Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

توليف الجسيمات النانوية المغناطيسية الوظيفية، والاقتران مع Siderophore فيلوكسامين وتقييمها للكشف عن البكتيريا

doi: 10.3791/60842 Published: June 16, 2020

Summary

يصف هذا العمل بروتوكولات لإعداد الجسيمات النانوية المغناطيسية ، وطلاءها مع SiO2، متبوعة بوظيفتها الأمينية مع (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) والاقتران مع تأجيلoxamine باستخدام مويتي succinyl كمرتابط. وصف توصيف الهيكلية العميقة ومقايسة البكتيريا التقاط باستخدام Y. enterocolitica لجميع الجسيمات النانوية المتوسطة ومترافق النهائي هي أيضا وصف مفصل.

Abstract

في العمل الحالي، وتوليف الجسيمات النانوية المغناطيسية، وطلاءها مع SiO2، تليها وظيفية أمين مع (3-أمينوبروبيل) triethoxysilane (APTES) والاقتران مع تأجيلoxamine، وs siderophore المعترف بها من قبل Yersinia enterocolitica، وذلك باستخدام مويتي succinyl كما وصفت رابط.

تم إعداد الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNP) من الممغنط (Fe3O4)بواسطة طريقة solvothermal ومغلفة بـ SiO2 (MNP@SiO2)باستخدام عملية Stöber تليها وظيفية مع APTES (MNP@SiO2@NH2). ثم، كان مترافقا فيروكسيمين مع MNP@SiO2@NH2 من قبل اقتران كاربودييميد لإعطاء MNP@SiO2@NH2@Fa. تم فحص مورفولوجيا وخصائص المترافقة والوسيطة من خلال ثماني طرق مختلفة بما في ذلك مسحوق X-Ray DIFFACTION (XRD) ، وفورييه تحويل الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (FT-IR) ، والتحليل الطيفي رامان ، والأشعة السينية الطيفي الضوئي (XPS) ، والمجهر الإلكتروني انتقال (TEM) وشعاع الأشعة السينية (EDX) الطاقة رسم الخرائط. وقد أكد هذا الوصف الشامل تشكيل المترافق. وأخيرا، من أجل تقييم قدرة وخصوصية الجسيمات النانوية، تم اختبارها في التقاط البكتيريا اختبار باستخدام Yersinia enterocolitica.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تعتمد طرق الكشف عن البكتيريا باستخدام MNP على الاعتراف الجزيئي للأجسام المضادة ، aptamers ، البروتين الحيوي ، الكربوهيدرات المترافقة مع MNP بواسطة البكتيريا المسببة للأمراض1. مع الأخذ في الاعتبار أن يتم التعرف على siderophores من قبل مستقبلات محددة على الغشاء الخارجي للبكتيريا، فإنها يمكن أن ترتبط أيضا إلى MNP لزيادة خصوصيتها2. Siderophores هي الجزيئات العضوية الصغيرة المشاركة في Fe3 + امتصاص البكتيريا3،4. لم يتم بعد الإبلاغ عن إعداد الترافق بين siderophores و MNP جنبا إلى جنب مع تقييمها لالتقاط وعزل البكتيريا.

واحدة من الخطوات الحاسمة في تركيب جسيمات نانوية مغناطيسية مع جزيئات صغيرة هي اختيار نوع الرابطة أو التفاعل بينها لضمان أن يتم إرفاق الجزيء الصغير على سطح MNP. لهذا السبب، كان تركيز الإجراء لإعداد الترافق بين الجسيمات النانوية المغناطيسية و فيروكزامين -siderophore المعترف بها من قبل Yersinia enterocolitica- في توليد سطح قابل للتعديل من MNP للسماح لها ربط بتكهوري إلى siderophore بواسطة الكيمياء كاربودييميد. من أجل الحصول على جسيمات نانوية موحدة المغنطيسية (MNP) وتحسين التحكم في التنوية والحجم ، تم إجراء تفاعل تحلية مع الكحول البنزيل في كتلة حرارية دون أن تهتز5. ثم، تم إنشاء طلاء السيليكا من قبل طريقة Stöber لمنح الحماية وتحسين استقرار تعليق الجسيمات النانوية في وسائل الإعلام مائي6. مع الأخذ في الاعتبار هيكل الفلوكسامين ، وإدخال مجموعات أمين ضروري لإنتاج الجسيمات النانوية المناسبة (MNP@SiO2@NH2) أن تكون مترافقة مع siderophore. وقد تحقق ذلك عن طريق التكثيف من (3-aminopropyl) ثلاثية الأيثوكسيسيلين (APTES) مع مجموعات الكحول الموجودة على سطح الجسيمات النانوية المعدلة السيليكا (MNP@SiO2) باستخدام طريقة سول جل7.

في موازاة, تم إعداد فيروكسيمين الحديد (III) مجمع من قبل تعقيد من deferoxamine المتاحة تجاريا مع أسيتونات أسيتيل الحديد في محلول مائي. N-succinylferoxamine، تحمل مجموعات السوتشينيل التي سوف تعمل كربطات، تم الحصول عليها من قبل رد فعل فيروكسيمين مع أنهيدريد succinic.

تمت عملية الاقتران بين MNP@SiO2@NH2 وN-succinylferoxamine لإعطاء MNP@SiO2@NH@Fa من خلال كيمياء كاربوديميد باستخدام الكواشف اقتران benzotriazole-1-yl-ox y-tris-(dimethylamino)-فوسفونيوم سداسي فلوريفوروفوسفات (BOP) و 1-هيدروكسي بنزوزيرول (HOBt) في وسائل الإعلام الأساسية لينة لتنشيط مجموعة حمض المحطة الطرفية في N-succinylferoxamine8. N

وبمجرد أن تم وصف MNPs ، قمنا بتقييم قدرات الجسيمات النانوية المغناطيسية العارية والمزملة لالتقاط النوع البري (WC-A) ومتحول من Y. enterocolitica تفتقر إلى مستقبلات الفلوكسامين FoxA (FoxA WC-A 12-8). وسمح لأعضاء البرلمان الوطنيين العاديين والنواب المُمَنَاة الوظيفية وأعضاء البرلمان الوطني MNP@SiO2@NH@Fa بالتفاعل مع كل سلالة من سلالة Y. enterocolitica. تم فصل المجاميع البكتيريا- مترافق من تعليق البكتيريا عن طريق تطبيق حقل مغناطيسي. تم شطف المجاميع المنفصلة مرتين مع المالحة الفوسفاتية المخزنة (PBS) ، وإعادة تعليقها في PBS لإعداد عمليات التخفيف التسلسلية ثم ، كانت مطلية لعد المستعمرة. يوضح هذا البروتوكول كل خطوة من توليف MNP@SiO2@NH@Fa، والتوصيف الهيكلي لجميع الوسيطات والمقارنات، ومقايسة التقاط البكتيريا كوسيلة سهلة لتقييم خصوصية المترافق فيما يتعلق بالمتوسطات. 9

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: بالنسبة لردود الفعل التي يتم تنفيذها تحت ظروف الغلاف الجوي الخاملة، كانت جميع الأواني الزجاجية قد جفت سابقا في فرن عند 65 درجة مئوية، مختومة بختم مطاطي وتطهيرها بالأرغون ثلاث مرات.

1. توليف الجسيمات النانوية المغناطيسية المقترنة مع فيلوكسامين

  1. تركيب Fe3O4 الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs)
    1. إضافة 0.5 غرام من Fe(acac)3 في 20 مل الزجاج قارورة ثم تخلط مع 10 مل من الكحول البنزيل.
    2. سونيكات هذا الخليط لمدة 2 دقيقة، ثم نقل إلى كتلة التدفئة والحرارة في 180 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
    3. بعد الانتهاء من التفاعل، والسماح للقارورة لتهدئة، وشطف الجسيمات النانوية مع 96٪ الإيثانول والطرد المركزي في 4000 س ز لمدة 30 دقيقة. كرر الطرد المركزي مرتين على الأقل.
    4. فصل الجسيمات النانوية من الفائقة عن طريق الجذب المغناطيسي باستخدام المغناطيس النيوديزيوم (NdFeB) والتخلص من المذيبات المتبقية.
    5. شطف مع 96٪ الإيثانول تكرار الخطوة 1.1.4. وتجاهل supernatant بالتناوب مع sonication في حمام لمدة 1 دقيقة في 40 كيلوهرتز حتى يبدو المذيب واضحة.
  2. المغناطيسي جسيمات نانوية SiO2 طلاء (MNP@SiO2)
    1. إعداد تعليق 2 غرام من MNP في 80 مل من الايزوبروبانول ثم إضافة 4 مل من 21٪ الأمونيا، 7.5 مل من الماء المقطر و 0.56 مل من رباعي الإيثيل orthosilicate (في هذا الترتيب) في قارورة أسفل مستديرة مع شريط ضجة المغناطيسي.
    2. سخني الخليط على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع التحريك المستمر ثم sonicate لمدة 1 ساعة.
    3. فصل MNP مع المغناطيس، والتخلص من عظمى، وتفريقه في 30 مل من الايزوبروبانول.
    4. كرر الخطوات 1.2.1. و1.2.2.
    5. إزالة وغسل شريط اثارة المغناطيسي مع 96٪ الإيثانول لاسترداد جميع المواد.
    6. فصل الجسيمات النانوية من عظمى عن طريق الجذب المغناطيسي باستخدام المغناطيس.
    7. تجاهل supernatant وشطف الجسيمات النانوية مع 96٪ الإيثانول ثلاث مرات بالتناوب مع sonication.
    8. جفف الجسيمات النانوية تحت فراغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.
  3. وظيفية MNP@SiO2 مع (3-أمينوبروبيل) ثلاثي الأيثوكسي سيلين (APTES)
    1. شطف 500 ملغ من MNP@SiO2 التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة مع N, N-dimethylformamide (DMF) تحت الجو الخامل ثم سونيكات لمدة 1 دقيقة في 40 كيلوهرتز. ثم، تجاهل ناظر وكرر هذه العملية ثلاث مرات.
    2. إعادة تعليق الجسيمات في قارورة أسفل جولة، تحت اثارة مع شريط ضجة المغناطيسي وإضافة 9 مل من APTES.
    3. يُحرّك الخليط عند 60 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
    4. تجاهل supernatant وشطف الجسيمات النانوية مع 96٪ الإيثانول ثلاث مرات بالتناوب مع sonication.
  4. توليف الفلوكسامين
    1. يُحلّل 100 ملغ (0.15 مليمول) من ملح المزيج الميّيّلوكسيلات المُرَيِّر المُرَيَّر و53.0 ملغ (0.15 مليمول) من Fe(acac)3 في 5 مل من الماء المقطر ويُحرّك الخليط بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    2. اغسل المنتج الناتج ثلاث مرات مع 20 مل من EtOAc في قمع الفصل ومن ثم، وإزالة المذيب العضوي تحت فراغ باستخدام المبخر الدوارة.
    3. تجميد الجافة المرحلة مائي لتحمل فيلوكسامين كما الصلبة الحمراء.
  5. توليف N-succinylferoxamine
    1. إضافة 350 ملغ (3.50 مليمول) من anhydride succinic إلى حل من 100 ملغ (0.17 مليمول) من فيروسامين في 5 مل من البيريدين في 50 مل جولة قاع القارورة تحت الجو الخامل.
    2. يُحرّك الخليط الناتج في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة. بعد ذلك الوقت، وإزالة فائض من البيريدين تحت ضغط مخفض في المبخر الدوار لإعطاء صلبة حمراء داكنة.
    3. حل رد فعل الخام في 3 مل من الميثانول.
    4. نقل محلول الميثانول إلى عمود Sephadex (20 سم من Sephadex في عمود قطره 20 مم) وlute في 0.5 مل / دقيقة.
    5. جمع الكسر الأحمر وإزالة الميثانول تحت فراغ باستخدام المبخر الدوارة.
  6. توليف MNP@SiO2@NH@Fa
    1. شطف 30 ملغ من MNP@SiOالجافة 2@NH2 مرتين مع DMF و sonicate الجسيمات النانوية في 100 مل Erlenmeyer قارورة لمدة 30 دقيقة تحت الجو الخامل.
    2. إعداد حل من N-succinylferoxamine (200 ملغ، 0.30 مليمول)، benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-فوسفونيوم سداسي فلوريوفوسفات (BOP، 173 ملغم، 0.45 مليمول)، 1-هيدروكسي بنزوزيرول (HOBt، 46 ملغ، 0.39 مليمول) وN،N-diisopropylethylamine (DIPEA، 128.8 ملغ، 1.21 مليمول) في 10 مل من DMF (مزيج A) في 50 مل قارورة مستديرة القاع تحت الغلاف الجوي الخام.N
    3. تعليق شطف سابقا MNP@SiO2@NH2 في 3 مل من DMF تحت سونيكيشن في ظل جفاف تحت ظروف خالية من الأوكسجين باستخدام الغلاف الجوي غاز الأرجون (مزيج B).
    4. إضافة مزيج A لخلط B قطرة.
    5. يهز الخليط النهائي باستخدام شاكر المدارية في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
    6. فصل القارن الناتج (MNP@SiO2@NH@Fa) من التعليق باستخدام المغناطيس.
    7. شطف الصلبة الناتجة ومن ثم، sonicate أنه خمس مرات مع 10 مل من الإيثانول.
    8. تجفيف الصلبة تحت فراغ لمدة 24 ساعة.

2. جرثومية مع Y. سلالات enterocolitica لتحديد كمية من القبض على البكتيريا المسببة للأمراض مع الجسيمات النانوية

  1. إعداد تعليق لجميع الجسيمات النانوية الوسيطة والمترافق النهائي في برنامج تلفزيوني في 1 ملغ / مل في أنابيب 2 مل العقيمة.
  2. إعداد ثقافة Y. enterocolitica في 5 مل من حساء لوريا بيرتاني (LB) بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  3. إعداد 5 مل من الحديد مرق الصويا تريبتيك نقص (TSB) عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من 10 مل 2،2′-bipyridyl.
  4. تلقيح 5 مل من الحديد ناقص TSB مع 50 ميكرولتر من ثقافة بين عشية وضحاها من Y. enterocolitica ومن ثم، احتضان في 37 درجة مئوية مع الانفعالات حتى يتم التوصل إلى OD600 = 0.5\u20120.8.
  5. اتخاذ 100 μL من الثقافة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.4 وتمييع في أنبوب 2.0 مل تحتوي على 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني للحصول على أول 1/10 تخفيف. ثم، إعداد تخفيف 1/100 من التخفيف الأول باستخدام نفس الإجراء للحصول على تركيز الخلايا البكتيرية في 1 × 106 مستعمرة تشكيل وحدات (CFU)/مل تقريبا.
  6. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق الجسيمات النانوية في 1 ملغم / مل إلى 1 مل من تخفيف 1/100 من تعليق البكتيرية في أنبوب 2.0 مل، والتجانس مع دوامة.
  7. احتضان الثقافة في 20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  8. فصل المجاميع MNP / البكتيريا باستخدام المغناطيس وتجاهل بعناية فائقة.
  9. شطف الجسيمات النانوية المنفصلة مرتين مع PBS 1 مل باستخدام دوامة.
  10. تعليق الجسيمات النانوية في 1 مل من برنامج تلفزيوني لحساب كمية التقاط البكتيرية في CFU / مل.
  11. إعداد أربعة متتالية 1/10 تخفيف من التعليق السابق حتى يتم التوصل إلى تخفيف 1 ×10-4.
  12. لوحة 10 μL من كل تخفيف على لوحات TS agar واحتضان لهم في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  13. تصوير لوحة مع digitalizer هلام في وضع الأبيض epi. معالجة الصورة مع برنامج مناسب لتضخيم بقعة لحساب عدد المستعمرات الفردية.
    ملاحظة: تم وصف كل وسيط من الحركة الوطنية NP لمتابعة التقدم المحرز في التوليف. أولاً، تمت دراسة MNPs العارية من قبل XRD للتحقق من الهيكل البلوري. ثم، تم تشغيل الطيف FT-IR لكل وسيطة للتحقق من التغييرات التي حدثت في التفاعل المقابل. كما تم إجراء تحليل طيفي من رامان لكل وسيط من أجل تأكيد الاستنتاجات المستخلصة من أطياف FT-IR. وأتاح لنا تحليل TGA تقدير الوزن الفقدان للمواد الوسيطة التي تحمل مواد عضوية في هيكلها. وقد درست TEM مورفولوجيا وحجم كل وسيطة. وأخيرا، كان تحليل XPS حاسما لتحديد حالات أكسدة الذرة في كل سطح متوسط من سطح MNP وللتأكد من تكوين السندات التساهمية في MNP@SiO2@NH@Fa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ويتم إجراء توصيف هيكلي شامل من أجل تحديد مورفولوجيا وخصائص كل من المرافق الوسيطة والنهائية. لهذا الغرض، وتستخدم تقنيات XRD، FT-IR، التحليل الطيفي رامان، TGA، TEM، EDX رسم الخرائط وXX من أجل إثبات تشكيل المترافق. حالات أكسدة الذرات على سطح الجسيمات النانوية التي حصل عليها التحليل الطيفي الضوئي بالأشعة السينية (XPS) هي البيانات الأكثر صلة لتأكيد تكوين الروابط التساهمية بين الجسيمات النانوية والجنبية. في الاتفاق مع هذه النتائج، هذا البروتوكول هو استنساخ.

يتم خلط MNP عارية، MNPs وظيفية وconjugate مع كل سلالة Y. enterocolitica في حل برنامج تلفزيوني. يتم فصل مجاميع البكتيريا MNPs من التعليق باستخدام المغناطيس. بعد شطف المجاميع مرتين مع برنامج تلفزيوني، يتم إعادة تعليقها في برنامج تلفزيوني لإعداد التخفيفات المسلسل التي مطلية للعد مستعمرة.

وقد قُدمت المواد الوسيطة والمقارنة النهائية المعدة باستخدام هذا البروتوكول إلى عدة تقنيات لعرض التغييرات التي تحدث في كل خطوة من خطوات التوليف. الأشعة تحت الحمراء والرامان الطيفي تشكل وسيلة سهلة وسريعة لرصد كل خطوة من عملية التوليف. وكان وجود نطاقات مميزة المقابلة لسي- O، C-سي-C، Fe-O، O = C الاهتزاز، O= C-N هيدروكسيميك الاهتزاز حمض في FT-IR ورامان (انظر أدناه) المؤشرات الأولى للتغيرات الكيميائية التي كانت تحدث على سطح الجسيمات النانوية المغناطيسية في كل خطوة من عملية التوليف.

XRD diffractogram

ويبين الشكل 1 التحليل XRD المستخدم لتأكيد تكوين وهيكل البلورية للجسيمات النانوية المغناطيسية الاصطناعية (MNP) من المغنطيسية بالمقارنة مع ملف JCPDS 00-003-0863.

تحليل TEM

يعرض الشكل 2C النقاط المضيئة لنمط الحيود الإلكتروني الذي يتطابق مع (111) و (220) و (311) و (400) و (422) و (511) و (440) من مستويات الحيود المغنطيسية المقابلة للمباعدة d من 4.9 ، 2.9 و 2.4 و 2.0 و 1.7 و 1.6 و 1.4 Å على التوالي. من ناحية أخرى، 2D الشكل والشكل 4E تظهر صور TEM MNP@SiO2@NH2@Fa المقابلة لجسيمات MNP مشتتة (~ 10 نانومتر) جزءا لا يتجزأ في المواد العضوية غير المتبلورة. سمك الطلاء هو أكثر من ~ 10 نانومتر.

تحليل EDX

تعرض خرائط EDX توزيع العناصر Fe و O و Si و C على السطح. ويبين الشكل 3A بوضوح وجود سي على سطح MNP@SiO2. بعد وظيفية أمين والاقتران مع فيلوكسامين، وزيادة C على سطح الجسيمات النانوية MNP@SiO2@NH@Fa يظهر في الشكل 3B كدليل على اقتران ناجحة.

تحليل الأشعة تحت الحمراء

FTIR أطياف من MNP عارية، MNP@SiO MNP@SiO2@NH2 MNP@SiO2@NH@Fa هو مبين في الشكل 4. جميع أطياف FTIR عرض بداية من نطاق داخل النطاق الطيفي للتحليل في 600 سم-1 الذي كان متصلا الاهتزازات Fe-O. وجود نطاق واسع في 1050 سم-1- يعزى إلى سي-O-سي تمتد الاهتزازات في أطياف FTIR من MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 و MNP@SiO2@NH@Fa أكد طلاء السيليكا.

الطيف FTIR من MNP@SiO2 (الشكل 4)يعرض نطاق واسع بين في 830 و 1275 سم-1 (سي- O السندات); يصبح أكثر كثافة بعد وظيفية مع APTES في الطيف FTIR من MNP@SiO2@NH2، وربما يرجع ذلك إلى السندات سي جيم (المتوقع بين 1175 و 1250 سم-1). وأخيرا، فإن النطاقات في 2995 سم-1 (C-H تمتد السندات)، 1640 سم-1 (O = C-NH إهتزاز الثاني) و 1577 سم-1 (O = الاهتزاز حمض هيدروكساميك C-N) لوحظ في الطيف FTIR من MNP@SiO2@NH@Fa أكد الاقتران من feroxamine مع الجسيمات النانوية10.

تحليل قياس الحرارة

وتظهر بيانات قياس الحرارة في الشكل 5، الذي يعرض فقدان الوزن بسبب إضافة المواد العضوية والمياه.

تحليل رامان

كما تم تأكيد طلاء السيليكا ووظيمية MNP العارية من خلال تحليل رامان لكل وسيط MNP@SiO2@NH@Fa(الشكل 6). جميع أطياف رامان تظهر القمم في 305.8، 537.2 و 665.6 سم-1، المقابلة للاهتزازات Fe-O (الشكل 6A)11، والكتف على الذروة عند 713.5 سم-1، فيما يتعلق بالاهتزازات Si-O-Si (الشكل 6B)12. بعد عملية التمليك APTES، فإن طيف رامان من MNP@SiO2@NH2 يعرض قمم مكثفة في 1001.5 و 1027.4 سم-1، المقابلة لوجود SiO2، وعلى 1578.6 و 1597.9 سم-1، مما يؤكد تشكيل السندات Si-C. وعلاوة على ذلك ، فإن وجود الكتف من الذروة في 703.0 سم-1 أكد أيضا وجود APTES (الشكل 6C)13،14. وأخيراً، فإن الذروة العريضة بين 1490 و1700 سم-1 (تركزت على ~1581 سم-1)، تقابل السندات Si-C ومجموعات أمواج في طيف رامان من MNP@SiO2@NH@Fa، تتفق مع تشكيل المترافق (الشكل 6D)14.

تحليل XPS

تم إجراء دراسة حالة أكسدة الذرات على السطح بواسطة تحليل XPS وأكدت تكوين السندات في الهياكل. ويبين الشكل 7 أطياف XPS من الشخصيات متعددة الوظائف والنواب وظيفية مختلفة. بالنسبة لـ MNP، قد يكون سبب وجود ذروة ضيقة في C1S بسبب الشوائب في التعامل مع العينة أثناء التوليف. ويلاحظ إدخال الكربون كسندات C-C و C-H في MNP@SiO2@NH2 MNP@SiO2@NH@Fa الأطياف. تحليل الذروة في 399 eV في أطياف N1s جنبا إلى جنب مع التوهين لوحظ MNP@SiO2@NH@Fa يؤكد تشكيل الروابط وسط بين MNP@SiO2@NH2 وفيرلوكسامين. وعلاوة على ذلك، فإن وجود سندات N-O من الهيدروكسامية يوافق على وجود ذروة عند 402 فولت. وجود ذروة في 102 eV في Si2p أطياف ضيقة في جميع وسيطة وconjugate هو في الاتفاق مع الطاقة ملزمة لمجموعة سيلوكسيكان15،16.

Z المحتملة

يتم عرض القيم المحتملة Z في الجدول 1. النتائج سلبية، -25.21 و-29.35 mV، ل MNP و MNP@SiO2، على التوالي. functionalization مع APTES لإعطاء MNP@SiO2@NH2 غيرت شحنة السطح من السلبية إلى الإيجابية. وقد عُزيت هذه الحقيقة إلى مجموعات الأمينين وتظل الشحنة السطحية إيجابية بالنسبة MNP@SiO2@NH@Fa. يمكن للسطح الإيجابي Z المحتملة أن تفسر التفاعل بين البكتيريا (التي سطحها سلبي) وconjugate17،18،19.

البكتيريا التقاط التشايس

عدد الخلايا من Y. enterocolitica WC-A وFoxA WC-A 12-8 التي تم التقاطها مع وسيطات MNP و MNP@SiO2@NH@Fa تم تحديدها كميا في تلك التخفيفات حيث تم فصل المستعمرات 40\u201260 وتصور بسهولة. عدد الخلايا التي تم التقاطها من قبل عارية، MNP@SiOMNP@SiO2@NH2 يظهر لا توجد اختلافات كبيرة فيما بينها (الشكل 8). القوى الكهربائية الساكنة بسبب مجموعات أمين الحرة في MNP@SiO2@NH2 والتركيز المنخفض لمستقبلات غشاء فيروسكامين في البكتيريا قد يبرر عدم وجود خصوصية الربط المتوقع.

ويمكن تطبيق هذا البروتوكول في تركيب نوع مختلف من conjugates، أساسا تلك التي تستخدم الكيمياء carbodiimide. وهو متعدد الاستخدامات بما يكفي لإدخال تعديلات من أجل الحصول على نتائج أفضل. التوصيف الكامل لجميع وسيطة ومترافق النهائي، وذلك باستخدام التقنيات الموصوفة، يسمح لأحد لمتابعة كل خطوة من عملية التوليف وتأكيد تشكيل السندات الرغبة. عد المستعمرات في البكتيريا التقاط فحص، وذلك باستخدام قطرة 10 ميكرولتر، يسمح للمرء لاختبار جميع العينات في نفس الوقت في لوحة واحدة مما يجعل من الأسهل للحصول على النسخ المتماثلة وأداء المقايسات في ظل ظروف مختلفة.

Figure 1
الشكل 1: مقارنة بين MNP (Fe3O4)(الأرجواني) ونمط المغنطيسي (أسود) diffractograms.
وقد تم تعديل هذا الرقم من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: صور TEM و حيود الإلكترونات في المجال الساطع لـ MNP (A, B و C) (A, B و C) MNP@SiO2@NH@Fa (D, E و F).
الصور في قرارات متوسطة وعالية. وقد تم تعديل هذا الرقم من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: خرائط EDX MNP@SiO2: صورة HAADF والخرائط المقابلة fe و Si و O و C لـ A. MNP@SiO2 و B. MNP@SiO2@NH@Fa.
وقد تم تعديل هذا الرقم من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أطياف FT-IR لأكسيد الحديد العاري (Fe3O4) MNP، MNP@SiOMNP@SiO2@NH2 و2 MNP@SiO2@NH@Fa (4).
وقد تم تعديل هذا الرقم من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تحليل قياس الحرارة لـ MNP، MNP@SiO2@NHMNP@SiO2@NH@Fa.
وقد تم تعديل هذا الرقم من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: أطياف رامان لأكسيد الحديد العاري (Fe3O4) MNP (A)، MNP@SiO2 (باء)، MNP@SiO2@NH2 (C)، و2 MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES، (**) مراحل أكسيد الحديد الأخرى، التي تشكلت على الأرجح من تحويل الممغنطة من قبل قوة الليزر. وقد تم تعديل هذا الرقم من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: أطياف XPS الضيقة لـ MNP، MNP@SiO2@NH2 و2 MNP@SiO2@NH@Fa. وقد تم تعديل هذا الرقم من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: CFU من Y. enterocolitica التي تم التقاطها لكل 100 ميكروغرام من الجسيمات النانوية المغناطيسية: عارية، MNP@SiOMNP@SiO2@NH2 MNP@SiO2@NH@Fa.
(أ) WC-A (نوع البرية) (ب) FoxA WC-A 12-8 (متحولة تفتقر إلى مستقبلات فيروكسامين FoxA) وصورة SEM من MNP@SiO2@NH@Fa التفاعل مع Y. enterocolitica. وقد تم تعديل هذا الرقم من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينه Z المحتملة
MNP -25.21
MNP@SiO2 -29.35
MNP@SiO2@NH2 17.03
MNP@SiO2@NH@Fa 22.14
MNP@SiO2@NHBoc@Fa 19.16
MNP@SiO2@NHCOOH@Fa 10.96

الجدول 1: القياسات المحتملة Z. وقد تم الحصول على هذا الجدول من مارتينيز - ماتاموروس وآخرون٩.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يصف هذا البروتوكول تركيب اقتران بين الجسيمات النانوية المغناطيسية وspartrophore feroxamine بواسطة الترابط التساهمي. تم تركيب الممغنطة باستخدام بروتوكول أبلغت عنه بينا وآخرون5 تليها طلاء السيليكا لحماية النواة المغناطيسية للتآكل في النظم مائي، للحد من تجميع وتوفير سطح مناسب للوظيفية6. تم تعديل عملية طلاء السيليكا. بدلا من تنفيذ ثلاثة طلاء كما ذكرت لي وآخرون6، كانت مغلفة MNPs مع طبقتين السيليكا في هذه الطريقة(الشكل 2D)الذي كان كافيا لمواصلة مع خطوة وظيفية مع APTES7.

وقد تم تعقيد Deferoxamine مع الحديد (III) لأنه عرضة للتدهور في غضون ساعات قليلة في درجة حرارة الغرفة. أفضل طريقة للحصول على مجمع الحديد هو استخدام أسيتونات أسيتيل الحديد لأن تنقيته عن طريق استخراج السائل السائل هو بسيط جدا ويتم الحصول على فيروكسيمين في العائد الكمي. فيروكسيمين مستقر ويمكن تعديله لإعطاء N-succinylferoxamine باستخدام أنهيدريد succinic لإضافة مجموعة حمضية طرفية كمرتابط. تنقية حسب حجم استبعاد الكروماتوغرافيا يسمح بإزالة أنهيدريد السيلينيك الزائد وحمض الكسينك من N-succinylferoxamine.

تم استخدام نانوكومبوسية أمين لربط N-succinylferoxamine covalently على السطح. لا يمكن استخدام الرنين المغناطيسي النووي (NMR) في التوضيح الهيكلي للمنتجات بسبب السلوك شبه المغناطيسي لأكسيد الحديد. لهذا السبب، تم رصد كل خطوة رد فعل من قبل FT-IR ومن ثم أكدها التحليل الطيفي رامان. تم إجراء قمم deconvolution وتركيب مع برنامج مناسب مع الأخذ في الاعتبار أن أطياف رامان شملت عشرة مقاييس من 300 s مع وقت قياس إجمالي 3000 s. تم قياس Morphology والحجم بواسطة TEM مراقبة المغنطيتيت الشكل الزائف مع توزيع حجم متجانس من 10 نانومتر(الشكل 2A،B). قياس سمك الطلاء مترافق تظهر طبقة متجانسة 10 نانومتر(الشكل 2D،E).

من الصعب جدا الحصول على حقل TEM حيث يمكن ملاحظة الجسيمات النانوية بشكل فردي بسبب طابعها المغناطيسي وميله إلى التكتل. تم استخدام رسم خرائط EDX للحصول على معلومات حول تكوين كل عنصر على السطح (الشكل 3A). وقد زادت كثافة الكربون بشكل واضح في MNP@SiO2@NH@Fa (الشكل 3B) مقارنة مع MNP@SiO المتوسطة2.

تم تصميم فحص التقاط البكتيريا من أجل اختبار قدرة المترافق لالتقاط البكتيريا من خلال مستقبلات بروتين الغشاء الخارجي فيلوكسامين. Yersinia enterocolitica تم اختيار سلالة WC-A لأنه يعبر عن مستقبلات فوكسا فيلوكسامين وسهلة النمو. وكانت الخطوة الحاسمة في هذا الإجراء إزالة البكتيريا غير الملتقطة. وقد تحقق ذلك عن طريق الشطف ودوامة مع برنامج تلفزيوني عقيمة مرتين تليها استعادة مجاميع البكتيريا مترافق باستخدام المغناطيس. تم تحديد أعداد الخلايا التي تم التقاطها من قبل كل من MNP المتوسطة ، وتستخدم كتحكم ، والماخرة MNP@SiO2@NH@Fa من قبل حساب المستعمرة من طريقة التخفيف. باستخدام 10 ميكرولتر قطرات يسهل الإجراء التجريبي ويسمح للتعامل مع أكثر من أربع عينات خفض تكلفة الاختبار من حيث الوقت والمواد بالمقارنة مع الطريقة الكلاسيكية لعد البلاك المستعمرات.

وأهم قيد في توليف MNP@SiO2@NH@Fa هو أنه لا يمكن تأكيد تكوين السندات بواسطة NMR. وعلى الرغم من أن إعداد MNP@SiO2@NH@Fa يبدو بسيطاً، فإن استخدام تقنيات توصيف التوصيف الهيكلي أمر بالغ الأهمية من أجل تأكيد الصلة بين الدعامات الجانبية و"الحركة الوطنية الشعبية" من خلال رابطة ساهمية.

بعد هذا البروتوكول، فمن الممكن لتوليد conjugates باستخدام الكيمياء carbodiimide. من أجل تحقيق ذلك، وجود مجموعات أمينية على سطح MNPs ووظيفة حمض الكربوكسيلي في مجمع الفائدة ضرورية. اختبار الروابط المختلفة وطلاء سطح MNPs مع مجموعات وظيفية أخرى لتجنب خلق رسوم إيجابية على أنه يمكن أن يحسن التمييز التقاط البكتيرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا ما نكشف عنه

Acknowledgments

الكتاب ممتنا نقدر البروفيسور كلاوس Hantke (جامعة توبنغن ، ألمانيا) للتكرم توريد Yersinia enterocolitica سلالات المستخدمة في هذا العمل. وقد تم دعم هذا العمل من خلال المنح AGL2015-63740-C2-1/2-R وRTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) من الوكالة الحكومية للأبحاث (AEI) في إسبانيا، والتي يشارك في تمويلها برنامج فيدر من الاتحاد الأوروبي. كما تم دعم العمل في جامعة سانتياغو دي كومبوستيلا وجامعة كورونيا بمنح من قبل GRC2018/018 و GRC2018/039 و ED431E 2018/03 (مجموعة إستراتيجية CICA-INIBIC) من Xunta de Galicia. وأخيراً، نود أن نشكر نوريا كالفو على تعاونها الكبير في تنفيذ بروتوكول الفيديو هذا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT
Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41, (7), 2912-2942 (2012).
  2. Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
  3. Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27, (5), 637-657 (2010).
  4. Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109, (10), 4580-4595 (2010).
  5. Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17, (15), 3044-3049 (2005).
  6. Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76, (5), 484-489 (2010).
  7. Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
  8. El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129, (44), 13392-13393 (2007).
  9. Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9, (24), 13533-13542 (2019).
  10. Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788, (1-3), 1-6 (2006).
  11. Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174, (4), 424-430 (2003).
  12. González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320, (12), 92-99 (2003).
  13. Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14, (3-7), 1051-1056 (2005).
  14. You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93, (10), 103111-103113 (2008).
  15. Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603, (18), 2849-2860 (2009).
  16. Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137, (1-4), 179-183 (2002).
  17. Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
  18. Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
  19. Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
توليف الجسيمات النانوية المغناطيسية الوظيفية، والاقتران مع Siderophore فيلوكسامين وتقييمها للكشف عن البكتيريا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).More

Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter