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Bioengineering

Herstellung der Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in der Erwachsenenratte

Published: February 25, 2020 doi: 10.3791/60841

Summary

Das folgende Manuskript beschreibt eine neuartige Methode zur Entwicklung eines biologischen, geschlossenen neuronalen Feedbacksystems, das als zusammengesetzte regenerative periphere Nervenschnittstelle (C-RPNI) bezeichnet wird. Dieses Konstrukt hat die Fähigkeit, mit peripheren Nerven zu integrieren, um effelösenmotorische Signale zu verstärken und gleichzeitig eine affete sensorische Rückmeldung zu liefern.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der Neuroprothetik haben es Menschen mit Extremitätsverlust ermöglicht, viele Funktionen zu reproduzieren, die in der fehlenden Extremität heimisch sind, und dies wird oft durch die Integration mit dem peripheren Nervensystem erreicht. Leider sind derzeit angewandte Methoden oft mit erheblichen Gewebeschäden verbunden, die eine längere Anwendung verhindern. Darüber hinaus fehlt es diesen Geräten oft an einem aussagekräftigen Grad an sensorischem Feedback, da ihre komplexe Konstruktion Vibrationen oder andere Empfindungen dämpft, von denen ein Benutzer zuvor bei der Verwendung einfacherer Prothesen abhängig gewesen sein könnte. Die composite regenerative periphere Nervenschnittstelle (C-RPNI) wurde als stabiles, biologisches Konstrukt entwickelt, das effetierische motorische Nervensignale verstärken und gleichzeitig eine sensorische Rückmeldung liefern kann. Das C-RPNI besteht aus einem Segment von freiem dermalen und Muskeltransplantat, das um einen gezielten gemischten sensorimotorischen Nerv gesichert ist, mit bevorzugter motorischer Nervenreinnervation des Muskeltransplantats und sensorischer Nervenreinnervation des dermalen Transplantats. Bei Ratten hat dieses Konstrukt die Erzeugung von zusammengesetzten Muskelaktionspotentialen (CMAPs) demonstriert, die das Signal des Zielnervs vom Mikro- bis Millivolt-Niveau verstärken, mit Signal-Rausch-Verhältnissen von durchschnittlich etwa 30-50. Die Stimulation der dermalen Komponente des Konstrukts erzeugt zusammengesetzte sensorische Nervenaktionspotentiale (CSNAPs) am proximalen Nerv. Als solches hat dieses Konstrukt vielversprechende zukünftige Nützlichkeit für die Realisierung der idealen, intuitiven Prothese.

Introduction

Extremitätamputationen betreffen fast 1 von 190 Amerikanern1, und ihre Prävalenz wird voraussichtlich von 1,6 Millionen heute auf über 3,6 Millionen bis 20502 steigen. Trotz dokumentierter Verwendung seit über einem Jahrtausend muss die ideale Prothese noch realisiert werden3. Derzeit gibt es komplexe Prothesen, die mehrere Gelenkmanipulationen mit dem Potenzial haben, viele motorische Funktionen der nativen Extremität4,5zu reproduzieren. Diese Geräte werden jedoch nicht als intuitiv betrachtet, da die gewünschte prothetische Bewegung in der Regel funktional vom Eingangssteuersignal getrennt ist. Benutzer betrachten diese "fortgeschrittene Prothetik" in der Regel als schwer zu erlernen und daher nicht für den täglichen Gebrauchgeeignet 1,6. Darüber hinaus bieten komplexe Prothesen, die derzeit auf dem Markt sind, keinen nennenswerten Grad an subtilem sensorischem Feedback für eine angemessene Kontrolle. Der Tastsinn und propriozeption sind entscheidend für die Durchführung täglicher Aufgaben, und ohne diese, einfache Handlungen wie das Abholen einer Tasse Kaffee werden belastend, da es vollständig auf visuelle Hinweise7,8,9. Aus diesen Gründen sind fortgeschrittene Prothesen mit einem erheblichen Grad an geistiger Ermüdung verbunden und werden oft als belastend und unbefriedigend beschrieben5,10,11. Um dies zu beheben, haben einige Forschungslabore Prothesen entwickelt, die in der Lage sind, ein begrenztes Maß an sensorischem Feedback über direkte neuronale Interaktion12,13,14,15, aber Feedback ist oft auf kleine, verstreute Bereiche an Händen und Fingern beschränkt12,13, und Empfindungen wurden festgestellt, schmerzhaft und unnatürlich manchmal15. Viele dieser Studien mangelt es leider an nennenswerten Langzeit-Follow-up und Nervenhistologie, um lokale Gewebeeffekte abzuleiten, während Schnittstellenversagen auf der Skala von Wochen bis Monaten16.

Für diese Population würde das ideale Prothesengerät eine hochpräzise Motorsteuerung bieten und gleichzeitig sinnvolles somatosensorisches Feedback aus der Umgebung des Einzelnen während seines gesamten Lebens bieten. Entscheidend für das Design dieser idealen Prothese ist die Entwicklung einer stabilen, zuverlässigen Schnittstelle, die eine gleichzeitige Übertragung von afferent somatosensorischen Informationen mit efferentmotorischen Signalen ermöglichen würde. Die vielversprechendsten der aktuellen Mensch-Maschine-Schnittstellen sind diejenigen, die direkt mit dem peripheren Nervensystem interagieren, und die jüngsten Entwicklungen auf dem Gebiet der neurointegrierten Prothetik haben darauf hingearbeitet, die Lücke zwischen bioelektrischen und mechanischen Signalen zu überbrücken17. Zu den verwendeten Stromschnittstellen gehören: flexible Nervenplatten14,15,18, extraneurale Manschettenelektroden13,19,20,21,22,23, Gewebe durchdringende Elektroden24,25,31,32und intrafascicular elektroden26,27 ,28. Jedoch, jede dieser Methoden hat Einschränkungen in Bezug auf Nervenspezifität, Gewebeverletzung, axonale Degeneration, Myelin-Erschöpfung und/oder Narbengewebebildung im Zusammenhang mit chronischer Indwelling Fremdkörperreaktion16,17,18,19gezeigt. In jüngerer Zeit wurde postuliert, dass ein Treiber hinter einem eventuellen implantierten Elektrodenversagen der signifikante Unterschied in Youngs Moduli zwischen elektronischem Material und nativem Neuronusgewebe ist. Gehirngewebe unterliegt einer signifikanten Mikrobewegung auf einer täglichen Basis, und es wurde theoretisiert, dass die Scherspannung durch Unterschiede in Youngs Moduli induziert verursacht Entzündungen und schließlich dauerhafteNarbenbildung 30,31,32. Dieser Effekt wird oft in den Extremitäten verstärkt, wo periphere Nerven sowohl physiologischen Mikrobewegungen als auch absichtlicher Extremitätsmakrobewegung ausgesetzt sind. Aufgrund dieser konstanten Bewegung ist es vernünftig, zu dem Schluss zu kommen, dass die Nutzung einer vollständig abiotischen peripheren Nervenschnittstelle nicht ideal ist und eine Schnittstelle mit einer biologischen Komponente besser geeignet wäre.

Um diesem Bedarf an einer biologischen Komponente gerecht zu werden, entwickelte unser Labor eine biotische Nervenschnittstelle mit dem Begriff Regenerative Periphere Nervenschnittstelle (RPNI), um transsektierte periphere Nerven in eine Restgliedmaße mit einem Prothesengerät zu integrieren. Die RPNI-Fertigung beinhaltet die chirurgische Implantation eines peripheren Nervs in ein autologes freies Muskeltransplantat, das sich anschließend vaskularisiert und reinnervatiert. Unser Labor hat diese biologische Nervenschnittstelle in den letzten zehn Jahren entwickelt, mit Erfolg bei der Verstärkung und Übertragung von motorischen Signalen in Kombination mit implantierten Elektroden in Tier- und Humanversuchen, die eine geeignete prothetische Kontrolle mit mehreren Freiheitsgraden2,34ermöglichen. Darüber hinaus haben wir die sensorische Rückkopplung durch die Verwendung von peripheren Nerven, die in dermalen Transplantaten eingebettet sind, die als Dermal Sensory Interface (DSI)3,35bezeichnet. Bei distaleren Amputationen ist die gleichzeitige Verwendung dieser Konstrukte möglich, da motorische und sensorische Faszikel innerhalb des Zielperipherienervs operativ getrennt werden können. Bei proximaleren Amputationen ist dies jedoch aufgrund der Vermischung von Motor- und Sensorfasern nicht möglich. Die Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) wurde für proximale amputationen entwickelt und beinhaltet die Implantation eines gemischten sensorimotorischen Nervs in ein Konstrukt, das aus freiem Muskeltransplantat besteht, das an einem Segment des dermalen Transplantats befestigt ist (Abbildung 1). Periphere Nerven zeigen bevorzugte gezielte Reinnervation, so dass sensorische Fasern das dermale Transplantat und die Motorfasern, das Muskeltransplantat, wieder verinnerlichten. Dieses Konstrukt hat somit die Fähigkeit, motorische Signale gleichzeitig zu verstärken und gleichzeitig somatosensorisches Feedback36 (Abbildung 2) bereitzustellen, was die Realisierung der idealen, intuitiven, komplexen Prothese ermöglicht.

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Protocol

Alle Tierversuche werden mit Genehmigung des Committee on the Use and Care of Animals der University of Michigan durchgeführt.

HINWEIS: Spenderratten haben freien Zugang zu Nahrung und Wasser vor haut- und Muskelspendeverfahren. Euthanasie wird unter tiefer Anästhesie durchgeführt, gefolgt von einer intrakardialen Kaliumchlorid-Injektion mit einer sekundären Methode des bilateralen Pneumothorax. Jeder Rattenstamm kann theoretisch mit diesem Experiment verwendet werden; unser Labor hat jedoch im Alter von zwei bis vier Monaten konsistente Ergebnisse sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Fischer F344 Ratten (200-250 g) erzielt. Spenderratten müssen für die Versuchsratten isisersein.

1. Zubereitung des dermalen Transplantats

  1. Anästhetisieren Spenderratte in einer Induktionskammer unter Verwendung einer Lösung von 5% Isofluran in Sauerstoff bei 0,8-1 L/min. Sobald die Ratte anästhesiert wurde, aus der Induktionskammer entfernen und auf einen reatmenden Nasenkegel legen, das Isofluran auf 2-2,5% zur Aufrechterhaltung der Anästhesie senken.
  2. Eine Lösung von 0,02-0,03 ml Carprofen (50 mg/ml) in 0,2 ml steriler Saline subkutan zwischen den Schulterblättern für Analgesie.
  3. Tragen Sie künstliche Tränen Salbe auf beide Augen, um Hornhautgeschwüre zu verhindern.
  4. Rasieren Sie mit Clippers die gesamte untere Hinterbeine, den Knöchelbereich und die Seiten der Pfoten.
  5. Reinigen Sie die gewählte Hinterglieds- und Plantaroberfläche der Pfote mit Alkohol, gefolgt von iodopovidon Lösung, die mit einer endgültigen Reinigung mit Alkohol endet, um Rest-Iodopovidon zu entfernen.
  6. Mit einem handgehaltenen Mikromotor-Hochgeschwindigkeitsbohrer mit einem abnehmbaren runden Feinkorn-Polierstein (4000 Umdrehungen pro Minute) gratumten Sie die Plantaroberfläche der Pfote, um die Epidermis zu entfernen. Während des Grabens, tropfen der Wäsche, um nicht die Haut zu verbrennen. Die zugrunde liegende Dermis wird ein glänzendes Aussehen mit punktgenauen Blutungen haben.
  7. Tragen Sie ein Tourniquet auf die untere Extremität auf, um den Blutfluss zu verlangsamen.
  8. Entfernen Sie die Plantaderhaut scharf mit einem #15 Skalpell und legen Sie sie in salzsäurebefeuchtete Gaze, um austrocknung zu verhindern. Einige Sehnen- und Bindegewebe werden von Natur aus mit der Haut in diesem Schritt entfernt und später entfernt.
  9. Tragen Sie Gaze wrap auf den blutenden Fuß auf langsame Blutungen auf. Wiederholen Sie die Schritte 1.5-1.9, wenn Sie zwei Konstrukte ausführen.
  10. Entfernen Sie unter dem Mikroskop (20-fache Vergrößerung) das Pflegende und Bindegewebe mit einer Mikroschere aus der tiefen Schicht des Hauttransplantats. Achten Sie darauf, keine Löcher im Transplantat zu machen. Das verdünnte dermale Transplantat sollte leicht opak sein und nur Dermis enthalten und etwa 0,5 cm x 1,0 cm groß sein.
  11. In saline-befeuchteter Gaze geben, bis sie für die C-RPNI-Konstruktionsfertigung bereit sind. Grafts sollten innerhalb von 2 Stunden nach der Ernte verwendet werden.

2. Vorbereitung des Muskeltransplantats

  1. Machen Sie einen Längsschnitt entlang des vorderen Aspekts des unteren Hinterglieds von knapp über dem Knöchel bis knapp unterhalb des Knies mit einem #15 Skalpell. Sezieren Sie durch subkutanes Gewebe, um die zugrunde liegende Muskulatur zu entlarven.
  2. Am distalen Aspekt des Schnittes, entlarven Sie die tendenziösen Einfügungen der unteren Gliedmaßenmuskulatur. Tibialis anterior (TA) ist typischerweise der größte und vordere der Muskeln, und direkt unter und hinter diesem Muskel liegt der Extensor digitorum longus (EDL). Isolieren Sie die distale EDL-Sehne von den anderen Sehnen in der Gegend, wobei darauf geachtet wird, dass sie an dieser Stelle nicht in die Einfügung eingreift.
  3. Gewährleisten Sie die Isolierung der richtigen Sehne, indem Sie beide Dosen einer Zange unter die Sehne einsetzen und einen Aufwärtsdruck ausüben, indem Sie die Zange öffnen, um einen Sehnenausflug zu verursachen. Die Manipulation dieser Sehne sollte dazu führen, dass sich alle Zehen gleichzeitig ausdehnen.
  4. Führen Sie eine distale Tenotomie mit scharfer Irisschere durch und trennen Sie den Muskel von den umgebenden Geweben unverblümt mit Tenotomien (oder einer anderen stumpf-spitzen Schere), die proximal arbeiten, um den pflegenden Ursprung zu finden.
  5. Sobald die proximale Sehne visualisiert ist, führen Sie wieder eine Tenotomie mit scharfen Irisschere. Legen Sie das Muskeltransplantat in eine salzbefeuchtete Gaze, um Austrocknung zu verhindern.
  6. Sobald alle gewünschten Transplantate von einer Spenderratte entfernt wurden, werden Sie in erster Linie durch intrakardiale KCl-Injektion (1-2 mEq K+/kg) eingeschläfert, gefolgt von sekundärer Euthanasie mit bilateraler Punktionspneumothorax mit #15 Klinge.

3. Häufige peronesale Nervenisolierung und -zubereitung

  1. Anästhetisieren und analgesien der experimentellen Ratte gemäß Protokoll in den Schritten 1.1-1.3.
  2. Rasieren Sie den gewünschten Oberschenkel und reinigen Sie mit Alkohol, Betadin, Endmit Alkohol, um Spuren von Betadin zu entfernen.
  3. Bewegen Sie das Tier vom chirurgischen Vorbereitungstisch zum chirurgischen Mikroskoptisch und legen Sie es auf das Heizkissen mit Temperaturfühler für die Körpertemperaturerhaltung. Halten Sie Isofluran bei 2-2,5% und Sauerstoff bei 0,8-1 L/min.
  4. Markieren Sie den Schnitt, der sich von nur distaler bis ischitischer Kerbe bis zum unteren Teil des Knies erstreckt. Diese Markierung sollte dem Oberschenkelknochen unterlegen und abgewinkelt sein. Machen Sie den Schnitt mit einer #15 Klinge, die durch den zugrunde liegenden Bizeps femoris fascia einführt.
  5. Sezieren Sie vorsichtig durch den Bizeps femoris Muskel mit entweder einem Hämostat oder stumpf-kipped Mikroschere zu dem Raum zugrunde liegenden bizeps femoris.
    HINWEIS: Der Ischiasnerv bewegt sich ungefähr in die gleiche Richtung wie der ursprüngliche Schnitt, der gemacht wurde. Es gibt drei Zweige, in der Regel mit suralen Nerven posterior und gemeinsamen peronealen und tibialen Nerven reisen oberflächlich und tief zum Knie, bzw.
  6. Nach der Identifizierung des gemeinsamen peronealen (CP) Nervs, mit einem Paar mikro-, fein-tipped Zange und Mikroschere, sorgfältig isolieren den CP-Nerv von den anderen Ischiaszweigen und entfernen Sie alle verweilenden Bindegewebe distal.
  7. An der Stelle, an der der Nerv die Oberfläche des Knies kreuzt, schneiden Sie den Nerv mit einer Mikroschere scharf ab.
    HINWEIS: Die Verwendung einer scharfen Schere ist in diesem Schritt äußerst wichtig, da die Ursache eines signifikanten Traumas des Nervs das Risiko einer Neurombildung erhöhen könnte.
  8. Befreien Sie vorsichtig das verbleibende Bindegewebe vom CP-Nerv und arbeiten Sie proximal, um den Nerv auf eine Länge von ca. 2 cm zu befreien.

4. C-RPNI-Konstruktionsfertigung

  1. Entfernen Sie das Muskeltransplantat aus der saline-befeuchteten Gaze und entfernen Sie alle zentralen Sehnengewebe sowie ein kleines zentrales Segment von Epimysium. Lassen Sie die sehnenförmigen Enden intakt.
  2. Verwenden eines 8-0 Nylon-Nähte, sichern Sie das Epineurium des transectierten Endes des CP-Nerven in den Bereich des Muskeltransplantats ohne Epimysium mit zwei unterbrochenen Stichen auf beiden Seiten des Nervs.
  3. Sichern Sie das Muskeltransplantat an der Oberschenkelmur periosteum mit einem einzigen 6-0 Nylon unterbrochen Stich sowohl proximal und distally mit dem Nerven-Muskel-Kreuzung weg vom Oberschenkelknochen.
    HINWEIS: Sichern Sie den Muskel so, dass er in normaler entspannter Länge ist. Versuchen Sie nicht, den Muskel deutlich zu dehnen oder lassen Sie zu viel Laxheit bei der Sicherung.
  4. Platzieren Sie eine 8-0 Nylonstich am unteren, zentralen Rand des Muskeltransplantats Epimysium, Sicherung an das CP-Nervenepineurium in einer Weise, die Laxheit im Nerv innerhalb des Muskeltransplantats zu schaffen und helfen, zukünftige Spannungen zu lindern, die es mit späterer Ambulation ausgesetzt sein kann.
  5. Entfernen Sie das Hauttransplantat aus der saline-befeuchteten Gaze und ordnen Sie es auf dem Muskeltransplantat so an, dass der Nerv und die Mehrheit des Muskels vollständig abgedeckt werden. Stellen Sie sicher, dass der tiefe Rand der Dermis auf dem Muskel ruht. Trimmen Sie jede Dermis, die über die Grenze des Muskels hinausreicht.
  6. Sichern Sie das Hauttransplantat mit 8-0 umlaufend am Muskeltransplantat Nylon unterbrochene Nähte. In der Regel werden je nach Größe des Konstrukts insgesamt 4-8 Nähte verwendet.
  7. Schließen Sie den Bizeps femoris fascia über dem Konstrukt in laufender Weise mit 5-0 chromische Naht.
  8. Schließen Sie die darüber liegende Haut mit 4-0 chromischen Naht in Laufen.
  9. Den Operationsbereich mit einem Alkoholpad abwischen und Antibiotikum salbe auftragen.
  10. Beenden Sie das inhalative Anästhetikum und lassen Sie ratten sich mit Nahrung und Wasserquellen erholen, die von Käfigkameraden getrennt sind.

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Representative Results

Konstruktherstellung gilt als erfolglos, wenn Ratten eine Infektion entwickeln oder die chirurgische Anästhesie nicht überleben. Frühere Forschungen haben gezeigt, dass diese Konstrukte etwa drei Monate benötigen, um zu rekonveraskieren und reinnervate2,3,17,36. Nach ablaufder dreimonatiger Erholungsphase können Konstrukttests durchgeführt werden, um die Lebensfähigkeit zu prüfen. Chirurgische Exposition der Konstrukte nach drei Monaten wird revaskularisierten Muskel und Haut offenbaren, wenn erfolgreich (Abbildung 3). Manchmal können die freien Muskeln und dermalen Transplantate ausschließlich aus Narbengewebe bestehen, und/oder der Nerv wird nicht am Konstrukt befestigt; diese Ergebnisse deuten auf einen erfolglosen Versuch hin. Im Erfolgsfalle führt jedoch ein sanftes Drücken des gemeinsamen Peronealnervs mit Zangen proximal zum Konstrukt zu einer sichtbaren Muskelkontraktion (Video 1). Die histologische Analyse von Konstrukten sollte lebensfähige Haut, Nerven und Muskeln nachweisen (Abbildung 4). Die Immunostainierung zeigt auch die motorische und sensorische Nervenreinnervation an ihren neuromuskulären Knoten bzw. sensorischen Endorganen (Abbildung 5). Wenn der gemeinsame Peronealnerv diese Gewebe nicht wieder aufleben lässt, zeigt die Immunfärbung keine einzelnen Nervenfasern innerhalb des Konstrukts mit Ausnahme des implantierten Nervs selbst.

An diesen Konstrukten können elektrophysiologische Tests in vivo durchgeführt werden (Abbildung 6); Frühere Untersuchungen wurden 3 und 9 Monate nach der C-RPNI-Fertigung36 (Tabelle 1) durchgeführt. Nach maximaler Stimulation mit einer Hakenelektrode am proximalen peronealen Peronealnerv, der nur distal zu seinem Start vom Ischiasnerv ist, können zusammengesetzte Muskelaktionspotentiale (CMAPs) an der Muskelkomponente mit sichtbarer Muskelkontraktion gemessen werden. Die Art der Elektrode, die am Muskel verwendet wird, kann je nach Präferenz variieren, aber epimysialpatch, epimysial pad und bipolare Sondenelektroden wurden erfolgreich in dieser Forschung verwendet. Die durchschnittliche CMAP-Amplitude, die am Muskel gemessen wurde, betrug 8,7 x 1,6 mV bei 3 Monaten und 10,2 x 2,1 mV bei 9 Monaten. Die durchschnittliche Leitungsgeschwindigkeit betrug 10 x 1,2 m/s bei 3 Monaten und 9,5 x 0,6 m/s bei 9 Monaten. Im Vergleich, CMAPs von physiologischen EDL-Muskel erzeugt in der Regel reichen von 10-18 mV37. Nach der Stimulation an der dermalen Komponente des C-RPNI wurden am proximalen gemeinsamen Peronealnerv zusammengesetzte sensorische Nervenaktionspotentiale (CSNAPs) mit einer durchschnittlichen CSNAP-Amplitude von 113,7 x 35,1 V bei 3 Monaten und 142,9 bei 63,7 V bei 9 Monaten erzeugt. Abbildung 7 zeigt Ein- und Summationssignale von CMAP und CSNAP, die während elektrophysiologischer Tests in einem grafischen Format erhalten wurden.

Das C-RPNI dient dazu, das inhärente Mikrovoltsignal eines Nervs zu verstärken, und frühere Forschungen haben eine ausreichende Verstärkung vom Mikrovolt- zum Millivolt-Pegel38gezeigt. Wenn ein Konstrukt diese Verstärkungsstufe nicht vorsieht, wird es daher nicht als erfolgreich angesehen. Wenn entweder die dermalen, Muskel, oder beide Komponenten des C-RPNI scheitern, Tests würden in Aufzeichnungen führen, die das Stimulationssignal imitieren verwendet. Speziell für die Muskelkomponente wäre ein suboptimales Ergebnis (aber eines, das immer noch als betriebsbereit gilt) ein Ergebnis, das CMAP-Amplitude und Leitungsgeschwindigkeit im Bereich hat, der zwischen dem Signalstimulationswert und dem des physiologischen EDL-Muskels liegt. Darüber hinaus können diese Signale abgeschwächt werden und fehlen die charakteristische CMAP-Wellenform (Abbildung 8A). Suboptimale Ergebnisse auf der Ebene der dermalen Komponente können auftreten, sind aber schwer zu quantifizieren, da Ratten die Qualität der Empfindung, die sie erleben, nicht ausdrücken können. Diese suboptimalen Ergebnisse beinhalten in der Regel eine Dämpfung der Wellenform mit signifikantem Hintergrundrauschen (Abbildung 8B). Wenn jedoch signifikante Narbenbildung oder Callusing des Hauttransplantats vorhanden ist oder minimaletransplantate überleben, werden keine CSNAPs am proximalen gemeinsamen Peronealnerv unabhängig vom Stimulationswert geschätzt.

Figure 1
Abbildung 1: Illustrative Sschemata des C-RPNI-Konstrukts. Der gemeinsame Peronealnerv kann zwischen der oberen dermalen Schicht und der unteren Muskelschicht gesichert gesehen werden. Dieses Konstrukt ist über die sehnenförmigen Knoten der EDL proximal und distal am Oberschenkelperiosteum befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Eine bildliche Darstellung des C-RPNI bei einem Patienten mit einer transradialen Amputation. Der Anwender bildet eine gewünschte motorische Absicht auf zerebraler Ebene (z.B. Zangengriff), die als effektes Motorsignal über den implantierten Peripherienerv an das C-RPNI übertragen wird. Dieses Signal erzeugt ein zusammengesetztes Muskelaktionspotential (CMAP) an der Muskelkomponente, das von implantierten Elektroden aufgezeichnet und von der Prothesenvorrichtung erkannt wird, wodurch die gewünschte Bewegung erzeugt wird. Sensoren an den Fingerspitzen des Geräts erkennen die erzeugte Druckmenge und leiten diese Informationen an eine Elektrode weiter, die in die dermale Komponente des C-RPNI implantiert wurde. Diese Signale aktivieren die entsprechenden sensorischen Endorgane und erzeugen ein afferent Compound sensorisches Nervenaktionspotential (CSNAP), das durch den peripheren Nerv an den sensorischen Kortex übertragen wird. Ein Beispielsignal, das an jeder Komponente generiert wird, ist in den blauen Feldern neben jeder Komponente abgebildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: C-RPNI in vivo. (A) Ein C-RPNI unmittelbar nach der Herstellung und bei (B) 3 Monate nach dem Bau zum Zeitpunkt der elektrophysiologischen Prüfung. Die Muskelkomponente ist die tiefe Schicht des Konstrukts und die dermale, die oberflächliche. Muskelgewebe ist gekennzeichnet durch (M), Dermis (D) und gemeinsamen Peronealnerv (N). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: C-RPNI Histologie 6 Monate. C-RPNI H&E nach 6 Monaten im (A) Querschnitt und (B) Längsschnitt. Muskel notiert durch (M), Dermis (D) und Nerven (N). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Immunostainierung des C-RPNI. (A) Repräsentatives Beispiel für einen Querschnitt von Muskelgewebe, mit roten Pfeilen, die neuromuskuläre Knoten identifizieren. Eine höhere Vergrößerung der zentralen neuromuskulären Kreuzung (NMJ) ist unten rechts abgebildet. (B) Nahaufnahme einer neuromuskulären Kreuzung, die in der Probe festgestellt wurde. Für (A) und (B) weist rote Färbung (Alpha-Bungarotoxin) auf das Vorhandensein cholinerger Rezeptoren im Muskelgewebe hin; blau (Neurofilament 200) gibt das Vorhandensein von Neurofilamenten im neuronalen Gewebe an; und grün (Cholin Acetyltransferase) notiert speziell motorische Neuron Präsenz. (C) Repräsentatives Beispiel für ein iDISCO-Bild, das sich auf die dermale Kreuzung konzentriert, wobei rote Pfeile sensorische Neuronen (weiß) markieren, die in die Dermis eindringen. (D) On-Lay-Ansicht von iDISCO, die mehrere sensorische Neuronen demonstriert (weiß, Neurofilament 200). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Elektrophysiologische Tests schematisch. Das obere Bild ist eine Illustration der Standard-Elektrodenanordnung zum Testen der C-RPNI-Konstrukte. Es gibt eine Patch- und/oder Sondenelektrode, die sowohl auf die Muskel- als auch auf die dermalen Komponenten des C-RPNI gelegt wird, wobei eine Doppelhakenelektrode proximal am gemeinsamen Peronealnerv platziert wird. Das untere Bild ist ein in vivo Beispiel für die Testanordnung an einem Rattensubjekt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: Typische elektrophysiologische C-RPNI-Signalisierung. (A) Ein einzelnes CMAP-Signal, das an der Muskelkomponente nach einem 5,00 mA-Signal auf den CP-Nerv aufgezeichnet wurde. (B) 24 CMAPs, die durch 5,00 mA Stimulation am Nerv erzeugt werden. (C) Ein einzelnes CSNAP-Signal, das vom proximalen CP-Nerv nach dermalen Komponentenstimulation bei 900 A aufgezeichnet wurde. (D) Eine Reihe von CSNAPs, die vom proximalen CP-Nerv nach zunehmender Stimulation an der dermalen Komponente von 500 auf 1000 A aufgezeichnet wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: Abnormale C-RPNI-Signalisierung. (A) Eine Reihe von CMAPs, die während der Amping-CP-Nervenstimulation von 0,2 bis 4 mA erreicht wurden. Wellenformen spitzen an verschiedenen Punkten an und kehren nicht zur Basislinie zurück, was möglicherweise auf defekte Elektroden oder eine unzureichende Gesamtkonstruktfunktion hinweist. (B) Summation von CSNAPs, die bei der Stimulierung dermaler Komponente erreicht wurden und 0,1 bis 5 mA ansteigen. Diese Befunde können aus einer Vielzahl von Gründen auftreten, einschließlich Fehlfunktionen der Elektrode(n), dermaler Transplantatnarben und/oder Nervenschäden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

3 Monatsdaten CMAP-Daten (Stimulieren Sie den CP-Nerv und zeichnen Sie aus Muskeltransplantat auf) CSNAP-Daten (Stimulieren Sie Hauttransplantat und Aufzeichnung von CP-Nerven)
Ratten-ID-Nummer KonstruktGewicht (g) Stimulationsamplitude (mA) Leitungsgeschwindigkeit (m/s) V Peak-to-Peak (mV) Stimulationsamplitude (mA) Leitungsgeschwindigkeit (m/s) V Peak-to-Peak (V)
4607 0.087 4.17 11.3 10.3 18 11.1 121
4608 0.15 1.65 11.1 17.1 7.7 6.5 136
4611 0.113 8.3 9.6 11.2 10 10 121
4613 0.116 3.18 10 9.6 1.44 8.3 134
4614 0.189 3 10.8 9.6 7.39 9 151
4616 0.122 5.2 9.4 14.9 1.8 9.1 100
4620 0.118 2.91 7.6 7.4 8.7 10 219
9 Monatsdaten CMAP-Daten (Stimulieren Sie den CP-Nerv und zeichnen Sie aus Muskeltransplantat auf) CSNAP-Daten (Stimulieren Sie Hauttransplantat und Aufzeichnung von CP-Nerven)
Ratten-ID-Nummer KonstruktGewicht (g) Stimulationsamplitude (mA) Leitungsgeschwindigkeit (m/s) V Peak-to-Peak (mV) Stimulationsamplitude (mA) Leitungsgeschwindigkeit (m/s) V Peak-to-Peak (V)
4687 0.238 1.35 9.6 18.2 0.99 11 181
4688 0.131 1.08 10 8.8 1.11 8 132
4689 0.26 1.26 9.6 21.8 1.9 8.6 237
4690 0.192 4.2 8.3 12.8 k.A. k.A. k.A.
4691 0.213 1.38 10 18.6 6.6 8 153
4693 0.178 1.11 9.6 15.1 8.7 8.3 306

Tabelle 1: Elektrophysiologische Tests von C-RPNIs bei 3- und 9-monatiger Nachkonstruktion. Um CMAPs zu erhalten, wurde eine Aufnahmeelektrode auf den Muskel mit einer stimulierenden Elektrode auf dem proximalen gemeinsamen Peronealnerv gelegt. Eine Reihe von Stimulationen, die in der Amplitude zunahmen, wurde auf den Nerv angewendet, bis maximale CMAP-Werte ermittelt und Ergebnisse aufgezeichnet wurden. Eine ähnliche Methode wurde auf die dermale Komponente angewendet, aber mit der Aufnahmeelektrode auf den Nerv gelegt und stimulierende Elektrode auf der Dermis. Für die sensorische Bewertung von Ratte 4690 bei 9 Monaten wurde festgestellt, dass das dermale Transplantat zu vernarbt ist, um tests zu ermöglichen.

Video 1
Video 1: Muskelkontraktion innerhalb eines C-RPNI. Links neben dem Video ist ein Zangenpaar zu sehen, das den proximalen peronealen Peronealnerv sanft drückt. Dies führt zu einer Kontraktion der Muskelkomponente eines 3 Monate alten C-RPNI, die für den Betrachter sichtbar ist. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen (Rechtsklick zum Download).

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Discussion

Das C-RPNI ist ein neuartiges Konstrukt, das eine gleichzeitige Verstärkung der motorischen Efferentsignale eines Zielnervs mit einer affekten sensorischen Rückkopplung ermöglicht. Insbesondere hat das C-RPNI einen einzigartigen Nutzen für diejenigen, die mit proximalen Amputationen leben, da ihre motorischen und sensorischen Faszikel während der Operation nicht einfach mechanisch getrennt werden können. Stattdessen nutzt das C-RPNI die inhärenten bevorzugten Reinnervationseigenschaften des Nervs selbst, um die sensorische Faserreinnervation zu dermalen sensorischen Endorganen und Motorfasern zu neuromuskulären Knoten zu fördern.

Da die C-RPNI-Fertigung auf den Reinnervationsfähigkeiten des Zielnervs beruht, steht während des Eingriffs ein sorgfältiger Umgang mit dem Nerv an erster Stelle. Vermeiden Sie während der Sezierung die direkte Manipulation und das Trauma des Zielnervs. Wenn der Nerv behandelt werden muss, wird empfohlen, stattdessen Epineurium oder umgebendes Bindegewebe zu manipulieren. Obwohl unser Labor in diesem Konstrukt nicht auf eine Neurombildung gestoßen ist, könnte theoretisch ein signifikantes Nerventrauma das Risiko erhöhen. Ein weiterer wichtiger Schritt in diesem Prozess ist die Ernte der dermalen Transplantate. Das gesamte epidermale Gewebe muss aus dem Hindpaw-Transplantat entfernt werden, da die zurückgehaltene Epidermis das Infektionsrisiko erhöhen kann und Zysten während des Heilungsprozesses einschlüsse. Darüber hinaus muss das dermale Transplantat ausreichend ausgedünnt werden, um die Imbibition und Revaskularisation während des gesamten Transplantats zu fördern und signifikante Ischämie und Nekrose zu vermeiden.

Obwohl die meisten Studien, die mit dem C-RPNI durchgeführt wurden, am gemeinsamen Peronealnerv durchgeführt wurden, konnte jeder gemischte sensorimotorische Nerv ersetzt werden. Ein reiner Motor oder reiner Sinnesnerv könnte genutzt werden, aber die Ergebnisse sind schwer vorherzusagen und würden wahrscheinlich entweder zu einer weitgehenden Muskel- bzw. Dermalrenervation führen. In Bezug auf das Muskeltransplantat, solange Epimysium aus dem Teil entfernt wird, der den Nerv kontaktiert, könnte jedes Muskeltransplantat ähnlich in der Größe verwendet werden, solange es pflegendes oder fasziales Gewebe an beiden Enden enthielt, das für die Verankerung an nahegelegenem Periosteum geeignet ist. Für das dermale Transplantat wird Glabrousgewebe speziell aufgrund des Potenzials für Haarwachstum nach der Transplantation verwendet. Nicht-glabrous Haut wurde zuvor versucht, aber aufgrund der Schwierigkeit, einzelne Haarfollikel zu entfernen, hatten alle resultierenden Konstrukte signifikantes Haarwachstum, Entzündungen und Narbenbildung nach der dreimonatigen Reifungszeit. Zusätzlich können andere Rattenarten eingesetzt werden, aber Lewis- und Fischer-Ratten werden für dieses Experiment empfohlen, da viele andere Rattenarten sich selbst verstümmeln werden, sekundär zum Nerventranabschnitt39,40.

Angesichts der Verzögerung zwischen Verfahren und Ergebnissen ist es schwierig, im Voraus zu wissen, ob Änderungen an der Methode vorgenommen werden müssen. Infektion ist ein theoretisches Risiko selten in unserem Labor begegnet, aber wenn eine Infektion auftritt, ist es in der Regel auf Antibiotika ansprechend. Gelegentlich kauen Ratten an ihren Einschnitten, was zu Dehiszenz führt, und dies kann mit Auswaschen, Debridement und Wiederverschluss behandelt werden. Wenn sich nach drei Monaten expositionsdauer Verstöße gegen das Konstrukt als nicht funktionsfähig und/oder vernarbt herausstellen, gibt es mehrere mögliche Ursachen. Manchmal, wenn der Nerv nicht richtig am Konstrukt mit mindestens drei Nähten befestigt ist, kann der Nerv mit Ambulation aus dem Konstrukt reißen. Zusätzlich können die Muskeln und/oder dermale Transplantate nekrose, was zu einem Ausfall führt. In der Regel ist dies ein Ergebnis entweder wiederholte Infektion, die dermale Transplantat zu dick, oder der Muskel bei der Ernte zu beschädigt, um richtig zu erholen. Darüber hinaus, wenn der Muskel nicht an Periost bei Ruhelänge gesichert ist, Kontraktion kann beeinträchtigt werden, verursacht unzureichende Signale während der Tests. Manchmal scheint das Konstrukt praktikabel zu sein, erzeugt aber beim Testen keine ausreichenden CMAPs/CSNAPs (durchschnittlich 5-10% der Konstrukte). Dies kann sekundär zu Ausfall in Geräten, erhöhte Elektrodenimpedanz, oder signifikante Haut Callusing sein. Skin Callusing kann die Signaltransduktion dämpfen und vollständig blockieren, wenn die Dermis während der Herstellung nicht richtig ausgedünnt wird. Wenn eines der zuvor beschriebenen Ereignisse während des Testvorgangs häufig angezeigt wird, muss man zum Protokoll zurückkehren und entsprechende Änderungen vornehmen. Nach der Erfahrung unseres Labors mit über 90 erfolgreichen C-RPNI-Konstrukten liegt unsere Ausfallrate bei <5% und wird typischerweise auf chirurgische Fehler während der Fertigung zurückgeführt.

Methoden, die üblicherweise verwendet werden, um Nervensignale zu verstärken oder aufzuzeichnen, sind flexible Nervenplatten18, extra-neurale Manschettenelektroden19,20,21,22,23, Gewebe durchdringende Elektroden24,25,31,32, und intrafascicular Elektroden26,27,28, alle von denen verbunden wurden mit Gewebeverletzungen, axonaler Degeneration und/oder Narbengewebebildung. Diese Narbenbildung wird oft auf chronische indwelling FremdkörperReaktion29 und Scherstress durch Unterschiede in Youngs Modul i30induziert zurückgeführt. Das C-RPNI ist jedoch ein biologisches Konstrukt und induziert daher keine Fremdkörperreaktion im Neuronalgewebe. Darüber hinaus sind seine mechanischen Eigenschaften mehrere Faktoren näher an neuronalen Gewebe als Elektroden. Die histologische Analyse dieser Proben hat keinen signifikanten Grad der Narbengewebebildung im Nerv mit chronischer Anwendung gezeigt, so dass das C-RPNI über einen längeren Zeitraum im Vergleich zu den oben aufgeführten Methoden mit dem Nerv in Kontakt kommt. Obwohl diese Methode bei der Verstärkung von effemittenen Motorsignalen sehr effektiv ist, ist sie in Bezug auf die sensorische signalerzeugung begrenzt. Wir haben die signaltransduktion s. an der mechanischen und elektrischen Stimulation der dermalen Komponente des C-RPNI36gemessen und charakterisiert; diese Rattenprobanden können jedoch nicht die Art oder den Grad der Empfindungen qualifizieren, die durch die Stimulation dieses Konstrukts ausgelöst werden. Daher ist es derzeit unmöglich zu wissen, welche Art von Effekt das C-RPNI in Bezug auf die Empfindung erzeugt. Zukünftige Richtungen für dieses Konstrukt umfassen die Charakterisierung von Signalen, die im proximalen Nerv nach spezifischen gegebenen Reizen (z. B. Hitze, Schmerz, Druck usw.) erzeugt werden, sowie Korrelation mit somatosensorischen evozierten Potentialen, die im sensorischen Kortex des Nagetierhirns erzeugt werden. Unser Labor hat sich zum Ziel gesetzt, eine umfassende Grundlage für C-RPNIs zu schaffen, die den Weg für die klinische Übersetzung an menschenterreichende Menschen ebnen wird.

Der Vorgänger des C-RPNI, das RPNI (regenerative periphere Nervenschnittstelle), besteht aus einem freien Muskeltransplantat, das an einem transektierten Nerv befestigt ist, wobei Motorfasern zuvor denervierte neuromuskuläre Knoten wieder aufleben lassen. Das RPNI hat bei menschlichen Probanden nutzend demonstriert, wobei mehrere Patienten fortgeschrittene Prothesen von Signalen steuern, die von diesen RPNIs34verstärkt und aufgezeichnet wurden. Darüber hinaus haben diese RPNIs positive Behandlungseffekte jenseits der prothetischen Kontrolle gezeigt, wobei mehrere vorläufige retrospektive und prospektive Studien eine verminderte Neurromabildung, chronische Schmerzen und Phantom-Gliederschmerzen bei Patienten mit Extremitätsamputationen zeigten. Trotz dieser Erfolge, eine gemeinsame Beschwerde für diejenigen, die diese fortschrittliche Prothetik, jedoch, ist die Notwendigkeit, die Prothese während der Verwendung zu visualisieren, da diese Prothesen Propriozeption fehlt und bieten minimale sensorische Feedback. Der C-RPNI könnte eine Lösung für diese häufige Kritik sein, indem es eine Möglichkeit bietet, sensorisches Feedback über die dermale Komponente zu liefern, was zur Realisierung der begehrten, idealen Prothese führt.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Angaben.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Jana Moon für die fachkundige technische Unterstützung. Die in diesem Beitrag vorgestellten Studien wurden durch ein R21-Stipendium (R21NS104584) an SK finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scalpel Aspen Surgical, Inc Ref 371115 Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15)
4-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 1654G P-3 Reverse Cutting Needle
5-0 Chromic Suture Ethicon SKU# 687G P-3 Reverse Cutting Needle
6-0 Ethilon Suture Ethicon SKU# 697G P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture)
8-0 Monofilament Suture AROSurgical T06A08N14-13 Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle
Experimental Rats Envigo F344-NH-sd Rats are Fischer F344 Strain
Fluriso (Isofluorane) VetOne 13985-528-40 Inhalational Anesthetic
Micro Motor High Speed Drill with Stone Master Mechanic Model 151369 Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones
Oxygen Cryogenic Gases UN1072 Standard medical grade oxygen canisters
Potassium Chloride APP Pharmaceuticals 63323-965-20 Injectable form, 2 mEq/mL
Povidone Iodine USP MediChoice 65517-0009-1 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps
Puralube Vet Opthalmic Ointment Dechra 17033-211-38 Corneal protective ointment for use during procedure
Rimadyl (Caprofen) Zoetis, Inc. NADA# 141-199 Injectable form, 50 mg/mL
Stereo Microscope Leica Model M60 User can adjust magnification to their preference
Surgical Instruments Fine Science Tools Various User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab
Triple Antibiotic Ointment MediChoice 39892-0830-2 Ointment comes in sterile, disposable packets
VaporStick 3 Surgivet V7015 Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister
Webcol Alcohol Prep Coviden Ref 6818 Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep

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References

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Bioengineering Ausgabe 156 periphere Nervenschnittstelle Prothesensteuerung C-RPNI neuronales Feedbacksystem
Herstellung der Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in der Erwachsenenratte
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Svientek, S. R., Ursu, D. C.,More

Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) in the Adult Rat. J. Vis. Exp. (156), e60841, doi:10.3791/60841 (2020).

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