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Chemistry

Synthèse des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées, leur conjugaison avec la feroxamine de Siderophore et son évaluation pour la détection des bactéries

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60842

Summary

Ce travail décrit des protocoles pour la préparation des nanoparticules magnétiques, son revêtement avec SiO2, suivi de sa fonctionnalisation d’amine avec (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) et sa conjugaison avec la dferoxamine utilisant une moiety succinyl comme lieneur. Une description structurelle profonde de caractérisation et un test de bactéries de capture utilisant Y. enteropolitica pour toutes les nanoparticules intermédiaires et le conjugué final sont également décrits en détail.

Abstract

Dans le présent travail, la synthèse des nanoparticules magnétiques, son revêtement avec SiO2, suivi de sa fonctionnalisation amine avec (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) et sa conjugaison avec la dferoxamine, un siderophore reconnu par Yersinia enterocolitica, en utilisant un succinyl moiety comme un linker sont décrits.

Les nanoparticules magnétiques (MNP) de la magnétite (Fe3O4) ont été préparées par méthode solcothermale et enduites de SiO2 (MNP@SiO2) à l’aide du procédé Stöber suivi d’une fonctionnalisation avec APTES (MNP@SiO2@NH2). Puis, la feroxamine a été conjuguée avec le MNP@SiO2@NH2 par couplage carbodiimide pour donner MNP@SiO2@NH2@Fa. La morphologie et les propriétés du conjugué et des intermédiaires ont été examinées par huit méthodes différentes, y compris la diffraction des rayons X (XRD), la spectroscopie infrarouge à transformation Fourier (FT-IR), la spectroscopie Raman, la spectroscopie photoélectron à rayons X (XPS), la microscopie électronique de transmission (TEM) et la cartographie des rayons X dispersifs d’énergie (EDX). Cette caractérisation exhaustive a confirmé la formation du conjugué. Enfin, afin d’évaluer la capacité et la spécificité des nanoparticules, ils ont été testés dans un test de capture de bactéries à l’aide de Yersinia enterocolitica.

Introduction

Les méthodes de détection des bactéries utilisant MNP sont basées sur la reconnaissance moléculaire des anticorps, des aptamères, de la bioprotéine, des hydrates de carbone conjugués au MNP par la bactérie pathogène1. Compte tenu du fait que les siderophores sont reconnus par des récepteurs spécifiques sur la membrane externe des bactéries, ils pourraient également être liés au MNP pour augmenter leur spécificité2. Les siderophores sont de petites molécules organiques impliquées dans l’absorption de Fe3+ par les bactéries3,4. La préparation des conjugués entre les siderophores et le MNP ainsi que leur évaluation pour la capture et l’isolement des bactéries n’a pas encore été rapportée.

L’une des étapes cruciales de la synthèse des conjugués de nanoparticules magnétiques avec de petites molécules est la sélection du type de lien ou d’interaction entre elles pour s’assurer que la petite molécule est attachée à la surface du MNP. Pour cette raison, la procédure de préparation du conjugué entre les nanoparticules magnétiques et la feroxamine — le siderophore reconnu par Yersinia enterocolitica— a été axée sur la génération d’une surface modifiable du MNP pour permettre de la relier covalent au siderophore par la chimie carbodiimide. Afin d’obtenir une nanoparticule de magnétite uniforme (MNP) et d’améliorer la nucléation et le contrôle de la taille, une réaction de solvolyse avec de l’alcool benzyle a été effectuée dans un bloc thermique sans secouer5. Ensuite, un revêtement de silice a été généré par la méthode Stöber pour conférer la protection et améliorer la stabilité de la suspension des nanoparticules dans les milieux aqueux6. Compte tenu de la structure de la feroxamine, l’introduction de groupes d’amines est nécessaire pour produire des nanoparticules appropriées (MNP@SiO2@NH2) à conjuguer avec le siderophore. Ceci a été réalisé par condensation de (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) avec les groupes d’alcool présents à la surface des nanoparticules modifiées de silice (MNP@SiO2) utilisant une méthode de sol-gel7.

En parallèle, le complexe de fer feroxamine(III) a été préparé par la complexation de la déféroxamine disponible dans le commerce avec l’acétonate d’acétonate d’acétyl de fer dans la solution aqueuse. N-succinylferoxamine, portant des groupes de succinyl qui agiront comme linkers, a été obtenu par la réaction de la feroxamine avec l’anhydride succinique.

La conjugaison entre MNP@SiO2@NH2 et N-succinylferoxamine pour donner MNP@SiO2@NH@Fa a été effectuée par la chimie carbodiimide en utilisant comme couplage réactifs benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP) et 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) dans un milieu de base doux pour activer le groupe acide terminal dans N-succinylferoxamine8.

Une fois que les MNP ont été caractérisés, nous avons évalué les capacités des nanoparticules magnétiques nues et fonctionnalisées pour capturer le type sauvage (WC-A) et un mutant de Y. enterocolitica manquant de récepteur de feroxamine FoxA (FoxA WC-A 12-8). Les députés ordinaires, les députés fonctionnalisés et les MNP@SiOconjugués 2@NH@Fa ont été autorisés à interagir avec chaque souche Y. enteropolitica. Les agrégats de bactéries conjuguées ont été séparés de la suspension bactérienne par l’application d’un champ magnétique. Les agrégats séparés ont été rincés deux fois avec du phosphate tamponné saline (PBS), re-suspendus dans PBS pour préparer des dilutions en série et puis, ils ont été plaqués pour le comptage des colonies. Ce protocole démontre chaque étape de la synthèse de MNP@SiO2@NH@Fa, la caractérisation structurelle de tous les intermédiaires et du conjugué, et un test de capture de bactérie comme un moyen facile d’évaluer la spécificité du conjugué par rapport aux intermédiaires. 9

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Protocol

REMARQUE : Pour les réactions effectuées dans des conditions d’atmosphère inertes, toute la verrerie a été préalablement séchée dans un four à 65 °C, scellée avec un septum en caoutchouc et purgée avec de l’argon trois fois.

1. Synthèse de nanoparticules magnétiques conjuguées à la feroxamine

  1. Synthèse des nanoparticules magnétiques Fe3O4 (MNPs)
    1. Ajouter 0,5 g de Fe(acac)3 dans un flacon en verre de 20 mL, puis mélanger avec 10 mL d’alcool benzyle.
    2. Sonicate ce mélange pendant 2 min, puis transférer dans un bloc de chauffage et chauffer à 180 °C pendant 72 h.
    3. Une fois la réaction terminée, laisser refroidir les flacons, rincer les nanoparticules avec 96 % d’éthanol et la centrifugeuse à 4000 x g pendant 30 min. Répétez la centrifugation au moins deux fois.
    4. Séparez les nanoparticules du supernatant par attraction magnétique à l’aide d’un aimant de néodyme (NdFeB) et jetez le solvant résiduel.
    5. Rincer à 96 % d’éthanol, étape de répétition 1.1.4. et jeter le supernatant en alternance avec sonication dans un bain pendant 1 min à 40 kHz jusqu’à ce que le solvant semble clair.
  2. Nanoparticules magnétiques SiO2 revêtement (MNP@SiO2)
    1. Préparer une suspension de 2 g de MNP dans 80 ml d’isopropanol, puis ajouter 4 ml d’ammoniac à 21 %, 7,5 ml d’eau distillée et 0,56 mL d’orthosilicate tétraéthylique (TEOS) (dans cet ordre) dans une fiole de fond ronde à l’aide d’une barre magnétique.
    2. Chauffer le mélange à 40 °C pendant 2 h avec un remuant continu, puis un sonicate pendant 1 h.
    3. Séparez le MNP d’un aimant, jetez le supernatant et dispersez-le dans 30 mL d’isopropanol.
    4. Répétez les étapes 1.2.1. et 1.2.2.
    5. Retirer et laver la barre magnétique avec 96% d’éthanol pour récupérer tout le matériel.
    6. Séparez les nanoparticules du supernatant par attraction magnétique à l’aide d’un aimant.
    7. Jeter le supernatant et rincer les nanoparticules avec 96% d’éthanol trois fois en alternance avec la sonication.
    8. Sécher les nanoparticules sous vide à température ambiante pendant 12 h.
  3. Fonctionnalisation de MNP@SiO2 avec (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
    1. Rincer 500 mg du MNP@SiO2 obtenus à partir de l’étape précédente avec N,N-diméthylformamide (DMF) sous atmosphère inerte, puis sonicate pendant 1 min à 40 kHz. Ensuite, jetez le supernatant et répétez ce processus trois fois.
    2. Re-suspendre les particules dans une fiole de fond ronde, sous agitation avec une barre de remue-ménage magnétique et ajouter 9 ml d’APTES.
    3. Remuer le mélange à 60 °C pendant 12 h.
    4. Jeter le supernatant et rincer les nanoparticules avec 96% d’éthanol trois fois en alternance avec la sonication.
  4. Synthèse de la feroxamine
    1. Dissoudre 100 mg (0,15 mmol) de sel de mésylate de déféroxamine et 53,0 mg (0,15 mmol) de Fe(acac)3 dans 5 mL d’eau distillée et remuer le mélange pendant la nuit à température ambiante.
    2. Laver le produit résultant trois fois avec 20 mL d’EtOAc dans un entonnoir de séparation, puis retirer le solvant organique sous vide à l’aide d’un évaporateur rotateur.
    3. Séchez-vous la phase aqueuse pour se permettre la feroxamine comme un solide rouge.
  5. Synthèse de N-succinylferoxamine
    1. Ajouter 350 mg (3,50 mmol) d’anhydride succinique à une solution de 100 mg (0,17 mmol) de feroxamine dans 5 ml de pyridine dans une fiole à fond rond de 50 ml sous atmosphère inerte.
    2. Remuer le mélange résultant à température ambiante pendant 16 h. Après ce temps, retirer l’excès de pyridine sous pression réduite dans un évaporateur rotateur pour donner un solide rouge foncé.
    3. Dissoudre le brut de réaction dans 3 mL de méthanol.
    4. Transférer la solution méthanolique dans une colonne Sephadex (20 cm de Sephadex dans une colonne de 20 mm de diamètre) et elute à 0,5 mL/min.
    5. Recueillir la fraction rouge et retirer le méthanol sous vide à l’aide d’un évaporateur rotateur.
  6. Synthèse du MNP@SiO conjugué2@NH@Fa
    1. Rincer 30 mg de MNP@SiO sec2@NH2 deux fois avec du DMF et soniquer les nanoparticules dans une fiole Erlenmeyer de 100 ml pendant 30 min sous atmosphère inerte.
    2. Préparer une solution de N-succinylferoxamine (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(diméthyllamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) et N,N-diisopropyléthylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) dans 10 mL de DMF (Mix A) dans un flacon rond de 50 mL sous l’atmosphère inert.
    3. Suspendre le MNP@SiO 2 @NH2@NH2 mL de DMF sous sonication à sec dans des conditions sans oxygène à l’aide d’une atmosphère de gaz d’argon (Mix B).
    4. Ajouter le mélange A pour mélanger B dropwise.
    5. Agiter le mélange final à l’aide d’un shaker orbital à température ambiante pendant la nuit.
    6. Séparez le conjugué résultant (MNP@SiO2@NH@Fa) de la suspension à l’aide d’un aimant.
    7. Rincez le solide résultant, puis, soniquer cinq fois avec 10 mL d’éthanol.
    8. Sécher le solide sous vide pendant 24 h.

2. Test bactérien avec souches de Y. entérocolite pour quantifier la capture de bactéries pathogènes avec des nanoparticules

  1. Préparer une suspension de toutes les nanoparticules intermédiaires et le conjugué final en PBS à 1 mg/mL dans des tubes stériles de 2 mL.
  2. Préparer une culture de Y. enteropolitica dans 5 mL de bouillon De Luria Bertani (LB) toute la nuit en incubation à 37 °C.
  3. Préparer un bouillon de soja tryptique déficient en fer de 5 mL (TSB) en ajoutant 50 μL de 10 mM 2,2′-bipyridyl.
  4. Inoculer les 5 mL de TSB déficient en fer avec 50 μL de la culture de nuit de Y. enterocolitica, puis, incuber à 37 °C avec agitation jusqu’à ce qu’un OD600 = 0,5\u20120.8 soit atteint.
  5. Prendre 100 μL de la culture obtenue à l’étape 2.4 et diluer dans un tube de 2,0 mL contenant 900 μL de PBS pour obtenir une première dilution 1/10. Ensuite, préparer une dilution de 1/100 à partir de la première dilution en utilisant la même procédure pour obtenir une concentration de cellules bactériennes à 1 x 106 Unités de formation de colonies (CFU)/mL environ.
  6. Ajouter 100 μL de suspension de nanoparticules à 1 mg/mL à 1 ml de la dilution de 1/100 de suspension bactérienne dans un tube de 2,0 mL, et homogénéiser avec vortex.
  7. Incuber la culture à 20 °C pendant 1 h.
  8. Séparez les agrégats MNP/bactéries à l’aide d’un aimant et jetez soigneusement le supernatant.
  9. Rincer les nanoparticules séparées deux fois avec 1 mL PBS à l’aide d’un vortex.
  10. Suspendre les nanoparticules dans 1 mL de PBS pour compter la quantité de capture bactérienne dans CFU/mL.
  11. Préparer quatre dilutions successives de 1/10 de l’ancienne suspension jusqu’à ce qu’une dilution de 1 x10 -4 soit atteinte.
  12. Plaquez 10 μL de chaque dilution sur les plaques d’agar TS et incuber à 37 °C pendant la nuit.
  13. Photographiez la plaque avec un digitalizer de gel en mode épi blanc. Traitez l’image avec un logiciel approprié pour amplifier un endroit pour compter le nombre de colonies individuelles.
    REMARQUE : Chaque intermédiaire MNP a été caractérisé pour suivre l’évolution de la synthèse. Tout d’abord, les députés nus ont été étudiés par XRD pour vérifier la structure cristalline. Ensuite, le spectre FT-IR de chaque intermédiaire a été exécuté pour vérifier les changements qui se sont produits dans la réaction correspondante. L’analyse de spectroscopie de Raman de chaque intermédiaire a également été effectuée afin de confirmer les conclusions déduites des spectres FT-IR. L’analyse TGA nous a permis d’estimer le poids de perte des intermédiaires portant des matières organiques dans sa structure. La morphologie et la taille de chaque intermédiaire ont été étudiées par TEM. Enfin, l’analyse XPS a été essentielle pour déterminer les états d’oxydation de l’atome à chaque surface intermédiaire MNP et pour confirmer la formation de liaisons covalentes dans le MNP@SiO2@NH@Fa conjugués.

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Representative Results

Une caractérisation structurelle exhaustive est effectuée afin de déterminer la morphologie et les propriétés de chaque intermédiaire et le conjugué final. À cette fin, les techniques XRD, FT-IR, Spectroscopie Raman, TGA, TEM, EDX mapping et XPS sont utilisées afin de démontrer la formation du conjugué. Les états d’oxydation des atomes à la surface des nanoparticules acquises par spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) sont les données les plus pertinentes pour confirmer la formation de liaisons covalentes entre la nanoparticule et le siderophore. En accord avec ces résultats, ce protocole est reproductible.

Bare MNP, MNPs fonctionnalisés et le conjugué sont mélangés avec chaque souche Y. enteropolitica dans la solution PBS. Les agrégats bactéries-MNP sont séparés de la suspension à l’aide d’un aimant. Après avoir rincé les agrégats deux fois avec pbs, ils sont re-suspendus dans PBS pour préparer des dilutions en série qui sont plaqués pour le comptage des colonies.

Les intermédiaires et le conjugué final préparé à l’aide de ce protocole ont été soumis à plusieurs techniques pour afficher les changements qui ont lieu à chaque étape de la synthèse. La spectroscopie infrarouge et raman constitue un moyen facile et rapide de surveiller chaque étape de la synthèse. La présence de bandes caractéristiques correspondant aux spectres Si-O, C-Si-C, Fe-O, O=C amide, vibration d’acide hydroxamique O=C-N dans les spectres FT-IR et Raman (voir ci-dessous) ont été les premiers indicateurs des changements chimiques qui se déroulaient à la surface des nanoparticules magnétiques à chaque étape de la synthèse.

Diffractogramme XRD

La figure 1 montre l’analyse XRD utilisée pour confirmer la composition et la structure cristalline des nanoparticules magnétiques synthétiques (MNP) de la magnétite par rapport au fichier JCPDS 00-003-0863.

Analyse TEM

La figure 2C présente des points lumineux du modèle de diffraction des électrons qui correspondent aux plans de diffraction (111), (220), (311), (400), (422), (511) et (440) de magnétite correspondant à des espacements d de 4,9, 2.9, 2.4, 2.0, 1.7, 1.6 et 1.4 Å, respectivement. D’autre part, la figure 2D et la figure 4E montrent des images TEM de MNP@SiO2@NH2@Fa correspondant à des particules dispersées de MNP (~10 nm) incorporées dans la matière organique inorganique amorphe. L’épaisseur du revêtement est supérieure à ~10 nm.

Analyse EDX

Les cartes EDX affichent la distribution des éléments Fe, O, Si et C à la surface. La figure 3A montre clairement la présence de Si à la surface de MNP@SiO2. Après la fonctionnalisation de l’amine et la conjugaison avec la feroxamine, l’augmentation de C à la surface des nanoparticules pour MNP@SiO2@NH@Fa est indiquée à la figure 3B comme preuve d’une conjugaison réussie.

Analyse IR

Les spectres FTIR du MNP nu, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 et MNP@SiO2@NH@Fa sont indiqués à la figure 4. Tous les spectres FTIR montrent le début d’une bande dans la plage spectrale de l’analyse à 600 cm-1 qui était liée aux vibrations fe–o. La présence d’une large bande à 1050 cm-1— attribuée à la vibration d’étirement Si-O-Si — dans les spectres FTIR de MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 et MNP@SiO2@NH@Fa a confirmé le revêtement de silice.

Le spectre FTIR de MNP@SiO2 (figure 4) affiche une large bande comprise entre 830 et 1275 cm-1 (liaison Si-O); il devient plus intense après sa fonctionnalisation avec APTES dans le spectre FTIR de MNP@SiO2@NH2, probablement en raison de la liaison Si-C (prévue entre 1175 et 1250 cm-1). Enfin, les bandes à 2995 cm-1 (liaisons d’étirement C-H), 1640 cm-1 (vibration O=C-NH amide II) et 1577 cm-1 (vibration hydroxamique O=C-N) observées dans le spectre FTIR de MNP@SiO2@NH@Fa confirmé la conjugaison de la feroxamine avec les nanopartles10.

Analyse thermogravise

Les données de thermogravimétrie sont indiquées à la figure 5, qui affiche la perte de poids due à l’ajout de matières organiques et d’eau.

Analyse de Raman

Le revêtement de silice et la fonctionnalisation du MNP nu ont également été confirmés par l’analyse de Raman de chaque intermédiaire et MNP@SiO2@NH@Fa (Figure 6). Tous les spectres Raman montrent des pics à 305,8, 537,2 et 665,6 cm-1, correspondant aux vibrations Fe-O (Figure 6A)11, et une épaule sur le pic à 713,5 cm-1, relative aux vibrations Si-O-Si (Figure 6B)12. Après la fonctionnalisation d’APTES, le spectre Raman de MNP@SiO2@NH2 affiche des pics intenses à 1001,5 et 1027,4 cm-1, correspondant à la présence de SiO2, et à 1578,6 et 1597,9 cm-1, confirmant la formation de liaisons Si-C. En outre, la présence d’une épaule du pic à 703,0 cm-1 a également confirmé la présence d’APTES (Figure 6C)13,14. Enfin, le pic large entre 1490 et 1700 cm-1 (centré à ~1581 cm-1),correspondant aux liaisons Si-C et aux groupes amide dans le spectre Raman de MNP@SiO2@NH@Fa, sont en accord avec la formation du conjugué (Figure 6D)14.

Analyse XPS

L’étude de l’état d’oxydation des atomes à la surface a été effectuée par l’analyse XPS et a confirmé la formation de liaisons dans les structures. La figure 7 montre les spectres XPS des députés non fonctionnels nus et différents. Pour le MNP, un pic étroit en C1 pourrait être dû à des impuretés dans la manipulation de l’échantillon pendant la synthèse. L’introduction du carbone est observée sous forme de liaisons C-C et C-H dans les MNP@SiO2@NH2 et MNP@SiO2@NH@Fa spectres. L’analyse du pic à 399 eV dans les spectres N1 ainsi que son atténuation observée pour MNP@SiO2@NH@Fa confirme la formation de liaisons amintes entre lesMNP@SiO 2@NH2 et la feroxamine. En outre, l’existence d’une liaison N-O de moieties hydroxamiques est en accord avec la présence d’un pic à 402 eV. La présence d’un pic à 102 eV dans les spectres étroits Si2p dans tous les intermédiaires et le conjugué est en accord avec l’énergie de liaison pour le groupe siloxane15,16.

Z Potentiel

Les valeurs potentielles Z s’affichent dans le tableau 1. Les résultats sont négatifs, -25,21 et -29,35 mV, respectivement pour le MNP et MNP@SiO2. La fonctionnalisation avec APTES pour donner MNP@SiO2@NH2 a changé la charge de surface de négative à positive. Ce fait a été attribué aux groupes d’amines et la charge de surface reste positive pour MNP@SiO2@NH@Fa. Le potentiel positif de surface Z pourrait expliquer l’interaction entre les bactéries (dont la surface est négative) et le conjugué17,18,19.

Test de capture des bactéries

Le nombre de cellules de Y. enteropolitica WC-A et FoxA WC-A 12-8 capturées avec des intermédiaires MNP et MNP@SiO2@NH@Fa ont été quantifiées dans ces dilutions où 40\u201260 colonies ont été séparées et facilement visualisées. Le nombre de cellules capturées par nu, MNP@SiO2et MNP@SiO2@NH2 ne montre aucune différence significative entre elles (figure 8). Les forces électrostatiques dues aux groupes d’amines libres dans MNP@SiO2@NH2 et la faible concentration du récepteur de la membrane de feroxamine chez les bactéries pourraient justifier l’absence de spécificité de liaison attendue.

Ce protocole pourrait être appliqué dans la synthèse de différents types de conjugués, principalement ceux qui utilisent la chimie carbodiimide. Il est assez polyvalent pour introduire des modifications afin d’obtenir de meilleurs résultats. La caractérisation complète de tous les intermédiaires et le conjugué final, à l’aide des techniques décrites, permet de suivre chaque étape de la synthèse et de confirmer la formation du lien de désir. Le comptage des colonies dans les bactéries capturent l’essai, à l’aide d’une baisse de 10 μL, permet de tester tous les échantillons en même temps dans une seule plaque qui facilite l’accès aux répliques et les essais dans différentes conditions.

Figure 1
Figure 1 : Comparaison des diffractogrammes mnp (Fe3O4) (violet) et de la magnétite (noir).
Ce chiffre a été modifié à partir de Martínez-Matamoros et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Images de TEM et de diffraction des électrons de MNP nue (A, B et C) et de MNP@SiO2@NH@Fa (D, E et F).
Les images sont à des résolutions moyennes et élevées. Ce chiffre a été modifié à partir de Martínez-Matamoros et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Cartes EDX de MNP@SiO2: image HAADF et cartes Fe, Si, O et C correspondantes de A. MNP@SiO2 et B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Ce chiffre a été modifié à partir de Martínez-Matamoros et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Spectres FT-IR d’oxyde de fer nu (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 et MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Ce chiffre a été modifié à partir de Martínez-Matamoros et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Analyse thermogravimétrique du MNP, MNP@SiO2@NH2et MNP@SiO2@NH@Fa.
Ce chiffre a été modifié à partir de Martínez-Matamoros et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Spectres raman d’oxyde de fer nu (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) et MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Autres phases d’oxyde de fer, probablement formées à partir de la transformation de la magnétite par la puissance laser. Ce chiffre a été modifié à partir de Martínez-Matamoros et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : Spectres étroits XPS du MNP, MNP@SiO2@NH2 et MNP@SiO2@NH@Fa. Ce chiffre a été modifié à partir de Martínez-Matamoros et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : CFU de Y. enteropolitica capturée par 100 μg de nanoparticules magnétiques : nues, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 et MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (type sauvage) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutant manquant de récepteur de feroxamine FoxA) et image SEM de MNP@SiO2@NH@Fa interagir avec Y. enteropolitica. Ce chiffre a été modifié à partir de Martínez-Matamoros et al.9. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Échantillon Z Potentiel
Mnp -25.21
MNP@SiO2 -29.35
MNP@SiO2@NH2 17.03
MNP@SiO2@NH@Fa 22.14
MNP@SiO2@NHBoc@Fa 19.16
MNP@SiO2@NHCOOH@Fa 10.96

Tableau 1 : Mesures potentielles Z. Ce tableau a été obtenu auprès de Martínez-Matamoros et coll.9.

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Discussion

Ce protocole décrit la synthèse d’un conjugué entre les nanoparticules magnétiques et la feroxamine de siderophore par liaison covalente. La synthèse de la magnétite a été réalisée à l’aide du protocole rapporté par Pinna et coll.5 suivi d’un revêtement de silice pour protéger le noyau magnétique de la corrosion dans les systèmes aqueux, pour minimiser l’agrégation et pour fournir une surface appropriée pour la fonctionnalisation6. Le processus de revêtement de silice a été modifié. Au lieu d’effectuer trois revêtements tels que rapportés par Li et al.6, les MNP ont été recouverts de deux couches de silice dans cette méthode (Figure 2D) qui a été suffisant pour continuer avec l’étape de fonctionnalisation avec APTES7.

La déféroxamine a été complexée avec du fer (III) parce qu’elle est susceptible de se dégrader en quelques heures à température ambiante. La meilleure façon d’obtenir le complexe de fer est d’utiliser l’acétonate d’acétélie de fer parce que sa purification par extraction liquide-liquide est très simple et la feroxamine est obtenue dans un rendement quantitatif. La feroxamine est stable et pourrait être modifiée pour donner n-succinylferoxamine en utilisant l’anhydride succinique pour ajouter un groupe acide terminal comme un linker. La chromatographie d’exclusion de purification par taille permet l’enlèvement Nde l’anhydride succinique et de l’acide succinique excédentaires de N-succinylferoxamine.

La nanocomposite d’amine Na été utilisée pour relier N-succinylferoxamine covalently sur la surface. La résonance magnétique nucléaire (RMN) ne peut pas être utilisée pour l’élucidation structurelle des produits en raison du comportement paramagnétique de l’oxyde de fer. Pour cette raison, chaque étape de réaction a été surveillée par FT-IR et ensuite confirmée par spectroscopie Raman. Les pics de déconvolution et d’ajustement ont été réalisés avec un logiciel pratique en tenant compte du fait que les spectres raman comprenaient dix mesures de 300 s avec un temps de mesure total de 3 000 s. La morphologie et la taille ont été mesurées par TEM observant la magnétite de forme pseudosphérique avec une distribution de taille homogène de 10 nm (Figure 2A,B). La mesure conjuguée de l’épaisseur du revêtement montre une couche homogène de 10 nm (Figure 2D,E).

Il est très difficile d’obtenir un champ TEM où les nanoparticules peuvent être observées individuellement en raison de son caractère magnétique et de sa tendance à l’agglomère. La cartographie EDX a été utilisée pour obtenir des informations sur la composition de chaque élément à la surface (figure 3A). La densité de carbone a été nettement augmentée dans le MNP@SiO conjugué2@NH@Fa (Figure 3B) par rapport à celle du MNP@SiO intermédiaire2.

Le test de capture des bactéries a été conçu afin de tester la capacité du conjugué à capturer les bactéries à travers le récepteur de la protéine de la membrane externe de la feroxamine. Yersinia enterocolitica Wc-A souche a été sélectionnée parce qu’elle exprime le récepteur de la feroxamine FoxA et est facile à cultiver. L’étape critique de cette procédure a été l’élimination des bactéries non capturées. Ceci a été réalisé par rinçage et vortexage avec PBS stérile deux fois suivi par la récupération des agrégats de bactéries conjuguées à l’aide d’un aimant. Le nombre de cellules capturées par chacun des intermédiaires du MNP, utilisé comme contrôle, et le conjugué MNP@SiO2@NH@Fa ont été déterminés par le comptage des colonies à partir de la méthode de dilution. L’utilisation de 10 gouttes de μL facilite la procédure expérimentale et permet de traiter plus de quatre échantillons réduisant le coût de l’essai en termes de temps et de matériel par rapport à la méthode classique de comptage des plaques colonies.

La limitation la plus importante de la synthèse du MNP@SiO2@NH@Fa conjugué est qu’il n’est pas possible de confirmer la formation de liaison par RMN. Bien que la préparation de MNP@SiO2@NH@Fa semble simple, l’utilisation des techniques de caractérisation structurelle est cruciale afin de confirmer le lien entre le siderophore et le MNP par un lien covalent.

Suivant le protocole actuel, il est possible de générer des conjugués en utilisant la chimie du carbodiimide. Pour ce faire, la présence de groupes aminés sur la surface des MNP et une fonctionnalité d’acide carboxylique dans le composé d’intérêt sont nécessaires. L’essai de différents linkers et le revêtement de la surface des MNPs avec d’autres groupes fonctionnels pour éviter de créer des charges positives à ce sujet pourrait améliorer la discrimination de capture bactérienne.

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Disclosures

Nous n’avons rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient le professeur Klaus Hantke (Université de Tübingen, Allemagne) d’avoir gentiment fourni les souches d’enteropolitica de Yersinia utilisées dans ce travail. Ces travaux ont été soutenus par des subventions AGL2015-63740-C2-1/2-R et RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) de l’Agence d’État pour la recherche (AEI) d’Espagne, cofinancé par le programme FEDER de l’Union européenne. Les travaux de l’Université de Saint-Jacques-de-Compostelle et de l’Université d’A Coruña ont également été soutenus par des subventions GRC2018/018, GRC2018/039 et ED431E 2018/03 (groupe stratégique CICA-INIBIC) de Xunta de Galicia. Enfin, nous tenons à remercier Nuria Calvo pour sa grande collaboration en faisant la voix-off de ce protocole vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT
Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

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Chimie Numéro 160 Nanoparticules magnétiques revêtement SiO2, fonctionnalisation de l’amine siderophore capture des bactéries caractérisation structurelle des nanoparticules feroxamine
Synthèse des nanoparticules magnétiques fonctionnalisées, leur conjugaison avec la feroxamine de Siderophore et son évaluation pour la détection des bactéries
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Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

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