Summary
El siguiente manuscrito describe un método novedoso para desarrollar un sistema de retroalimentación neuronal biológico de bucle cerrado llamado la interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI). Esta construcción tiene la capacidad de integrarse con los nervios periféricos para amplificar las señales motoras eferentes mientras que al mismo tiempo proporciona una retroalimentación sensorial aferente.
Abstract
Los recientes avances en neuroprótesis han permitido a quienes viven con pérdida de extremidades reproducir muchas funciones nativas de la extremidad ausente, y esto a menudo se logra a través de la integración con el sistema nervioso periférico. Desafortunadamente, los métodos actualmente empleados se asocian a menudo con daños importantes en los tejidos que impiden el uso prolongado. Además, estos dispositivos a menudo carecen de cualquier grado significativo de retroalimentación sensorial, ya que su construcción compleja amortigua cualquier vibración u otras sensaciones de las que un usuario pueda haber dependido anteriormente al usar prótesis más simples. La interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI) fue desarrollada como una construcción biológica estable con la capacidad de amplificar las señales nerviosas del motor eferente mientras proporciona retroalimentación sensorial aferente simultánea. El C-RPNI consiste en un segmento de injerto dérmico y muscular libre asegurado alrededor de un nervio sensorimotor mixto objetivo, con reinnervación del nervio motor preferencial del injerto muscular y reinnervación del nervio sensorial del injerto dérmico. En ratas, esta construcción ha demostrado la generación de potencial estridebidos de acción muscular compuesta (CMAP), amplificando la señal del nervio objetivo desde el nivel de micro a mil voltios, con relaciones señal-ruido promediando aproximadamente 30-50. La estimulación del componente dérmico de la construcción genera potenciales de acción nerviosa sensorial compuesta (CSP) en el nervio proximal. Como tal, esta construcción tiene una utilidad futura prometedora para la realización de la prótesis ideal e intuitiva.
Introduction
Las amputaciones de extremidades afectan a casi 1 de cada 190 estadounidenses1, y se prevé que su prevalencia aumente de 1,6 millones hoy a más de 3,6 millones para 20502. A pesar del uso documentado durante más de un milenio, la prótesis ideal aún no se ha realizado3. Actualmente existen prótesis complejas capaces de múltiples manipulaciones articulares con el potencial de reproducir muchas funciones motoras de la extremidad nativa4,5. Sin embargo, estos dispositivos no se consideran intuitivos, ya que el movimiento protésico deseado suele estar separado funcionalmente de la señal de control de entrada. Los usuarios suelen considerar estas "prótesis avanzadas" difíciles de aprender y por lo tanto no son adecuados para el uso diario1,6. Además, las prótesis complejas actualmente en el mercado no proporcionan ningún grado apreciable de retroalimentación sensorial sutil para un control adecuado. El sentido del tacto y la propriocepción son vitales para llevar a cabo las tareas diarias, y sin éstas, actos simples como recoger una taza de café se vuelven gravosos ya que se basa enteramente en señales visuales7,8,9. Por estas razones, prótesis avanzadas se asocian con un grado significativo de fatiga mental y a menudo se describen como gravosas e insatisfactorias5,10,11. Para hacer frente a esto, algunos laboratorios de investigación han desarrollado prótesis capaces de proporcionar un grado limitado de retroalimentación sensorial a través de la interacción neuronal directa12,13,14,15, pero la retroalimentación a menudo se limita a pequeñas áreas dispersas en las manos y los dedos12,13, y las sensaciones se notaron para ser dolorosas y antinaturales a veces15. Muchos de estos estudios desafortunadamente carecen de cualquier seguimiento apreciable a largo plazo y histología nerviosa para delinear los efectos del tejido local, mientras que la observación de fallo de la interfaz en la escala de semanas a meses16.
Para esta población, el dispositivo protésico ideal proporcionaría un control motor de alta fidelidad junto con una retroalimentación somatosensorial significativa del entorno del individuo a lo largo de su vida útil. Crítico para el diseño de dicha prótesis ideal es el desarrollo de una interfaz estable y confiable que permita la transmisión simultánea de información somatosensorial aferente con señales motoras eferentes. Las interfaces hombre-máquina más prometedoras son las que interactúan directamente con el sistema nervioso periférico, y los recientes desarrollos en el campo de las prótesis neurointegradas han trabajado para salvar la brecha entre las señales bioeléctricas y mecánicas17. Las interfaces actuales utilizadas incluyen: placas nerviosas flexibles14,15,18, electrodos de manguito extraneurales13,19,20,21,22,23, electrodos penetrantes de tejido24,25,31,32,y electrodos intrafasciculares26,27 ,28. Sin embargo, cada uno de estos métodos ha demostrado limitaciones con respecto a la especificidad nerviosa, lesión tisular, degeneración axonal, agotamiento de mielina y/o formación de tejido cicatricial asociado con la respuesta crónica del cuerpo extraño residente16,17,18,19. Más recientemente, se ha postulado que un conductor detrás de una eventual falla de electrodo implantado es la diferencia significativa en los módulos de Young entre el material electrónico y el tejido neural nativo. El tejido cerebral está sujeto a una micromoción significativa a diario, y se ha teorizado que el estrés de cizallamiento inducido por las diferencias en los módulos de Young causa inflamación y cicatrices permanentes eventuales30,31,32. Este efecto a menudo se compone en las extremidades, donde los nervios periféricos están sujetos a micromoción fisiológica y macromoción intencional de las extremidades. Debido a este movimiento constante, es razonable concluir que la utilización de una interfaz de nervio periférico completamente abiótico no es ideal, y una interfaz con un componente biológico sería más adecuada.
Para hacer frente a esta necesidad de un componente biológico, nuestro laboratorio desarrolló una interfaz nerviosa biótica conlanada interfaz nerviosa periférica regenerativa (RPNI) para integrar los nervios periféricos transectos en una extremidad residual con un dispositivo protésico. La fabricación de RPNI consiste en implantar quirúrgicamente un nervio periférico en un injerto muscular libre autólogo, que posteriormente revasculariza y reinnerva. Nuestro laboratorio ha desarrollado esta interfaz nerviosa biológica en la última década, con éxito en la amplificación y transmisión de señales motoras cuando se combina con electrodos implantados en ensayos tanto animales como humanos, permitiendo un control protésico adecuado con múltiples grados de libertad2,34. Además, hemos demostrado por separado la retroalimentación sensorial mediante el uso de nervios periféricos incrustados en injertos dérmicos, llamados La Interfaz Sensorial Dérmica (DSI)3,35. En las amputaciones más distales, el uso de estas construcciones simultáneamente es factible ya que los fascículos motores y sensoriales dentro del nervio periférico objetivo se pueden separar quirúrgicamente. Sin embargo, para las amputaciones de nivel más proximal, esto no es factible debido a la mezcla de fibras motoras y sensoriales. La interfaz nerviosa periférica regenerativa compuesta (C-RPNI) fue desarrollada para amputaciones más proximales, e implica la implantación de un nervio sensorimotor mixto en una construcción que consiste en injerto muscular libre asegurado a un segmento de injerto dérmico(Figura 1). Los nervios periféricos demuestran una reinnervación dirigida preferencial, por lo que las fibras sensoriales reinertan el injerto dérmico y las fibras motoras, el injerto muscular. Esta construcción tiene así la capacidad de amplificar simultáneamente las señales del motor mientras que proporciona retroalimentación somatosensorial36 (Figura 2), lo que permite la realización de la prótesis ideal, intuitiva, compleja.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizan bajo la aprobación del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Michigan.
NOTA: Las ratas donantes tienen acceso gratuito a alimentos y agua antes de los procedimientos de donación de la piel y los músculos. La eutanasia se realiza bajo anestesia profunda seguida de inyección intracardiaca de cloruro de potasio con un método secundario de neumotórax bilateral. Cualquier cepa de rata se puede utilizar teóricamente con este experimento; sin embargo, nuestro laboratorio ha logrado resultados consistentes tanto en ratas Fischer F344 machos como hembras (200-250 g) a los dos o cuatro meses de edad. Las ratas donantes deben ser isogénicas para las ratas experimentales.
1. Preparación del injerto dérmico
- Anestetizar rata donante en una cámara de inducción utilizando una solución de 5% de isoflurano en oxígeno a 0.8-1 L/min. Una vez anestesiada la rata, retirar de la cámara de inducción y colocar la nariz de respiración, reduciendo el isoflurano a 2-2,5% para el mantenimiento de la anestesia.
- Administrar una solución de 0,02-0,03 ml de carprofeno (50 mg/ml) en 0,2 ml de solución salina estéril subcutánea entre los omóplatos para la analgesia.
- Aplica un unción de lágrimas artificiales en ambos ojos para prevenir las úlceras corneales.
- Con las pinzas, asemete toda la(s) extremidades posteriores inferiores, la región del tobillo y los lados de las patas.
- Limpiar la extremidad posterior elegida y la superficie plantar de la pata con alcohol, seguido de la solución de yodopovidona, terminando con una limpieza final con alcohol para eliminar la iodopovidona residual.
- Usando un taladro de alta velocidad micromotor de mano con una piedra de pulido de grano fino redonda extraíble (4000 rpm), rebaba la superficie plantar de la pata para eliminar la epidermis. Durante el enredo, aplicar goteos de salina para no quemar la piel. La dermis subyacente tendrá un aspecto brillante con sangrado preciso.
- Aplique un torniquete en la extremidad inferior para disminuir el flujo sanguíneo.
- Retire la piel plantar bruscamente con un bisturí #15 y colóquela en gasa húmeda con salina para evitar la desecación. Algunos tejidos tendinosos y conectivos se extirparán intrínsecamente con la piel en este paso y se extraerán más adelante.
- Aplique una envoltura de gasa en el pie sangrante para reducir la hemorragia. Repita los pasos 1.5-1.9 si realiza dos construcciones.
- Bajo un microscopio (aumento de 20x), retire el tejido tendinoso y conectivo de la capa profunda del injerto de piel utilizando microtijeras. Tenga cuidado de no hacer agujeros en el injerto. El injerto dérmico adelgazado debe ser ligeramente opaco que contenga sólo dermis, midiendo aproximadamente 0,5 cm x 1,0 cm de tamaño.
- Colocar en gasa húmeda por salina hasta que esté lista para la fabricación de la construcción C-RPNI. Los injertos deben utilizarse dentro de las 2 horas posteriores a la cosecha.
2. Preparación del injerto muscular
- Haga una incisión longitudinal a lo largo del aspecto anterior de la extremidad posterior inferior desde justo por encima del tobillo hasta justo debajo de la rodilla con un escalpelo #15. Diseccionar a través del tejido subcutáneo para exponer la musculatura subyacente.
- En el aspecto distal de la incisión, exponga las inserciones tendinosas de la musculatura de la extremidad inferior. Tibialis anterior (TA) es típicamente el más grande y más anterior de los músculos, y justo debajo y posterior a este músculo se encuentra el digitorum longus extensor (EDL). Aísle el tendón disal de EDL de los otros tendones de la zona, teniendo cuidado de no incisar su inserción en este punto.
- Asegurar el aislamiento del tendón correcto insertando ambos dientes de un fórceps debajo del tendón y ejerciendo presión ascendente abriendo los fórceps para causar la excursión del tendón. La manipulación de este tendón debe hacer que todos los dedos de los dedos se extiendan simultáneamente.
- Realizar una tenotomía distal con tijeras de iris afiladas y separar el músculo de los tejidos circundantes sin rodeos con tenotomías (u otras tijeras con punta sin rodeos) trabajando proximalmente para encontrar el origen tendinoso.
- Una vez visualizado el tendón proximal, vuelva a realizar una tenotomía utilizando tijeras de iris afiladas. Coloque el injerto muscular en una gasa humedecida con salina para evitar la desecación.
- Una vez que todos los injertos deseados han sido retirados de una rata donante, eutanasia principalmente por inyección intra-cardiaca de KCl (1-2 mEq K+/kg) seguida de eutanasia secundaria con pneumotórax punmotórax bilateral con una cuchilla #15.
3. Aislamiento y preparación del nervio peroneo común
- Anestesiar y proporcionar analgesia a la rata experimental de acuerdo con el protocolo descrito en los pasos 1.1-1.3.
- Afeitar el muslo deseado y limpiar con alcohol, betadina, terminando con alcohol para eliminar los rastros de betadina.
- Mueva al animal de la mesa de preparación quirúrgica a la mesa del microscopio quirúrgico y colóquelo en la almohadilla de calentamiento con sonda de temperatura para el mantenimiento de la temperatura corporal. Mantener el isoflurano al 2-2.5% y oxígeno a 0.8-1 L/min.
- Marque la incisión, extendiéndose de una muesca distal a una muesca ciática a la parte inferior de la rodilla. Esta marca debe ser inferior al fémur y alejarse de él. Haga la incisión con una cuchilla #15 incising a través del bíceps subyacente femoris fascia.
- Disecciona cuidadosamente a través del músculo del bíceps femoris con una microtijeras hemostadas o de punta contundente al espacio subyacente al bíceps femoris.
NOTA: El nervio ciático viaja aproximadamente en la misma dirección que la incisión inicial que se hizo. Hay tres ramas, típicamente con nervio sural posterior y nervio peroneo común y nervio tibial viajando superficial y profundo hasta la rodilla, respectivamente. - Después de la identificación del nervio peroneal común (CP), utilizando un par de fórceps micro, de punta fina y microtijeras, aislar cuidadosamente el nervio CP de las otras ramas ciáticas y eliminar cualquier tejido conectivo persistente distalmente.
- En el punto donde el nervio cruza la superficie de la rodilla, transpira bruscamente el nervio con un par de microtijeras.
NOTA: El uso de tijeras afiladas es extremadamente importante en este paso, ya que causar un trauma significativo en el nervio podría aumentar el riesgo de formación de neuroma. - Libere cuidadosamente cualquier tejido conectivo restante del nervio CP y trabaje proximalmente para liberar el nervio a una longitud de aproximadamente 2 cm.
4. Fabricación de construcción C-RPNI
- Retire el injerto muscular de la gasa humedecida salina y retire todo el tejido tendinoso central, así como un pequeño segmento central de epimisio. Deje intactos los extremos tendinosos.
- Uso de un 8-0 sutura de nylon, asegurar el epineumrium del extremo transecto del nervio CP a la zona del injerto muscular desprovisto de epimisio con dos puntos de sutura interrumpida a cada lado del nervio.
- Asegure el injerto muscular al periosteum del fémur con una sola puntada interrumpida de nylon 6-0 tanto proximalmente como diselectrónicamente con la unión nervio-músculo mirando lejos del fémur.
NOTA: Asegure el músculo de modo que esté a una longitud relajada normal. Trate de no estirar el músculo significativamente o dejar demasiada laxitud al asegurar. - Coloque un 8-0 punto de nylon en el margen inferior y central del epimisio del injerto muscular, asegurándolo al epineumrium nervioso CP de una manera que crea laxitud en el nervio dentro del injerto muscular y ayuda a aliviar cualquier tensión futura a la que pueda estar expuesto con la ambulación posterior.
- Retire el injerto de piel de la gasa humedecida con salina y colóquelo en el injerto muscular de tal manera que cubra completamente el nervio y la mayor parte del músculo. Asegúrese de que el margen profundo de la dermis está descansando sobre el músculo. Recortar cualquier dermis que se extiende más allá del borde del músculo.
- Asegure el injerto de piel al injerto muscular circunferencialmente usando 8-0 suturas interrumpidas de nylon. Típicamente, 4-8 suturas totales se utilizan dependiendo del tamaño de la construcción.
- Cierre el bíceps femoris fascia sobre la construcción de una manera de correr con 5-0 sutura cromática.
- Cierra la piel superpuesta con una sutura cromática 4-0 de moda.
- Swab el área quirúrgica con una almohadilla de alcohol y aplicar un unción antibiótica.
- Cese el anestésico inhalatoccional y permita que la rata se recupere con fuentes de alimentos y agua separadas de las compañeras de jaula.
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Representative Results
La fabricación de la construcción se considera infructuosa si las ratas desarrollan una infección o no sobreviven a la anestesia quirúrgica. Investigaciones anteriores han indicado que estas construcciones requieren aproximadamente tres meses para revascularizar y reinnervate2,3,17,36. Después del período de recuperación de tres meses, se pueden realizar pruebas de construcción para examinar la viabilidad. La exposición quirúrgica de las construcciones después de tres meses revelará músculo y piel revascularizados si tiene éxito(Figura 3). A veces, el músculo libre y los injertos dérmicos pueden consistir únicamente en tejido cicatricial, y / o el nervio no se unirá a la construcción; estos hallazgos indican un intento fallido. Sin embargo, si tiene éxito, apretamiento suave del nervio peroneo común con fórceps proximales a la construcción dará lugar a una contracción muscular visible (Video 1). El análisis histológico de las construcciones debe demostrar piel, nervio y músculo viables(Figura 4). La inmunomancha también revelará la reinnervación del nervio motor y sensorial a sus uniones neuromusculares y órganos finales sensoriales, respectivamente(Figura 5). Si el nervio peroneo común no vuelve a ininnervar esos tejidos, la inmunomancha no demostrará ninguna fibra nerviosa individual dentro de la construcción con la excepción del nervio implantado en sí.
Las pruebas electrofisiológicas se pueden realizar en estas construcciones in vivo(Figura 6); investigaciones anteriores se han llevado a cabo a los 3 y 9 meses siguientes a la fabricación de C-RPNI36 (Tabla 1). Después de la estimulación máxima con un electrodo de gancho en el nervio peroneo común proximal sólo distal a su despegue del nervio ciático, potenciales de acción muscular compuesto (CMAP) se pueden medir en el componente muscular con contracción muscular visible. El tipo de electrodo utilizado en el músculo puede variar según la preferencia, pero el parche epimisial, la almohadilla epimisial y los electrodos de sonda bipolar se han utilizado con éxito en esta investigación. La amplitud media de CMAP registrada en el músculo fue de 8,7 a 1,6 mV a los 3 meses y de 10,2 a 2,1 mV a los 9 meses. La velocidad media de conducción fue de 10 a 1,2 m/s a los 3 meses y de 9,5 a 0,6 m/s a los 9 meses. En comparación, los CMAP generados por el músculo fisiológico EDL suelen oscilar entre 10-18 mV37. Después de la estimulación en el componente dérmico del C-RPNI, se produjeron potenciales de acción del nervio sensorial compuesto (CSNP) en el nervio peroneo común proximal, con una amplitud media de CSNAP que mide 113,7 a 35,1 v a los 3 meses y 142,9 a 63,7 v a los 9 meses. La Figura 7 ilustra las señales CMAP y CSNAP únicas y de suma obtenidas durante las pruebas electrofisiológicas en formato gráfico.
El C-RPNI sirve para amplificar la señal de microvoltios inherente de un nervio, y investigaciones previas han demostrado suficiente amplificación desde el microvoltosa al nivel de milivoltios38. Por lo tanto, si una construcción no proporciona ese nivel de amplificación, no se considera correcta. Si el dérmico, el músculo o ambos componentes del C-RPNI fallan, las pruebas darían lugar a grabaciones que imitan la señal de estimulación utilizada. Para el componente muscular específicamente, un resultado subóptimo (pero uno que todavía se considera operativo) sería uno que tiene amplitud CMAP y velocidad de conducción en el rango que se encuentra entre el valor de estimulación de la señal y el del músculo FIsiológico EDL. Además, estas señales pueden atenuarse y carecer de la forma de onda CMAP característica(Figura 8A). Los resultados subóptimos a nivel del componente dérmico pueden ocurrir, pero son difíciles de cuantificar dado que las ratas no pueden expresar la calidad de la sensación que experimentan. Estos resultados subóptimos generalmente implican la amortiguación de la forma de onda con un ruido de fondo significativo(Figura 8B). Sin embargo, si hay cicatrices significativas o llamadas del injerto de piel, o injerto mínimo sobrevivió, no se apreciarán CSNAPs en el nervio peroneo común proximal independientemente del valor de estimulación.
Figura 1: Esquema ilustrativo de la construcción C-RPNI. El nervio peroneo común se puede ver asegurado entre la capa dérmica superior y la capa muscular inferior. Esta construcción se fija al periosteum del fémur proximalmente y discada mente a través de las uniones tendinosas de EDL. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación pictórica del C-RPNI en un paciente con una amputación trans-radial. El usuario forma una intención motora deseada a nivel cerebral (por ejemplo, agarre de la pinza), que se transmite como una señal motora eferente al C-RPNI a través del nervio periférico implantado. Esta señal genera un potencial de acción muscular compuesto (CMAP) en el componente muscular, que es registrado por electrodos implantados y reconocido por el dispositivo protésico, generando el movimiento deseado. Los sensores en las yemas de los dedos del dispositivo reconocen la cantidad de presión generada y transmiten esa información a un electrodo implantado en el componente dérmico del C-RPNI. Estas señales activan los órganos finales sensoriales correspondientes, generando un potencial de acción nerviosa sensorial compuesto aferente (CSNAP) transmitido a través del nervio periférico a la corteza sensorial. Una señal de ejemplo generada en cada componente se muestra dentro de los cuadros azules que se muestran junto a cada componente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: C-RPNI in vivo. (A) Un C-RPNI inmediatamente después de la fabricación y en (B) 3 meses después de la construcción en el momento de las pruebas electrofisiológicas. El componente muscular es la capa profunda de la construcción y el dérmico, lo superficial. El tejido muscular está marcado por (M), dermis (D) y nervio peroneo común (N). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Histología C-RPNI 6 meses. C-RPNI H&E a los 6 meses en(A)sección transversal y (B) sección longitudinal. Músculo observado por (M), dermis (D) y nervio (N). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Inmunomanchación del C-RPNI. (A) Ejemplo representativo de una sección transversal del tejido muscular, con flechas rojas que identifican las uniones neuromusculares. Un aumento más alto de la unión neuromuscular central (NMJ) se muestra en la parte inferior derecha. (B) Primer plano de una unión neuromuscular observada en la muestra. Para (A) y (B), tinción roja (alfa-bungarotoxina) indica la presencia de receptores colinérgicos en el tejido muscular; azul (neurofilamento 200) especifica la presencia de neurofilamentos dentro del tejido neuronal; y verde (colina acetiltransferasa) notas específicamente la presencia de neuronas motoras. (C) Ejemplo representativo de una imagen iDISCO centrada en la unión dérmica, con flechas rojas que marcan las neuronas sensoriales (blancas) entrando en la dermis. (D) Vista en puesta de iDISCO demostrando múltiples neuronas sensoriales (blanco, neurofilamento 200). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Esquema de pruebas electrofisiológicas. La imagen superior es una ilustración de la disposición de electrodos estándar para probar las construcciones C-RPNI. Hay un parche y/o electrodo de sonda colocado en los componentes musculares y dérmicos del C-RPNI, con un electrodo de doble gancho colocado en el nervio peroneo común proximalmente. La imagen inferior es un ejemplo in vivo de la disposición de prueba en un sujeto de rata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Señalización electrofisiológica típica C-RPNI. (A) Una sola señal CMAP registrada en el componente muscular después de una señal de 5,00 mA aplicada al nervio CP. (B) 24 CMAPs generados por estimulación de 5,00 mA en el nervio. (C) Una sola señal CSNAP registrada desde el nervio CP proximal después de la estimulación del componente dérmico a 900 a. (D) Una serie de CSNA registrados desde el nervio DE CP proximal después de aumentar la estimulación en el componente dérmico de 500 a 1000 aA. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Señalización Anormal C-RPNI. (A) Se obtiene una serie de MCA obtenidamidas durante la estimulación nerviosa de CP de 0,2 a 4 mA. Las formas de onda alcanzan un pico en diferentes puntos y no pueden volver a la línea de base, lo que posiblemente indica electrodos defectuosos o una función de construcción general inadecuada. (B) Sumación de CSNAPs obtenidos al estimular el componente dérmico, rampa de 0,1 a 5 mA. Estos hallazgos pueden ocurrir por una multitud de razones, incluyendo electrodos que no funcionan correctamente, cicatrices dérmicas del injerto, y / o daño a los nervios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Datos de 3 meses | Datos CMAP (Estimular el nervio CP y registro del injerto muscular) | Datos CSNAP (Estimular el injerto de piel y registro del nervio CP) | |||||
| Número de identificación de rata | Construir peso (g) | Amplitud de estimulación (mA) | Velocidad de conducción (m/s) | V Pico a Pico (mV) | Amplitud de estimulación (mA) | Velocidad de conducción (m/s) | V Pico a Pico (V) |
| 4607 | 0.087 | 4.17 | 11.3 | 10.3 | 18 | 11.1 | 121 |
| 4608 | 0.15 | 1.65 | 11.1 | 17.1 | 7.7 | 6.5 | 136 |
| 4611 | 0.113 | 8.3 | 9.6 | 11.2 | 10 | 10 | 121 |
| 4613 | 0.116 | 3.18 | 10 | 9.6 | 1.44 | 8.3 | 134 |
| 4614 | 0.189 | 3 | 10.8 | 9.6 | 7.39 | 9 | 151 |
| 4616 | 0.122 | 5.2 | 9.4 | 14.9 | 1.8 | 9.1 | 100 |
| 4620 | 0.118 | 2.91 | 7.6 | 7.4 | 8.7 | 10 | 219 |
| Datos de 9 meses | Datos CMAP (Estimular el nervio CP y registro del injerto muscular) | Datos CSNAP (Estimular el injerto de piel y registro del nervio CP) | |||||
| Número de identificación de rata | Construir peso (g) | Amplitud de estimulación (mA) | Velocidad de conducción (m/s) | V Pico a Pico (mV) | Amplitud de estimulación (mA) | Velocidad de conducción (m/s) | V Pico a Pico (V) |
| 4687 | 0.238 | 1.35 | 9.6 | 18.2 | 0.99 | 11 | 181 |
| 4688 | 0.131 | 1.08 | 10 | 8.8 | 1.11 | 8 | 132 |
| 4689 | 0.26 | 1.26 | 9.6 | 21.8 | 1.9 | 8.6 | 237 |
| 4690 | 0.192 | 4.2 | 8.3 | 12.8 | n/a | n/a | n/a |
| 4691 | 0.213 | 1.38 | 10 | 18.6 | 6.6 | 8 | 153 |
| 4693 | 0.178 | 1.11 | 9.6 | 15.1 | 8.7 | 8.3 | 306 |
Tabla 1: Pruebas electrofisiológicas de C-RPNIs a los 3 y 9 meses posteriores a la construcción. Para obtener MASP, se colocó un electrodo de grabación en el músculo con un electrodo estimulante en el nervio peroneo común proximal. Se aplicó una serie de estimulaciones que aumentaron en amplitud al nervio hasta que se obtuvieron los valores máximos de CMAP y se registraron los resultados. Se aplicó una metodología similar al componente dérmico, pero con el electrodo de grabación colocado en el nervio y el electrodo estimulante en la dermis. Para la evaluación sensorial de la rata 4690 a los 9 meses, se encontró que el injerto dérmico estaba demasiado marcado para permitir la prueba.
Vídeo 1: Contracción muscular dentro de un C-RPNI. Se puede ver un par de fórceps a la izquierda del video apretando suavemente el nervio peroneo común proximal. Esto resulta en la contracción del componente muscular de un C-RPNI de 3 meses de edad que es visible para el espectador. Haga clic aquí para ver este video (Haga clic con el botón derecho para descargar).
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Discussion
El C-RPNI es una construcción novedosa que proporciona amplificación simultánea de las señales eferentes motoras de un nervio objetivo con el suministro de retroalimentación sensorial aferente. En particular, el C-RPNI tiene una utilidad única para aquellos que viven con amputaciones proximales, ya que sus fascículos motores y sensoriales no se pueden separar mecánicamente fácilmente durante la cirugía. En su lugar, el C-RPNI utiliza las propiedades inherentes de reinnervación preferencial del nervio mismo para estimular la reinnervación de fibra sensorial a órganos extremos sensoriales dérmales y fibras motoras a uniones neuromusculares.
Como la fabricación de C-RPNI se basa en las habilidades de reinnervación del nervio objetivo, el manejo cuidadoso del nervio es primordial durante el procedimiento. Durante la disección, evite la manipulación directa y el trauma tenso en el nervio objetivo. Si el nervio debe ser manejado, se recomienda manipular el epineumrium o el tejido conectivo circundante en su lugar. Aunque nuestro laboratorio no ha encontrado formación de neuroma dentro de esta construcción, teóricamente, trauma nervioso significativo podría aumentar el riesgo. Un paso clave adicional en el proceso es la cosecha de los injertos dérmicos. Todo el tejido epidérmico debe eliminarse del injerto de pata trasera, ya que la epidermis retenida puede aumentar el riesgo de infección y quistes de inclusión durante el proceso de curación. Además, el injerto dérmico debe adelgazar adecuadamente para promover la imbibición y la revascularización a lo largo del injerto y evitar una isquemia y necrosis significativas.
Aunque la mayoría de los estudios realizados con el C-RPNI se han realizado en el nervio peroneo común, cualquier nervio sensorial mezclado podría ser sustituido. Se podría utilizar un nervio sensorial puro o motor puro, pero los resultados son difíciles de predecir y probablemente resultarían en reinnervación muscular o dérmica, respectivamente. Con respecto al injerto muscular, siempre y cuando se elimine el epimisio de la porción que entra en contacto con el nervio, cualquier injerto muscular similar en tamaño podría ser utilizado siempre y cuando contenía tejido tendinoso o fascial en cualquiera de los extremos adecuadopara el anclaje al periosteum cercano. Para el injerto dérmico, tejido glabra se utiliza específicamente debido al potencial de crecimiento del cabello después del injerto. Anteriormente se intentó que la piel no glabra, pero debido a la dificultad de eliminar los folículos pilosos individuales, todas las construcciones resultantes tuvieron un crecimiento significativo del cabello, inflamación y cicatrices después del período de maduración de tres meses. Además, se pueden emplear otras especies de ratas, pero se recomiendan ratas Lewis y Fischer para este experimento, ya que muchas otras especies de ratas se automutilarán secundarias a la transecciónnerviosa 39,40.
Dado el retraso entre el procedimiento y los resultados, es difícil saber con antelación si se debe realizar alguna alteración en el método. La infección es un riesgo teórico que rara vez encuentra nuestro laboratorio, pero si se produce una infección, normalmente responde a los antibióticos. Ocasionalmente, las ratas mastican sus incisiones causando dehiscencia, y esto se puede tratar con lavado, desbridamiento y recierre. Si, después de tres meses en el momento de la exposición, se encuentra que la construcción no es funcional y/o tiene cicatrices, hay varias causas potenciales. A veces, si el nervio no está asegurado correctamente a la construcción con al menos tres suturas, el nervio puede romperse de la construcción con la ambulación. Además, los injertos musculares y/o dérmicos pueden necrosar, causando fracaso. Típicamente, esto es el resultado de una infección repetida, el injerto dérmico es demasiado grueso, o el músculo demasiado dañado en la cosecha para recuperarse correctamente. Además, si el músculo no está asegurado a periosteum a la longitud de reposo, la contracción puede verse afectada causando señales inadecuadas durante las pruebas. A veces, la construcción parecerá viable, pero no puede producir CMAP/CAP adecuados en las pruebas (5-10% de las construcciones, en promedio). Esto podría ser secundario a fallas en el equipo, impedancia elevada del electrodo o llamadas significativas de la piel. Las llamadas cutáneas pueden amortiguar y bloquear completamente la transducción de la señal si la dermis no se adelgaza correctamente durante la fabricación. Si alguno de los eventos descritos anteriormente se ve con frecuencia durante el proceso de prueba, uno debe volver al protocolo y realizar las alteraciones adecuadas. En la experiencia de nuestro laboratorio con más de 90 construcciones exitosas de C-RPNI, nuestra tasa de fracaso es de <5% y normalmente se atribuye a un error quirúrgico durante la fabricación.
Los métodos comúnmente empleados para amplificar o registrar señales nerviosas incluyen placas nerviosas flexibles18, electrodos de manguito extraneural19,20,21,22,23, electrodos penetrantes de tejido24,25,31,32,y electrodos intrafasciculares26,27,28, todos los cuales se han asociado con lesión tisular, degeneración axonal y/o formación de tejido cicatricial. Esta cicatrización se atribuye a menudo a la respuesta crónica del cuerpo extraño residente29 y al estrés de cizallamiento inducido por las diferencias en los módulos30de Young. El C-RPNI, sin embargo, es una construcción biológica y por lo tanto no induce la respuesta del cuerpo extraño en el tejido neural. Además, sus propiedades mecánicas son varios factores más cercanos al tejido neural que los electrodos. El análisis histológico de estas muestras no ha demostrado ningún grado significativo de formación de tejido cicatricial en el nervio con uso crónico, permitiendo así que el C-RPNI interinteren con el nervio durante períodos prolongados en comparación con los métodos mencionados anteriormente. Aunque este método es altamente eficaz en la amplificación de señales de motor eferentes, está limitado con respecto a la producción de señales aferentes sensoriales. Hemos medido y caracterizado la transducción de señal producida con estimulación mecánica y eléctrica del componente dérmico del C-RPNI36; sin embargo, estos sujetos de rata no pueden calificar el tipo o grado de sensaciones provocados por la estimulación de esta construcción. Como tal, en este momento es imposible saber qué tipo de efecto está produciendo el C-RPNI con respecto a la sensación. Las instrucciones futuras para esta construcción incluirán la caracterización de las señales producidas en el nervio proximal siguiendo estímulos específicos proporcionados (por ejemplo, calor, dolor, presión, etc.), así como la correlación con potenciales evocados somatosensoriales generados en la corteza sensorial del cerebro de roedores. El objetivo de nuestro laboratorio es establecer una base integral para c-RPNI que allanará el camino para la traducción clínica a los seres humanos.
El predecesor del C-RPNI, el RPNI (interfaz nerviosa periférica regenerativa), consiste en un injerto muscular libre unido a un nervio transecto, con fibras motoras que reinnervan las uniones neuromusculares previamente denervadas. El RPNI ha demostrado utilidad en sujetos humanos, con varios pacientes que controlan prótesis avanzadas a partir de señales amplificadas y registradas a partir de estos RPNi34. Además, estos RPNI han demostrado efectos beneficiosos del tratamiento más allá del control protésico, con varios estudios retrospectivos y prospectivos que muestran disminución de la formación de neuroma, dolor crónico y dolor fantasma en las extremidades en aquellos pacientes con amputaciones de extremidades. A pesar de estos éxitos, una queja común para aquellos que utilizan estas prótesis avanzadas, sin embargo, es la necesidad de visualizar la prótesis durante el uso como estas prótesis carecen de propriocepción y proporcionan una retroalimentación sensorial mínima. El C-RPNI podría ser una solución a esta crítica común proporcionando una manera de entregar retroalimentación sensorial a través del componente dérmico, lo que conduce a la realización de la prótesis ideal tan deseada.
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Disclosures
Los autores no tienen revelaciones.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Jana Moon por la asistencia técnica experta. Los estudios presentados en este documento fueron financiados a través de una subvención R21 (R21NS104584) a SK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scalpel | Aspen Surgical, Inc | Ref 371115 | Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15) |
| 4-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 1654G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 5-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 687G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 6-0 Ethilon Suture | Ethicon | SKU# 697G | P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture) |
| 8-0 Monofilament Suture | AROSurgical | T06A08N14-13 | Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle |
| Experimental Rats | Envigo | F344-NH-sd | Rats are Fischer F344 Strain |
| Fluriso (Isofluorane) | VetOne | 13985-528-40 | Inhalational Anesthetic |
| Micro Motor High Speed Drill with Stone | Master Mechanic | Model 151369 | Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones |
| Oxygen | Cryogenic Gases | UN1072 | Standard medical grade oxygen canisters |
| Potassium Chloride | APP Pharmaceuticals | 63323-965-20 | Injectable form, 2 mEq/mL |
| Povidone Iodine USP | MediChoice | 65517-0009-1 | 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Corneal protective ointment for use during procedure |
| Rimadyl (Caprofen) | Zoetis, Inc. | NADA# 141-199 | Injectable form, 50 mg/mL |
| Stereo Microscope | Leica | Model M60 | User can adjust magnification to their preference |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | Various | User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab |
| Triple Antibiotic Ointment | MediChoice | 39892-0830-2 | Ointment comes in sterile, disposable packets |
| VaporStick 3 | Surgivet | V7015 | Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister |
| Webcol Alcohol Prep | Coviden | Ref 6818 | Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep |
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