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Chemistry

Synthese funktionalisierter magnetischer Nanopartikel, deren Konjugation mit dem Siderophor Feroxamin und deren Bewertung für den Bakteriennachweis

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60842
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 3, 1
1Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA), Departamento de Química, Facultade de Ciencias, Universidade da Coruña, 2Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA), Unidad de Comunicación y Divulgación, Universidade da Coruña, 3Department of Microbiology and Parasitology, Institute of Aquaculture, Universidade de Santiago de Compostela

Summary

Diese Arbeit beschreibt Protokolle für die Herstellung von magnetischen Nanopartikeln, seine Beschichtung mit SiO2, gefolgt von seiner Aminfunktionalisierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und seiner Konjugation mit Deferoxamin unter Verwendung eines Succinylmoiety als Linker. Eine tiefe strukturelle Charakterisierungsbeschreibung und ein Aufnahmebakterientest mit Y. enterocolitica für alle Zwischen-Nanopartikel und das endliche Konjugat werden ebenfalls ausführlich beschrieben.

Abstract

In der vorliegenden Arbeit werden die Synthese von magnetischen Nanopartikeln, ihre Beschichtung mit SiO2, gefolgt von ihrer Aminfunktionalisierung mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES) und ihre Konjugation mit Deferoxamin, einem von Yersinia enterocoliticaerkannten Siderophor, mit einem Succinyl-Moiety als Linker beschrieben.

Magnetische Nanopartikel (MNP) von Magnetit (Fe3O4) wurden nach solvothermaler Methode hergestellt und mit SiO2 (MNP@SiO2) nach dem Stöber-Verfahren beschichtet, gefolgt von der Funktionalisierung mit APTES (MNP@SiO2@NH2). Dann wurde Feroxamin mit dem MNP@SiO2@NH2 durch Carbodiimid-Kupplung konjugiert, um MNP@SiO2@NH2@Fa zu geben. Die Morphologie und eigenschaften der Konjugat- und Zwischenprodukte wurden mit acht verschiedenen Methoden untersucht, darunter Pulver-Röntgenbeugung (XRD), Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FT-IR), Raman-Spektroskopie, Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und energiedispersive S-Ray-Mapping (EDX). Diese erschöpfende Charakterisierung bestätigte die Bildung des Konjugats. Schließlich, um die Kapazität und Spezifität der Nanopartikel zu bewerten, wurden sie in einem Capture-Bakterien-Assay mit Yersinia enterocoliticagetestet.

Introduction

Die Methoden zum Nachweis von Bakterien mit MNP basieren auf der molekularen Erkennung von Antikörpern, Aptamen, Bioproteinen, Kohlenhydraten, die von den pathogenen Bakterien 1 mit MNP konjugiertwerden. Unter Berücksichtigung, dass Siderophore von bestimmten Rezeptoren auf der äußeren Membran von Bakterien erkannt werden, könnten sie auch mit MNP verbunden werden, um ihre Spezifität zu erhöhen2. Siderophore sind kleine organische Moleküle, die an der Fe3+-Aufnahme durch Bakterien beteiligt sind3,4. Die Herstellung von Konjugaten zwischen Siderophoren und MNP zusammen mit ihrer Bewertung für die Abscheidung und Isolierung von Bakterien wurde noch nicht berichtet.

Einer der entscheidenden Schritte bei der Synthese von Konjugaten magnetischer Nanopartikel mit kleinen Molekülen ist die Auswahl der Art der Bindung oder Interaktion zwischen ihnen, um sicherzustellen, dass das kleine Molekül an der Oberfläche des MNP befestigt wird. Aus diesem Grund konzentrierte sich das Verfahren zur Herstellung des Konjugats zwischen magnetischen Nanopartikeln und Feroxamin – dem von Yersinia enterocoliticaerkannten Siderophor – auf die Erzeugung einer veränderbaren Oberfläche des MNP, um es durch Carbodiimidchemie kovalent mit dem Siderophor zu verbinden. Um ein gleichmäßiges Magnetit-Nanopartikel (MNP) zu erhalten und die Keimbildung und Größenkontrolle zu verbessern, wurde in einem thermischen Block eine Solvolyse-Reaktion mit Benzylalkohol ohne Schütteln5durchgeführt. Dann wurde mit der Stöber-Methode eine Kieselsäurebeschichtung erzeugt, um Schutz zu gewähren und die Stabilität der Nanopartikelsuspension in wässrigen Medien zu verbessern6. Unter Berücksichtigung der Struktur des Feroxamins ist die Einführung von Amingruppen notwendig, um geeignete Nanopartikel (MNP@SiO2@NH2) herzustellen, die mit dem Siderophor konjugiert werden. Dies wurde durch Kondensation von (3-Aminopropyl)Triethoxysilan (APTES) mit den auf der Oberfläche der Kieselsäure modifizierten Nanopartikel (MNP@SiO2) mit einer Sol-Gel-Methode7erreicht.

Parallel dazu wurde der Feroxamin-Eisen(III)-Komplex durch Komplexierung des handelsüblichen Deferoxamins mit Eisenacetylaceton in wässriger Lösung hergestellt. NN-Succinylferoxamin, tragende Succinylgruppen, die als Linker fungieren, wurde durch die Reaktion von Feroxamin mit Bernsteinanhydrid erhalten.

Die Konjugation zwischen MNP@SiO2@NH2 und N-Succinylferoxamin, um MNP@SiO2@NHfazu geben, wurde durch Carbodiimid-Chemie unter Verwendung von Kupplungsreagenzien benzotriazol-1-yl-oxy-tris- (di Methylamino)-Phosphoniumhexafluorphosphat (BOP) und 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt) in einem weichen Basismedium zur Aktivierung der Terminalsäuregruppe in N-Succinylferoxamin8. N

Nachdem die MNPs charakterisiert wurden, bewerteten wir die Fähigkeiten von nackten und funktionalisierten magnetischen Nanopartikeln zur Erfassung des Wildtyps (WC-A) und eines Mutanten von Y. enterocolitica ohne Feroxaminrezeptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Plain MNPs, funktionalisierte MNPs und das Konjugat MNP@SiO2@NHFadurften mit jedem Y. enterocolitica Stamm interagieren. Die Bakterien-Konjugat-Aggregate wurden durch die Anwendung eines Magnetfeldes von der Bakteriensuspension getrennt. Die getrennten Aggregate wurden zweimal mit Phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) abgetrennt, in PBS wieder aufgehängt, um serielle Verdünnungen vorzubereiten, und dann wurden sie für die Koloniezählung plattiert. Dieses Protokoll zeigt jeden Schritt der Synthese von MNP@SiO2@NH@Fa, die strukturelle Charakterisierung aller Zwischenprodukte und des Konjugats und einen Bakterium-Capture-Assay als einfache Möglichkeit, die Spezifität des Konjugats in Bezug auf die Zwischenprodukte zu bewerten. 9

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Protocol

HINWEIS: Für die Reaktionen, die unter inerten Atmosphärenbedingungen durchgeführt wurden, wurden alle Glaswaren zuvor in einem Ofen bei 65 °C getrocknet, mit einem Gummiseptum versiegelt und dreimal mit Argon gereinigt.

1. Synthese von magnetischen Nanopartikeln konjugiert mit Feroxamin

  1. Synthese von Fe3O4 magnetischen Nanopartikeln (MNPs)
    1. 0,5 g Fe(acac)3 in eine 20 ml Glasdurchstechflasche geben und dann mit 10 ml Benzylalkohol vermischen.
    2. Beschallen Sie diese Mischung für 2 min, dann auf einen Heizblock übertragen und bei 180 °C für 72 h erhitzen.
    3. Nach Abschluss der Reaktion die Fläschchen abkühlen lassen, die Nanopartikel mit 96% Ethanol und Zentrifuge bei 4000 x g 30 min abspülen.
    4. Trennen Sie die Nanopartikel durch magnetische Anziehung mit einem Neodym -Magneten (NdFeB) vom Überstand und entsorgen Sie das Restlösungsmittel.
    5. Spülen Sie mit 96% Ethanol wiederholenSchritt 1.1.4. und entsorgen Sie den Überstand abwechselnd mit Beschallung in einem Bad für 1 min bei 40 kHz, bis das Lösungsmittel klar aussieht.
  2. Magnetische Nanopartikel SiO2 Beschichtung (MNP@SiO2)
    1. Bereiten Sie eine Suspension von 2 g MNP in 80 ml Isopropanol vor und fügen Sie dann 4 ml 21% Ammoniak, 7,5 ml destilliertes Wasser und 0,56 ml Tetraethylorthosilikat (TEOS) (in dieser Reihenfolge) in einem runden Bodenkolben mit einem magnetischen Rührstab hinzu.
    2. Die Mischung bei 40 °C für 2 h unter kontinuierlichem Rühren erhitzen und dann 1 h beschallen.
    3. Trennen Sie die MNP mit einem Magneten, entsorgen Sie den Überstand und dispergieren Sie ihn in 30 ml Isopropanol.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.1. und 1.2.2.
    5. Entfernen und waschen Sie die magnetische Rührstange mit 96% Ethanol, um das gesamte Material zurückzugewinnen.
    6. Trennen Sie die Nanopartikel vom Überstand durch magnetische Anziehung mit einem Magneten.
    7. Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie die Nanopartikel mit 96% Ethanol dreimal abwechselnd mit Beschallung ab.
    8. Trocknen Sie die Nanopartikel unter Vakuum bei Raumtemperatur für 12 h.
  3. Funktionalisierung von MNP@SiO2 mit (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTES)
    1. Spülen Sie 500 mg des MNP@SiO2 aus dem vorherigen Schritt mit N,N-Dimethylformamid (DMF) unter inerte Atmosphäre erhalten und dann für 1 min bei 40 kHz beschallen. Entsorgen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie diesen Vorgang dreimal.
    2. Die Partikel unter Rühren mit einem magnetischen Rührstab in einem runden Bodenkolben wieder aufhängen und 9 ml APTES hinzufügen.
    3. Die Mischung bei 60 °C 12 h rühren.
    4. Entsorgen Sie den Überstand und spülen Sie die Nanopartikel mit 96% Ethanol dreimal abwechselnd mit Beschallung ab.
  4. Synthese von Feroxamin
    1. 100 mg (0,15 mmol) Deferoxamin-Mesylatsalz und 53,0 mg (0,15 mmol) Fe(acac)3 in 5 ml destilliertem Wasser auflösen und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur rühren.
    2. Waschen Sie das resultierende Produkt dreimal mit 20 ml EtOAc in einem Trenntrichter und entfernen Sie dann das organische Lösungsmittel unter Vakuum mit einem Rotatorverdampfer.
    3. Gefriertrocknen Sie die wässrige Phase, um sich Feroxamin als roten Feststoff zu leisten.
  5. Synthese Nvon N-Succinylferoxamin
    1. Fügen Sie 350 mg (3,50 mmol) Bernsteinanhydrid zu einer Lösung von 100 mg (0,17 mmol) Feroxamin in 5 ml Pyridin in einem 50 ml runden Bodenkolben unter inerter Atmosphäre hinzu.
    2. Die resultierende Mischung bei Raumtemperatur 16 h rühren. Nach dieser Zeit entfernen Sie den Überschuss von Pyridin unter reduziertem Druck in einem rotatorischen Verdampfer, um einen dunkelroten Feststoff zu erhalten.
    3. Lösen Sie die Reaktion roh in 3 ml Methanol.
    4. Die Methanollösung in eine Sephadex-Säule (20 cm Sephadex in einer 20 mm Durchmesser-Säule) geben und bei 0,5 ml/min elute.
    5. Sammeln Sie die rote Fraktion und entfernen Sie das Methanol unter Vakuum mit einem rotatorischen Verdampfer.
  6. Synthese des Konjugats MNP@SiO2@NH@Fa
    1. Spülen Sie 30 mg trockene MNP@SiO2@NH2 zweimal mit DMF und beschallen Sie die Nanopartikel in einem 100 ml Erlenmeyer Kolben für 30 min unter inerer Atmosphäre.
    2. Herstellung einer Lösung von N-Succinylferoxamin (200 mg, 0,30 mmol), Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphat (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) und N,N-Diisopropylethylamin(DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) in 10 ml DMF (Mix A) in einem 50 ml Rundkolben unter inerter Atmosphäre. N
    3. Die zuvor MNP@SiO2@NH2 in 3 ml DMF unter Beschallung unter trockenen Bedingungen unter sauerstofffreien Bedingungen unter Einer Argongasatmosphäre (Mix B) aussetzen.
    4. Fügen Sie Mix A hinzu, um B dropwise zu mischen.
    5. Schütteln Sie die endgültige Mischung mit einem Orbital-Shaker bei Raumtemperatur über Nacht.
    6. Trennen Sie das resultierende Konjugat (MNP@SiO2@NH@Fa) von der Suspension mit einem Magneten.
    7. Spülen Sie den resultierenden Feststoff und beschallen Sie ihn dann fünfmal mit 10 ml Ethanol.
    8. Trocknen Sie den Feststoff unter Vakuum für 24 h.

2. Bakterielle Assay mit Y. enterocolitica Stämmen, um den Abfang von pathogenen Bakterien mit Nanopartikeln zu quantifizieren

  1. Bereiten Sie eine Suspension aller Zwischen-Nanopartikel und des Endkonjugats in PBS bei 1 mg/ml in sterilen 2 ml-Röhrchen vor.
  2. Bereiten Sie eine Kultur von Y. enterocolitica in 5 ml Luria Bertani (LB) Brühe über Nacht Inkubation bei 37 °C.
  3. Bereiten Sie eine 5 ml Eisenmangel tryptische Sojabrühe (TSB) durch Zugabe von 50 l von 10 mM 2,2-bipyridyl.
  4. Die 5 ml Eisenmangel TSB mit 50 l der Nachtkultur von Y. enterocolitica impfen und dann bei 37 °C mit Rührung inkubieren, bis eine OD600 = 0,5-u20120.8 erreicht ist.
  5. Nehmen Sie 100 l der in Schritt 2.4 erhaltenen Kultur und verdünnen Sie sie in einem 2,0 ml-Rohr mit 900 l PBS, um eine erste Verdünnung von 1/10 zu erhalten. Bereiten Sie dann eine Verdünnung von 1/100 aus der ersten Verdünnung mit dem gleichen Verfahren vor, um eine Konzentration von Bakterienzellen bei 1 x 106 Colony Forming Units (CFU)/ml ungefähr zu erhalten.
  6. Fügen Sie 100 l Nanopartikel Suspension bei 1 mg/ml bis 1 ml der 1/100 Verdünnung der bakteriellen Suspension in einem 2,0 ml Rohr hinzu und homogenisieren mit Wirbel.
  7. Die Kultur bei 20 °C für 1 h inkubieren.
  8. Trennen Sie die MNP/Bakterienaggregate mit einem Magneten und entsorgen Sie den Überstand sorgfältig.
  9. Spülen Sie die abgetrennten Nanopartikel zweimal mit 1 ml PBS mit einem Wirbel.
  10. Setzen Sie die Nanopartikel in 1 ml PBS aus, um die Menge der bakteriellen Erfassung in CFU/ml zu zählen.
  11. Bereiten Sie vier aufeinanderfolgende 1/10 Verdünnungen von der früheren Suspension vor, bis eine Verdünnung von 1 x 10-4 erreicht ist.
  12. Platte 10 l jeder Verdünnung auf TS-Agarplatten und inkubieren Sie sie bei 37 °C über Nacht.
  13. Fotografieren Sie die Platte mit einem Gel-Digitalisierer im Epi-White-Modus. Verarbeiten Sie das Bild mit einer geeigneten Software, um einen Punkt zu verstärken, um die Anzahl der einzelnen Kolonien zu zählen.
    HINWEIS: Jedes MNP-Zwischenprodukt wurde charakterisiert, um den Fortschritt der Synthese zu verfolgen. Erstens wurden nackte MNPs von XRD untersucht, um die kristalline Struktur zu überprüfen. Dann wurde das FT-IR-Spektrum jedes Zwischenprodukts ausgeführt, um die Änderungen zu überprüfen, die in der entsprechenden Reaktion aufgetreten sind. Raman-Spektroskopie-Analyse jedes Zwischenprodukts wurde auch durchgeführt, um die Schlussfolgerungen aus FT-IR-Spektren abgeleitet zu bestätigen. Die TGA-Analyse ermöglichte es uns, das Verlustgewicht der Zwischenprodukte mit organischem Material in seiner Struktur abzuschätzen. Die Morphologie und Größe jedes Zwischenprodukts wurde von TEM untersucht. Schließlich war die XPS-Analyse entscheidend, um die Atomoxidationszustände an jeder MNP-Zwischenoberfläche zu bestimmen und die kovalente Bindungsbildung im Konjugat MNP@SiO2@NH@Fa zu bestätigen.

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Representative Results

Eine erschöpfende strukturelle Charakterisierung wird durchgeführt, um die Morphologie und die Eigenschaften jedes Zwischen- und Endkonjugats zu bestimmen. Zu diesem Zweck werden die Techniken XRD, FT-IR, Raman Spektroskopie, TGA, TEM, EDX Mapping und XPS eingesetzt, um die Bildung des Konjugats zu demonstrieren. Die Oxidationszustände der Atome an der Oberfläche der nanopartikel, die durch Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) erworben wurden, sind die relevantesten Daten, um die Bildung kovalenter Bindungen zwischen dem Nanopartikel und dem Siderophor zu bestätigen. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen ist dieses Protokoll reproduzierbar.

Bare MNP, funktionalisierte MNPs und das Konjugat werden mit jedem Y. Enterocolitica-Stamm in PBS-Lösung gemischt. Die Bakterien-MNPs-Aggregate werden mit einem Magneten von der Suspension getrennt. Nach dem zweimaligen Spülen der Aggregate mit PBS werden sie in PBS wieder aufgehängt, um serielle Verdünnungen vorzubereiten, die für die Koloniezählung plattiert sind.

Zwischenprodukte und das mit diesem Protokoll erstellte endgültige Konjugat wurden mehreren Techniken unterzogen, um die Änderungen anzuzeigen, die in jedem Schritt der Synthese stattfinden. Die Infrarot- und Raman-Spektroskopie ist eine einfache und schnelle Möglichkeit, jeden Schritt der Synthese zu überwachen. Das Vorhandensein von charakteristischen Bändern, die Si-O, C-Si-C, Fe-O, O=C Amidschwingungen, O=C-N-Hydroxamsäureschwingungen in den FT-IR- und Raman-Spektren (siehe unten) entsprachen, waren die ersten Indikatoren für die chemischen Veränderungen, die auf der Oberfläche der magnetischen Nanopartikel in jedem Schritt der Synthese stattfanden.

XRD-Diffraktogramm

Abbildung 1 zeigt die XRD-Analyse zur Bestätigung der Zusammensetzung und kristallinen Struktur der synthetischen magnetischen Nanopartikel (MNP) von Magnetit im Vergleich zur JCPDS-Datei 00-003-0863.

TEM-Analyse

Abbildung 2C zeigt helle Flecken des Elektronenbeugungsmusters, die mit den (111), (220), (311), (400), (422), (511) und (440) Beugungsebenen von Magnetit übereinstimmen, die d-Abständen von 4,9, 2,9, 2,4, 2,0, 1,7, 1,6 bzw. 1,4 % entsprechen. Auf der anderen Seite zeigen Abbildung 2D und Abbildung 4E TEM-Bilder von MNP@SiO2@NH2@Fa, die dispergierten MNP-Partikeln (ca. 10 nm) entsprechen, die in das amorphe anorganisch-organische Material eingebettet sind. Die Schichtdicke beträgt über 10 nm.

EDX-Analyse

EDX-Karten zeigen die Verteilung der Elemente Fe, O, Si und C auf der Oberfläche an. Abbildung 3A zeigt deutlich das Vorhandensein von Si auf der Oberfläche von MNP@SiO2. Nach Der aminialisierung und Konjugation mit Feroxamin ist das Inkrement von C auf der Oberfläche von Nanopartikeln für MNP@SiO2@NH@Fa in Abbildung 3B als Beweis für eine erfolgreiche Konjugation dargestellt.

IR-Analyse

FTIR-Spektren von blankem MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 undMNP@SiO 2@NH@Fa ist in Abbildung 4dargestellt. Alle FTIR-Spektren zeigen den Beginn eines Bandes innerhalb des Spektralbereichs der Analyse bei 600 cm-1 an, der mit Fe-O-Vibrationen zusammenhängt. Das Vorhandensein eines Breitenbandes bei 1050 cm-1– zugeschrieben auf die Si-O-Si Dehnungsschwingung – in den FTIR-Spektren von MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 und MNP@SiO2@NH@Fa bestätigte die Kieselsäurebeschichtung.

Das FTIR-Spektrum von MNP@SiO2 (Abbildung 4) zeigt ein breites Band zwischen 830 und 1275 cm-1 (Si-O-Bindung); Es wird intensiver nach seiner Funktionalisierung mit APTES im FTIR-Spektrum von MNP@SiO2@NH2, wahrscheinlich aufgrund der Si-C-Bindung (erwartet zwischen 1175 und 1250 cm-1). Schließlich bestätigten die im FTIR-Spektrum von MNP@SiO @NH@Fa2beobachteten Bänder bei 2995 cm-1 (C-H-Dehnungsbindungen), 1640 cm-1 (O=C-NH Amid II-Vibrationen) und 1577 cm-1 (O=C-N-Hydroxamsäure-Vibrationen) die Konjugation von Feroxamin mit den Nanopartikeln10.

Thermogravimetrie-Analyse

Die Thermogravimetriedaten sind in Abbildung 5dargestellt, die den Gewichtsverlust durch Zugabe von organischem Material und Wasser anzeigt.

Raman-Analyse

Die Kieselsäurebeschichtung und Funktionalisierung des nackten MNP wurden auch durch Raman-Analyse jedes Zwischen- und MNP@SiO2@NH@Fa bestätigt (Abbildung 6). Alle Raman-Spektren zeigen Spitzen bei 305,8, 537,2 und 665,6 cm-1, entsprechend Fe-O-Vibrationen (Abbildung 6A)11, und eine Schulter auf der Spitze bei 713,5 cm-1, bezogen auf Si-O-Si Vibrationen (Abbildung 6B)12. Nach der APTES-Funktionalisierung zeigt das Raman-Spektrum von MNP@SiO2@NH2 intensive Spitzen bei 1001,5 und 1027,4 cm-1, was dem Vorhandensein von SiO2entspricht, und bei 1578,6 und 1597,9 cm-1, was die Bildung von Si-C-Bindungen bestätigt. Darüber hinaus bestätigte das Vorhandensein einer Schulter des Peaks bei 703,0 cm-1 auch das Vorhandensein von APTES (Abbildung 6C)13,14. Schließlich ist der breite Gipfel zwischen 1490 und 1700 cm-1 (zentriert bei 1581 cm-1), entsprechend Si-C-Bindungen und Amidgruppen im Raman-Spektrum von MNP@SiO2@NH@Fa, mit der Bildung des Konjugats einverstanden (Abbildung 6D)14.

XPS-Analyse

Die Untersuchung des Oxidationszustandes der Atome auf der Oberfläche wurde durch XPS-Analyse durchgeführt und bestätigte die Bindungsbildung in den Strukturen. Abbildung 7 zeigt die XPS-Spektren der nackten und verschiedenen funktionalisierten MNPs. Für MNP kann ein schmaler Peak in C1s auf Verunreinigungen bei der Handhabung der Probe während der Synthese zurückzuführen sein. Die Einführung von Kohlenstoff wird als C-C- und C-H-Bindung in MNP@SiO2@NH2 und MNP@SiO2@NH@Fa Spektren beobachtet. Die Analyse des Peaks bei 399 eV in den N1s-Spektren zusammen mit seiner Dämpfung, die für MNP@SiO2@NH@Fa beobachtet wurde, bestätigt die Bildung von Amidbindungen zwischen den MNP@SiO2@NH2 und Feroxamin. Darüber hinaus ist die Existenz von N-O-Bindung von hydroxamischen Moieties im Einverständigen mit dem Vorhandensein eines Peaks bei 402 eV. Das Vorhandensein eines Peaks bei 102 eV in Si2p-Schmalspektren in allen Zwischenprodukten und dem Konjugat stimmt mit der Bindungsenergie für die Siloxangruppe15,16überein.

Z-Potenzial

Z-Potenzialwerte werden in Tabelle 1angezeigt. Die Ergebnisse sind negativ, -25,21 bzw. -29,35 mV, für MNP bzw. MNP@SiO2. Die Funktionalisierung mit APTES, um MNP@SiO2@NH2 zu geben, änderte die Oberflächenladung von negativ auf positiv. Diese Tatsache wurde den Amingruppen zugeschrieben, und die Oberflächenladung bleibt für MNP@SiO2@NH@Fa positiv. Das positive Oberflächenpotential Z könnte die Wechselwirkung zwischen Bakterien (deren Oberfläche negativ ist) und dem Konjugat17,18,19erklären.

Bakterien fangen Assay ein

Die Anzahl der Zellen von Y. enterocolitica WC-A und FoxA WC-A 12-8, die mit MNP-Zwischenprodukten und MNP@SiO2@NH@Fa gefangen wurden, wurden in jenen Verdünnungen quantifiziert, in denen 40-u201260 Kolonien getrennt und leicht visualisiert wurden. Die Anzahl der eingefangenen Zellen durch blanke, MNP@SiO2und MNP@SiO2@NH2 zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen ihnen (Abbildung 8). Die elektrostatischen Kräfte durch freie Amingruppen in MNP@SiO2@NH2 und die geringe Konzentration des Feroxamin-Membranrezeptors bei Bakterien könnten das Fehlen der erwarteten Bindungsspezifität rechtfertigen.

Dieses Protokoll könnte bei der Synthese verschiedener Arten von Konjugaten angewendet werden, vor allem solche, die Carbodiimid-Chemie verwenden. Es ist vielseitig genug, um Änderungen einzuführen, um bessere Ergebnisse zu erzielen. Die vollständige Charakterisierung aller Zwischenprodukte und des endgültigen Konjugats, mit den beschriebenen Techniken, ermöglicht es einem, jedem Schritt der Synthese zu folgen und die Bildung der Wunschbindung zu bestätigen. Die Zählung der Kolonien in der Bakterien-Capture-Assay, mit einem 10 L Tropfen, ermöglicht es, alle Proben zur gleichen Zeit in einer Platte zu testen, die einfacher macht, Replikationen zu erhalten und Assays unter verschiedenen Bedingungen durchzuführen.

Figure 1
Abbildung 1: Vergleich von MNP-Diffraktogrammen (Fe3O4) (lila) und Magnetitmuster (schwarz).
Diese Zahl wurde von Martinez-Matamoros et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Hellfeld-TEM- und Elektronenbeugungsbilder von nackten MNP (A, B und C) und von MNP@SiO2@NH@Fa (D, E und F).
Bilder sind mit mittlerer und hoher Auflösung. Diese Zahl wurde von Martinez-Matamoros et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: EDX-Karten von MNP@SiO2: HAADF-Bild und die entsprechenden Fe-, Si-, O- und C-Karten von A. MNP@SiO2 und B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Diese Zahl wurde von Martinez-Matamoros et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: FT-IR-Spektren von blankem Eisenoxid (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 und MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Diese Zahl wurde von Martinez-Matamoros et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Thermogravimetrische Analyse von MNP, MNP@SiO2@NH2und MNP@SiO2@NH@Fa.
Diese Zahl wurde von Martinez-Matamoros et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Raman-Spektren von blankem Eisenoxid (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) und MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Andere Eisenoxidphasen, die wahrscheinlich aus der Umwandlung von Magnetit durch die Laserleistung gebildet werden. Diese Zahl wurde von Martinez-Matamoros et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 7
Abbildung 7: XPS-Schmalspektren von MNP, MNP@SiO2@NH2 und MNP@SiO2@NH@Fa. Diese Zahl wurde von Martinez-Matamoros et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 8
Abbildung 8: KBE von Y. enterocolitica, die pro 100 g magnetischen Nanopartikeln erfasst wird: nackt, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 und MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (wilder Typ) (B) FoxA WC-A 12-8 (Mutant fehlt Feroxamin-Rezeptor FoxA) und SEM-Bild von MNP@SiO2@NH@Fa Interaktion mit Y. enterocolitica. Diese Zahl wurde von Martinez-Matamoros et al.9geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Beispiel Z-Potenzial
Mnp -25.21
MNP@SiO2 -29.35
MNP@SiO2@NH2 17.03
MNP@SiO2@NH@Fa 22.14
MNP@SiO2@NHBoc@Fa 19.16
MNP@SiO2@NHCOOH@Fa 10.96

Tabelle 1: Z-Potentialmessungen. Diese Tabelle wurde von Martinez-Matamoros et al.9bezogen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese eines Konjugats zwischen magnetischen Nanopartikeln und dem Siderophor feroxamin durch kovalente Bindung. Die Synthese von Magnetit wurde mit dem von Pinna et al.5 gemeldeten Protokoll durchgeführt, gefolgt von einer Kieselsäurebeschichtung, um den magnetischen Korrosionskern in wässrigen Systemen zu schützen, die Aggregation zu minimieren und eine geeignete Oberfläche für die Funktionalisierungbereitzustellen 6. Das Kieselsäurebeschichtungsverfahren wurde modifiziert. Anstatt drei Beschichtungen durchzuführen, wie von Li et al.6berichtet, wurden die MNPs mit zwei Kieselsäureschichten bei diesem Verfahren beschichtet (Abbildung 2D), was ausreichte, um mit dem Funktionalisierungsschritt mit APTES7fortzufahren.

Deferoxamin wurde mit Eisen (III) komplexiert, da es innerhalb weniger Stunden bei Raumtemperatur anfällig für Abbau ist. Der beste Weg, um den Eisenkomplex zu erhalten, ist die Verwendung von Eisenacetylaceton, da seine Reinigung durch flüssig-flüssige Extraktion sehr einfach ist und Feroxamin in einer quantitativen Ausbeute erhalten wird. Feroxamin ist stabil und könnte Nmodifiziert werden, um N-Succinylferoxamin mit Bernsteinanhydrid eine terminale saure Gruppe als Linker hinzuzufügen. Die Reinigung durch Größenausschlusschromatographie ermöglicht die Entfernung des überschüssigen Bernsteinanhydrids und der Bernsteinsäure aus N-Succinylferoxamin. N

Das Amin-Nanokomposit Nwurde verwendet, um N-Succinylferoxamin kovalent auf der Oberfläche zu verknüpfen. Kernspinresonanz (NMR) kann aufgrund des paramagnetischen Verhaltens von Eisenoxid nicht zur strukturellen Aufklärung der Produkte verwendet werden. Aus diesem Grund wurde jeder Reaktionsschritt von FT-IR überwacht und dann durch Raman-Spektroskopie bestätigt. Peaks Dekonvolution und Fitting wurden mit einer praktischen Software unter Berücksichtigung der Raman Spektren umfasste zehn Maße von 300 s mit einer Gesamtmesszeit von 3.000 s. Morphologie und Größe wurden durch TEM Beobachtung der pseudosphärischen Form Magnetit mit einer homogenen Größenverteilung von 10 nm(Abbildung 2A,B) gemessen. Die Konjugatschichtdicke zeigt eine 10 nm homogene Schicht (Abbildung 2D,E).

Es ist sehr schwierig, ein TEM-Feld zu erhalten, in dem Nanopartikel aufgrund ihres magnetischen Charakters und ihrer Neigung zur Agglomeratierung einzeln beobachtet werden können. Die EDX-Zuordnung wurde verwendet, um Informationen über die Zusammensetzung der einzelnen Elemente auf der Oberfläche zu erhalten (Abbildung 3A). Die Kohlenstoffdichte wurde im Konjugat MNP@SiO2@NH-Fa (Abbildung 3B) im Vergleich zu der des Zwischen- MNP@SiO2deutlich erhöht.

Der Bakterien-Capture-Assay wurde entwickelt, um die Fähigkeit des Konjugats zu testen, Bakterien durch den Feroxamin-Outer-Membran-Protein-Rezeptor zu erfassen. Yersinia enterocolitica WC-A Stamm wurde ausgewählt, weil es den FoxA Feroxamin-Rezeptor ausdrückt und leicht zu züchten ist. Der entscheidende Schritt in diesem Verfahren war die Entfernung von nicht gefangenen Bakterien. Dies wurde durch Spülen und Wirbeln mit sterilem PBS zweimal erreicht, gefolgt von der Wiederherstellung der Bakterien-Konjugat-Aggregate mit einem Magneten. Die Anzahl der eingefangenen Zellen durch jedes MNP-Zwischenprodukt, das als Kontrolle verwendet wird, und das Konjugat MNP@SiO2@NH@Fa wurden durch Koloniezählung aus Verdünnungsmethode bestimmt. Die Verwendung von 10 L Tropfen erleichtert das experimentelle Verfahren und ermöglicht es, mehr als vier Proben zu verarbeiten, die die Kosten der Prüfung in Bezug auf Zeit und Material im Vergleich zur klassischen Methode der Plaquezählung von Kolonien reduzieren.

Die wichtigste Einschränkung der Synthese des MNP@SiO2@NH@Fa Konjugats ist, dass es nicht möglich ist, die Bindungsbildung durch NMR zu bestätigen. Obwohl die Herstellung von MNP@SiO2@NH@Fa einfach erscheint, ist der Einsatz der strukturellen Charakterisierungstechniken entscheidend, um die Verbindung zwischen dem Siderophor und dem MNP durch eine kovalente Bindung zu bestätigen.

Nach dem vorliegenden Protokoll ist es möglich, Konjugate mit Carbodiimid-Chemie zu erzeugen. Um dies zu erreichen, sind das Vorhandensein von Aminogruppen auf der MNPs-Oberfläche und eine Carbonsäure-Funktionalität in der Verbindung von Interesse notwendig. Das Testen verschiedener Linker und das Beschichten der MNPs-Oberfläche mit anderen funktionellen Gruppen, um zu vermeiden, dass positive Ladungen auf sie entstehen, könnte die bakterielle Erfassungsdiskriminierung verbessern.

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Disclosures

Wir haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken Professor Klaus Hantke (Universität Tübingen) für die freundliche Versorgung der yersinia enterocolitica-Stämme, die in diesem Werk verwendet werden. Diese Arbeit wurde durch Stipendien AGL2015-63740-C2-1/2-R und RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) der spanischen Staatlichen Agentur für Forschung (AEI) unterstützt, die vom FEDER-Programm der Europäischen Union kofinanziert wurde. Die Arbeit an der Universität Santiago de Compostela und der Universität A Corusa wurde auch durch die Stipendien GRC2018/018, GRC2018/039 und ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC Strategic Group) von Xunta de Galicia unterstützt. Abschließend möchten wir Nuria Calvo für ihre großartige Zusammenarbeit bei der Voice-off dieses Videoprotokoll danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT		 Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

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Chemie Ausgabe 160 Magnetische Nanopartikel SiO2-Beschichtung, Aminfunktionalisierung Siderophor Abfangen von Bakterien Strukturcharakterisierung von Nanopartikeln Feroxamin
Synthese funktionalisierter magnetischer Nanopartikel, deren Konjugation mit dem Siderophor Feroxamin und deren Bewertung für den Bakteriennachweis
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Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

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