Summary
Dette arbejde beskriver protokoller for fremstilling af magnetiske nanopartikler, dens belægning med SiO2, efterfulgt af dens amine funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens bøjning med deferoxamin ved hjælp af en succinyl moiety som linker. En dyb strukturel karakterisering beskrivelse og en fange bakterier assay ved hjælp af Y. enterocolitica for alle de mellemliggende nanopartikler og den endelige konjugat er også beskrevet i detaljer.
Abstract
I dette arbejde, syntesen af magnetiske nanopartikler, dens belægning med SiO2, efterfulgt af dens amine funktionalisering med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) og dens konjugation med deferoxamin, en siderophore anerkendt af Yersinia enterocolitica, ved hjælp af en succinyl moiety som en linker er beskrevet.
Magnetitens magnetiske nanopartikler (MNP) (Fe3O4) blev fremstillet ved solvotermisk metode og belagt med SiO2 (MNP@SiO2) ved hjælp af Stöber-processen efterfulgt af funktionalisering med APTES (MNP@SiO2@NH2). Derefter blev feroxamin konjugeret med MNP@SiO2@NH2 ved carbodiimidekobling for at give MNP@SiO2@NH2@Fa. Konjugattens og mellemprodukternes morfologi og egenskaber blev undersøgt ved hjælp af otte forskellige metoder, herunder pulver røntgendiffraktion (XRD), Fourier transform infrarød spektroskopi (FT-IR), Raman-spektroskopi, røntgenfotoelektroskopi (XPS), transmissionseleklektronmikroskopi (TEM) og kortlægning af energispredning X-Ray (EDX). Denne udtømmende karakteristik bekræftede dannelsen af konjugatet. Endelig, for at vurdere kapaciteten og specificiteten af nanopartikler, de blev testet i en fange bakterier assay ved hjælp af Yersinia enterocolitica.
Introduction
De bakteriedetektionsmetoder, der anvender MNP, er baseret på molekylær genkendelse af antistoffer, aptamere, bioprotein, kulhydrater, der er konjugeret til MNP af de patogene bakterier1. I betragtning af at siderophores er anerkendt af specifikke receptorer på den ydre membran af bakterier, de kunne også knyttet til MNP at øge deres specificitet2. Siderophores er små organiske molekyler involveret i Fe3 + optagelse af bakterier3,4. Udarbejdelsen af konjugater mellem siderophores og MNP sammen med deres vurdering for opsamling og isolering af bakterier er endnu ikke blevet rapporteret.
Et af de afgørende trin i syntesen af konjugater af magnetiske nanopartikler med små molekyler er valget af typen af binding eller interaktion mellem dem for at sikre, at det lille molekyle er fastgjort til overfladen af MNP. Af denne grund, proceduren for at forberede konjugat mellem magnetiske nanopartikler og feroxamin-den siderophore anerkendt af Yersinia enterocolitica-var fokuseret på generering af en modificerbar overflade af MNP at tillade forbinder det kovalent til siderophore af carbodiimide kemi. For at få en ensartet magnetit nanopartikler (MNP) og for at forbedre nukleation og størrelse kontrol, en solvolyse reaktion med benzylalkohol blev gennemført i en termisk blok uden at ryste5. Derefter blev en silica belægning genereret af Stöber metode til at give beskyttelse og forbedre stabiliteten af nanopartikler suspension i vandige medier6. Under hensyntagen til feroxaminens struktur er det nødvendigt at indføre amingrupper for at producere egnede nanopartikler (MNP@SiO2@NH2), der skal konjugeres med den siderophore. Dette blev opnået ved kondensation af (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) med de alkoholgrupper, der var til stede på overfladen af de silica modificerede nanopartikler (MNP@SiO2) ved hjælp af en sol-gel metode7.
Parallelt hermed blev feroxaminjern(III)-komplekset fremstillet ved kompleksdannelse af det kommercielt tilgængelige deferoxamin med jernacetylacetont i vandig opløsning. N-succinylferoxamin, der bærer succinyl grupper, der vil fungere som linkere, blev opnået ved reaktionen af feroxamin med kortfattet anhydrid.
Konjugationen mellem MNP@SiO2@NH2 og N-succinylferoxamin for at give MNP@SiO2@NH@Fa blev udført gennem carbodiimidekemi ved hjælp af som koblingsreagenser benzotriazol-1-yl-yloxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphat (BOP) og 1-hydroxybenzotriazole (HOBt) i et blødt grundlæggende medie til aktivering af terminalsyregruppen i N-succinylferoxamin8.
Når parlamentarikere blev karakteriseret, vi evalueret mulighederne i nøgne og funktionaliserede magnetiske nanopartikler til at fange vilde type (WC-A) og en mutant af Y. enterocolitica mangler feroxamin receptor FoxA (FoxA WC-A 12-8). Plain parlamentsmedlemmer, funktionaliserede parlamentsmedlemmer og konjugat MNP@SiO2@NH@Fa fik lov til at interagere med hver Y. enterocolitica stamme. De bakteriekonjugataggregater blev adskilt fra bakteriesuspensionen ved anvendelse af et magnetfelt. De separerede aggregater blev skyllet to gange med fosfatbufferet saltvand (PBS), re-suspenderet i PBS for at forberede serielle fortyndinger og derefter, de blev belagt til koloni tælling. Denne protokol viser hvert trin i syntesen af MNP@SiO2@NH@Fa, den strukturelle karakterisering af alle mellemprodukter og konjugat, og en bakterie fange assay som en nem måde at vurdere specificiteten af konjugat i forhold til mellemprodukter. kr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: For de reaktioner, der blev udført under inert atmosfæreforhold, blev alt glasvarer tidligere tørret i en ovn ved 65 °C, forseglet med en gummiskille og renset med argon tre gange.
1. Syntese af magnetiske nanopartikler konjugeret med feroxamin
- Syntese af Fe3O4 magnetiske nanopartikler (MNPs)
- Der tilsættes 0,5 g Fe(acac)3 i et 20 ml glashætteglas, og der blandes derefter med 10 ml benzylalkohol.
- Soniker denne blanding i 2 min., og overfør den derefter til en varmeblok og opvarmes ved 180 °C i 72 timer.
- Når reaktionen er afsluttet, skal hætteglassene køle af, nanopartiklerne skylles med 96% ethanol og centrifugeres ved 4000 x g i 30 min. Gentag centrifugationen mindst to gange.
- Adskil nanopartiklerne fra supernatanten ved magnetisk tiltrækning ved hjælp af en neodym (NdFeB) magnet og kassér det resterende opløsningsmiddel.
- Skyl med 96% ethanol gentage trin 1.1.4. og kassér supernatanten skiftevis med sonikering i et bad i 1 min ved 40 kHz, indtil opløsningsmidlet ser klart ud.
- Magnetiske nanopartikler SiO2 belægning (MNP@SiO2)
- Der fremstilles en suspension af 2 g MNP i 80 ml isopropanol, hvorefter der tilsættes 4 ml 21% ammoniak, 7,5 ml destilleret vand og 0,56 ml tetraethylsontosilikat (i denne rækkefølge) i en rund bundkolbe med magnetisk omrøringsstang.
- Blandingen opvarmes ved 40 °C i 2 timer under kontinuerlig omrøring og derefter sonikeres i 1 time.
- Adskil MNP med en magnet, kassér supernatanten, og disperger det i 30 ml isopropanol.
- Gentag trin 1.2.1. og 1.2.2.
- Fjern og vask den magnetiske omrørsbar med 96% ethanol for at genvinde alt materialet.
- Adskil nanopartiklerne fra supernatanten ved magnetisk tiltrækning ved hjælp af en magnet.
- Kassér supernatanten, og skyl nanopartiklerne med 96% ethanol tre gange skiftevis med sonikering.
- Nanopartiklerne tørres under vakuum ved stuetemperatur i 12 timer.
- Funktionalisering af MNP@SiO2 med (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
- 500 mg af MNP@SiO2 fra det foregående trin med N,N-dimethylformamid (DMF) under inert atmosfære og derefter sonikere i 1 min ved 40 kHz. Derefter kasseres supernatanten, og gentag denne proces tre gange.
- Partiklerne opses igen i en rund bundkolbe under omrøring med en magnetisk omrørstang, og der tilsættes 9 ml APTES.
- Blandingen omrøres ved 60 °C i 12 timer.
- Kassér supernatanten, og skyl nanopartiklerne med 96% ethanol tre gange skiftevis med sonikering.
- Syntese af feroxamin
- 100 mg (0,15 mmol) af deferoxamin mesylate salt og 53,0 mg (0,15 mmol) fe (acac)3 i 5 ml destilleret vand og rør blandingen natten over ved stuetemperatur.
- Det resulterende produkt vaskes tre gange med 20 ml EtOAc i en separationstragt, og fjern derefter det organiske opløsningsmiddel under vakuum ved hjælp af en roterende fordamper.
- Fryse-tør den vandige fase råd feroxamin som et rødt fast stof.
- Syntese Naf N-succinylferoxamin
- Der tilsættes 350 mg feroxamin i 5 ml pyridin i en 50 ml rundbundet kolbe på 50 ml under inert atmosfære.
- Den resulterende blanding omrøres ved stuetemperatur i 16 timer. Efter dette tidspunkt, fjerne overskydende af pyridin under reduceret tryk i en roterende fordamper at give en mørk rød fast stof.
- Reaktionen opløses i 3 ml methanol.
- Den methanolice opløsning overføres til en Sephadex-kolonne (20 cm Sephadex i en kolonne med en diameter på 20 mm) og elueres ved 0,5 ml/min.
- Opsaml den røde fraktion og fjern methanolen under vakuum ved hjælp af en roterende fordamper.
- Syntese af konjugat MNP@SiO2@NH@Fa
- 30 mg tør MNP@SiO2@NH2 to gange med DMF og soniker nanopartiklerne i en 100 ml Erlenmeyerkolbe i 30 min under inert atmosfære.
- Der fremstilles en opløsning af N-succinylferoxamin (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorphosphat (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hydroxybenzotriazol (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) og N,N-diisopropylethylamin (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) i 10 ml DMF (Mix A) i en 50 ml rundbundet kolbe under inert atmosfære. N
- Den tidligere skyllede MNP@SiO2@NH2 i 3 ml DMF under sonikering under tør under iltfrie forhold ved hjælp af en argongasatmosfære (Mix B).
- Tilføj mix A for at blande B dropwise.
- Ryst den endelige blanding ved hjælp af en orbital shaker ved stuetemperatur natten over.
- Adskil den resulterende konjugat (MNP@SiO2@NH@Fa) fra suspensionen ved hjælp af en magnet.
- Skyl den resulterende faste og derefter sonikere det fem gange med 10 ml ethanol.
- Fast stoftørres under vakuum i 24 timer.
2. Bakterieanalyse med Y. enterocoliticastammer til kvantificering af indfangning af patogene bakterier med nanopartikler
- Der forberedes en suspension af alle de mellemliggende nanopartikler og den endelige konjugat i PBS ved 1 mg/ml i sterile 2 ml rør.
- Forbered en kultur af Y. enterocolitica i 5 ml Luria Bertani (LB) bouillon natten inkubere ved 37 °C.
- Der tilberedes en 5 ml jernmangel tryptisk sojabouillon (TSB) ved at tilføje 50 μL 10 mM 2,2′-bipyridyl.
- Den 5 ml jerndefekt TSB podes med 50 μL af nattens y. enterocoliticas dyrkning og derefter inkuberes ved 37 °C med omrøring, indtil en OD600 = 0,5\u20120.8 er nået.
- Der udtages 100 μL af den dyrkning, der er opnået i trin 2.4, og fortyndes i et 2,0 ml rør indeholdende 900 μL PBS for at opnå en første 1/10 fortynding. Derefter forberede en 1/100 fortynding fra den første fortynding ved hjælp af samme procedure for at få en koncentration af bakterieceller på 1 x10 6 Colony Forming Units (CFU) / ml ca.
- Der tilsættes 100 μL nanopartiklersuspension ved 1 mg/ml til 1 ml af 1/100 fortyndingen af bakteriesuspensionen i et 2,0 ml rør og homogeniseres med vortex.
- Dyrkningen inkuberes ved 20 °C i 1 time.
- Adskil MNP/bakterier aggregater ved hjælp af en magnet og omhyggeligt kassere supernatant.
- Skyl de adskilte nanopartikler to gange med 1 ml PBS ved hjælp af en vortex.
- Nanopartiklerne suspenderes i 1 ml PBS for at tælle mængden af bakteriefangst i CFU/ml.
- Fire på hinanden følgende 1/10 fortyndinger fra den tidligere suspension, indtil en 1 x 10-4 fortynding er nået.
- Plade 10 μL af hver fortynding på TS agarplader og inkuberes ved 37 °C natten over.
- Fotografer pladen med en gel digitalizer i epi hvid tilstand. Behandl billedet med en passende software for at forstærke et sted for at tælle antallet af individuelle kolonier.
BEMÆRK: Hvert MNP-mellemprodukt var karakteriseret til at følge op på syntesens forløb. For det første blev de nøgne parlamentsmedlemmer undersøgt af XRD for at kontrollere den krystallinske struktur. Derefter blev FT-IR-spektret for hvert mellemprodukt kørt for at kontrollere de ændringer, der fandt sted i den tilsvarende reaktion. Der blev også foretaget en analyse af ramanspektroskopi af hvert mellemprodukt for at bekræfte konklusionerne fra FT-IR-spektre. TGA analyse gav os mulighed for at vurdere tabsvægten af mellemprodukterne med organisk materiale i sin struktur. Morfologien og størrelsen af hvert mellemprodukt blev undersøgt af TEM. Endelig var XPS-analyse afgørende for at bestemme atomoxidationstilstandene ved hver MNP-mellemoverflade og for at bekræfte kovalent bindingsformation i konjugatten MNP@SiO2@NH@Fa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En udtømmende strukturel karakterisering udføres for at bestemme morfologien og egenskaberne af hvert mellemprodukt og den endelige konjugat. Til dette formål anvendes teknikkerne XRD, FT-IR, Raman spektroskopi, TGA, TEM, EDX mapping og XPS til at påvise konjugattens dannelse. Oxidationstilstande af atomer på overfladen af nanopartikler erhvervet af X-ray fotoelektroskopi (XPS) er de mest relevante data til at bekræfte dannelsen af kovalente bindinger mellem nanopartikel og siderophore. I overensstemmelse med disse resultater, denne protokol er reproducerbar.
Bare MNP, funktionaliserede parlamentsmedlemmer og konjugat blandes med hver Y. enterocolitica stamme i PBS opløsning. De bakterier-MNPs aggregater er adskilt fra suspensionen ved hjælp af en magnet. Efter skylning af aggregater to gange med PBS, er de re-suspenderet i PBS at forberede serielle fortyndinger, der er belagt til koloni tælling.
Mellemprodukter og den endelige konjugat udarbejdet ved hjælp af denne protokol blev forelagt flere teknikker til at vise de ændringer, der finder sted i hvert trin i syntesen. Infrarød og Raman spektroskopi udgør en nem og hurtig måde at overvåge hvert trin i syntesen. Tilstedeværelsen af karakteristiske bånd svarende til Si-O, C-Si-C, Fe-O, O=C midt i vibrationer, O=C-N hydroxamsyrevibrationer i FT-IR- og Raman-spektrene (se nedenfor) var de første indikatorer for de kemiske ændringer, der fandt sted på overfladen af de magnetiske nanopartikler i hvert trin i syntesen.
XRD-diffractogram
Figur 1 viser den XRD-analyse, der anvendes til at bekræfte sammensætningen og den krystallinske struktur af magnetitens syntetiske magnetiske nanopartikler (MNP) i sammenligning med JCPDS-filen 00-003-0863.
TEM-analyse
Figur 2C viser lyspunkter i elektrondiffraktionsmønsteret, der svarer til magnetitens (111), (220), (311), (400), (422), (511) og (440) diffraktionsplaner, der svarer til d-afstand på 4,9 2.9, 2.4, 2.0, 1.7, 1.6 og 1.4 Å. På den anden side viser figur 2D og figur 4E TEM-billeder af MNP@SiO2@NH2@Fa svarende til spredte MNP-partikler (~10 nm), der er indlejret i det amorfe uorganiske/organiske materiale. Belægningen tykkelse er over ~ 10 nm.
EDX-analyse
EDX kort viser fordelingen af elementerne Fe, O, Si og C på overfladen. Figur 3A viser tydeligt tilstedeværelsen af Si på overfladen af MNP@SiO2. Efter aminefunktionalisering og bøjning med feroxamin er forøgelse af C på overfladen af nanopartikler i MNP@SiO2@NH@Fa vist i figur 3B som bevis for en vellykket bøjning.
IR-analyse
FTIR-spektre af nøgne MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa er vist i figur 4. Alle FTIR-spektre viser begyndelsen af et bånd inden for analyseområdet ved 600 cm-1, som var relateret til Fe-O-vibrationer. Tilstedeværelsen af et bredt bånd på 1050 cm-1- tilskrives Si-O-Si stretching vibrationer-i FTIR spektre af MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa bekræftet silica belægning.
FTIR-spektret på MNP@SiO2 (figur 4) viser et bredt bånd mellem 830 og 1275 cm-1 (Si-O-binding); det bliver mere intens efter sin funktionalisering med APTES i FTIR spektrum af MNP@SiO2@NH2, sandsynligvis på grund af Si-C obligation (forventes mellem 1175 og 1250 cm-1). Endelig de bånd på 2995 cm-1 (C-H stretching obligationer), 1640 cm-1 (O = C-NH midte II vibration) og 1577 cm-1 (O = C-N hydroxamic syre vibrationer) observeret i FTIR spektrum af MNP@SiO2@NH@Fa bekræftet konjugation af feroxamin med nanopartikler10.
Termogravimetrianalyse
Termogravimetri data er vist i figur 5, som viser vægttab på grund af tilsætning af organisk materiale og vand.
Raman analyse
Silicabelægningen og funktionaliseringen af den nøgne MNP blev også bekræftet af Raman-analysen af hvert mellemprodukt og MNP@SiO2@NH@Fa (figur 6). Alle Raman-spektre viser toppe ved 305,8, 537,2 og 665,6 cm-1, svarende til Fe-O-vibrationer (Figur 6A)11, og en skulder på toppen ved 713,5 cm-1, vedrørende Si-O-Si-vibrationer ( Figur6B)12. Efter APTES funktionalisering viser Raman-spektret af MNP@SiO2@NH2 intense toppe på 1001,5 og 1027,4 cm-1, svarende til tilstedeværelsen af SiO2, og ved 1578,6 og 1597,9 cm-1, hvilket bekræfter dannelsen af Si-C-obligationer. Desuden bekræftede tilstedeværelsen af en skulder af toppen på 703,0 cm-1 også tilstedeværelsen af APTES (Figur 6C)13,14. Endelig er den brede top mellem 1490 og 1700 cm-1 (centreret ved ~ 1581 cm-1), svarende til Si-C-bindinger og amidgrupper i Raman-spektret på MNP@SiO2@NH@Fa, enig i dannelsen af konjugatten (figur 6D)14.
XPS-analyse
Undersøgelsen af atomernes oxidationstilstand på overfladen blev udført ved XPS-analyse og bekræftede bindingsdannelsen i strukturerne. Figur 7 viser XPS-spektrene for de nøgne og forskellige funktionsdygtige parlamentsmedlemmer. For MNP kan en smal top i C1 skyldes urenheder i håndteringen af prøven under syntesen. Indførelsen af kulstof er observeret som C-C og C-H obligationer i MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa spektre. Analysen af toppen ved 399 eV i N1s-spektrene sammen med dens adæmpning observeret for MNP@SiO2@NH@Fa bekræfter dannelsen af amidbindinger mellem MNP@SiO2@NH2 og feroxamin. Desuden er der i nærheden af N-O-bindingen af hydroxamiske moieties i stået med tilstedeværelsen af et højdepunkt ved 402 eV. Tilstedeværelsen af et højdepunkt ved 102 eV i Si2p smalle spektre i alle mellemprodukter og konjugatten er enig i den bindende energi for siloxangruppen15,16.
Z Potentiale
Z-potentielle værdier vises i tabel 1. Resultaterne er negative, henholdsvis -25,21 og -29,35 mV, for MNP og MNP@SiO2. Funktionalisering med APTES for at give MNP@SiO2@NH2 ændrede overfladeladningen fra negativ til positiv. Dette faktum blev tilskrevet amingrupperne, og overfladeladningen er fortsat positiv for MNP@SiO2@NH@Fa. Det positive overflade-Z-potentiale kan forklare samspillet mellem bakterier (hvis overflade er negativ) og konjugatten17,18,19.
Bakteriefangst assay
Antallet af celler af Y. enterocolitica WC-A og FoxA WC-A 12-8 fanget med MNP mellemprodukter og MNP@SiO2@NH@Fa blev kvantificeret i de fortyndinger, hvor 40 \u201260 kolonier blev adskilt og let visualiseret. Antallet af optagne celler med nøgne, MNP@SiO2og MNP@SiO2@NH2 viser ingen signifikante forskelle mellem dem (figur 8). De elektrostatiske kræfter på grund af frie amingrupper i MNP@SiO2@NH2 og den lave koncentration af feroxaminmembranreceptor i bakterier kan retfærdiggøre manglen på forventet bindende specificitet.
Denne protokol kan anvendes i syntesen af forskellige typer konjugater, primært dem, der bruger carbodiimide kemi. Det er alsidigt nok til at indføre ændringer for at opnå bedre resultater. Den fuldstændige karakterisering af alle mellemprodukter og den endelige konjugat, ved hjælp af de beskrevne teknikker, gør det muligt for en at følge hvert trin i syntesen og bekræfte dannelsen af ønsket obligation. Optællingen af kolonier i bakterieopsamlingsanalysen ved hjælp af en dråbe på 10 μL gør det muligt at teste alle prøverne på samme tid i én plade, hvilket gør det lettere at få replikater og udføre analyser under forskellige forhold.
Figur 1: Sammenligning af MNP (Fe3O4) (lilla) og magnetitmønster (sort) diffractogram.
Dette tal er blevet ændret fra Martínez-Matamoros et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Bright felt TEM og elektron diffraktion billeder af nøgne MNP (A, B og C), og af MNP@SiO2@NH@Fa (D, E og F).
Billederne har mellemstore og høje opløsninger. Dette tal er blevet ændret fra Martínez-Matamoros et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: EDX-kort over MNP@SiO2: HAADF-billede og de tilsvarende Kort mellem Fe, Si, O og C over A. MNP@SiO2 og B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Dette tal er blevet ændret fra Martínez-Matamoros et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: FT-IR-spektre af bar jernoxid (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Dette tal er blevet ændret fra Martínez-Matamoros et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Termogravimetrisk analyse af MNP, MNP@SiO2@NH2og MNP@SiO2@NH@Fa.
Dette tal er blevet ændret fra Martínez-Matamoros et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Ramanspektre af bar jernoxid (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 C og MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Andre jernoxid faser, sandsynligvis dannet ved omdannelsen af magnetit af laser magt. Dette tal er blevet ændret fra Martínez-Matamoros et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: XPS smalle spektre af MNP, MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa. Dette tal er blevet ændret fra Martínez-Matamoros et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: CFU af Y. enterocolitica fanget pr. 100 μg magnetiske nanopartikler: nøgne, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 og MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (vildtype) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutant mangler feroxamin receptor FoxA) og SEM billede af MNP@SiO2@NH@Fa interagere med Y. enterocolitica. Dette tal er blevet ændret fra Martínez-Matamoros et al.9. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Prøve | Z Potentiale |
| Mnp | -25.21 |
| MNP@SiO2. | -29.35 |
| MNP@SiO2@NH2. | 17.03 |
| MNP@SiO2@NH@Fa | 22.14 |
| MNP@SiO2@NHBoc@Fa | 19.16 |
| MNP@SiO2@NHCOOH@Fa | 10.96 |
Tabel 1: Z potentielle målinger. Denne tabel er hentet fra Martínez-Matamoros et al.9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver syntesen af en konjugat mellem magnetiske nanopartikler og siderophore feroxamin ved kovalent binding. Syntesen af magnetit blev udført ved hjælp af den protokol, der er rapporteret af Pinna et al.5 efterfulgt af silicabelægning for at beskytte den magnetiske kerne af korrosion i vandige systemer, for at minimere aggregering og for at give en passende overflade til funktionalisering6. Silicabelægningsprocessen blev ændret. I stedet for at udføre tre belægninger som rapporteret af Li et al.6blev parlamentarikerne belagt med to silicalag i denne metode (Figur 2D) , som var nok til at fortsætte med funktionaliseringstrinnet med APTES7.
Deferoxamin blev kompleks med jern (III), fordi det er modtageligt for nedbrydning inden for et par timer ved stuetemperatur. Den bedste måde at opnå jernkomplekset er ved hjælp af jern acetyl acetont, fordi dens rensning ved væske-flydende ekstraktion er meget enkel og feroxamin opnås i et kvantitativt udbytte. Feroxamin er stabil og kan Nændres for at give N-succinylferoxamin ved hjælp af kortfattet anhydrid til at tilføje en terminal sur gruppe som linker. Rensningen efter størrelse udelukkelse kromatografi gør det muligt at fjerne den overskydende kortfattet anhydrid og ravsyre fra N-succinylferoxamin. N
Den amin nanokomposit blev Nbrugt til at forbinde N-succinylferoxamin kovalent på overfladen. Nuklear magnetisk resonans (NMR) kan ikke anvendes til strukturel belysning af produkterne på grund af jernoxidens paramagnetiske adfærd. Af denne grund blev hvert reaktionstrin overvåget af FT-IR og derefter bekræftet af Raman-spektroskopi. Dekonvolution og -montering blev foretaget med en praktisk software, idet der blev taget hensyn til, at Raman-spektrene omfattede ti mål på 300 s med en samlet måletid på 3.000 s. Morfologi og størrelse blev målt ved, at TEM observerede den pseudosfæreformede formmagnetit med en homogen størrelsesfordeling på 10 nm (figur 2A,B). Konjugatbelægningens tykkelsesforanstaltning viser et homogent lag på 10 nm (Figur 2D,E).
Det er meget vanskeligt at opnå et TEM-felt, hvor nanopartikler kan observeres individuelt på grund af dets magnetiske karakter og dets tendens til agglomerat. EDX-kortlægningen blev anvendt til at indhente oplysninger om sammensætningen af hvert element på overfladen (Figur 3A). Kulstoftætheden blev klart forøget i konjugatet MNP@SiO2@NH@Fa (figur 3B) i forhold til den mellemliggende MNP@SiO2.
Bakterieopsamlingsanalysen blev designet med henblik på at teste konjugattens evne til at fange bakterier gennem feroxamin ydre membranproteinreceptor. Yersinia enterocolitica WC-A stamme blev valgt, fordi det udtrykker FoxA feroxamin receptor og er let at dyrke. Det kritiske trin i denne procedure var fjernelse af ikke-tilfangetagne bakterier. Dette blev opnået ved skylning og vortexing med sterile PBS to gange efterfulgt af at inddrive bakterier-konjugat aggregater ved hjælp af en magnet. Antallet af tilfangetagne celler af hver af MNP-mellemproduktett, der anvendes som kontrol, og konjugatten MNP@SiO2@NH@Fa blev bestemt ved kolonitælling fra fortyndingsmetode. Brug af 10 μL dråber letter forsøgsproceduren og gør det muligt at håndtere mere end fire prøver, der reducerer omkostningerne ved testen med hensyn til tid og materiale i forhold til den klassiske metode til plaque tælle kolonier.
Den vigtigste begrænsning af syntesen af MNP@SiO2@NH@Fa konjugat er, at det ikke er muligt at bekræfte bindingsdannelsen ved NMR. Selv om udarbejdelsen af MNP@SiO2@NH@Fa synes enkel, er brugen af de strukturelle karakteriseringsteknikker afgørende for at bekræfte forbindelsen mellem siderophore og MNP gennem en kovalent binding.
Efter denne protokol er det muligt at generere konjugater ved hjælp af carbodiimidekemi. For at opnå dette er tilstedeværelsen af aminogrupper på parlamentsoverfladen og en carboxylsyrefunktionalitet i interessesammensætningen nødvendig. Test af forskellige linkere og belægning parlamentsmedlemmer overflade med andre funktionelle grupper for at undgå at skabe positive afgifter på det kunne forbedre bakteriel fange diskrimination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender taknemmeligt professor Klaus Hantke (Universitetet i Tübingen, Tyskland) for venligt at levere Yersinia enterocolitica stammer, der anvendes i dette arbejde. Dette arbejde blev støttet af tilskud AGL2015-63740-C2-1/2-R og RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, EU) fra det statslige agentur for forskning (AEI) i Spanien, der er medfinansieret af FEDER-programmet fra Den Europæiske Union. Arbejdet på Universitetet i Santiago de Compostela og University of A Coruña blev også støttet af tilskud GRC2018/018, GRC2018/039 og ED431E 2018/03 (CICA-INIBIC strategisk gruppe) fra Xunta de Galicien. Endelig vil vi gerne takke Nuria Calvo for hendes store samarbejde gør voice-off denne video protokol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
References
- Pan, Y., Du, X., Zhao, F., Xu, B. Magnetic nanoparticles for the manipulation of proteins and cells. Chemical Society Reviews. 41 (7), 2912-2942 (2012).
- Zheng, T., Nolan, E. M. Siderophore-based detection of Fe(III) and microbial pathogens. Metallomics. 4, 866-880 (2012).
- Hider, R. C., Kong, X. Chemistry and biology of siderophores. Natural Product Reports. 27 (5), 637-657 (2010).
- Sandy, M., Butler, A. Microbial Iron Acquisition: Marine and Terrestrial Siderophores. Chemical Reviews. 109 (10), 4580-4595 (2010).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals : Nonaqueous Synthesis, Characterization. Chemistry of Materials. 17 (15), 3044-3049 (2005).
- Li, Y. S., Church, J. S., Woodhead, A. L., Moussa, F. Preparation and characterization of silica coated iron oxide magnetic nano-particles. Spectrochimica Acta - Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy. 76 (5), 484-489 (2010).
- Chen, J. P., Yang, P. C., Ma, Y. H., Tu, S. J., Lu, Y. J. Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle. International Journal of Nanomedicine. 7, 5137-5149 (2012).
- El-Boubbou, K., Gruden, C., Huang, X. Magnetic glyco-nanoparticles: a unique tool for rapid pathogen detection, decontamination, and strain differentiation. Journal of the American Chemical Society. 129 (44), 13392-13393 (2007).
- Martínez-Matamoros, D., et al. Preparation of functionalized magnetic nanoparticles conjugated with feroxamine and their evaluation for pathogen detection. RSC Advances. 9 (24), 13533-13542 (2019).
- Cozar, O., et al. Raman and surface-enhanced Raman study of desferrioxamine B and its Fe(III) complex, ferrioxamine B. Journal of Molecular Structure. 788 (1-3), 1-6 (2006).
- Shebanova, O. N., Lazor, P. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Journal of Solid State Chemistry. 174 (4), 424-430 (2003).
- González, P., Serra, J., Liste, S., Chiussi, S., León, B., Pérez-Amor, M. Raman spectroscopic study of bioactive silica based glasses. Journal of Non-Crystalline Solids. 320 (12), 92-99 (2003).
- Veres, M., et al. Characterisation of a-C:H and oxygen-containing Si:C:H films by Raman spectroscopy and XPS. Diamond and Related Materials. 14 (3-7), 1051-1056 (2005).
- You, Y., et al. Visualization and investigation of Si-C covalent bonding of single carbon nanotube grown on silicon substrate. Applied Physics Letters. 93 (10), 103111-103113 (2008).
- Graf, N., et al. XPS and NEXAFS studies of aliphatic and aromatic amine species on functionalized surfaces. Surface Science. 603 (18), 2849-2860 (2009).
- Michaeli, W., Blomfield, C. J., Short, R. D., Jones, F. R., Alexander, M. R. A study of HMDSO/O2 plasma deposits using a high-sensitivity and -energy resolution XPS instrument: curve fitting of the Si 2p core level. Applied Surface Science. 137 (1-4), 179-183 (2002).
- Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).
- Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency. RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).
- Zhan, S., et al. Efficient removal of pathogenic bacteria and viruses by multifunctional amine-modified magnetic nanoparticles. Journal of Hazardous Materials. 274, 115-123 (2014).
