Summary
Dit werk beschrijft protocollen voor de bereiding van magnetische nanodeeltjes, de coating met SiO2, gevolgd door de amine functionalisatie met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) en de vermenging met deferoxamine met behulp van een succinyl moiety als linker. Een diepe structurele karakteriseringsbeschrijving en een vangstbacteriëntest met behulp van Y. enterocolitica voor alle tussenliggende nanodeeltjes en de uiteindelijke conjugaat worden ook in detail beschreven.
Abstract
In het huidige werk, de synthese van magnetische nanodeeltjes, de coating met SiO2, gevolgd door de amine functionalisatie met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) en de vervoeging met deferoxamine, een siderophore erkend door Yersinia enterocolitica, met behulp van een succinyl moiety als een linker worden beschreven.
Magnetische nanodeeltjes (MNP) van magnetiet (Fe3O4) werden bereid volgens de solvothermale methode en bekleed met SiO2 (MNP@SiO2) met behulp van het Stöber-proces gevolgd door functionalisatie met APTES (MNP@SiO2@NH2). Vervolgens werd feroxamine geconjugeerd met de MNP@SiO2@NH2 door carbodiimide koppeling om MNP@SiO2@NH2@Fa te geven. De morfologie en eigenschappen van de conjugaat en tussenproducten werden onderzocht door acht verschillende methoden, waaronder poeder X-Ray diffractie (XRD), Fourier transformeren infrarood spectroscopie (FT-IR), Raman spectroscopie, Röntgenfoto elektronenspectroscopie (XPS), transmissie elektronenmicroscopie (TEM) en energiedispersieve X-Ray (EDX) mapping. Deze uitputtende karakterisering bevestigde de vorming van het conjugaat. Ten slotte, om de capaciteit en specificiteit van de nanodeeltjes te evalueren, werden ze getest in een vangst bacteriën test met behulp van Yersinia enterocolitica.
Introduction
De bacteriedetectiemethoden met behulp van MNP zijn gebaseerd op de moleculaire herkenning van antilichamen, aptamers, bioproteïne, koolhydraten die door de pathogenebacteriënaan MNP worden geconjugeerd. Rekening houdend met het feit dat siderophores worden herkend door specifieke receptoren op het buitenste membraan van bacteriën, kunnen ze ook gekoppeld zijn aan MNP om hun specificiteit te verhogen2. Siderophores zijn kleine organische moleculen die betrokken zijn bij de Fe3+ opname door bacteriën3,4. De voorbereiding van conjugaten tussen siderophores en MNP samen met hun evaluatie voor het vangen en isoleren van bacteriën is nog niet gemeld.
Een van de cruciale stappen in de synthese van conjugaten van magnetische nanodeeltjes met kleine moleculen is de selectie van het type binding of interactie tussen hen om ervoor te zorgen dat het kleine molecuul is bevestigd aan het oppervlak van de MNP. Om deze reden was de procedure voor de voorbereiding van de conjugaat tussen magnetische nanodeeltjes en feroxamine - de siderophore erkend door Yersinia enterocolitica- gericht op het genereren van een aanpasbaar oppervlak van de MNP om het covalent te koppelen aan de siderophore door carbodiimide chemie. Om een uniforme magnetiet nanodeeltjes (MNP) te krijgen en om de nucleatie- en groottecontrole te verbeteren, werd een solvolysereactie met benzylalcohol in een thermisch blok gedragen zonder te schudden5. Vervolgens werd een silica coating gegenereerd door Stöber methode om bescherming te verlenen en de stabiliteit van de nanodeeltjes suspensie in waterige media6te verbeteren. Rekening houdend met de structuur van de feroxamine is de introductie van aminegroepen noodzakelijk om geschikte nanodeeltjes (MNP@SiO2@NH2) te produceren die met de zijroprhore moeten worden geconjugeerd. Dit werd bereikt door condensatie van (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) met de alcoholgroepen die aanwezig zijn op het oppervlak van de silica gemodificeerde nanodeeltjes (MNP@SiO2) met behulp van een sol-gel methode7.
Tegelijkertijd werd het feroxamineijzer(III) complex bereid door de complexiteit van de commercieel verkrijgbare deferoxamine met ijzeracetylacetonaat in waterige oplossing. NN-succinylferoxamine, met succinylgroepen die als linkers zullen fungeren, werd verkregen door de reactie van feroxamine met barnische anhydride.
De conjugatie tussen MNP@SiO2@NH2 en N-succinylferoxamine om MNP@SiO2@NH@Fa te geven werd uitgevoerd door middel van carbodiimide chemie met behulp van als koppeling reagentia benzotriazole-1-yl-oxy -tris-(dimethylamino)-fosfonium hexafluorfosfaat (BOP) en 1-hydroxybenzotriazool (HOBt) in een zachte basismedia om de terminalzuurgroep in N-succinylferoxamine8te activeren. N
Zodra de parlementsleden werden gekarakteriseerd, evalueerden we de mogelijkheden van kale en gefunctionaliseerde magnetische nanodeeltjes om wild type (WC-A) en een mutant van Y. enterocolitica zonder feroxaminereceptor FoxA (FoxA WC-A 12-8) vast te leggen. Gewone parlementsleden, gefunctionaliseerde parlementsleden en de conjugaat MNP@SiO2@NH@Fa mochten communiceren met elke Y. enterocolitica stam. De bacteriën-conjugaat aggregaten werden gescheiden van de bacteriën suspensie door de toepassing van een magnetisch veld. De gescheiden aggregaten werden twee maal gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), opnieuw opgehangen in PBS om seriële verdunningen voor te bereiden en vervolgens werden ze verguld voor het tellen van kolonies. Dit protocol toont elke stap van de synthese van MNP@SiO2@NH@Fa, de structurele karakterisering van alle tussenproducten en de conjugaat, en een bacterievangsttest als een gemakkelijke manier om de specificiteit van het conjugaat ten opzichte van de tussenproducten te evalueren. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Voor de reacties die onder inerte atmosfeeromstandigheden worden uitgevoerd, werd al het glaswerk eerder gedroogd in een oven bij 65 °C, verzegeld met een rubberen septum en drie keer met argon gezuiverd.
1. Synthese van magnetische nanodeeltjes geconjugeerd met feroxamine
- Synthese van Fe3O4 magnetische nanodeeltjes (MNP's)
- Voeg 0,5 g Fe(acac)3 toe in een glazen flacon van 20 mL en meng vervolgens met 10 mL benzylalcohol.
- Soniceer dit mengsel gedurende 2 minuten, breng vervolgens over op een verwarmingsblok en verwarm 72 uur op 180 °C.
- Laat de flesjes afkoelen, spoel de nanodeeltjes af met 96% ethanol en centrifuge bij 4000 x g gedurende 30 minuten. Herhaal de centrifugatie minstens tweemaal.
- Scheid de nanodeeltjes van de supernatant door magnetische aantrekkingskracht met behulp van een neodymium (NdFeB) magneet en gooi het resterende oplosmiddel.
- Spoel af met 96% ethanol herhalen stap 1.1.4. en gooi de supernatant af die afgewisseld wordt met sonicatie in een bad gedurende 1 min op 40 kHz totdat het oplosmiddel er duidelijk uitziet.
- Magnetische nanodeeltjes SiO2 coating (MNP@SiO2)
- Bereid een suspensie van 2 g MNP in 80 mL isopropanol en voeg vervolgens 4 mL van 21% ammoniak, 7,5 mL gedestilleerd water en 0,56 mL tetraethyl orthosilicaat (TEOS) (in deze volgorde) toe in een ronde bodemkolf met een magnetische roerstaaf.
- Verwarm het mengsel 2 uur met continu roeren op 40 °C en vervolgens 1 uur sonisch.
- Scheid de MNP met een magneet, gooi het supernatant weg en verdeel deze in 30 mL isopropanol.
- Herhaal stap 1.2.1. en 1.2.2.
- Verwijder en was de magnetische roerstaaf met 96% ethanol om al het materiaal terug te krijgen.
- Scheid de nanodeeltjes van de supernatant door magnetische aantrekkingskracht met behulp van een magneet.
- Gooi de supernatant weg en spoel de nanodeeltjes met 96% ethanol drie keer afgewisseld met sonicatie.
- Droog de nanodeeltjes onder vacuüm op kamertemperatuur gedurende 12 uur.
- Functionalisatie van MNP@SiO2 met (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
- Spoel 500 mg van de MNP@SiO2 verkregen uit de vorige stap met N,N-dimethylformamide (DMF) onder inerte atmosfeer en sonicate vervolgens gedurende 1 min op 40 kHz. Gooi vervolgens de supernatant weg en herhaal dit proces drie keer.
- Stel de deeltjes opnieuw op in een ronde bodemkolf, onder roeren met een magnetische roerstaaf en voeg 9 mL APTES toe.
- Roer het mengsel 12 uur op 60 °C.
- Gooi de supernatant weg en spoel de nanodeeltjes met 96% ethanol drie keer afgewisseld met sonicatie.
- Synthese van feroxamine
- Los 100 mg (0,15 mmol) deferoxamine mesylaatzout en 53,0 mg (0,15 mmol) Fe(acac) 3 op5 mL gedestilleerd water op en roer het mengsel 's nachts op kamertemperatuur.
- Was het resulterende product drie maal met 20 mL EtOAc in een scheidingstrechter en verwijder het organische oplosmiddel onder vacuüm met behulp van een rotator.
- Vriesdroog de waterige fase om feroxamine als rode vaste stof te betalen.
- Synthese Nvan N-succinylferoxamine
- Voeg 350 mg (3,50 mmol) barnsteenzuurzuur uit aan een oplossing van 100 mg feroxamine in 5 mL pyridine in een 50 mL afgeronde kolf onder inerte atmosfeer.
- Roer het resulterende mengsel 16 uur op kamertemperatuur. Na die tijd, verwijder de overmaat van pyridine onder verminderde druk in een rotatory verdamper om een donkerrode vaste stof te geven.
- Los de reactie ruwe in 3 mL van methanol.
- Breng de methanoloplossing over in een Sephadex-kolom (20 cm Sephadex in een kolom met een diameter van 20 mm) en elute op 0,5 mL/min.
- Verzamel de rode fractie en verwijder de methanol onder vacuüm met behulp van een rotatorverdamper.
- Synthese van de conjugaat MNP@SiO2@NH@Fa
- Spoel 30 mg droge MNP@SiO2@NH2 twee maal met DMF en soniceer de nanodeeltjes in een Erlenmeyer-kolf van 100 m L gedurende 30 minuten onder inerte atmosfeer.
- Bereid een oplossing voor van N-succinylferoxamine (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazool-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfoniumhexafluofofofofofosfaat (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hydroxybenzotriazool (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) en N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) in 10 mL DMF (Mix A) in een 50 mL ronde kolf onder inert atmosfeer. N
- Hang de eerder gespoelde MNP@SiO2@NH2 in 3 mL DMF onder sonicatie in droge omstandigheden met behulp van een argongasatmosfeer (Mix B).
- Voeg mix A toe om B dropwise te mengen.
- Schud het uiteindelijke mengsel met behulp van een orbitale shaker bij kamertemperatuur 's nachts.
- Scheid de resulterende conjugaat (MNP@SiO2@NH@Fa) met behulp van een magneet van de suspensie.
- Spoel de resulterende vaste stof en vervolgens, sonicate het vijf keer met 10 mL ethanol.
- Droog de vaste stof onder vacuüm gedurende 24 uur.
2. Bacteriële test met Y. enterocoliticastammen om de vangst van pathogene bacteriën met nanodeeltjes te kwantificeren
- Bereid een suspensie van alle tussenliggende nanodeeltjes en de uiteindelijke conjugaat in PBS op 1 mg/mL in steriele 2 mL buizen.
- Bereid een cultuur van Y. enterocolitica voor in 5 mL Luria Bertani (LB) bouillon 's nachts uitbroeden bij 37 °C.
- Bereid een 5 mL ijzertekort tryptische sojabouillon (TSB) door toevoeging van 50 μL van 10 mM 2,2′-bipyridyl.
- Inenting de 5 mL van ijzertekort TSB met 50 μL van de nachtelijke cultuur van Y. enterocolitica en vervolgens, incubeer bij 37 °C met agitatie tot een OD600 = 0,5\u20120.8 wordt bereikt.
- Neem 100 μL van de cultuur verkregen in stap 2.4 en verdun in een 2,0 mL buis met 900 μL PBS om een eerste 1/10 verdunning te verkrijgen. Bereid vervolgens een verdunning van 1/100 van de eerste verdunning met dezelfde procedure om een concentratie bacteriële cellen te krijgen bij 1 x 106 Colony Forming Units (CFU)/mL ongeveer.
- Voeg 100 μL nanodeeltjes suspensie toe bij 1 mg/mL tot 1 mL van de 1/100 verdunning van bacteriële suspensie in een buis van 2,0 mL en homogeniseren met vortex.
- Broed de cultuur op 20 °C voor 1 uur.
- Scheid de MNP/bacterieaggregaten met behulp van een magneet en gooi de supernatant voorzichtig weg.
- Spoel de gescheiden nanodeeltjes twee keer af met 1 mL PBS met behulp van een vortex.
- Hang de nanodeeltjes op in 1 mL PBS om de hoeveelheid bacteriële afvang in CFU/mL te tellen.
- Bereid vier opeenvolgende 1/10 verdunningen van de voormalige suspensie tot een 1 x 10-4 verdunning is bereikt.
- Plaat 10 μL van elke verdunning op TS agarplaten en incuberen ze 's nachts bij 37 °C.
- Fotografeer de plaat met een gel digitalisator in epi witte modus. Verwerk de afbeelding met een geschikte software om een plek te versterken om het aantal afzonderlijke kolonies te tellen.
LET OP: Elke MNP intermediair werd gekenmerkt om de voortgang van de synthese op te volgen. Ten eerste werden kale parlementsleden door XRD bestudeerd om de kristallijne structuur te controleren. Vervolgens werd het FT-IR-spectrum van elke tussenpersoon uitgevoerd om de veranderingen te controleren die zich in de overeenkomstige reactie hebben voorgedaan. Raman spectroscopie analyse van elke intermediair werd ook uitgevoerd om de conclusies afgeleid van FT-IR spectra te bevestigen. TGA analyse stelde ons in staat om het gewichtsverlies van de tussenproducten met organisch materiaal in de structuur te schatten. De morfologie en grootte van elke intermediair werd bestudeerd door TEM. Ten slotte was de XPS-analyse van cruciaal belang om de atomoxidatietoestanden op elk MNP-tussenoppervlak te bepalen en de covalente bindingsvorming in de conjugaat MNP@SiO2@NH@Fa te bevestigen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een uitputtende structurele karakterisering wordt uitgevoerd om de morfologie en de eigenschappen van elke tussenliggende en de uiteindelijke conjugaat te bepalen. Hiervoor worden de technieken XRD, FT-IR, Raman spectroscopie, TGA, TEM, EDX mapping en XPS gebruikt om de vorming van de conjugaat aan te tonen. De oxidatietoestanden van de atomen aan het oppervlak van de nanodeeltjes die door röntgenfotoelectronspectroscopie (XPS) worden verworven, zijn de meest relevante gegevens om de vorming van covalente bindingen tussen het nanodeeltje en het zijtouw te bevestigen. In overeenstemming met deze resultaten is dit protocol reproduceerbaar.
Kale MNP, gefunctionaliseerde MNP's en de conjugaat worden gemengd met elke Y. enterocolitica stam in PBS oplossing. De bacteriën-Parlementsleden aggregaten worden gescheiden van de suspensie met behulp van een magneet. Na het spoelen van de aggregaten tweemaal met PBS, worden ze opnieuw opgehangen in PBS om seriële verdunningen voor te bereiden die zijn verguld voor het tellen van kolonies.
Intermediates en de laatste conjugaat bereid met behulp van dit protocol werden voorgelegd aan verschillende technieken om de veranderingen die plaatsvinden in elke stap van de synthese weer te geven. Infrarood en Raman spectroscopie vormen een eenvoudige en snelle manier om elke stap van de synthese te controleren. De aanwezigheid van karakteristieke banden die overeenkomen met Si-O, C-Si-C, Fe-O, O=C amide trillingen, O=C-N hydroxaamzuurtrillingen in de FT-IR en Raman (zie hieronder) spectra waren de eerste indicatoren van de chemische veranderingen die plaatsvonden op het oppervlak van de magnetische nanodeeltjes in elke stap van de synthese.
XRD diffractogram
Figuur 1 toont de XRD-analyse die wordt gebruikt om de samenstelling en kristallijne structuur van de synthetische magnetische nanodeeltjes (MNP) van magnetiet te bevestigen in vergelijking met JCPDS-bestand 00-003-0863.
TEM-analyse
Figuur 2C toont lichtpuntjes van het elektronendiffractiepatroon dat overeenkomt met de (111), (220), (311), (400), (422), (511) en (440) diffractievlakken van magnetiet die overeenkomen met d-afstanden van 4,9; respectievelijk 2,9, 2,4, 2,0, 1,7, 1,6 en 1,4 Å. Aan de andere kant tonen figuur 2D en figuur 4E TEM-beelden van MNP@SiO2@NH2@Fa die overeenkomen met verspreide MNP-deeltjes (~10 nm) ingebed in het amorfe anorisch-organisch materiaal. De coatingdikte is meer dan ~ 10 nm.
EDX-analyse
EDX-kaarten geven de verdeling van de elementen Fe, O, Si en C op het oppervlak weer. Figuur 3A toont duidelijk de aanwezigheid van Si op het oppervlak van MNP@SiO2. Na amine functionalisatie en vervoeging met feroxamine wordt de toename van C op het oppervlak van nanodeeltjes voor MNP@SiO2@NH@Fa in figuur 3B weergegeven als bewijs van een succesvolle vervoeging.
IR-analyse
FTIR spectra van kale MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 en MNP@SiO2@NH@Fa is te zien in figuur 4. Alle FTIR spectra tonen het begin van een band binnen het spectra bereik van de analyse op 600 cm-1 die gerelateerd was aan Fe-O trillingen. De aanwezigheid van een brede band op 1050 cm-1-toegeschreven aan de Si-O-Si stretching trillingen-in de FTIR spectra van MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 en MNP@SiO2@NH@Fa bevestigde de silica coating.
Het FTIR-spectrum van MNP@SiO2 (figuur 4) vertoont een brede band tussen 830 en 1275 cm-1 (Si-O-binding); het wordt intenser na zijn functionalisering met APTES in het FTIR-spectrum van MNP@SiO2@NH2, waarschijnlijk te wijten aan de Si-C-binding (verwacht tussen 1175 en 1250 cm-1). Ten slotte zijn de banden op 2995 cm-1 (C-H stretching bindingen), 1640 cm-1 (O=C-NH amide II trillingen) en 1577 cm-1 (O=C-N hydroxamic acid trillingen) waargenomen in het FTIR spectrum van MNP@SiO2@NH@Fa bevestigde de vervoeging van feroxamine met de nanodeeltjes10.
Thermogravimetry analyse
Thermogravimetrie gegevens worden weergegeven in figuur 5, die het gewichtsverlies als gevolg van toevoeging van organisch materiaal en water weergeeft.
Raman analyse
De silicacoating en functionalisatie van de kale MNP werden ook bevestigd door raman-analyse van elke tussenliggende en MNP@SiO2@NH@Fa (figuur 6). Alle Raman spectra tonen pieken op 305,8, 537,2 en 665,6 cm-1, wat overeenkomt met Fe-O trillingen (figuur 6A)11, en een schouder op de piek op 713,5 cm-1, met betrekking tot Si-O-Si trillingen (figuur 6B)12. Na de functionalisering van APTES vertoont het Raman-spectrum van MNP@SiO2@NH2 intense pieken op 1001,5 en 1027,4 cm-1, wat overeenkomt met de aanwezigheid van SiO2, en op 1578,6 en 1597,9 cm-1, wat de vorming van Si-C-obligaties bevestigt. Bovendien bevestigde de aanwezigheid van een schouder van de piek op 703,0 cm-1 ook de aanwezigheid van APTES (figuur 6C)13,14. Ten slotte is de brede piek tussen 1490 en 1700 cm-1 (gecentreerd op ~1581 cm-1), overeenkomend met Si-C-bindingen en amidegroepen in het Raman-spectrum van MNP@SiO2@NH@Fa , in overeenstemming met de vorming van de conjugaat (figuur 6D)14.
XPS-analyse
De studie van de oxidatietoestand van de atomen op het oppervlak werd uitgevoerd door XPS-analyse en bevestigde de bindingenvorming in de structuren. Figuur 7 toont de XPS spectra van de kale en verschillende gefunctionaliseerde MNP's. Voor MNP kan een smalle piek in C1's te wijten zijn aan onzuiverheden bij het hanteren van het monster tijdens de synthese. De introductie van koolstof wordt waargenomen als C-C en C-H obligaties in MNP@SiO2@NH2 en MNP@SiO2@NH@Fa spectra. De analyse van de piek bij 399 eV in de N1s spectra samen met de demping waargenomen voor MNP@SiO2@NH@Fa bevestigt de vorming van amide bindingen tussen de MNP@SiO2@NH2 en feroxamine. Bovendien is het bestaan van N-O-binding van hydroxamische moieties het eens met de aanwezigheid van een piek op 402 eV. De aanwezigheid van een piek bij 102 eV in Si2p smalle spectra in alle tussenproducten en de conjugaat is in overeenstemming met de bindende energie voor de siloxane groep15,16.
Z Potentieel
Z-potentiële waarden worden weergegeven in tabel 1. De resultaten zijn negatief, respectievelijk -25,21 en -29,35 mV, voor MNP en MNP@SiO2. Functionalisatie met APTES om MNP@SiO2@NH2 te geven veranderde de oppervlaktelading van negatief naar positief. Dit feit werd toegeschreven aan de aminegroepen en de oppervlaktelast blijft positief voor MNP@SiO2@NH@Fa. Het positieve oppervlakte Z-potentieel kan de interactie tussen bacteriën (waarvan het oppervlak negatief is) en het conjugaat17,18,19verklaren .
Bacteriën vangen assay
Het aantal cellen van Y. enterocolitica WC-A en FoxA WC-A 12-8 gevangen met MNP intermediates en MNP@SiO2@NH@Fa werden gekwantificeerd in die verdunningen waar 40\u201260 kolonies werden gescheiden en gemakkelijk gevisualiseerd. Het aantal gevangen cellen met kale, MNP@SiO2en MNP@SiO2@NH2 vertoont geen significante verschillen tussen hen (figuur 8). De elektrostatische krachten als gevolg van vrije aminegroepen in MNP@SiO2@NH2 en de lage concentratie van feroxaminemembraanreceptor bij bacteriën kunnen het gebrek aan verwachte bindende specificiteit rechtvaardigen.
Dit protocol kan worden toegepast in de synthese van verschillende soorten conjugaten, voornamelijk die gebruik maken van carbodiimide chemie. Het is veelzijdig genoeg om wijzigingen in te voeren om betere resultaten te verkrijgen. De volledige karakterisering van alle tussenproducten en de uiteindelijke conjugaat, met behulp van de beschreven technieken, maakt het mogelijk om elke stap van de synthese te volgen en de vorming van de wensband te bevestigen. Het tellen van kolonies in de bacteriën vangen test, met behulp van een 10 μL daling, maakt het mogelijk om alle monsters te testen op hetzelfde moment in een plaat die gemakkelijker maakt om replica's te krijgen en tests uit te voeren onder verschillende omstandigheden.
Figuur 1: Vergelijking van MNP (Fe3O4) (paars) en magnetietpatroon (zwart) diffractogrammen.
Dit cijfer is gewijzigd van Martínez-Matamoros et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Helder veld TEM en elektronendiffractie beelden van kale MNP (A, B en C), en van MNP@SiO2@NH@Fa (D, E en F).
Afbeeldingen zijn op gemiddelde en hoge resoluties. Dit cijfer is gewijzigd van Martínez-Matamoros et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: EDX-kaarten van MNP@SiO2: HAADF-afbeelding en de bijbehorende Fe-, Si-, O- en C-kaarten van A. MNP@SiO2 en B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Dit cijfer is gewijzigd van Martínez-Matamoros et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: FT-IR spectra van bare iron oxide (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 en MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Dit cijfer is gewijzigd van Martínez-Matamoros et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Thermogravimetrische analyse van MNP, MNP@SiO2@NH2en MNP@SiO2@NH@Fa.
Dit cijfer is gewijzigd van Martínez-Matamoros et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Raman spectra van kaal ijzeroxide (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) en MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Andere ijzeroxide fasen, waarschijnlijk gevormd uit de transformatie van magnetiet door de laser kracht. Dit cijfer is gewijzigd van Martínez-Matamoros et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 7: XPS smalle spectra van MNP, MNP@SiO2@NH2 en MNP@SiO2@NH@Fa. Dit cijfer is gewijzigd van Martínez-Matamoros et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 8: CFU van Y. enterocolitica die per 100 μg aan magnetische nanodeeltjes wordt opgevangen: kaal, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 en MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (wild type) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutant ontbreekt feroxamine receptor FoxA) en SEM beeld van MNP@SiO2@NH@Fa interactie met Y. enterocolitica. Dit cijfer is gewijzigd van Martínez-Matamoros et al.9. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Monster | Z Potentieel |
| Mnp | -25.21 |
| MNP@SiO2 | -29.35 |
| MNP@SiO2@NH2 | 17.03 |
| MNP@SiO2@NH@Fa | 22.14 |
| MNP@SiO2@NHBoc@Fa | 19.16 |
| MNP@SiO2@NHCOOH@Fa | 10.96 |
Tabel 1: Z potentiële metingen. Deze tabel is verkregen van Martínez-Matamoros et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de synthese van een conjugaat tussen magnetische nanodeeltjes en de siderophore feroxamine door covalente binding. De synthese van magnetiet werd uitgevoerd met behulp van het protocol gerapporteerd door Pinna et al.5 gevolgd door silica coating om de magnetische kern van corrosie in waterige systemen te beschermen, om de aggregatie te minimaliseren en om een geschikt oppervlak voor functionalisatie6te bieden. Het silica coating proces werd aangepast. In plaats van het uitvoeren van drie coatings zoals gerapporteerd door Li et al.6, werden de Parlementsleden gecoat met twee silicalagen in deze methode (figuur 2D) die voldoende was om door te gaan met de functionaliseringsstap met APTES7.
Deferoxamine was complex met ijzer (III) omdat het gevoelig is voor afbraak binnen een paar uur bij kamertemperatuur. De beste manier om het ijzercomplex te verkrijgen is het gebruik van ijzeracetylacetonaat omdat de zuivering door vloeistof-vloeibare extractie zeer eenvoudig is en feroxamine wordt verkregen in een kwantitatieve opbrengst. Feroxamine is stabiel en kan Nworden aangepast om N-succinylferoxamine te geven met behulp van barnisch anhydride om een terminale zure groep als linker toe te voegen. De zuivering per grootte uitsluiting chromatografie maakt het mogelijk verwijdering van Nde overtollige barnsteen anhydride en barnsteenzuur uit N-succinylferoxamine.
De amine nanocomposiet werd Ngebruikt om N-succinylferoxamine covalent aan het oppervlak te koppelen. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) kan niet worden gebruikt voor de structurele opheldering van de producten als gevolg van het paramagnetische gedrag van ijzeroxide. Om deze reden werd elke reactiestap gecontroleerd door FT-IR en vervolgens bevestigd door Raman spectroscopie. Pieken deconvolutie en montage werden gemaakt met een handige software rekening houdend met het feit dat de Raman spectra tien maten van 300 s met een totale meettijd van 3.000 s. Morphologie en grootte werden gemeten door TEM observeren van de pseudosferische vorm magnetiet met een homogene grootte verdeling van 10 nm (Figuur 2A,B). De conjugaat coating dikte maatregel tonen een 10 nm homogene laag (Figuur 2D,E).
Het is zeer moeilijk om een TEM-veld te verkrijgen waar nanodeeltjes individueel kunnen worden waargenomen vanwege het magnetische karakter en de neiging tot agglomeratie. EDX mapping werd gebruikt om informatie te verkrijgen over de samenstelling van elk element op het oppervlak (Figuur 3A). De koolstofdichtheid werd duidelijk verhoogd in de conjugaat MNP@SiO2@NH@Fa (figuur 3B) ten opzichte van die van de tussenliggende MNP@SiO2.
De bacteriën vangen test werd ontworpen om het vermogen van de conjugaat om bacteriën te vangen door middel van de feroxamine buitenste membraan eiwitreceptor te testen. Yersinia enterocolitica WC-A stam werd geselecteerd omdat het de FoxA feroxamine receptor uitdrukt en is gemakkelijk te groeien. De kritieke stap in deze procedure was het verwijderen van niet-gevangen bacteriën. Dit werd bereikt door tweemaal te spoelen en te wervelen met steriele PBS, gevolgd door het terugwinnen van de bacteriën-conjugaat aggregaten met behulp van een magneet. De aantallen gevangen cellen door elk van de MNP intermediair, gebruikt als controle, en de conjugaat MNP@SiO2@NH@Fa werden bepaald door kolonie tellen van verdunningsmethode. Het gebruik van 10 μL druppels vergemakkelijkt de experimentele procedure en maakt het mogelijk om meer dan vier monsters te verwerken waardoor de kosten van de test in termen van tijd en materiaal worden verlaagd in vergelijking met de klassieke methode van plaquetelkolonies.
De belangrijkste beperking van de synthese van de MNP@SiO2@NH@Fa conjugaat is dat het niet mogelijk is om de obligatievorming door NMR te bevestigen. Hoewel de voorbereiding van MNP@SiO2@NH@Fa eenvoudig lijkt, is het gebruik van de structurele karakteriseringstechnieken van cruciaal belang om het verband tussen de siderophore en de MNP te bevestigen door middel van een covalente binding.
Volgens het huidige protocol is het mogelijk om conjugaten te genereren met behulp van carbodiimide chemie. Om dit te bereiken, de aanwezigheid van aminogroepen op het mps oppervlak en een carboxylzuur functionaliteit in de verbinding van belang zijn noodzakelijk. Het testen van verschillende linker's en het coaten van het mp's oppervlak met andere functionele groepen om te voorkomen dat het creëren van positieve ladingen op het kan de bacteriële capture discriminatie te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
We hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen dankbaar Professor Klaus Hantke (Universiteit van Tübingen, Duitsland) voor het vriendelijk leveren van de Yersinia enterocolitica stammen die in dit werk worden gebruikt. Dit werk werd ondersteund door subsidies AGL2015-63740-C2-1/2-R en RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) van het Staatsagentschap voor Onderzoek (AEI) van Spanje, medegefinancierd door het FEDER-programma van de Europese Unie. Werk aan de Universiteit van Santiago de Compostela en de Universiteit van A Coruña werd ook ondersteund door subsidies GRC2018/018, GRC2018/039 en ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC strategische groep) van Xunta de Galicia. Tot slot willen we Nuria Calvo bedanken voor haar geweldige samenwerking met de voice-off van dit videoprotocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
