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Chemistry

Sintesi di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, la loro coniugazione con la feroxamina Sideroforo e la sua valutazione per il rilevamento dei batteri

Published: June 16, 2020 doi: 10.3791/60842
Automatic Translation
1, 1, 2, 3, 1, 3, 1
1Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA), Departamento de Química, Facultade de Ciencias, Universidade da Coruña, 2Centro de Investigacións Científicas Avanzadas (CICA), Unidad de Comunicación y Divulgación, Universidade da Coruña, 3Department of Microbiology and Parasitology, Institute of Aquaculture, Universidade de Santiago de Compostela

Summary

Questo lavoro descrive i protocolli per la preparazione delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO2, seguito dalla sua funzionalizzazione dell'amine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina utilizzando una moiety succinyl come linker. Una descrizione della caratterizzazione strutturale profonda e un assaggio di batteri di cattura utilizzando Y. enterocolitica per tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale sono anche descritti in dettaglio.

Abstract

Nel lavoro attuale, la sintesi delle nanoparticelle magnetiche, il suo rivestimento con SiO2, seguita dalla sua funzionalizzazione dell'ammine con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e la sua coniugazione con deferoxamina, un siderophore riconosciuto da Yersinia enterocolitica,utilizzando una moiety succinyl come linker sono descritti.

Le nanoparticelle magnetiche (MNP) della magnetite (Fe3O4) sono state preparate con metodo solvothermal e rivestite con SiO2 (MNP@SiO2)utilizzando il processo di Stober seguito dalla funzionalizzazione con APTES (MNP@SiO2@NH2). Poi, la feroxamina è stata coniugata con il MNP@SiO2@NH2 da accoppiamento carbodimide per dare MNP@SiO2@NH2@Fa. La morfologia e le proprietà del coniugato e degli intermedi sono state esaminate con otto diversi metodi, tra cui la diffrazione in polvere X-Ray (XRD), la spettroscopia a infrarossi trasformata di Fourier (FT-IR), la spettroscopia Raman, la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS), la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) e la mappatura di dispersione energetica x-Ray (EDX). Questa caratterizzazione esaustiva confermò la formazione del coniugato. Infine, al fine di valutare la capacità e la specificità delle nanoparticelle, sono state testate in un test di cattura batteri utilizzando Yersinia enterocolitica.

Introduction

I metodi di rilevamento dei batteri utilizzando MNP si basano sul riconoscimento molecolare di anticorpi, aptamers, bioproteine, carboidrati coniugati a MNP dai batteri patogeni1. Tenendo conto che i siderofori sono riconosciuti da recettori specifici sulla membrana esterna dei batteri, potrebbero anche essere collegati a MNP per aumentare la loro specificità2. I siderofori sono piccole molecole organiche coinvolte nell'assorbimento di Fe3 dai batteri3,,4. La preparazione di coniugati tra siderophores e MNP insieme alla loro valutazione per la cattura e l'isolamento dei batteri non è ancora stata segnalata.

Uno dei passaggi cruciali nella sintesi di coniugati di nanoparticelle magnetiche con piccole molecole è la selezione del tipo di legame o di interazione tra di loro per garantire che la piccola molecola sia attaccata alla superficie del MNP. Per questo motivo, la procedura per preparare il coniugato tra nanoparticelle magnetiche e feroxamina - il sideroforo riconosciuto da Yersinia enterocolitica- si è concentrata sulla generazione di una superficie modificabile dell'MNP per consentire il collegamento covalente al sideroforo dalla chimica del carbodicolo. Al fine di ottenere una nanoparticelle magnetite uniformi (MNP) e per migliorare la nucleazione e il controllo delle dimensioni, una reazione di solvosi con alcool benzileè è stata trasportata in un blocco termico senza agitare5. Poi, un rivestimento di silice è stato generato dal metodo St'ber per conferire protezione e migliorare la stabilità delle sospensioni nanoparticelle in un supporto acquoso6. Tenendo conto della struttura della ferosamina, l'introduzione di gruppi di ammina è necessaria per produrre nanoparticelle adatte (MNP@SiO2@NH2) da coniugare con il siderophore. Ciò è stato ottenuto condensando (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) con i gruppi alcolici presenti sulla superficie delle nanoparticelle modificate di silice (MNP@SiO2)utilizzando un metodo sol-gel7.

Parallelamente, il complesso di ferro di ferosamina(III) è stato preparato con la complessità della deferoxamina disponibile in commercio con acetonato di acetil di ferro in soluzione aques. N-succinylferoxamina, recante gruppi di succinyl che fungeranno da linker, è stata ottenuta dalla reazione della feroxamina con anidride succinica.

La coniugazione tra MNP@SiO2@NH2 e N-succinylferoxamine per dare MNP@SiO2@NH-Fa è stata effettuata attraverso la chimica del carbodiimide utilizzando come reagenti di accoppiamento benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosofanio esafluorofosfato (BOP) e 1-idrossibenzotriazolo (HOBt) in un supporto di base morbido per attivare il gruppo di acido terminale in N-succinylferoxamine8.

Una volta che gli MNP sono stati caratterizzati, abbiamo valutato le capacità delle nanoparticelle magnetiche nude e funzionaliste per catturare il tipo selvaggio (WC-A) e un mutante di Y. enterocolitica privo del recettore della feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Gli MNP semplici, gli MNP funzionalizzati e i coniugati MNP@SiO2@NH-Fa sono stati autorizzati a interagire con ogni ceppo Y. enterocolitica. Gli aggregati battericoconiugi sono stati separati dalla sospensione dei batteri dall'applicazione di un campo magnetico. Gli aggregati separati sono stati sciacquati due volte con la salina tampina tamponata di fosfato (PBS), ri-sospesi in PBS per preparare le diluizioni seriali e poi, sono stati placcati per il conteggio delle coccie. Questo protocollo dimostra ogni fase della sintesi di MNP@SiO2@NH@Fa, la caratterizzazione strutturale di tutti gli intermedi e il coniugato, e un analisi di cattura del batterio come un modo semplice per valutare la specificità del coniugato in relazione agli intermedi. 9 (in vie

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Protocol

NOTA: Per le reazioni eseguite in condizioni di atmosfera inerte, tutte le vetrerie sono state precedentemente essiccate in forno a 65 gradi centigradi, sigillate con un setto di gomma e eliminate con argon tre volte.

1. Sintesi di nanoparticelle magnetiche coniugate con feroxamina

  1. Sintesi di Fe3O4 nanoparticelle magnetiche (MNP)
    1. Aggiungere 0,5 g di Fe (acac)3 in una fiala di vetro da 20 mL e quindi mescolare con 10 mL di alcool benzile.
    2. Sonicare questa miscela per 2 min, quindi trasferire in un blocco di riscaldamento e riscaldare a 180 gradi centigradi per 72 h.
    3. Una volta completata la reazione, lasciare raffreddare le fiale, sciacquare le nanoparticelle con 96% etanolo e centrifugare a 4000 x g per 30 min. Ripetere la centrifuga almeno due volte.
    4. Separare le nanoparticelle dal supernatante per attrazione magnetica utilizzando un magnete neodimium (NdFeB) e scartare il solvente residuo.
    5. Risciacquare con 96% etanolo ripetendo il passo 1.1.4. e scartare il supernatante alternando alla sonicazione in un bagno per 1 min a 40 kHz fino a quando il solvente sembra chiaro.
  2. Nanoparticelle magnetiche Rivestimento SiO2 (MNP@SiO2)
    1. Preparare una sospensione di 2 g di MNP in 80 mL di isopropanolo e quindi aggiungere 4 mL di 21% ammoniaca, 7,5 mL di acqua distillata e 0,56 mL di orthosilicate tetraetil (TEOS) (in questo ordine) in un fiascheggio inferiore rotondo con una barra di agitazione magnetica.
    2. Riscaldare il composto a 40 gradi centigradi per 2 h con agitazione continua e poi sonicare per 1 ora.
    3. Separare l'MNP con un magnete, scartare il supernatante e disperderlo in 30 mL di isopropanolo.
    4. Ripetere i passaggi 1.2.1. e 1.2.2.
    5. Rimuovere e lavare la barra magnetica di agitazione con 96% di etanolo per recuperare tutto il materiale.
    6. Separare le nanoparticelle dal supernatante per attrazione magnetica utilizzando un magnete.
    7. Scartare il supernatante e sciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo tre volte alternandosi alla sonicazione.
    8. Asciugare le nanoparticelle sotto vuoto a temperatura ambiente per 12 ore.
  3. Funzionalizzazione del MNP@SiO2 con (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES)
    1. Risciacquare 500 mg del MNP@SiO2 ottenuto dal passaggio precedente con N,N-dimethylformamide (DMF) sotto atmosfera inerte e poi sonicare per 1 min a 40 kHz. Quindi, scartare il supernatante e ripetere questo processo tre volte.
    2. Sospendere nuovamente le particelle in un flacone inferiore rotondo, sotto agitazione con una barra di stirazione magnetica e aggiungere 9 mL di APTES.
    3. Mescolare il composto a 60 gradi centigradi per 12 h.
    4. Scartare il supernatante e sciacquare le nanoparticelle con il 96% di etanolo tre volte alternandosi alla sonicazione.
  4. Sintesi di feroxamina
    1. Sciogliere 100 mg (0,15 mmol) di sale di deferoxamina mesylate e 53,0 mg (0,15 mmol) di Fe(acac)3 in 5 mL di acqua distillata e mescolare la miscela durante la notte a temperatura ambiente.
    2. Lavare il prodotto risultante tre volte con 20 mL di EtOAc in un imbuto di separazione e quindi rimuovere il solvente organico sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotatorio.
    3. Asciugare a secco la fase acquosa per permettersi la feroxamina come solido rosso.
  5. Sintesi di N-succinylferoxamine
    1. Aggiungere 350 mg (3,50 mmol) di anidride succinica a una soluzione di 100 mg (0,17 mmol) di feroxamina in 5 mL di pilride in una fiaschetta rotonda da 50 mL sotto atmosfera inerte.
    2. Mescolare la miscela risultante a temperatura ambiente per 16 h. Dopo quel tempo, rimuovere l'eccesso di piridina sotto pressione ridotta in un evaporatore rotatorio per dare un solido rosso scuro.
    3. Sciogliere il greggio di reazione in 3 mL di metanolo.
    4. Trasferire la soluzione metanolica in una colonna di Sephadex (20 cm di Sephadex in una colonna di diametro di 20 mm) ed elutare a 0,5 mL/min.
    5. Raccogliere la frazione rossa e rimuovere il metanolo sotto vuoto utilizzando un evaporatore rotatoria.
  6. Sintesi del coniugato MNP@SiO2@NH@Fa
    1. Risciacquare 30 mg di MNP@SiO secco2@NH2 due volte con DMF e sonicare le nanoparticelle in una fiaschetta Erlenmeyer da 100 ml per 30 min sotto atmosfera inerte.
    2. Preparare una soluzione di N-succinylferoxamine (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosofanio hexafluorophofosfato (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-idrossibenzotriazole (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) e N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21mmol) in 10 mL di DMF (Mix A) in un'atmosfera di flistre a fondo rotondo da 50 mL.
    3. Sospendere il MNP@SiOprecedentementesciacquato 2 @NH2 in 3 mL di DMF sotto la sonicazione a secco in condizioni di assenza di ossigeno utilizzando un'atmosfera di gas argon (Mix B).
    4. Aggiungere il mix A per mescolare B dropwise.
    5. Agitare la miscela finale utilizzando uno shaker orbitale a temperatura ambiente durante la notte.
    6. Separare il coniugato risultante (MNP@SiO2@NH@Fa) dalla sospensione utilizzando un magnete.
    7. Sciacquare il solido risultante e poi, sonicare cinque volte con 10 mL di etanolo.
    8. Asciugare il solido sotto vuoto per 24 ore.

2. L'assaggio batterico con ceppi di Y. enterocolitica per quantificare la cattura di batteri patogeni con nanoparticelle

  1. Preparare una sospensione di tutte le nanoparticelle intermedie e il coniugato finale in PBS a 1 mg/mL in sterili tubi da 2 mL.
  2. Preparare una cultura di Y. enterocolitica in 5 mL di luria Bertani (LB) inincubazione durante la notte a 37 gradi centigradi.
  3. Preparare un 5 mL di brodo di soia triplicato (TSB) di 5 mL aggiungendo 50 -L di 10 mMM 2,2'-bipyridyl.
  4. Inoculare i 5 mL di TSB carente di ferro con 50 -L della cultura notturna di Y. enterocolitica e poi, incubare a 37 s con agitazione fino a quando non viene raggiunto un OD600 - 0.5-u20120.8.
  5. Prendere 100 l della coltura ottenuta al passo 2.4 e diluire in un tubo da 2,0 mL contenente 900 -L di PBS per ottenere una prima diluizione di 1/10. Quindi, preparare una diluizione di 1/100 dalla prima diluizione utilizzando la stessa procedura per ottenere una concentrazione di cellule batteriche a 1 x 106 unità formanti colonia (CFU)/mL circa.
  6. Aggiungete 100 l di sospensione nanoparticelle a 1 mg/mL a 1 mL della diluizione di 1/100 della sospensione batterica in un tubo da 2,0 mL e omogeneizzare con il vortice.
  7. Incubare la coltura a 20 gradi centigradi per 1 ora.
  8. Separare gli aggregati MNP/batteri utilizzando un magnete e scartare attentamente il supernatale.
  9. Sciacquare le nanoparticelle separate due volte con 1 mL PBS utilizzando un vortice.
  10. Sospendere le nanoparticelle in 1 mL di PBS per contare la quantità di cattura batterica in CFU/mL.
  11. Preparare quattro diluizioni successive 1/10 dalla precedente sospensione fino a raggiungere una diluizione 1 x 10-4.
  12. Piastra 10 -L di ciascuna piastre di agar TS e incubarle a 37 gradi durante la notte.
  13. Fotografare la piastra con un digitaliizzatore gel in modalità epi bianco. Elaborare l'immagine con un software appropriato per amplificare un punto per contare il numero di singole colonie.
    NOTA: Ogni intermedio MNP è stato caratterizzato per seguire l'avanzamento della sintesi. In primo luogo, gli MP nudi sono stati studiati da XRD per controllare la struttura cristallina. Quindi, è stato eseguito lo spettro FT-IR di ogni intermedio per verificare i cambiamenti che si sono verificati nella reazione corrispondente. È stata inoltre effettuata un'analisi spettroscopia Raman di ogni intermedio al fine di confermare le conclusioni dedotte dagli spettri FT-IR. L'analisi TGA ci ha permesso di stimare il peso di perdita degli intermedi recanti materiale organico nella sua struttura. La morfologia e le dimensioni di ogni intermedio sono state studiate da TEM. Infine, l'analisi XPS è stata fondamentale per determinare gli stati di ossidazione dell'atomo su ciascuna superficie intermedia MNP e per confermare la formazione di legami covalenti nel coniugato MNP@SiO2@NH@Fa.

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Representative Results

Viene effettuata una caratterizzazione strutturale esaustiva al fine di determinare la morfologia e le proprietà di ogni intermedio e il coniugato finale. A tale scopo, le tecniche XRD, FT-IR, Raman spettroscopy, TGA, TEM, mappatura EDX e XPS sono utilizzati al fine di dimostrare la formazione del coniugato. Gli stati di ossidazione degli atomi sulla superficie delle nanoparticelle acquisite dalla spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) sono i dati più rilevanti per confermare la formazione di legami covalenti tra la nanoparticella e il sideroforo. In accordo con questi risultati, questo protocollo è riproducibile.

MNP bare, MNP funzionalizzati e coniugati sono mescolati con ogni ceppo Y. enterocolitica nella soluzione PBS. Gli aggregati batteri-MNP sono separati dalla sospensione utilizzando un magnete. Dopo aver risciacquato gli aggregati due volte con PBS, vengono risospesi in PBS per preparare le diluizioni seriali che vengono placcate per il conteggio delle coccie.

Gli intermedi e il coniugato finale preparato con questo protocollo sono stati sottoposti a diverse tecniche per visualizzare i cambiamenti che avvengono in ogni fase della sintesi. La spettroscopia a infrarossi e Raman costituisce un modo semplice e veloce per monitorare ogni fase della sintesi. La presenza di bande caratteristiche corrispondenti agli spettri Si-O, C-Si-C, Fe-O, Amide vibrazione, vibrazione dell'acido idramico di O-C-N negli spettri FT-IR e Raman (vedi sotto) sono stati i primi indicatori dei cambiamenti chimici che si stavano verificando sulla superficie delle nanoparticelle magnetiche in ogni fase della sintesi.

Diffractogramma XRD

La figura 1 mostra l'analisi XRD utilizzata per confermare la composizione e la struttura cristallina delle nanoparticelle magnetiche sintetiche (MNP) della magnetite rispetto al file JCPDS 00-003-0863.

Analisi TEM

Figura 2C visualizza i punti luminosi del modello di diffrazione degli elettroni che corrispondono con le distanze (111), (220), (311), (400), (422), (511) e (440) i piani di diffrazione della magnetite corrispondenti rispettivamente a d-spacings di 4.9, 2.9, 2.4, 2.0, 1.7, 1.6 e 1.4 . D'altra parte, la figura 2D e la figura 4E mostrano le immagini TEM di MNP@SiO2@NH2@Fa corrispondenti a particelle MNP disperse (10 nm) incorporate nel materiale amorfo inorganico-organico. Lo spessore del rivestimento è di oltre 10 nm.

Analisi EDX

Le mappe EDX mostrano la distribuzione degli elementi Fe, O, Si e C sulla superficie. Figura 3A mostra chiaramente la presenza di Si sulla superficie del MNP@SiO2. Dopo la funzionalizzazione dell'ammina e la coniugazione con la feroxamina, l'incremento di C sulla superficie delle nanoparticelle per MNP@SiO2@NH@Fa è mostrato nella Figura 3B come prova di una coniugazione di successo.

Analisi IR

Gli spettri FTIR di MNP bare,MNP@SiO 2, MNP@SiO2@NH2 eMNP@SiO 2@NH@Fa sono illustrati nella Figura 4. Tutti gli spettri FTIR mostrano l'inizio di una banda all'interno della gamma spettrale dell'analisi a 600 cm-1 che era legato alle vibrazioni Fe-O. La presenza di una banda larga a 1050 cm-1- attribuita alla vibrazione si-O-Si - negli spettri FTIR di MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa confermato il rivestimento in silice.

Lo spettro FTIR di MNP@SiO2 (Figura 4) mostra una larga fascia tra 830 e 1275 cm-1 (legame Si-O); diventa più intenso dopo la sua funzionalizzazione con APTES nello spettro FTIR di MNP@SiO2@NH2, probabilmente a causa del legame Si-C (previsto tra 1175 e 1250 cm-1). Infine, le bande a 2995 cm-1 (c-H allungando i legami), 1640 cm-1 (vibrazione di amide II) e 1577 cm-1 (vibrazione dell'acido idramico O-C-N) osservate nello spettro FTIR di MNP@SiO2@NH@Fa confermato la coniugazione della ferosamina con le nanoparticelle10.

Analisi termogravimetria

I dati termogravimetrici sono mostrati nella Figura 5, che visualizza la perdita di peso dovuta all'aggiunta di materiale organico e acqua.

Raman analisi

Il rivestimento e la funzionalizzazione in silice dell'MNP nudo sono stati confermati anche dall'analisi Raman di ogni intermedio e MNP@SiO2@NH@Fa (Figura 6). Tutti gli spettri Raman mostrano picchi a 305.8, 537.2 e 665.6 cm-1, corrispondente alle vibrazioni Fe-O (Figura 6A)11e una spalla sul picco a 713.5 cm-1, relativo alle vibrazioni Si-O-Si (Figura 6B)12. Dopo la funzionalizzazione di APTES, lo spettro Raman di MNP@SiO2@NH2 visualizza picchi intensi a 1001,5 e 1027,4 cm-1, corrispondenti alla presenza di SiO2e a 1578,6 e 1597,9 cm-1,confermando la formazione di legami Si-C. Inoltre, la presenza di una spalla del picco a 703,0 cm-1 ha confermato anche la presenza di APTES (Figura 6C)13,14. Infine, l'ampio picco tra 1490 e 1700 cm-1 (centrato a 1581 cm-1), corrispondente ai legami Si-C e amide gruppi nello spettro Raman di MNP@SiO2@NH@Fa, sono in accordo con la formazione del coniugato (Figura 6D)14.

Analisi XPS

Lo studio dello stato di ossidazione degli atomi sulla superficie è stato effettuato mediante l'analisi XPS e ha confermato la formazione dei legami nelle strutture. Nella figura 7 sono illustrati gli spettri XPS degli MNP sbarrati e diversi. Per MNP, un picco stretto in C1 potrebbe essere dovuto a impurità nella manipolazione del campione durante la sintesi. L'introduzione del carbonio è osservata come legami C-C e C-H in MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2spettri di @NH@Fa. L'analisi del picco a 399 eV negli spettri N1 spettrali insieme alla sua attenuazione osservata per MNP@SiO2@NH@Fa conferma la formazione di legami amide tra i MNP@SiO2@NH2 e la feroxamina. Inoltre, l'esistenza del legame N-O di moieties idrossimiche è in accordo con la presenza di un picco a 402 eV. La presenza di un picco a 102 eV in spettri stretti Si2p in tutti gli intermedi e il coniugato è in accordo con l'energia legante per il gruppo siloxane15,16.

Potenziale

I valori potenziali sono visualizzati nella tabella 1. I risultati sono negativi, rispettivamente -25,21 e -29,35 mV, rispettivamente per MNP e MNP@SiO2. La funzionalizzazione con APTES per dare a MNP@SiO2@NH2 ha cambiato la carica superficiale da negativa a positiva. Questo fatto è stato attribuito ai gruppi di ammine e la carica superficiale rimane positiva per MNP@SiO2@NH@Fa. La superficie positiva - potenziale potrebbe spiegare l'interazione tra i batteri (la cui superficie è negativa) e il coniugato17,18,19.

I batteri catturano il saggio

Il numero di cellule di Y. enterocolitica WC-A e FoxA WC-A 12-8 catturate con gli intermedi MNP e MNP@SiO2@NH@Fa sono state quantificate in quelle diluizioni in cui le colonie 40-u201260 sono state separate e facilmente visualizzate. Il numero di celle acquisite da bare, MNP@SiO2e MNP@SiO2@NH2 non mostra differenze significative tra di esse (Figura 8). Le forze elettrostatiche dovute a gruppi di ammine libere in MNP@SiO2@NH2 e la bassa concentrazione di recettore della membrana della ferosamina nei batteri potrebbero giustificare la mancanza di una specificità di legame attesa.

Questo protocollo potrebbe essere applicato nella sintesi di diversi tipi di coniugati, principalmente quelli che utilizzano la chimica del carbodimide. È abbastanza versatile per introdurre modifiche al fine di ottenere risultati migliori. La caratterizzazione completa di tutti gli intermedi e del coniugato finale, utilizzando le tecniche descritte, permette di seguire ogni fase della sintesi e confermare la formazione del legame del desiderio. Il conteggio delle colonie nei batteri cattura il saggio, usando una caduta di 10 gradi, permette di testare tutti i campioni contemporaneamente in una piastra che rende più facile ottenere repliche ed eseguire saggi in condizioni diverse.

Figure 1
Figura 1: Confronto dei diffractogrammi MNP (Fe3O4) (viola) e magnetite pattern (nero).
Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagini TEM e diffrazione di elettroni a campo luminoso di MNP (A, B e C) e di MNP@SiO2@NH@Fa (D, E ed F).
Le immagini sono a risoluzione media e alta. Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: mappe EDX di MNP@SiO2: Immagine HAADF e le corrispondenti mappe Fe, Si, O e C di A. MNP@SiO2 e B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: spettri FT-IR di ossido di ferro nudo (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2,MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Analisi termogravimetrica di MNP,MNP@SiO 2@NH2e MNP@SiO2@NH@Fa.
Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: spettri raman di ossido di ferro nudo (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) e MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (a)) Altre fasi di ossido di ferro, probabilmente formate dalla trasformazione della magnetite da parte della potenza laser. Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: spettri stretti XPS di MNP, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa. Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: CFU di Y. enterocolitica catturata per 100 g di nanoparticelle magnetiche: nuda, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 e MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (tipo selvaggio) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutante privo di recettore feroxamina FoxA) e immagine SEM di MNP@SiO2@NH@Fa che interagiscono con Y. enterocolitica. Questa cifra è stata modificata da Martènez-Matamoros etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Esempio Potenziale
Mnp -25.21
MNP@SiO 2 -29.35
MNP@SiO2@NH2 17.03
MNP@SiO 2@NH@Fa 22.14
MNP@SiO 2@NHBoc@Fa 19.16
MNP@SiO 2@NHCOOH@Fa 10.96

Tabella 1: : misure potenziali. Questa tabella è stata ottenuta da Martènez-Matamoros etal.

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Discussion

Questo protocollo descrive la sintesi di un coniugato tra nanoparticelle magnetiche e la ferosamina sideroforo mediante incollaggio covalente. La sintesi della magnetite è stata effettuata utilizzando il protocollo riportato da Pinna et al.5 seguito dal rivestimento in silice per proteggere il nucleo magnetico della corrosione nei sistemi acquosi, per ridurre al minimo l'aggregazione e per fornire una superficie adatta per la funzionalizzazione6. Il processo di rivestimento della silice è stato modificato. Invece di effettuare tre rivestimenti come riportato da Li et al.6, gli MRP sono stati rivestiti con due strati di silice in questo metodo (Figura 2D) che è stato sufficiente per continuare con la fase di funzionalizzazione con APTES7.

Deferoxamina era complessa con ferro (III) perché è suscettibile alla degradazione entro poche ore a temperatura ambiente. Il modo migliore per ottenere il complesso di ferro è utilizzare l'acetonato di acetil di ferro perché la sua purificazione per estrazione liquida è molto semplice e la feroxamina si ottiene in una resa quantitativa. Feroxamina è stabile e potrebbe essere modificata per dare N-succinylferoxamina utilizzando anidride succinica per aggiungere un gruppo acido terminale come linker. La purificazione per dimensione esclude la cromatomia permette la rimozione dell'anidride succinica in eccesso e dell'acido succinico da N-succinylferoxamina.

Il nanocomposito di ammina è stato utilizzato per collegare Covalentmente N-succinylferoxamine sulla superficie. La risonanza magnetica nucleare (NMR) non può essere utilizzata per la chiarificazione strutturale dei prodotti a causa del comportamento paramagnetico dell'ossido di ferro. Per questo motivo, ogni fase di reazione è stata monitorata da FT-IR e poi confermata dalla spettroscopia Raman. Picchi di deconvoluzione e raccordo sono stati fatti con un comodo software tenendo conto che gli spettri Raman comprendevano dieci misure di 300 s con un tempo di misura totale di 3.000 s. Morfologia e dimensioni sono stati misurati da TEM osservando la magnetite forma pseudosferica con una distribuzione di dimensioni omogenee di 10 nm (Figura 2A,B). La misura dello spessore di rivestimento coniugato mostra uno strato omogeneo di 10 nm (Figura 2D,E).

È molto difficile ottenere un campo TEM dove le nanoparticelle possono essere osservate individualmente a causa del suo carattere magnetico e della sua tendenza all'agglomerato. Il mapping EDX è stato utilizzato per ottenere informazioni sulla composizione di ogni elemento sulla superficie (Figura 3A). La densità di carbonio è stata chiaramente aumentata nella MNP@SiO coniugata2@NH:Fa(Figura 3B)rispetto a quella della MNP@SiO intermedia2.

Il test di cattura dei batteri è stato progettato al fine di testare la capacità del coniugato di catturare i batteri attraverso il recettore della proteina della membrana esterna della ferosamina. Yersinia enterocolitica Il ceppo WC-A è stato selezionato perché esprime il recettore della ferosamina FoxA ed è facile da coltivare. Il passo critico in questa procedura è stata la rimozione di batteri non catturati. Ciò è stato ottenuto risciacquando e vortice con PBS sterile due volte seguito recuperando gli aggregati batterico-coniugati utilizzando un magnete. Il numero di cellule catturate da ciascuno dei MNP intermedi, utilizzati come controllo, e il coniugato MNP@SiO2@NH@Fa sono stati determinati dal conteggio delle colonia dal metodo di diluizione. L'utilizzo di 10 gocce di zl facilita la procedura sperimentale e permette di gestire più di quattro campioni riducendo il costo della prova in termini di tempo e materiale rispetto al metodo classico delle colonie di conteggio delle placche.

La limitazione più importante della sintesi del MNP@SiO2@NH@Fa coniugato è che non è possibile confermare la formazione del legame da parte di NMR. Anche se la preparazione di MNP@SiO2@NH@Fa sembra semplice, l'uso delle tecniche di caratterizzazione strutturale è fondamentale per confermare il collegamento tra il sideroforo e il MNP attraverso un legame covalente.

Seguendo il protocollo attuale, è possibile generare coniugati utilizzando la chimica del carbodimide. Per raggiungere questo obiettivo, sono necessari la presenza di gruppi di amminomino sulla superficie delle MFP e una funzionalità dell'acido carboxylico nel composto di interesse. Testare diversi linker e rivestire la superficie delle NP con altri gruppi funzionali per evitare di creare cariche positive su di esso potrebbe migliorare la discriminazione di cattura batterica.

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Disclosures

Non abbiamo niente da rivelare.

Acknowledgments

Gli autori riconoscono con gratitudine il professor Klaus Hantke (Università di Tubinga, Germania) per aver gentilmente fornito i ceppi enterocolitica Yersinia utilizzati in questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni AGL2015-63740-C2-1/2-R e RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) dell'Agenzia statale per la ricerca (AEI) della Spagna, cofinanziato dal programma FEDE dell'Unione europea. Il lavoro svolto nell'Università di Santiago di Santiago di Compostela e dall'Università di A Coruèa è stato sostenuto anche dalle sovvenzioni GRC2018/018, GRC2018/039 ed ED431E 2018/03 (gruppo strategico CICA-INIBIC) della Xunta de Galicia. Infine, vogliamo ringraziare Nuria Calvo per la sua grande collaborazione facendo la voce-off questo protocollo video.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT		 Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

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References

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Chimica Problema 160 Nanoparticelle magnetiche Rivestimento SiO2, funzionalizzazione dell'ammine sideroforo batteri di cattura nanoparticelle di caratterizzazione strutturale feroxamina
Sintesi di nanoparticelle magnetiche funzionalizzate, la loro coniugazione con la feroxamina Sideroforo e la sua valutazione per il rilevamento dei batteri
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Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

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