Summary
Följande manuskript beskriver en ny metod för att utveckla ett biologiskt, slutet kretscellsneuralåterkopplingssystem som kallas det sammansatta regenerativa perifera nervgränssnittet (C-RPNI). Denna konstruktion har förmågan att integrera med perifera nerver för att förstärka brusande motorsignaler samtidigt som den ger afferent sensorisk feedback.
Abstract
Senaste framsteg i neuroprotetik har gjort det möjligt för dem som lever med extremitetförlust att reproducera många funktioner hemma i den frånvarande änden, och detta sker ofta genom integration med det perifera nervsystemet. Tyvärr är metoder som för närvarande används ofta förknippade med betydande vävnadsskador som förhindrar långvarig användning. Dessutom saknar dessa enheter ofta någon meningsfull grad av sensorisk feedback eftersom deras komplexa konstruktion dämpar eventuella vibrationer eller andra förnimmelser som en användare tidigare kan ha varit beroende av när du använder enklare proteser. Det sammansatta regenerativa perifera nervgränssnittet (C-RPNI) utvecklades som en stabil, biologisk konstruktion med förmågan att förstärka brusande nervsignaler med motorn samtidigt som den gav samtidig afferent sensorisk feedback. C-RPNI består av ett segment av fritt dermal och muskeltransplantat säkrat runt ett mål blandad sensorimotorisk nerv, med förmånstagare motor nerv reinnervation av muskeltransplantat och sensorisk nerv reinnervation av dermal graft. Hos råttor har denna konstruktion visat generering av sammansatta muskelverkan potentiella randen (CMAPs), förstärka målet nervens signal från mikro-till milli-volt nivå, med signal till buller nyckeltal i genomsnitt cirka 30-50. Stimulering av dermal komponenten i konstruktionen genererar sammansatta sensoriska nerv åtgärder potentialer (CSNAPs) vid proximala nerv. Som sådan har denna konstruktion lovande framtida nytta mot förverkligandet av den ideala, intuitiva protesen.
Introduction
Extremitetamputationer påverkar nästan 1 av 190 amerikaner1, och deras prevalens beräknas öka från 1,6 miljoner idag till över 3,6 miljoner 20502. Trots dokumenterad användning i över ett årtusende, har den idealiska protesen ännu inte realiserats3. För närvarande finns det komplexa proteser som kan flera gemensamma manipulationer med potential att reproducera många motoriska funktioner i den inhemska änden4,5. Dessa enheter anses dock inte intuitiva eftersom önskad protesrörelse vanligtvis är funktionellt skild från ingångskontrollsignalen. Användare anser vanligtvis dessa "avancerade proteser" svårt att lära sig och därför inte lämpar sig för dagligt bruk1,6. Dessutom ger komplexa proteser som för närvarande finns på marknaden inte någon märkbar grad av subtil sensorisk feedback för adekvat kontroll. Känslan av beröring och proprioception är avgörande för att utföra dagliga uppgifter, och utan dessa, enkla handlingar som att plocka upp en kopp kaffe blir betungande eftersom det är helt beroende av visuella ledtrådar7,8,9. Av dessa skäl är avancerade proteser förknippade med en betydande grad av mental trötthet och beskrivs ofta som betungande och otillfredsställande5,10,11. För att ta itu med detta har vissa forskningslaboratorier utvecklat proteser som kan ge en begränsad grad av sensorisk feedback via direkt neural interaktion12,13,14,15, men feedback är ofta begränsad till små, spridda områden på händer och fingrar12,13, och förnimmelser noterades vara smärtsamma och onaturliga ibland15. Många av dessa studier saknar tyvärr någon märkbar långsiktig uppföljning och nerv histologi att avgränsa lokala vävnadseffekter, samtidigt som man konstaterar gränssnitt misslyckande på omfattningen av veckor till månader16.
För denna population skulle den idealiska protesenheten ge hög trohet motorisk kontroll tillsammans meningsfull somatosensory feedback från individens miljö under hela sin livstid. Avgörande för utformningen av nämnda idealprotes är utvecklingen av ett stabilt, tillförlitligt gränssnitt som skulle möjliggöra samtidig överföring av afferent somatosensorisk information med brusande motorsignaler. Den mest lovande av nuvarande människa-maskin gränssnitt är de som interagerar med det perifera nervsystemet direkt, och den senaste utvecklingen inom neuro-integrerade proteser har arbetat för att överbrygga klyftan mellan bioelektriska och mekaniska signaler17. Strömgränssnitt som används inkluderar: flexibla nervplattor14,15,18,extra neuralmanschettelektroder13,19,20,21,22,23, vävnad genomträngande elektroder24,25,31,32, och intrafasicular elektroder26,27 ,28. Var och en av dessa metoder har dock visat begränsningar när det gäller nervspecificitet, vävnadsskada, axonal degeneration, myelin utarmning och/eller ärrvävnadsbildning i samband med kronisk indwelling främmande kroppssvar16,17,18,19. På senare tid har det varit insatt att en förare bakom eventuella implanterade elektrodfel är den betydande skillnaden i Youngs moduli mellan elektroniskt material och inföding neural vävnad. Hjärnvävnad är föremål för betydande mikrorörelse dagligen, och det har teoretiserats att skjuvning stress framkallas av skillnader i Youngs moduli orsakar inflammation och eventuellpermanent ärrbildning30,31,32. Denna effekt förvärras ofta i extremiteterna, där perifera nerver är föremål för både fysiologisk mikrorörelse och avsiktlig extremitet makrorörelse. På grund av denna ständiga rörelse är det rimligt att dra slutsatsen att utnyttjandet av ett helt abiotiska perifert nervgränssnitt inte är idealiskt, och ett gränssnitt med en biologisk komponent skulle vara lämpligare.
För att ta itu med detta behov av en biologisk komponent utvecklade vårt laboratorium ett biotiska nervgränssnitt som kallas Regenerativ peripheral nerve interface (RPNI) för att integrera transected perifera nerver i en kvarvarande lem med en protesenhet. RPNI tillverkning innebär kirurgiskt implantera en perifer nerv i en autolog fri muskel transplantat, som därefter revascularizes och reinnervates. Vårt labb har utvecklat detta biologiska nervgränssnitt under det senaste decenniet, med framgång i att förstärka och överföra motoriska signaler i kombination med implanterade elektroder i både djur- och mänskliga försök, vilket möjliggör lämplig proteskontroll med flera frihetsgrader2,34. Dessutom har vi separat visat sensorisk feedback genom användning av perifera nerver inbäddade i dermal ympkvistar, kallas Dermal Sensorisk Interface (DSI)3,35. I mer distala amputationer, med hjälp av dessa konstruktioner samtidigt är möjligt som motor och sensoriska fascicles inom målet perifera nerv kan kirurgiskt separeras. Men för mer proximala nivå amputationer, Detta är inte möjligt på grund av sammanblandning av motor och sensoriska fibrer. Composite Regenerativ Peripheral Nerve Interface (C-RPNI) utvecklades för mer proximala amputationer, och det innebär att implantera en blandad sensorimotorisk nerv i en konstruktion bestående av fritt muskeltransplantat säkrat till ett segment av dermal graft(figur 1). Perifera nerver visar förmånliga riktade reinnervation, alltså sensoriska fibrer kommer åter innervat dermal moderplantor och motorfibrer, muskeltransplantat. Denna konstruktion har således förmågan att samtidigt förstärka motoriska signaler samtidigt som somatosensory feedback36 (Figur 2), möjliggör förverkligandet av den ideala, intuitiva, komplexa protesen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utförs under godkännande av University of Michigans kommitté för användning och vård av djur.
OBS: Donatorråttor får fri tillgång till mat och vatten före hud- och muskeldonation. Dödshjälp utförs under djup anestesi följt av kaliumkloridinjektion inom hjärt och hjärt med en sekundär metod för bilaterala pneumothorax. Varje stam av råtta kan teoretiskt utnyttjas med detta experiment; Emellertid, vårt laboratorium har uppnått konsekventa resultat i både manliga och kvinnliga Fischer F344 råttor (~ 200-250 g) vid två till fyra månaders ålder. Donatorråttor måste vara isogenic för de experimentella råttorna.
1. Beredning av dermal-transplantatet
- Anesthetize givaren råtta i en induktionskammare använder en lösning på 5% isofluran i syre vid 0,8-1 L/min. När råttan har sövd, ta bort från induktionskammaren och placera på en andas näsa kon, sänka isofluran till 2-2,5% för underhåll av anestesi.
- Administrera en lösning på 0,02-0,03 mL Carprofen (50 mg/ml) i 0,2 ml steril saline subkutant mellan skulderbladen för analgesi.
- Applicera konstgjorda tårar salva på båda ögonen för att förhindra hornhinnans sår.
- Med hjälp av klippare, raka hela nedre bakbenet(er), fotled sregionen, och sidorna av tass (s).
- Rengöra valda bakben och plantar yta av tass med alkohol, följt av iodopovidone lösning, slutar med en slutlig rengöra med alkohol för att ta bort resterande iodopovidone.
- Med hjälp av en handhållen mikromotor hög hastighet borr med en avtagbar rund fin grus polering sten (4000 rpm), burr plantar ytan av tassen för att ta bort epidermis. Medan gradering, applicera droppar av saline som att inte bränna huden. Den underliggande dermis kommer att ha ett glänsande utseende med exakt blödning.
- Applicera en tourniquet på den nedre änden för att bromsa blodflödet.
- Ta bort plantarhuden kraftigt med en #15 skalpell och placera i saltfuktad gasväv för att förhindra uttorkning. Vissa tendinous och bindväv kommer i sig att tas bort med huden i detta steg och kommer att tas bort senare.
- Applicera gasvävwrap på blödningsfoten för långsam blödning. Upprepa steg 1,5-1,9 om du gör två konstruktioner.
- Under ett mikroskop (20x förstoring), ta bort den tendinösa och bindväv från det djupa lagret av huden ympkvisten med mikrosaxar. Var noga med att inte göra hål i transplantatet. Det tunnadermala transplantatet ska vara något ogenomskinligt och endast innehålla dermis, som mäter ca 0,5 cm x 1,0 cm i storlek.
- Placera i saline-fuktad gasväv tills redo för C-RPNI konstruera tillverkning. Ympkvistar bör användas inom 2 timmar efter skörden.
2. Beredning av muskeltransplantat
- Gör ett längsgående snitt längs den främre aspekten av nedre bakbenet från strax ovanför fotleden till strax under knäet med en #15 skalpell. Dissekera genom subkutan vävnad för att exponera den underliggande muskulaturen.
- Vid den distala aspekten av snittet, exponera de sena infogningar i nedre delen muskulatur. Tibialis främre (TA) är vanligtvis den största och mest främre av musklerna, och strax under och bakre till denna muskel ligger extensor digitorum longus (EDL). Isolera den distala EDL sena från andra senor i området, var noga med att inte incise dess insättning på denna punkt.
- Se till att isoleringen av rätt senor genom att sätta in båda pinnarna på en pincett under senan och utöva uppåttryck genom att öppna pincetten för att orsaka sena utflykt. Manipulering av denna sena bör orsaka att alla tår att sträcka sig samtidigt.
- Utför en distala tenotomy med skarp iris sax och separera muskeln från de omgivande vävnaderna rakt på sak med tenotomies (eller andra trubbigt tippade sax) arbetar proximalt för att hitta det sena ursprunget.
- När proximala sena visualiseras, återigen utföra en tenotomy använder skarp iris sax. Placera muskeltransplantat i en saline-fuktad gasväv för att förhindra uttorkning.
- När alla önskade transplantat har tagits bort från en donatorråtta avlivas i första hand genom ccl-injektion inom hjärt (1-2 mEq K+/kg) följt av sekundär dödshjälp med bilaterala punkteringspneumothorax med ett #15 blad.
3. Gemensam peroneal nervisolering och beredning
- Anesthetize och ge analgesi till den experimentella råtta enligt protokoll som beskrivs i steg 1.1-1.3.
- Raka önskat lår och rengöra med alkohol, betadin, slutar med alkohol för att ta bort spår av betadin.
- Flytta djur från kirurgiska prep bord till kirurgiska mikroskop bord och placera på värmedyna med temperatur sond för kroppstemperatur underhåll. Underhåll isofluran vid 2-2,5% och syre vid 0,8-1 L/min.
- Markera snittet, sträcker sig från bara distala till ischiassk tår till den sämre delen av knäet. Denna märkning bör vara sämre än, och vinklade bort från, lårbenet. Gör snittet med ett #15 blad som framtänder genom den underliggande biceps femoris fascia.
- Dissekera försiktigt genom biceps femoris muskel med antingen en hemostat eller trubbigt tippade mikro-sax till utrymmet underliggande biceps femoris.
OBS: Ischiasnerven färdas ungefär i samma riktning som det första snittet som gjordes. Det finns tre grenar, vanligtvis med fonetiska nerv posterior och gemensamma peroneal och skennerven reser ytligoch djupt till knäet, respektive. - Efter identifiering av den gemensamma peroneal (CP) nerv, med hjälp av ett par mikro-, fin-tippade pincett och mikro-sax, isolera noggrant CP nerv från andra ischiasgrenar och ta bort eventuella kvardröjande bindväv distally.
- Vid den punkt där nerven korsar ytan av knäet, kraftigt transect nerven med ett par mikro-sax.
OBS: Använda vasssax är oerhört viktigt i detta steg som orsakar betydande trauma mot nerven kan öka risken för neuroma bildning. - Fri försiktigt eventuella återstående bindväv från CP nerv och arbeta proximalt för att frigöra nerven till en längd av ca 2 cm.
4. C-RPNI konstruera tillverkning
- Ta bort muskeltransplantat et från saltlösning-fuktad gasväv och ta bort alla centrala tendinous vävnad samt ett litet centralt segment av epimysium. Lämna de sena ändarna intakta.
- Använda en 8-0 nylon sutur, säkra epineurium av den transected änden av CP nerv till området för muskeltransplantat saknar epimysium med två avbrutna stygn på vardera sidan av nerven.
- Säkra muskeltransplantat till lårbenet periosteum med en enda 6-0 nylon avbruten stygn både proximalt och distally med nervmuskeln korsningen vänd bort från lårbenet.
OBS: Säkra muskeln så att den är vid normal avslappnad längd. Försök att inte sträcka muskeln betydligt eller lämna för mycket slapphet när du säkrar. - Placera en 8-0 nylon stygn på sämre, central marginal av muskeltransplantat epimysium, säkra den till CP nerv epineurium på ett sätt som att skapa slapphet i nerven i muskeltransplantat och bidra till att lindra eventuella framtida spänningar det kan utsättas för med senare ambulation.
- Ta bort hudtransplantatet från saltlösningsfuktad gasväv och ordna det på muskeltransplantatpå ett sådant sätt att helt täcka nerven och majoriteten av muskeln. Se till att dermis djupa marginal vilar på muskeln. Trimma eventuella dermis som sträcker sig bortom gränsen till muskeln.
- Säkra hudtransplantatet till muskeltransplantatet omistlig med 8-0 nylon avbrutna suturer. Vanligtvis används 4-8 totala suturer beroende på konstruktionens storlek.
- Stäng biceps femoris fascia över konstruktionen på ett löpande sätt med 5-0 kromsutur.
- Stäng den överliggande huden med 4-0 krom i kör mode.
- Svabb operationsområdet med en alkoholpad och applicera antibiotikasalva.
- Upphöra inhalationsbedövning och låt råtta återhämta sig med mat och vattenkällor åtskilda från burkompisar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruera tillverkning anses misslyckas om råttor utveckla en infektion eller inte överlever kirurgiskanestesi. Tidigare forskning har visat att dessa konstruktioner kräver cirka tre månader för att revascularize och reinnervate2,3,17,36. Efter återhämtningsperioden på tre månader kan konstruktionstester utföras för att undersöka lönsamheten. Kirurgisk exponering av konstruktioner efter tre månader kommer att avslöja revascularized muskler och hud om det lyckas(Figur 3). Ibland kan de fria muskel- och hudtransplantaten bestå enbart av ärrvävnad, och/eller nerven kommer inte att fästas vid konstruktionen; dessa resultat tyder på ett misslyckat försök. Men om det lyckas, mild klämma av den gemensamma peroneal nerv med pincett proximala till konstruktionen kommer att resultera i synlig muskelkontraktion (Video 1). Histologisk analys av konstruktioner bör visa livskraftig hud, nerv och muskler (Figur 4). Immunostaining kommer också att avslöja motorisk och sensorisk nervreinnervation till sina neuromuskulära korsningar och sensoriska ändorgan, respektive (Figur 5). Om den gemensamma peroneal nervinte reinnervate dessa vävnader, immunostaining kommer inte att visa några enskilda nervfibrer i konstruktionen med undantag för den implanterade nerven själv.
Elektrofysiologisk testning kan utföras på dessa konstruktioner in vivo (figur 6); tidigare forskning har bedrivits vid 3 och 9 månader efter C-RPNI tillverkning36 (tabell 1). Efter maximal stimulering med en krok elektrod vid proximala gemensamma peroneal nerv bara distala till sin start från ischiasnerven, sammansatta muskelverkan potentiella randämnen (CMAPs) kan mätas vid muskelkomponenten med synlig muskelkontraktion. Den typ av elektrod som används vid muskeln kan variera beroende på preferens, men epimysial patch, epimysial pad och bipolär sond elektroder har använts framgångsrikt i denna forskning. Den genomsnittliga CMAP amplitud som registrerats vid muskeln var 8,7 ± 1,6 mV vid 3 månader och 10,2 ± 2,1 mV vid 9 månader. Den genomsnittliga ledningshastigheten var 10 ± 1,2 m/s vid 3 månader och 9,5 ± 0,6 m/s vid 9 månader. I jämförelse, CMAPs genereras av fysiologiska EDL muskel varierar vanligtvis från 10-18 mV37. Efter stimulering vid dermal-komponenten i C-RPNI producerades sammansatta sensoriska nervverkspotentialer (CSNAPs) vid proximala gemensamma peronealnerven, med genomsnittlig CSNAP amplitud som mäter 113,7 ± 35,1 μV vid 3 månader och 142,9 ± 63,7 μV vid 9 månader. Figur 7 illustrerar enkla och summering CMAP och CSNAP-signaler som erhållits under elektrofysiologisk testning i ett grafiskt format.
C-RPNI tjänar till att förstärka en nerv inneboende mikrovolt signal, och tidigare forskning har visat tillräcklig förstärkning från mikrovolt till millivolt nivå38. Om en konstruktion inte ger denna förstärkningsnivå anses den därför inte framgångsrik. Om antingen dermal, muskel, eller båda komponenterna i C-RPNI misslyckas, skulle testning resultera i inspelningar som efterliknar stimulering signal utnyttjas. För muskelkomponenten specifikt, ett suboptimalt resultat (men en som fortfarande anses vara operativ) skulle vara en som har CMAP amplitud och resistiv hastighet i intervallet som faller mellan signal stimulering svärdet och physiologic EDL muskel. Dessutom kan dessa signaler dämpas och saknar den karakteristiska CMAP vågform (Figur 8A). Suboptimala resultat på nivån för dermal komponenten kan uppstå men är svåra att kvantifiera med tanke på att råttor inte kan uttrycka kvaliteten på känslan de upplever. Dessa suboptimala resultat innebär vanligtvis dämpning av vågformen med betydande bakgrundsljud(figur 8B). Men om det finns betydande ärrbildning eller kallanvändning av huden ympkvisten, eller minimalt transplantat överlevde, inga CSNAPs kommer att uppskattas vid proximala gemensamma peroneal nerv oavsett stimulering värde.
Bild 1: Belysande schematisk av C-RPNI-konstruktionen. Den gemensamma peroneal nerv kan ses säkras mellan den övre dermal lager och botten muskelskikt. Denna konstruktion är säkrad till lårbenet periosteum proximalt och distally via EDL: s tendinous korsningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: En bildmässig representation av C-RPNI hos en patient med en transradiell amputation. Användaren bildar en önskad motor avsikt på cerebral nivå (t.ex. pincer grepp), som överförs som en sprudlande motorsignal till C-RPNI via den implanterade perifera nerven. Denna signal genererar en sammansatt muskelverkan potential (CMAP) vid muskelkomponenten, som registreras av implanterade elektroder och erkänns av protesenheten, genererar önskad rörelse. Sensorer på enhetens fingertoppar känner igen mängden tryck som genereras och vidarebefordrar informationen till en elektrod implanteras i dermal-komponenten i C-RPNI. Dessa signaler aktiverar motsvarande sensoriska slutorgan, vilket genererar en brusande sammansatt sensorisk amellansensorisk adrisk adriska nervverkan potential (CSNAP) överförs genom perifera nerv till sensoriska cortex. En exempelsignal som genereras vid varje komponent avbildas i de blå rutorna som avbildas bredvid varje komponent. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: C-RPNI in vivo. A)En C-RPNI omedelbart efter tillverkning och vid (B) 3 månader efter konstruktion vid tidpunkten för elektrofysiologisk testning. Muskelkomponenten är konstruktionens djupa lager och hud, det ytliga. Muskelvävnad kännetecknas av (M), dermis (D) och vanlig peroneal nerv (N). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: C-RPNI histologi 6 månader. C-RPNI H&E vid 6 månader i(A)tvärsnitt och (B)longitudinell sektion. Muskel nattetid (M), dermis (D) och nerv (N). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Immunfärgning av C-RPNI. (A)Representativt exempel på ett tvärsnitt av muskelvävnad, med röda pilar som identifierar neuromuskulära korsningar. En högre förstoring av den centrala neuro-muskulös korsning (NMJ) avbildas längst ner till höger. (B)Närbild av en neuromuskulär korsning som noteras i provet. För (A) och (B), röd färgning (alfa-bungarotoxin) indikerar närvaron av kolinerga receptorer i muskelvävnad; blå (neurofilament 200) anger förekomst av neurofilament inom neuronal vävnad; och gröna (kolinacetyltransferas) anteckningar specifikt motor neuron närvaro. (C)Representativt exempel på en iDISCO bild med fokus på dermal korsningen, med röda pilar märkning sensoriska nervceller (vit) in i dermis. (D)On-lay syn på iDISCO visar flera sensoriska nervceller (vit, neurofilament 200). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 6: Elektrofysiologisk testning schematisk. Den övre bilden är en illustration av standardelektrodarrangemanget för testning av C-RPNI-konstruktionerna. Det finns en patch och / eller sond elektrod placeras på både muskel och dermal komponenter i C-RPNI, med en dubbel krok elektrod placeras vid den gemensamma peroneal nerv proximalt. Den nedre bilden är ett in vivo exempel på testarrangemanget på ett råttämne. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 7: Typisk C-RPNI-elektrofysiologisk signalering. (A)En enda CMAP-signal som registrerats vid muskelkomponenten efter en 5,00 mA-signal som appliceras på CP-nerven. (B)24 CMAPs genereras av 5,00 mA stimulering vid nerven. (C)En enda CSNAP-signal som registrerats från proximala CP-nerv en efter dermal komponentstimulering vid 900 μA. (D)En serie cnaps som registrerats från proximala CP-nerven efter ökad stimulering vid dermalkomponenten från 500 μA till 1000 μA. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 8: Onormal C-RPNI-signalering. (A)En serie CMAPs erhålls under rampning CP nerv stimulering från 0,2 till 4 mA. Waveforms topp vid olika punkter och misslyckas med att återgå till baslinjen, eventuellt indikerar defekta elektroder eller otillräcklig övergripande konstruktionsfunktion. B)Summering av cnaps erhålls samtidigt som de stimulerar dermal-komponenten, rampning 0,1–5 mA. Dessa fynd kan förekomma av många skäl, inklusive felelektrodering(er), dermal graft ärrbildning och/eller nervskador. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 3 månaders data | CMAP-data (Stimulera CP-nerv och spela in från muskeltransplantat) | CSNAP-data (Stimulera hudtransplantat och spela in från CP-nerv) | |||||
| Rat-ID-nummer | Konstruera vikt (g) | Stimulering amplitud (mA) | Ledningshastighet (m/s) | V Peak-to-Peak (mV) | Stimulering amplitud (mA) | Ledningshastighet (m/s) | V Topp-till-topp (μV) |
| 4607 | 0.087 | 4.17 | 11.3 | 10.3 | 18 | 11.1 | 121 |
| 4608 | 0.15 | 1.65 | 11.1 | 17.1 | 7.7 | 6.5 | 136 |
| 4611 | 0.113 | 8.3 | 9.6 | 11.2 | 10 | 10 | 121 |
| 4613 | 0.116 | 3.18 | 10 | 9.6 | 1.44 | 8.3 | 134 |
| 4614 | 0.189 | 3 | 10.8 | 9.6 | 7.39 | 9 | 151 |
| 4616 | 0.122 | 5.2 | 9.4 | 14.9 | 1.8 | 9.1 | 100 |
| 4620 | 0.118 | 2.91 | 7.6 | 7.4 | 8.7 | 10 | 219 |
| 9 månaders data | CMAP-data (Stimulera CP-nerv och spela in från muskeltransplantat) | CSNAP-data (Stimulera hudtransplantat och spela in från CP-nerv) | |||||
| Rat-ID-nummer | Konstruera vikt (g) | Stimulering amplitud (mA) | Ledningshastighet (m/s) | V Peak-to-Peak (mV) | Stimulering amplitud (mA) | Ledningshastighet (m/s) | V Topp-till-topp (μV) |
| 4687 | 0.238 | 1.35 | 9.6 | 18.2 | 0.99 | 11 | 181 |
| 4688 | 0.131 | 1.08 | 10 | 8.8 | 1.11 | 8 | 132 |
| 4689 | 0.26 | 1.26 | 9.6 | 21.8 | 1.9 | 8.6 | 237 |
| 4690 | 0.192 | 4.2 | 8.3 | 12.8 | n/a | n/a | n/a |
| 4691 | 0.213 | 1.38 | 10 | 18.6 | 6.6 | 8 | 153 |
| 4693 | 0.178 | 1.11 | 9.6 | 15.1 | 8.7 | 8.3 | 306 |
Tabell 1: Elektrofysiologisk testning av C-RPNIs vid 3- och 9-månaders efterkonstruktion. För att få CMAPs, en inspelning elektrod placerades på muskeln med en stimulerande elektrod på proximala gemensamma peroneal nerv. En serie stimuleringar som ökade i amplitud applicerades på nerven tills maximal CMAP-värden erhölls och resultat registrerades. En liknande metod tillämpades på dermal komponentmen med inspelningen elektroden placeras på nerven och stimulera elektrod på dermis. För sensorisk utvärdering av råttan 4690 vid 9 månader, dermal transplantat befanns vara alltför ärrad för att möjliggöra testning.
Video 1: Muskelkontraktion inom en C-RPNI. Ett par pincett kan ses till vänster om videon försiktigt klämma proximala gemensamma peroneal nerv. Detta resulterar i sammandragning av muskelkomponenten i en 3 månader gammal C-RPNI som är synlig för betraktaren. Klicka här för att se den här videon (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C-RPNI är en ny konstruktion som ger samtidig förstärkning av ett mål nerv motor brusande signaler med tillhandahållande av afferent sensorisk feedback. I synnerhet har C-RPNI unikt nytta för dem som lever med proximala amputationer som deras motor och sensoriska fascicles kan inte lätt mekaniskt separeras under kirurgi. Istället använder C-RPNI de inneboende förmånsförrättningar av nerven själv för att uppmuntra sensorisk fiber reinnervation att dermal sensoriska slutorgan och motorfibrer till neuromuskulära korsningar.
Som C-RPNI tillverkning bygger på reinnervation förmågor målnerven, noggrann hantering av nerven är av största vikt under förfarandet. Under dissekering, undvika direkt manipulation av, och trauma till, målet nerv. Om nerven måste hanteras, rekommenderas att manipulera epineurium eller omgivande bindväv istället. Även om vårt laboratorium inte har stött på neuroma bildning inom denna konstruktion, teoretiskt, betydande nervtrauma kan öka risken. Ytterligare ett viktigt steg i processen är skörden av dermal ympkvistar. All epidermal vävnad måste tas bort från hindpaw transplantat et as behålls epidermis kan öka risken för infektion och integration cystor under läkningsprocessen. Dessutom måste dermal transplantatet vara tillräckligt tunnat för att främja imbibition och revascularization i hela transplantatet och undvika betydande ischemi och nekros.
Även om majoriteten av studier som utförts med C-RPNI har utförts på den gemensamma peroneal nerv, kan alla blandade sensorimotor nerv ersättas. En ren motor eller ren sensorisk nerv kan utnyttjas, men resultaten är svåra att förutsäga och skulle sannolikt resultera i antingen till stor del muskler eller dermal reinnervation, respektive. När det gäller muskeltransplantat, så länge epimysium tas bort från den del som kontaktar nerven, kan alla muskeltransplantat liknande i storlek utnyttjas så länge den innehöll tendinous eller fascial vävnad i endera lämplig för förankring till närliggande periosteum. För dermal graft används glabrousvävnad specifikt på grund av risken för hårväxt efter ympning. Icke-glabrous hud har tidigare försökt, men på grund av svårigheten att ta bort enskilda hårsäckar, alla resulterande konstruktioner hade betydande hårväxt, inflammation, och ärrbildning efter tre månaders mognadsperiod. Dessutom kan andra råtta arter användas, men Lewis och Fischer råttor rekommenderas för detta experiment som många andra råtta arter kommer självstympa sekundärt till nerv transection39,40.
Med tanke på förseningen mellan förfarandet och resultaten är det svårt att veta i förväg om några ändringar måste göras av metoden. Infektion är en teoretisk risk som sällan uppstår av vårt laboratorium, men om infektion inträffar, är det vanligtvis lyhörd för antibiotika. Ibland tuggar råttor på sina snitt som orsakar dehiscence, och detta kan behandlas med washout, debridement och återförslutning. Om konstruktionen efter tre månader vid exponeringstillfället visar sig vara icke-funktionell och/eller ärrad finns det flera potentiella orsaker. Ibland, om nerven inte är ordentligt säkrad till konstruktionen med minst tre suturer, kan nerven riva från konstruktionen med ambulation. Dessutom kan muskeln och/eller dermal-transplantaten nekros, vilket orsakar misslyckande. Typiskt, Detta är ett resultat av antingen upprepad infektion, dermal transplantatär är för tjock, eller muskeln alltför skadad vid skörd för att återhämta sig ordentligt. Dessutom, om muskeln inte är säkrad till periosteum vid vilolängd, kan kontraktion försämras orsakar otillräckliga signaler under testning. Ibland kommer konstruktionen att verka livskraftig, men misslyckas med att producera adekvata CMAPs/CSNAPs på testning (5-10% av konstruktioner, i genomsnitt). Detta kan vara sekundärt till fel i utrustning, förhöjd elektrod impedans, eller betydande hud callusing. Hudanropkan dämpa och helt blockera signaltransduktion om dermis inte tunnas ut ordentligt under tillverkningen. Om någon av de föregående beskrivna händelserna ses ofta under testprocessen måste man återgå till protokollet och göra lämpliga ändringar. I vårt laboratorium erfarenhet med över 90 framgångsrika C-RPNI konstruktioner, vår felfrekvens är <5% och vanligtvis tillskrivs kirurgiska fel under tillverkning.
Metoder som vanligen används för att förstärka eller spela in nervsignaler inkluderar flexibla nervplattor18,extra neurala manschettelektroder19,20,21,22,23, vävnad genomträngande elektroder24,25,31,32, och intrafaskulära elektroder26,27,28, som alla har associerats med vävnadsskada, axonal degeneration och/eller ärrvävnadsbildning. Detta ärrbildning tillskrivs ofta kronisk indwelling främmande kropp svar29 och skjuvning stress framkallas av skillnader i Youngs moduli30. C-RPNI är dock en biologisk konstruktion och därmed inte inducera främmande kroppen svar i neuralvävnad. Dessutom är dess mekaniska egenskaper flera faktorer närmare neuralvävnad än elektroder. Histologic analys av dessa prover har inte visat någon betydande grad av ärrvävnad bildas i nerven med kronisk användning, vilket gör att C-RPNI att samverka med nerven under längre perioder i jämförelse med de metoder som anges ovan. Även om denna metod är mycket effektiv vid förstärkning av brusande motorsignaler, är den begränsad när det gäller sensorisk afferent signalproduktion. Vi har mätt och karakteriserat signaltransduktion som produceras med mekanisk och elektrisk stimulering av dermal komponenten i C-RPNI36; Emellertid, dessa råtta ämnen kan inte kvalificera den typ eller grad av förnimmelser framkallas från stimulering av denna konstruktion. Som sådan, vid denna tid är det omöjligt att veta vilken typ av effekt C-RPNI producerar när det gäller känsla. Framtida riktningar för denna konstruktion kommer att omfatta karakterisering av signaler som produceras i proximala nerv efter specifika förutsatt stimuli (t.ex. värme, smärta, tryck, etc.) samt korrelation med somatosensory framkallat potentialer som genereras i sensorisk cortex av gnagare hjärnan. Det är vårt laboratorium s mål att etablera en omfattande grund för C-RPNIs som kommer att bana väg för klinisk översättning till försökspersoner.
Föregångaren till C-RPNI, RPNI (regenerativ perifert nervgränssnitt), består av en fri muskel transplantat fäst vid en transected nerv, med motorfibrer reinnervating tidigare denervated neuromuskulära korsningar. RPNI har visat nytta hos försökspersoner, med flera patienter som kontrollerar avancerade proteser från signaler förstärkta by-och registreras från dessa RPNIs34. Dessutom har dessa RPNIs visat positiva behandlingseffekter bortom proteskontroll, med flera preliminära retrospektiva och prospektiva studier som visar minskad neurombildning, kronisk smärta och fantomlemsmärta hos de patienter med extremitetsamputationer. Trots dessa framgångar, ett vanligt klagomål för dem som använder dessa avancerade proteser, är dock behovet av att visualisera protesen under användning eftersom dessa proteser saknar proprioception och ge minimal sensorisk feedback. C-RPNI kan vara en lösning på denna gemensamma kritik genom att ge ett sätt att leverera sensorisk feedback via dermal komponent, vilket leder till förverkligandet av den mycket önskade, idealiska protes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga avslöjanden.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Jana Moon för expert teknisk hjälp. Studier som presenteras i denna uppsats finansierades genom ett R21 (R21NS104584) bidrag till SK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scalpel | Aspen Surgical, Inc | Ref 371115 | Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15) |
| 4-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 1654G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 5-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 687G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 6-0 Ethilon Suture | Ethicon | SKU# 697G | P-1 Reverse Cutting Needle (Nylon suture) |
| 8-0 Monofilament Suture | AROSurgical | T06A08N14-13 | Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle |
| Experimental Rats | Envigo | F344-NH-sd | Rats are Fischer F344 Strain |
| Fluriso (Isofluorane) | VetOne | 13985-528-40 | Inhalational Anesthetic |
| Micro Motor High Speed Drill with Stone | Master Mechanic | Model 151369 | Handheld rotary tool; kit comes with multiple fine grit stones |
| Oxygen | Cryogenic Gases | UN1072 | Standard medical grade oxygen canisters |
| Potassium Chloride | APP Pharmaceuticals | 63323-965-20 | Injectable form, 2 mEq/mL |
| Povidone Iodine USP | MediChoice | 65517-0009-1 | 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Corneal protective ointment for use during procedure |
| Rimadyl (Caprofen) | Zoetis, Inc. | NADA# 141-199 | Injectable form, 50 mg/mL |
| Stereo Microscope | Leica | Model M60 | User can adjust magnification to their preference |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | Various | User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab |
| Triple Antibiotic Ointment | MediChoice | 39892-0830-2 | Ointment comes in sterile, disposable packets |
| VaporStick 3 | Surgivet | V7015 | Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister |
| Webcol Alcohol Prep | Coviden | Ref 6818 | Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep |
References
- Biddiss, E. A., Chau, T. T. Upper limb prosthesis use and abandonment: A survey of the last 25 years. Prosthetics and Orthotics International. 31 (3), 236-257 (2007).
- Kung, T. A., et al. Regenerative peripheralnerve interface viability and signal transduction with an implanted electrode. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (6), 1380-1394 (2014).
- Larson, J. V., et al. Prototype Sensory Regenerative Peripheral Nerve Interface for Artificial Limb Somatosensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 133 (3 Suppl), 26-27 (2014).
- Hijjawi, J. B., et al. Improved myoelectric prosthesis control accomplished using multiple nerve transfers. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (7), 1573-1578 (2006).
- Pylatiuk, C., Schulz, S., Döderlein, L. Results of an Internet survey of myoelectric prosthetic hand users. Prosthetics and Orthotics International. 31 (4), 362-370 (2007).
- Baghmanli, Z., et al. Biological and electrophysiologic effects of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) on regenerating peripheral nerve fibers. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (2), 374-385 (2013).
- Dhillon, G. S., Horch, K. W. Direct neural sensory feedback and control of a prosthetic arm. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 13 (4), 468-472 (2005).
- Romo, R., Hernández, A., Zainos, A., Salinos, E. Somatosensory discrimination based on cortical microstimulation. Nature. 392, 387-390 (1998).
- O'Doherty, J., et al. Active tactile exploration using a brain-machine-brain interface. Nature. 479, 228-231 (2011).
- Stein, R. B., Walley, M. Functional comparison of upper extremity amputees using myoelectric and conventional prostheses. Archives of Physical Medicine and Rehabilitation. 64 (6), 243-248 (1983).
- Millstein, S. G., Heger, H., Hunter, G. A. Prosthetic Use in Adult Upper Limb Amputees: A Comparison of the Body Powered and Electrically Powered Prostheses. Prosthetics and Orthotics International. 10 (1), 27-34 (1986).
- Zollo, L., et al. Restoring tactile sensations via neural interfaces for real-time force-and-slippage closed-loop control of bionic hands. Science Robotics. 4 (27), eaau9924 (2019).
- Tan, D. W., et al. A neural interface provides long-term stable natural touch perception. Science Translational Medicine. 6 (257), 257ra138 (2014).
- Stieglitz, T., et al. On Biocompatibility and Stability of Transversal Intrafascicular Multichannel Electrodes-TIME. Converging Clinical and Engineering Research on Neurorehabilitation II. 15, 731-735 (2017).
- Petrini, F. M., et al. Six-months assessment of a hand prosthesis with intraneural tactile feedback. Annals of Neurology. 85 (1), 137-154 (2019).
- Jung, R., Abbas, J., Kuntaegowdanahalli, S., Thota, A. Bionic intrafascicular interfaces for recording and stimulating peripheral nerve fibers. Bioelectronics in Medicine. 1 (1), 55-69 (2018).
- Micera, S., Navarro, X., Yoshida, K. Interfacing With the Peripheral Nervous System to Develop Innovative Neuroprostheses. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 17 (5), 417-419 (2009).
- Stieglitz, T., Schuettler, M., Schneider, A., Valderrama, E., Navarro, X. Noninvasive measurement of torque development in the rat foot: measurement setup and results from stimulation of the sciatic nerve with polyimide-based cuff electrodes. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 11 (4), 427-437 (2003).
- Polasek, K. H., Hoyen, H. A., Keith, M. W., Tyler, D. J. Human nerve stimulation thresholds and selectivity using a multi-contact nerve cuff electrode. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 15 (1), 76-82 (2007).
- Nielson, K. D., Watts, C., Clark, W. K. Peripheral nerve injury from implantation of chronic stimulating electrodes for pain control. Surgical Neurology. 5 (1), 51-53 (1976).
- Waters, R. L., McNeal, D. R., Faloon, W., Clifford, B. Functional electrical stimulation of the peroneal nerve for hemiplegia. Long-term clinical follow-up. Journal of Bone and Joint Surgery. 67 (5), 792-793 (1985).
- Larsen, J. O., Thomsen, M., Haugland, M., Sinkjaer, T. Degeneration and regeneration in rabbit peripheral nerve with long-term nerve cuff electrode implant: a stereological study of myelinated and unmyelinated axons. Acta Neuropathologica. 96 (4), 365-378 (1998).
- Krarup, C., Loeb, G. E., Pezeshkpour, G. H. Conduction studies in peripheral cat nerve using implanted electrodes: III. The effects of prolonged constriction on the distal nerve segment. Muscle Nerve. 12 (11), 915-928 (1989).
- Micera, S., Navarro, X. Bidirectional interfaces with the peripheral nervous system. International Review of Neurobiology. 86, 23-38 (2009).
- Urbanchek, M. G., et al. Microscale Electrode Implantation during Nerve Repair: Effects on Nerve Morphology, Electromyography, and Recovery of Muscle Contractile Function. Plastic and Reconstructive Surgery. 128 (4), 270e-278e (2011).
- Yoshida, K., Horch, K. Selective stimulation of peripheral nerve fibers using dual intrafascicular electrodes. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 40 (5), 492-494 (1993).
- Branner, A., Stein, R. B., Normann, R. A. Selective stimulation of cat sciatic nerve using an array of varying length microelectrodes. Journal of Neurophysiology. 85 (4), 1585-1594 (2001).
- Zheng, X. J., Zhang, J., Chen, T., Chen, Z. Longitudinally implanted intrascicular electrodes for stimulating and recording fascicular physioelectrical signals in the sciatic nerve of rabbits. Microsurgery. 23, 268-273 (2003).
- del Valle, J., Navarro, X. Interfaces with the peripheral nerve for the control of neuroprostheses. International Review of Neurobiology. 109, 63-83 (2013).
- Stiller, A. M., et al. A Meta-Analysis of Intracortical Device Stiffness and Its Correlation with Histological Outcomes. Micromachines. 9 (9), 443 (2018).
- Hanson, T., Diaz-Botia, C., Kharazia, V., Maharbiz, M., Sabes, P. The "sewing machine" for minimally invasive neural recording. bioRxiv. , Published online (2019).
- Yang, X., et al. Bioinspired neuron-like electronics. Nature Materials. 18, 510-517 (2019).
- Irwin, Z. T., et al. Chronic recording of hand prosthesis control signals via a regenerative peripheral nerve interface in a rhesus macaque. Journal of Neural Engineering. 13 (4), 046007 (2016).
- Kubiak, C. A., et al. Abstract 24: Successful Control of Virtual and Robotic Hands using Neuroprosthetic Signals from Regenerative Peripheral Nerve Interfaces in a Human Subject. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (4), 19-20 (2018).
- Sando, I. C., et al. Dermal-Based Peripheral Nerve Interface for Transduction of Sensory Feedback. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (4 Suppl), 19-20 (2015).
- Kubiak, C. A., et al. Abstract 36: Viability and Signal Transduction with the Composite Regenerative Peripheral Nerve Interface (C-RPNI). Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4), 26-27 (2019).
- Kubiak, C. A., et al. Abstract QS18: Neural Signal Transduction with the Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 7 (4 Suppl), 114 (2019).
- Woo, S. L., et al. Utilizing nonvascularized partial skeletal muscle grafts in peripheral nerve interfaces for prosthetic control. Journal of the American College of Surgeons. 219 (4), e136-e137 (2014).
- Sporel-Özakat, R. E., Edwards, P. M., Hepgul, K. T., Savas, A., Gispen, W. H. A simple method for reducing autotomy in rats after peripheral nerve lesions. Journal of Neuroscience Methods. 36 (2-3), 263-265 (1991).
- Carr, M. M., Best, T. J., Mackinnon, S. E., Evans, P. J. Strain differences in autotomy in rats undergoing sciatic nerve transection or repair. Annals of Plastic Surgery. 28 (6), 538-544 (1992).
