proximales, et il s’agit d’implanter un nerf sensorimoteur mixte dans une construction consistant en une greffe musculaire libre fixée à un segment de greffe cutanée (Figure 1). Les nerfs périphériques démontrent la réinnervation ciblée préférentielle, ainsi les fibres sensorielles re-innervate la greffe cutanée et les fibres motrices, la greffe de muscle. Cette construction a donc la capacité d’amplifier simultanément les signaux moteurs tout en fournissant une rétroaction somatosensorielle36 (Figure 2), permettant la réalisation de la prothèse idéale, intuitive et complexe.

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Protocol

Toutes les expériences sur les animaux sont effectuées sous l’approbation du Comité sur l’utilisation et le soin des animaux de l’Université du Michigan.

REMARQUE : Les rats donneurs ont accès gratuitement à la nourriture et à l’eau avant les procédures de don de la peau et des muscles. L’euthanasie est réalisée sous anesthésie profonde suivie d’une injection intra-cardiaque de chlorure de potassium avec une méthode secondaire de pneumothorax bilatéral. Toute souche de rat peut théoriquement être utilisée avec cette expérience; cependant, notre laboratoire a obtenu des résultats cohérents chez les rats Fischer F344 mâles et femelles (200-250 g) à l’âge de deux à quatre mois. Les rats donneurs doivent être isogènes pour les rats expérimentaux.

1. Préparation de la greffe cutanée

  1. Anesthésier le rat de donneur dans une chambre d’induction utilisant une solution de 5% d’isoflurane dans l’oxygène à 0.8-1 L/min. Une fois que le rat a été anesthésié, retirer de la chambre d’induction et placer sur un cône de nez respirant, abaissant l’isoflurane à 2-2.5% pour le maintien de l’anesthésie.
  2. Administrer une solution de 0,02-0,03 ml de carprofène (50 mg/ml) dans 0,2 ml de salin stérile sous-cutané entre les omoplates pour l’analgésie.
  3. Appliquer onduleur artificiel de larmes aux deux yeux pour empêcher les ulcères cornéens.
  4. À l’aide de tondeuses, raser l’ensemble du membre postérieur inférieur, la région de la cheville et les côtés de la patte.
  5. Nettoyer la surface postérieure choisie et plantaire de la patte avec de l’alcool, suivie d’une solution iodopovidone, se terminant par un nettoyage final avec de l’alcool pour enlever l’iodopovidone résiduel.
  6. À l’aide d’une perceuse à haute vitesse micro moteur portatif avec une pierre de polissage de gravier rond amovible (4000 tr/min), enterrez la surface plantaire de la patte pour enlever l’épiderme. Pendant l’enburrage, appliquer des gouttes de saline pour ne pas brûler la peau. Le derme sous-jacent aura un aspect brillant avec des saignements précis.
  7. Appliquer un tourniquet à l’extrémité inférieure pour ralentir la circulation sanguine.
  8. Retirer la peau plantaire fortement avec un scalpel #15 et placer dans la gaze saline-humidifiée pour empêcher la dessiccation. Certains tissus tendineux et conjonctifs seront intrinsèquement enlevés avec la peau dans cette étape et seront enlevés plus tard.
  9. Appliquer l’enveloppe de gaze sur le pied qui saigne pour ralentir l’hémorragie. Répétez les étapes 1.5-1.9 si vous faites deux constructions.
  10. Sous un microscope (grossissement 20x), retirer le tissu tendineux et conjonctif de la couche profonde de la greffe de peau à l’aide de micro-ciseaux. Veillez à ne pas faire de trous dans la greffe. La greffe cutanée éclaircie doit être légèrement opaque contenant seulement du derme, mesurant environ 0,5 cm x 1,0 cm de taille.
  11. Placer dans de la gaze saline jusqu’à ce qu’elle soit prête pour la fabrication de la construction C-RPNI. Les greffons doivent être utilisés dans les 2 heures suivant la récolte.

2. Préparation de la greffe musculaire

  1. Faire une incision longitudinale le long de l’aspect antérieur de l’arrière inférieur juste au-dessus de la cheville à juste en dessous du genou avec un scalpel #15. Disséquer à travers le tissu sous-cutané pour exposer la musculature sous-jacente.
  2. À l’aspect distal de l’incision, exposez les insertions tendineuses de la musculature inférieure de membre. Tibialis antérieure (TA) est généralement le plus grand et le plus antérieur des muscles, et juste en dessous et postérieur à ce muscle se trouve l’extenseur digitorum longus (EDL). Isoler le tendon Distal EDL des autres tendons dans la région, en prenant soin de ne pas inciser son insertion à ce stade.
  3. Assurer l’isolement du tendon correct en insérant les deux dents d’un forceps sous le tendon et en exerçant une pression vers le haut en ouvrant les forceps pour provoquer une excursion au tendon. La manipulation de ce tendon devrait faire en sorte que tous les orteils s’étendent simultanément.
  4. Effectuer une ténotomie distale avec des ciseaux d’iris pointus et séparer le muscle des tissus environnants sans ménagement avec des ténotomies (ou d’autres ciseaux à pointe émoussée) de travail proximally pour trouver l’origine tendineuse.
  5. Une fois que le tendon proximal est visualisé, à nouveau effectuer une ténotomie en utilisant des ciseaux d’iris forte. Placez la greffe musculaire dans une gaze saline-humidifiée pour empêcher la dessiccation.
  6. Une fois que toutes les greffes désirées ont été enlevées d’un rat de distributeur, euthanasiez principalement par injection intra-cardiaque de KCl (1-2 mEq K/kg) suivi s’euthanasiant secondaire avec le pneumothorax bilatéral de perforation avec une lame #15.

3. Isolement et préparation peronéal communs de nerf

  1. Anesthésier et fournir de l’analgésie au rat expérimental selon le protocole décrit dans les étapes 1.1-1.3.
  2. Raser la cuisse désirée et nettoyer avec de l’alcool, la bétadine, se terminant par de l’alcool pour enlever les traces de bétadine.
  3. Déplacez l’animal de la table de préparation chirurgicale à la table de microscope chirurgicale et placez sur le coussin chauffant avec la sonde de température pour le maintien de la température corporelle. Maintenir l’isoflurane à 2-2,5% et l’oxygène à 0.8-1 L/min.
  4. Marquez l’incision, s’étendant de juste distal à l’encoche sciatique à la partie inférieure du genou. Ce marquage doit être inférieur au fémur et s’éloigner de celui-ci. Faire l’incision avec une lame #15 incisant à travers le biceps sous-jacent femoris fascia.
  5. Disséquez soigneusement par le muscle de femoris de biceps avec un hemostat ou des micro-ciseaux émoussés à l’espace sous-jacent des femoris de biceps.
    REMARQUE : Le nerf sciatique se déplace approximativement dans la même direction que l’incision initiale qui a été faite. Il y a trois branches, typiquement avec le nerf postérieur sural et le nerf peronal et tibial commun voyageant superficiel et profond au genou, respectivement.
  6. Après identification du nerf peronal commun (CP), utilisant une paire de micro-, forceps fin-vers et micro-ciseaux, isolez soigneusement le nerf de CP des autres branches sciatiques et enlèvent n’importe quel tissu conjonctif persistant distally.
  7. Au point où le nerf traverse la surface du genou, transect fortement le nerf avec une paire de micro-ciseaux.
    REMARQUE: L’utilisation de ciseaux pointus est extrêmement important dans cette étape que causer un traumatisme important au nerf pourrait augmenter le risque de formation de neuromes.
  8. Libérez soigneusement tout tissu conjonctif restant du nerf du CP et travaillez de façon proxiale pour libérer le nerf à une longueur d’environ 2 cm.

4. Fabrication de construction C-RPNI

  1. Enlever la greffe musculaire de la gaze saline-humidifiée et enlever tous les tissus tendineux centraux ainsi qu’un petit segment central de l’épimysium. Laissez les extrémités tendineuses intactes.
  2. Utilisation d’un 8-0 suture de nylon, fixent l’épineurium de l’extrémité transected du nerf de CP à la zone de la greffe de muscle dépourvue de l’épimysium avec deux points interrompus de chaque côté du nerf.
  3. Fixer la greffe musculaire au périosteume du fémur avec un seul 6-0 nylon interrompu point à la fois proximally et distally avec la jonction nerf-muscle face loin du fémur.
    REMARQUE: Fixer le muscle de sorte qu’il est à la longueur normale détendue. Essayez de ne pas étirer le muscle de manière significative ou laisser trop de laxisme lors de la sécurisation.
  4. Placer un 8-0 point de nylon à la marge inférieure et centrale de l’épimysium de greffe de muscle, le fixant à l’épineurium de nerf de CP de manière à créer le laxisme dans le nerf dans la greffe de muscle et aider à soulager n’importe quelle tension future qu’il peut être exposé à avec la déambulation postérieure.
  5. Enlever la greffe de peau de la gaze saline-humidifiée et l’organiser sur la greffe de muscle de telle sorte que de couvrir complètement le nerf et la majorité du muscle. Assurez-vous que la marge profonde du derme repose sur le muscle. Couper tout derme qui s’étend au-delà de la frontière du muscle.
  6. Fixer la greffe de peau à la greffe musculaire circontisériquement en utilisant 8-0 sutures interrompues en nylon. Typiquement, 4-8 sutures totales sont utilisées en fonction de la taille de la construction.
  7. Fermez le biceps femoris fascia sur la construction d’une manière courante avec 5-0 suture chromic.
  8. Fermez la peau sus-jacente avec 4-0 suture chromic dans la mode courante.
  9. Swab la zone chirurgicale avec un tampon d’alcool et appliquer onguent antibiotique.
  10. Cessez l’anesthésie par inhalation et laissez le rat se rétablir avec des sources de nourriture et d’eau séparées des cages.

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Representative Results

La fabrication de construction est considérée infructueuse si les rats développent une infection ou ne survivent pas à l’anesthésie chirurgicale. Des recherches antérieures ont indiqué que ces constructions nécessitent environ trois mois pour revasculariser et réinnervate2,3,17,36. Après la période de récupération de trois mois, des essais de construction peuvent être poursuivis pour examiner la viabilité. L’exposition chirurgicale des constructions après trois mois révélera le muscle et la peau revascularisés en cas de succès (figure 3). Parfois, le muscle libre et les greffes cutanées peuvent se composer uniquement de tissu cicatriciel, et / ou le nerf ne sera pas attaché à la construction; ces résultats indiquent une tentative infructueuse. Cependant, en cas de succès, la compression douce du nerf peronéal commun avec des forceps proximal à la construction aura comme conséquence la contraction visible de muscle (vidéo 1). L’analyse histologique des constructions devrait démontrer la peau, le nerf, et le muscle viables (figure 4). Immunostaining révélera également la réinnervation motrice et sensorielle de nerf à leurs jonctions neuromusculaires et organes sensoriels fin, respectivement (figure 5). Si le nerf peronéal commun ne réinnervate pas ces tissus, l’immunostaining ne démontrera aucune fibre de nerf individuelle dans la construction à l’exception du nerf implanté lui-même.

Des tests électrophysiologiques peuvent être effectués sur ces constructions in vivo (figure 6); des recherches antérieures ont été menées à 3 et 9 mois suivant la fabrication C-RPNI36 (tableau 1). Après stimulation maximale avec une électrode de crochet au nerf peroneal commun proximal juste distal à son décollage du nerf sciatique, les potentiels d’action de muscle composé (CMAPs) peuvent être mesurés au composant de muscle avec la contraction visible de muscle. Le type d’électrode utilisée au muscle peut varier selon la préférence, mais le patch épimysial, le tampon épimysial, et les électrodes bipolaires de sonde ont été employés avec succès dans cette recherche. L’amplitude moyenne de CMAP enregistrée au muscle était de 8,7 à 1,6 mV à 3 mois et de 10,2 à 2,1 mV à 9 mois. La vitesse moyenne de conduction était de 10 à 1,2 m/s à 3 mois et de 9,5 à 0,6 m/s à 9 mois. En comparaison, les CMAP générés par le muscle physiologique d’EDL vont typiquement de 10-18 mV37. Après stimulation à la composante cutanée du C-RPNI, des potentiels d’action sensorielle composée (CSNAPs) ont été produits au nerf peronal commun proximal, avec l’amplitude moyenne de CSNAP mesurant 113.7 - 35.1 V à 3 mois et 142.9 - 63.7 V à 9 mois. La figure 7 illustre les signaux CMAP et CSNAP simples et summation obtenus lors d’essais électrophysiologiques dans un format graphique.

Le C-RPNI sert à amplifier le signal microvolt inhérent d’un nerf, et la recherche précédente a démontré l’amplification suffisante du niveau de microvolt au niveaumillivolt 38. Par conséquent, si une construction ne fournit pas ce niveau d’amplification, elle n’est pas considérée comme réussie. Si la dermale, le muscle, ou les deux composants du C-RPNI échouent, l’essai acommenserait des enregistrements qui imitent le signal de stimulation utilisé. Pour le composant musculaire en particulier, un résultat sous-optimal (mais qui est toujours considéré comme opérationnel) serait celui qui a l’amplitude CMAP et la vitesse de conduction dans la gamme qui se situe entre la valeur de stimulation du signal et celle du muscle physiologique EDL. De plus, ces signaux peuvent s’atténuer et ne pas avoir la forme d’onde caractéristique du CMAP (figure 8A). Des résultats sous-optimaux au niveau de la composante cutanée peuvent se produire, mais sont difficiles à quantifier étant donné que les rats ne peuvent pas exprimer la qualité de la sensation qu’ils éprouvent. Ces résultats sous-optimaux impliquent généralement l’amortissement de la forme d’onde avec un bruit de fond important (figure 8B). Cependant, s’il y a la cicatrisation ou l’appel significatif de la greffe de peau, ou la greffe minimale a survécu, aucun CSNAPs ne sera apprécié au nerf peroneal commun proximal indépendamment de la valeur de stimulation.

Figure 1
Figure 1 : Schéma d’illustration de la construction C-RPNI. Le nerf peronéal commun peut être vu fixé entre la couche cutanée supérieure et la couche de muscle inférieure. Cette construction est fixée au périosteume du fémur proximally et distally par les jonctions tendineuses d’EDL. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Représentation picturale du C-RPNI chez un patient amputé transradial. L’utilisateur forme une intention motrice désirée au niveau cérébral (p. ex., la prise de pince), qui est transmise comme un signal moteur efferent au C-RPNI par l’intermédiaire du nerf périphérique implanté. Ce signal génère un potentiel d’action musculaire composé (CMAP) à la composante musculaire, qui est enregistré par des électrodes implantées et reconnu par le dispositif prothétique, générant le mouvement désiré. Les capteurs du bout des doigts de l’appareil reconnaissent la quantité de pression générée et transmettent cette information à une électrode implantée dans la composante cutanée du C-RPNI. Ces signaux activent les organes sensoriels correspondants, générant un potentiel d’action nerveuse sensorielle composé afferent (CSNAP) transmis par le nerf périphérique au cortex sensoriel. Un exemple de signal généré à chaque composant est représenté dans les boîtes bleues représentées à côté de chaque composant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : C-RPNI in vivo. (A) Un C-RPNI immédiatement après la fabrication et à (B) 3 mois après la construction au moment des tests électrophysiologiques. Le composant musculaire est la couche profonde de la construction et la dermale, la superficielle. Le tissu musculaire est marqué par (M), le derme (D) et le nerf peronéal commun (N). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Histologie C-RPNI 6 mois. C-RPNI H et E à 6 mois dans (A) section transversale et (B) section longitudinale. Muscle noté par (M), derme (D), et nerf (N). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Immunostaining de la C-RPNI. (A) Exemple représentatif d’une section transversale de tissu musculaire, avec des flèches rouges identifiant les jonctions neuromusculaires. Un grossissement plus élevé de la jonction neuro-musculaire centrale (NMJ) est représenté en bas à droite. (B) Gros plan d’une jonction neuromusculaire notée dans l’échantillon. Pour (A) et (B), coloration rouge (alpha-bungarotoxin) indique la présence de récepteurs cholinergiques dans le tissu musculaire; bleu (neurofilament 200) spécifie la présence des neurofilaments dans le tissu neuronal ; et vert (acétyltransferase de choline) note spécifiquement la présence de neurones moteurs. (C) Exemple représentatif d’une image iDISCO se concentrant sur la jonction cutanée, avec des flèches rouges marquant les neurones sensoriels (blanc) entrant dans le derme. (D) Vue de la pose de l’iDISCO démontrant les neurones sensoriels multiples (blanc, neurofilament 200). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Schéma d’essai électrophysiologique. L’image du haut est une illustration de l’arrangement standard d’électrode pour tester les constructions C-RPNI. Il y a un patch et/ou une électrode de sonde placé sur les composants musculaires et dermiques du C-RPNI, avec une électrode de double crochet placée au nerf peronal commun proximally. L’image du bas est un exemple in vivo de l’arrangement d’essai sur un sujet de rat. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Signalisation électrophysiologique C-RPNI typique. (A) Un seul signal CMAP enregistré à la composante musculaire à la suite d’un signal de 5,00 mA appliqué au nerf CP. (B) 24 CMAPs générés par une stimulation de 5,00 mA au nerf. (C) Un seul signal CSNAP enregistré à partir du nerf proximal du CP à la suite d’une stimulation des composants dermiques à 900 'A. (D) Une série de CSNAP enregistrés à partir du nerf proximal du CP suite à l’augmentation de la stimulation à la composante cutanée de 500 à 1000 'A. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Signalisation anormale c-RPNI. (A) Une série de CMAPs obtenus tout en rampant la stimulation de nerf de CP de 0.2 à 4 mA. Les formes d’ondes atteignent leur maximum à différents points et ne parviennent pas à revenir à la ligne de base, ce qui indique peut-être des électrodes défectueuses ou une fonction de construction globale inadéquate. (B) Summation des CSNAPs obtenus tout en stimulant la composante cutanée, rampant 0.1 à 5 mA. Ces résultats peuvent se produire pour une multitude de raisons, y compris l’électrode défectueuse(s), la cicatrisation de greffe cutanée, et/ou des dommages de nerf. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Données de 3 mois Données CMAP (Stimuler le nerf CP et enregistrer de la greffe musculaire) Données CSNAP (Stimuler la greffe de peau et l’enregistrement du nerf CP)
Numéro d’iD rat Poids de construction (g) Amplitude de stimulation (mA) Conduction Velocity (m/s) V Peak-to-Peak (mV) Amplitude de stimulation (mA) Conduction Velocity (m/s) V Pic-à-Pic (V)
4607 0.087 4.17 11.3 10.3 18 11.1 121
4608 0.15 1.65 11.1 17.1 7.7 6.5 136
4611 0.113 8.3 9.6 11.2 10 10 121
4613 0.116 3.18 10 9.6 1.44 8.3 134
4614 0.189 3 10.8 9.6 7.39 9 151
4616 0.122 5.2 9.4 14.9 1.8 9.1 100
4620 0.118 2.91 7.6 7.4 8.7 10 219
Données de 9 mois Données CMAP (Stimuler le nerf CP et enregistrer de la greffe musculaire) Données CSNAP (Stimuler la greffe de peau et l’enregistrement du nerf CP)
Numéro d’iD rat Poids de construction (g) Amplitude de stimulation (mA) Conduction Velocity (m/s) V Peak-to-Peak (mV) Amplitude de stimulation (mA) Conduction Velocity (m/s) V Pic-à-Pic (V)
4687 0.238 1.35 9.6 18.2 0.99 11 181
4688 0.131 1.08 10 8.8 1.11 8 132
4689 0.26 1.26 9.6 21.8 1.9 8.6 237
4690 0.192 4.2 8.3 12.8 n/a n/a n/a
4691 0.213 1.38 10 18.6 6.6 8 153
4693 0.178 1.11 9.6 15.1 8.7 8.3 306

Tableau 1 : Essais électrophysiologiques des IRPC à 3 et 9 mois après la construction. Pour obtenir des CMAPs, une électrode d’enregistrement a été placée sur le muscle avec une électrode stimulante sur le nerf peronal commun proximal. Une série de stimulations augmentant dans l’amplitude a été appliquée au nerf jusqu’à ce que des valeurs maximales de CMAP aient été obtenues et que des résultats enregistrés aient été enregistrés. Une méthodologie semblable a été appliquée à la composante cutanée mais avec l’électrode d’enregistrement placée sur le nerf et l’électrode stimulante sur le derme. Pour l’évaluation sensorielle du rat 4690 à 9 mois, la greffe cutanée s’est avérée trop marquée pour permettre l’essai.

Video 1
Vidéo 1 : Contraction musculaire dans un C-RPNI. Une paire de forceps peut être vu à gauche de la vidéo serrant doucement le nerf peronal commun proximal. Il en résulte une contraction de la composante musculaire d’un C-RPNI de 3 mois qui est visible par le spectateur. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo (Cliquez à droite pour télécharger).

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Discussion

Le C-RPNI est une nouvelle construction qui fournit une amplification simultanée des signaux efferents moteurs d’un nerf cible avec une rétroaction sensorielle afférente. En particulier, le C-RPNI a une utilité unique pour ceux qui vivent avec des amputations proximales que leur moteur et fascicles sensoriels ne peuvent pas facilement être mécaniquement séparés pendant la chirurgie. Au lieu de cela, le C-RPNI utilise les propriétés de réinnervation préférentielles inhérentes du nerf lui-même pour encourager la réinnervation sensorielle de fibre aux organes sensoriels dermiques fin et aux fibres motrices aux jonctions neuromusculaires.

Comme la fabrication de C-RPNI repose sur les capacités de réinnervation du nerf cible, la manipulation soigneuse du nerf est primordiale pendant la procédure. Pendant la dissection, évitez la manipulation directe du nerf cible et le trauma. Si le nerf doit être manipulé, il est recommandé de manipuler l’épineurium ou le tissu conjonctif environnant à la place. Bien que notre laboratoire n’ait pas rencontré la formation de neuromes dans cette construction, théoriquement, le trauma significatif de nerf pourrait augmenter le risque. Une autre étape clé dans le processus est la récolte des greffes cutanées. Tous les tissus épidermiques doivent être retirés de la greffe de patte postérieure car l’épiderme retenu peut augmenter le risque d’infection et de kystes d’inclusion pendant le processus de guérison. En outre, la greffe cutanée doit être suffisamment éclaircie pour favoriser l’imbibition et la revascularisation tout au long de la greffe et éviter l’ischémie et la nécrose significatives.

Bien que la majorité des études menées avec le C-RPNI aient été exécutées sur le nerf peroneal commun, n’importe quel nerf sensorimoteur mélangé pourrait être substitué. Un moteur pur ou un nerf sensoriel pur pourrait être utilisé, mais les résultats sont difficiles à prévoir et entraîneraient probablement une réinnervation musculaire ou cutanée, respectivement. En ce qui concerne la greffe musculaire, tant que l’épimysium est retiré de la partie contactant le nerf, toute greffe musculaire similaire dans la taille pourrait être utilisé tant qu’il contenait tendineux ou tissu fascial à chaque extrémité approprié pour l’ancrage au périosteum à proximité. Pour la greffe cutanée, le tissu glabrous est spécifiquement utilisé en raison du potentiel de croissance des cheveux après la greffe. La peau non-glabrous a été précédemment essayée, mais en raison de la difficulté d’enlever les follicules pileux individuels, toutes les constructions résultantes ont eu la croissance significative de cheveux, l’inflammation, et la cicatrisation après la période de maturation de trois mois. En outre, d’autres espèces de rats peuvent être employées, mais les rats de Lewis et de pêcheur sont recommandés pour cette expérience car beaucoup d’autres espèces de rat s’automutileront secondaire à la transection de nerf39,40.

Étant donné le délai entre la procédure et les résultats, il est difficile de savoir à l’avance si des modifications doivent être apportées à la méthode. L’infection est un risque théorique rarement rencontré par notre laboratoire, mais si l’infection se produit, elle est typiquement sensible aux antibiotiques. De temps en temps, les rats mâchent sur leurs incisions causant la déhiscence, et ceci peut être traité avec le lavage, le débridement, et la re-fermeture. Si, après trois mois au moment de l’exposition, la construction s’est avérée non fonctionnelle et/ou marquée, il y a plusieurs causes potentielles. Parfois, si le nerf n’est pas fixé correctement à la construction avec au moins trois sutures, le nerf peut déchirer de la construction avec la déambulation. En outre, les greffes musculaires et/ou cutanées peuvent necrose, causant l’échec. Typiquement, c’est le résultat d’une infection répétée, la greffe cutanée étant trop épaisse, ou le muscle trop endommagé à la récolte pour récupérer correctement. En outre, si le muscle n’est pas fixé au périosteum à la longueur de repos, la contraction peut être altérée causant des signaux inadéquats pendant l’essai. Parfois, la construction semble viable, mais ne produira pas de CAPS/CSNAPs adéquats lors des essais (5 à 10 % des constructions, en moyenne). Ceci pourrait être secondaire à la défaillance dans l’équipement, à l’empêchement élevé d’électrode, ou à l’appel significatif de peau. L’appel de la peau peut amortir et bloquer complètement la transduction du signal si le derme n’est pas éclairci correctement pendant la fabrication. Si l’un des événements décrits précédemment est fréquemment observé au cours du processus d’essai, il faut revenir au protocole et apporter les modifications appropriées. Dans l’expérience de notre laboratoire avec plus de 90 constructions réussies de C-RPNI, notre taux d’échec est de 'lt;5% et typiquement attribué à l’erreur chirurgicale pendant la fabrication.

Méthodes couramment utilisées pour amplifier ou enregistrer les signaux nerveux comprennent les plaques nerveuses flexibles18, électrodes de manchette extra-neurale19,21,22,23, tissus électrodes pénétrantes24,25,31,32, et électrodes intrafascicular26,27,28, qui ont tous été associés avec des lésions tissulaires, une dégénérescence axonale et/ou une formation de tissu cicatriciel. Cette cicatrice est souvent attribuée à la réponse chronique du corps étrangerhabitation 29 et le stress de cisaillement induit par les différences dans le moduli30de Young . Le C-RPNI, cependant, est une construction biologique et n’induit donc pas la réponse du corps étranger dans le tissu neural. En outre, ses propriétés mécaniques sont plusieurs facteurs plus proches du tissu neural que les électrodes. L’analyse histologique de ces échantillons n’a pas démontré n’importe quel degré significatif de formation de tissu cicatriciel dans le nerf avec l’utilisation chronique, permettant ainsi au C-RPNI d’interfacer avec le nerf pendant des périodes prolongées par rapport aux méthodes énumérées ci-dessus. Bien que cette méthode soit très efficace à l’amplification des signaux moteurs efferents, elle est limitée en ce qui concerne la production sensorielle de signaux afferent. Nous avons mesuré et caractérisé la transduction de signal produite avec la stimulation mécanique et électrique de la composante cutanée du C-RPNI36; cependant, ces sujets de rat ne peuvent pas qualifier le type ou le degré des sensations obtenues de la stimulation de cette construction. En tant que tel, à l’heure actuelle, il est impossible de savoir quel genre d’effet le C-RPNI produit en ce qui concerne la sensation. Les orientations futures de cette construction comprendront la caractérisation des signaux produits dans le nerf proximal suivant des stimuli fournis spécifiques (par exemple, chaleur, douleur, pression, etc.) ainsi que la corrélation avec les potentiels évoqués somatosensoriels générés dans le cortex sensoriel du cerveau des rongeurs. L’objectif de notre laboratoire est d’établir une base complète pour les IRPC qui ouvrira la voie à la traduction clinique aux sujets humains.

Le prédécesseur du C-RPNI, le RPNI (interface nerveuse périphérique régénérative), se compose d’une greffe musculaire libre attachée à un nerf transecté, avec des fibres motrices réinnerélevanant des jonctions neuromusculaires précédemment dénervées. Le RPNI a démontré l’utilité dans les sujets humains, avec plusieurs patients contrôlant des prothèses avancées des signaux amplifiés par-et enregistrés de ces RPNIs34. En outre, ces RPNIs ont démontré des effets bénéfiques de traitement au-delà du contrôle prosthétique, avec plusieurs études rétrospectives et prospectives préliminaires montrant la formation diminuée de neuroma, la douleur chronique, et la douleur fantôme de membre dans ces patients présentant des amputations d’extrémité. En dépit de ces succès, une plainte commune pour ceux utilisant ces prothèses avancées, cependant, est la nécessité de visualiser la prothèse pendant l’utilisation pendant l’utilisation pendant que ces prothèses manquent de proprioception et fournissent la rétroaction sensorielle minimale. Le C-RPNI pourrait être une solution à cette critique commune en fournissant un moyen de fournir une rétroaction sensorielle par l’intermédiaire de la composante cutanée, menant à la réalisation de la prothèse idéale tant désirée.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas de divulgations.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier Jana Moon pour son assistance technique experte. Les études présentées dans ce document ont été financées par une subvention R21 (R21NS104584) à SK.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scalpel Aspen Surgical, Inc Ref 371115 Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15)
4-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 1654G P-3 Reverse Cutting Needle
5-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 687G P-3 Reverse Cutting Needle
6-0 Ethilon Suture Ethicon SKU# 697G P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture)
8-0 Monofilament Suture AROSurgical T06A08N14-13 Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle
Experimental Rats Envigo F344-NH-sd Rats are Fischer F344 Strain
Fluriso (Isofluorane) VetOne 13985-528-40 Inhalational Anesthetic
Micro Motor High Speed Drill with Stone Master Mechanic Model 151369 Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones
Oxygen Cryogenic Gases UN1072 Standard medical grade oxygen canisters
Potassium Chloride APP Pharmaceuticals 63323-965-20 Injectable form, 2 mEq/mL
Povidone Iodine USP MediChoice 65517-0009-1 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps
Puralube Vet Opthalmic Ointment Dechra 17033-211-38 Corneal protective ointment for use during procedure
Rimadyl (Caprofen) Zoetis, Inc. NADA# 141-199 Injectable form, 50 mg/mL
Stereo Microscope Leica Model M60 User can adjust magnification to their preference
Surgical Instruments Fine Science Tools Various User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab
Triple Antibiotic Ointment MediChoice 39892-0830-2 Ointment comes in sterile, disposable packets
VaporStick 3 Surgivet V7015 Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister
Webcol Alcohol Prep Coviden Ref 6818 Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep

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References

  1. Biddiss, E. A., Chau, T. T. Upper limb prosthesis use and abandonment: A survey of the last 25 years. Prosthetics and Orthotics International. 31 (3), 236-257 (2007).
  2. Kung, T. A., et al. Regenerative peripheralnerve interface viability and signal transduction with an implanted electrode. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1380-1394 (2014).
  3. Larson, J. V., et al. Prototype Sensory Regenerative Peripheral Nerve Interface for Artificial Limb Somatosensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3 Suppl), 26-27 (2014).
  4. Hijjawi, J. B., et al. Improved myoelectric prosthesis control accomplished using multiple nerve transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (7), 1573-1578 (2006).
  5. Pylatiuk, C., Schulz, S., Döderlein, L. Results of an Internet survey of myoelectric prosthetic hand users. Prosthetics and Orthotics International. 31 (4), 362-370 (2007).
  6. Baghmanli, Z., et al. Biological and electrophysiologic effects of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) on regenerating peripheral nerve fibers. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (2), 374-385 (2013).
  7. Dhillon, G. S., Horch, K. W. Direct neural sensory feedback and control of a prosthetic arm. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 13 (4), 468-472 (2005).
  8. Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinos, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
  9. O'Doherty, J., et al. Active tactile exploration using a brain-machine-brain interface. Nature. 479, 228-231 (2011).
  10. Stein, R. B., Walley, M. Functional comparison of upper extremity amputees using myoelectric and conventional prostheses. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 64 (6), 243-248 (1983).
  11. Millstein, S. G., Heger, H., Hunter, G. A. Prosthetic Use in Adult Upper Limb Amputees: A Comparison of the Body Powered and Electrically Powered Prostheses. Prosthetics and Orthotics International. 10 (1), 27-34 (1986).
  12. Zollo, L., et al. Restoring tactile sensations via neural interfaces for real-time force-and-slippage closed-loop control of bionic hands. Science Robotics. 4 (27), eaau9924 (2019).
  13. Tan, D. W., et al. A neural interface provides long-term stable natural touch perception. Science Translational Medicine. 6 (257), 257ra138 (2014).
  14. Stieglitz, T., et al. On Biocompatibility and Stability of Transversal Intrafascicular Multichannel Electrodes-TIME. Converging Clinical and Engineering Research on Neurorehabilitation II. 15, 731-735 (2017).
  15. Petrini, F. M., et al. Six-months assessment of a hand prosthesis with intraneural tactile feedback. Annals of Neurology. 85 (1), 137-154 (2019).
  16. Jung, R., Abbas, J., Kuntaegowdanahalli, S., Thota, A. Bionic intrafascicular interfaces for recording and stimulating peripheral nerve fibers. Bioelectronics in Medicine. 1 (1), 55-69 (2018).
  17. Micera, S., Navarro, X., Yoshida, K. Interfacing With the Peripheral Nervous System to Develop Innovative Neuroprostheses. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (5), 417-419 (2009).
  18. Stieglitz, T., Schuettler, M., Schneider, A., Valderrama, E., Navarro, X. Noninvasive measurement of torque development in the rat foot: measurement setup and results from stimulation of the sciatic nerve with polyimide-based cuff electrodes. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 11 (4), 427-437 (2003).
  19. Polasek, K. H., Hoyen, H. A., Keith, M. W., Tyler, D. J. Human nerve stimulation thresholds and selectivity using a multi-contact nerve cuff electrode. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 15 (1), 76-82 (2007).
  20. Nielson, K. D., Watts, C., Clark, W. K. Peripheral nerve injury from implantation of chronic stimulating electrodes for pain control. Surgical Neurology. 5 (1), 51-53 (1976).
  21. Waters, R. L., McNeal, D. R., Faloon, W., Clifford, B. Functional electrical stimulation of the peroneal nerve for hemiplegia. Long-term clinical follow-up. Journal of Bone and Joint Surgery. 67 (5), 792-793 (1985).
  22. Larsen, J. O., Thomsen, M., Haugland, M., Sinkjaer, T. Degeneration and regeneration in rabbit peripheral nerve with long-term nerve cuff electrode implant: a stereological study of myelinated and unmyelinated axons. Acta Neuropathologica. 96 (4), 365-378 (1998).
  23. Krarup, C., Loeb, G. E., Pezeshkpour, G. H. Conduction studies in peripheral cat nerve using implanted electrodes: III. The effects of prolonged constriction on the distal nerve segment. Muscle Nerve. 12 (11), 915-928 (1989).
  24. Micera, S., Navarro, X. Bidirectional interfaces with the peripheral nervous system. International Review of Neurobiology. 86, 23-38 (2009).
  25. Urbanchek, M. G., et al. Microscale Electrode Implantation during Nerve Repair: Effects on Nerve Morphology, Electromyography, and Recovery of Muscle Contractile Function. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (4), 270e-278e (2011).
  26. Yoshida, K., Horch, K. Selective stimulation of peripheral nerve fibers using dual intrafascicular electrodes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (5), 492-494 (1993).
  27. Branner, A., Stein, R. B., Normann, R. A. Selective stimulation of cat sciatic nerve using an array of varying length microelectrodes. Journal of Neurophysiology. 85 (4), 1585-1594 (2001).
  28. Zheng, X. J., Zhang, J., Chen, T., Chen, Z. Longitudinally implanted intrascicular electrodes for stimulating and recording fascicular physioelectrical signals in the sciatic nerve of rabbits. Microsurgery. 23, 268-273 (2003).
  29. del Valle, J., Navarro, X. Interfaces with the peripheral nerve for the control of neuroprostheses. International Review of Neurobiology. 109, 63-83 (2013).
  30. Stiller, A. M., et al. A Meta-Analysis of Intracortical Device Stiffness and Its Correlation with Histological Outcomes. Micromachines. 9 (9), 443 (2018).
  31. Hanson, T., Diaz-Botia, C., Kharazia, V., Maharbiz, M., Sabes, P. The "sewing machine" for minimally invasive neural recording. bioRxiv. , Published online (2019).
  32. Yang, X., et al. Bioinspired neuron-like electronics. Nature Materials. 18, 510-517 (2019).
  33. Irwin, Z. T., et al. Chronic recording of hand prosthesis control signals via a regenerative peripheral nerve interface in a rhesus macaque. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046007 (2016).
  34. Kubiak, C. A., et al. Abstract 24: Successful Control of Virtual and Robotic Hands using Neuroprosthetic Signals from Regenerative Peripheral Nerve Interfaces in a Human Subject. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (4), 19-20 (2018).
  35. Sando, I. C., et al. Dermal-Based Peripheral Nerve Interface for Transduction of Sensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4 Suppl), 19-20 (2015).
  36. Kubiak, C. A., et al. Abstract 36: Viability and Signal Transduction with the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI). Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4), 26-27 (2019).
  37. Kubiak, C. A., et al. Abstract QS18: Neural Signal Transduction with the Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4 Suppl), 114 (2019).
  38. Woo, S. L., et al. Utilizing nonvascularized partial skeletal muscle grafts in peripheral nerve interfaces for prosthetic control. Journal of the American College of Surgeons. 219 (4), e136-e137 (2014).
  39. Sporel-Özakat, R. E., Edwards, P. M., Hepgul, K. T., Savas, A., Gispen, W. H. A simple method for reducing autotomy in rats after peripheral nerve lesions. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 263-265 (1991).
  40. Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).

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Bioingénierie Numéro 156 interface nerveuse périphérique contrôle prothétique C-RPNI système de rétroaction neuronale
Fabrication de l’interface nerveuse périphérique régénératrice composite (C-RPNI) chez le rat adulte
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Svientek, S. R., Ursu, D. C.,… More

Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (156), e60841, doi:10.3791/60841 (2020).

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