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Chemistry

Síntesis de nanopartículas magnéticas funcionalizadas, su conjugación con el Siderophore Feroxamine y su Evaluación para la Detección de Bacterias

doi: 10.3791/60842 Published: June 16, 2020

Summary

Este trabajo describe protocolos para la preparación de nanopartículas magnéticas, su recubrimiento con SiO2,seguido de su funcionalización de amina con (3-aminopropil)trietilsilano (APTES) y su conjugación con deferoxamina utilizando una moiedad sucinil como enlace. También se describe en detalle una descripción estructural profunda y un ensayo de bacterias de captura utilizando Y. enterocolitica para todas las nanopartículas intermedias y el conjugado final.

Abstract

En el presente trabajo, se describe la síntesis de nanopartículas magnéticas, su recubrimiento con SiO2,seguido de su funcionalización de aminas con (3-aminopropil)triexisilano (APTES) y su conjugación con deferoxamina, un sideroforo reconocido por Yersinia enterocolitica,utilizando una moieteidad sucinil como enlacedor.

Las nanopartículas magnéticas (MNP) de magnetita (Fe3O4) se prepararon mediante método solvotermal y se recubrieron con SiO2 (MNP@SiO2) mediante el proceso de Stéber seguido de la funcionalización con APTES (MNP@SiO2@NH2). Luego, la feroxamina se conjugaba con el MNP@SiO2@NH2 por acoplamiento de carbodímida para dar MNP@SiO2@NH2@Fa. La morfología y las propiedades del conjugado y los intermedios fueron examinadas por ocho métodos diferentes, incluyendo la difracción de rayos X en polvo (RDX), la espectroscopia infrarroja de transformación de Fourier (FT-IR), la espectroscopia de Raman, la espectroscopia de fotoelectrón de rayos X (XPS), la microscopía electrónica de transmisión (TEM) y el mapeo de rayos X dispersivos de energía (EDX). Esta caracterización exhaustiva confirmó la formación del conjugado. Finalmente, con el fin de evaluar la capacidad y especificidad de las nanopartículas, se probaron en un ensayo de bacterias de captura utilizando Yersinia enterocolitica.

Introduction

Los métodos de detección de bacterias que utilizan MNP se basan en el reconocimiento molecular de anticuerpos, aptámeros, bioproteínas, carbohidratos conjugados con MNP por la bacteria patógena1. Teniendo en cuenta que los sideróforos son reconocidos por receptores específicos en la membrana externa de las bacterias, también podrían vincularse a MNP para aumentar su especificidad2. Los sideróforos son pequeñas moléculas orgánicas implicadas en la absorción De Fe3+ por bacterias3,,4. Todavía no se ha notificado la preparación de conjugados entre los sideróforos y MNP junto con su evaluación para la captura y aislamiento de bacterias.

Uno de los pasos cruciales en la síntesis de conjugados de nanopartículas magnéticas con moléculas pequeñas es la selección del tipo de enlace o interacción entre ellas para asegurar que la molécula pequeña esté unida a la superficie del MNP. Por esta razón, el procedimiento para preparar el conjugado entre nanopartículas magnéticas y feroxamina —el sideróforo reconocido por Yersinia enterocolitica—se centró en la generación de una superficie modificable del MNP para permitir vincularlo covalentemente al sideróforo por la química del carbodia. Con el fin de obtener una nanopartículas de magnetita uniforme (MNP) y para mejorar la nucleación y el control de tamaño, se llevó una reacción de solvolisis con alcohol bencílico en un bloque térmico sin sacudir5. A continuación, se generó un recubrimiento de sílice por el método St-ber para conferir protección y mejorar la estabilidad de la suspensión de nanopartículas en medios acuosos6. Teniendo en cuenta la estructura de la feroxamina, la introducción de grupos de aminas es necesaria para producir nanopartículas adecuadas (MNP@SiO2@NH2)que se conjugan con el sideroforo. Esto se logró mediante la condensación de (3-aminopropil)triexisilano (APTES) con los grupos de alcohol presentes en la superficie de las nanopartículas modificadas de sílice (MNP@SiO2) utilizando un método sol-gel7.

Paralelamente, el complejo de hierro de feroxamina(III) se preparó mediante la complejidad de la deferoxamina disponible comercialmente con acetil acetil de hierro en solución acuosa. N-succinilferoxamina, que lleva grupos sucintos que actuarán como enlaces, se obtuvo por la reacción de la feroxamina con anhídrido succínico.

La conjugación entre MNP@SiO2@NH2 y N-succinilferoxamina para dar MNP@SiO2@NHFase llevó a cabo a través de la química de carbodiimida utilizando como reactivos de acoplamiento benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate (BOP) y 1-hydroxybenzotriazol (HOBt) en un medio básico suave para activar el grupo de ácido terminal en N-succinylferoxamine8.

Una vez que los MNP se caracterizaron, evaluamos las capacidades de las nanopartículas magnéticas desnudas y funcionalizadas para capturar el tipo salvaje (WC-A) y un mutante de Y. enterocolitica carente de receptor de feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). Los MNP simples, los MNP funcionalizados y el MNP@SiO conjugado2@NHFase les permitió interactuar con cada cepa de Y. enterocolitica. Los agregados bacteria-conjugados fueron separados de la suspensión bacteriana por la aplicación de un campo magnético. Los agregados separados se enjuagaron dos veces con solución salina tamponada de fosfato (PBS), re-suspendido en PBS para preparar diluciones en serie y luego, fueron chapados para el conteo de colonias. Este protocolo demuestra cada paso de la síntesis de MNP@SiO2@NH@Fa, la caracterización estructural de todos los intermedios y el conjugado, y un ensayo de captura de bacterias como una manera fácil de evaluar la especificidad del conjugado en relación con los intermedios. 9

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Protocol

NOTA: Para las reacciones realizadas en condiciones de atmósfera inerte, toda la cristalería se secó previamente en un horno a 65oC, sellada con un tabique de goma y purgada con argón tres veces.

1. Síntesis de nanopartículas magnéticas conjugadas con feroxamina

  1. Síntesis de nanopartículas magnéticas Fe3O4 (MNP)
    1. Añadir 0,5 g de Fe(acac)3 en un vial de vidrio de 20 ml y luego mezclar con 10 ml de alcohol bencílico.
    2. Sonicar esta mezcla durante 2 min, luego transferir a un bloque de calentamiento y calentar a 180 oC durante 72 h.
    3. Una vez completada la reacción, deje que los viales se enfríen, enjuague las nanopartículas con 96% de etanol y centrífuga a 4000 x g durante 30 min. Repita la centrifugación al menos dos veces.
    4. Separe las nanopartículas del sobrenadante por atracción magnética utilizando un imán de neodimio (NdFeB) y deseche el disolvente residual.
    5. Enjuagar con 96% de etanol repitiendo paso 1.1.4. y desechar el sobrenadante alternando con sonicación en un baño durante 1 min a 40 kHz hasta que el disolvente se vea claro.
  2. Recubrimiento de nanopartículas magnéticas SiO2 (MNP@SiO2)
    1. Preparar una suspensión de 2 g de MNP en 80 ml de isopropanol y luego añadir 4 ml de amoníaco al 21%, 7,5 ml de agua destilada y 0,56 ml de ortósitil tetraetilo (TEOS) (en este orden) en un matraz inferior redondo con una barra de agitación magnética.
    2. Calentar la mezcla a 40 oC durante 2 h con agitación continua y luego sonicar durante 1 h.
    3. Separe el MNP con un imán, deseche el sobrenadante y disperse en 30 ml de isopropanol.
    4. Repita los pasos 1.2.1. y 1.2.2.
    5. Retire y lave la barra de agitación magnética con 96% de etanol para recuperar todo el material.
    6. Separe las nanopartículas del sobrenadante por atracción magnética usando un imán.
    7. Deseche el sobrenadante y enjuague las nanopartículas con 96% de etanol tres veces alternando con sonicación.
    8. Seque las nanopartículas al vacío a temperatura ambiente durante 12 h.
  3. Funcionalización de MNP@SiO2 con (3-aminopropil)triexisilano (APTES)
    1. Enjuagar 500 mg del MNP@SiO2 obtenidos del paso anterior con N,N-dimetilformamida (DMF) en atmósfera inerte y luego sonicar durante 1 min a 40 kHz. A continuación, deseche el sobrenadante y repita este proceso tres veces.
    2. Vuelva a suspender las partículas en un matraz inferior redondo, bajo agitación con una barra de agitación magnética y añada 9 ml de APTES.
    3. Revuelva la mezcla a 60oC durante 12 h.
    4. Deseche el sobrenadante y enjuague las nanopartículas con 96% de etanol tres veces alternando con sonicación.
  4. Síntesis de feroxamina
    1. Disolver 100 mg (0,15 mmol) de sal desferoxamina de mesilato y 53,0 mg (0,15 mmol) de Fe(acac)3 en 5 ml de agua destilada y agitar la mezcla durante la noche a temperatura ambiente.
    2. Lave el producto resultante tres veces con 20 ml de EtOAc en un embudo de separación y, a continuación, retire el disolvente orgánico al vacío utilizando un evaporador rotatorio.
    3. Seque la fase acuosa para pagar la feroxamina como un sólido rojo.
  5. Síntesis de N-succiniferoxamina
    1. Añadir 350 mg (3,50 mmol) de anhídrido succínico a una solución de 100 mg (0,17 mmol) de feroxamina en 5 ml de piridina en un matraz de fondo redondo de 50 ml bajo atmósfera inértea.
    2. Revuelva la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 16 h. Después de ese tiempo, eliminar el exceso de piridina bajo presión reducida en un evaporador rotatorio para dar un sólido de color rojo oscuro.
    3. Disolver el crudo de reacción en 3 ml de metanol.
    4. Transfiera la solución metanol a una columna sephadex (20 cm de Sephadex en una columna de 20 mm de diámetro) y elula a 0,5 ml/min.
    5. Recoger la fracción roja y retirar el metanol bajo vacío utilizando un evaporador rotatorio.
  6. Síntesis del MNP@SiO conjugado2@NH@Fa
    1. Enjuagar 30 mg de MNP@SiO seco2@NH2 dos veces con DMF y sonicar las nanopartículas en un matraz Erlenmeyer de 100 ml durante 30 minutos bajo atmósfera inerte.
    2. Preparar una solución de N-succinilferoxamina (200 mg, 0,30 mmol), benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-hexafluorofosfato de fosfonio (BOP, 173 mg, 0,45 mmol), 1-hidroxibenzotriazol (HOBt, 46 mg, 0,39 mmol) y N,N-diisopropylethylamine (DIPEA, 128,8 mg, 1,21 mmol) en 10 ml de DMF (Mix A) en un matraz de fondo redondo de 50 ml bajo atmósfera inert.
    3. Suspenda el MNP@SiO previamente enjuagado2@NH2 en 3 ml de DMF bajo sonicación en seco en condiciones libres de oxígeno utilizando una atmósfera de gas de argón (Mix B).
    4. Agregue la mezcla A para mezclar B dropwise.
    5. Agitar la mezcla final con un agitador orbital a temperatura ambiente durante la noche.
    6. Separe el conjugado resultante (MNP@SiO2@NH@Fa) de la suspensión utilizando un imán.
    7. Enjuagar el sólido resultante y luego sonicarlo cinco veces con 10 ml de etanol.
    8. Seque el sólido al vacío durante 24 h.

2. Ensayo bacteriano con cepas de Y. enterocolitica para cuantificar la captura de bacterias patógenas con nanopartículas

  1. Preparar una suspensión de todas las nanopartículas intermedias y el conjugado final en PBS a 1 mg/ml en tubos estériles de 2 ml.
  2. Preparar un cultivo de Y. enterocolitica en 5 ml de caldo de Luria Bertani (LB) durante la noche incubando a 37 oC.
  3. Preparar un caldo de soja triprítico (TSB) de 5 ml añadiendo 50 ml de 10 ml 2,2o-bipiril.
  4. Inocular los 5 ml de TSB deficiente en hierro con 50 ml del cultivo nocturno de Y. enterocolitica y luego, incubar a 37 oC con agitación hasta alcanzar un OD600 a 0,5-u20120.8.
  5. Tomar 100 l del cultivo obtenido en el paso 2.4 y diluir en un tubo de 2,0 ml que contenga 900 l de PBS para obtener una primera dilución de 1/10. Luego, prepare una dilución 1/100 de la primera dilución utilizando el mismo procedimiento para obtener una concentración de células bacterianas a 1 x 106 Unidades Formadoras de Colonias (CFU)/ml aproximadamente.
  6. Añadir 100 l de suspensión de nanopartículas a 1 mg/ml a 1 ml de la dilución 1/100 de la suspensión bacteriana en un tubo de 2,0 ml, y homogeneizar con vórtice.
  7. Incubar el cultivo a 20oC durante 1 h.
  8. Separe los agregados MNP/bacterias utilizando un imán y deseche cuidadosamente el sobrenadante.
  9. Enjuague las nanopartículas separadas dos veces con 1 ml de PBS utilizando un vórtice.
  10. Suspenda las nanopartículas en 1 ml de PBS para contar la cantidad de captura bacteriana en CFU/ml.
  11. Preparar cuatro diluciones sucesivas 1/10 de la suspensión anterior hasta alcanzar una dilución de 1 x10 -4.
  12. Placa de 10 l de cada dilución sobre placas de agar TS e incubarlas a 37oC durante la noche.
  13. Fotografía la placa con un digitalizador de gel en modo epi blanco. Procesar la imagen con un software adecuado para amplificar un lugar para contar el número de colonias individuales.
    NOTA: Cada intermedio MNP se caracterizó para dar seguimiento al progreso de la síntesis. En primer lugar, los MNP desnudos fueron estudiados por XRD para comprobar la estructura cristalina. Entonces, el espectro FT-IR de cada intermedio fue ejecutado para marcar los cambios que ocurrieron en la reacción correspondiente. También se llevó a cabo un análisis de espectroscopia raman de cada intermedio con el fin de confirmar las conclusiones deducidas de los espectros FT-IR. El análisis TGA nos permitió estimar el peso de pérdida de los intermedios que llevan material orgánico en su estructura. La morfología y el tamaño de cada intermedio fueron estudiados por TEM. Finalmente, el análisis de XPS fue crítico para determinar los estados de oxidación del átomo en cada superficie intermedia de MNP y para confirmar la formación de unión covalente en el MNP@SiO conjugado2@NH@Fa.

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Representative Results

Se lleva a cabo una caracterización estructural exhaustiva para determinar la morfología y las propiedades de cada conjugado intermedio y final. Para ello, se utilizan las técnicas XRD, FT-IR, Espectroscopia Raman, TGA, TEM, mapeo EDX y XPS para demostrar la formación del conjugado. Los estados de oxidación de los átomos en la superficie de las nanopartículas adquiridas por espectroscopia de fotoelectrón de rayos X (XPS) son los datos más relevantes para confirmar la formación de enlaces covalentes entre la nanopartícula y el sideróforo. De acuerdo con estos resultados, este protocolo es reproducible.

MNP desnudo, MNP funcionalizados y el conjugado se mezclan con cada cepa Y. enterocolitica en solución PBS. Los agregados bacteria-MNP se separan de la suspensión utilizando un imán. Después de enjuagar los agregados dos veces con PBS, se re-suspenden en PBS para preparar diluciones en serie que están chapadas para el conteo de colonias.

Los intermediarios y el conjugado final preparado con este protocolo se sometieron a varias técnicas para mostrar los cambios que tienen lugar en cada paso de la síntesis. La espectroscopia infrarroja y Raman constituyen una forma fácil y rápida de monitorear cada paso de la síntesis. La presencia de bandas características correspondientes a los espectros Si-O, C-Si-C, Fe-O, O-C amida, vibración de ácido hidroxamico O-C-N en los espectros FT-IR y Raman (ver más abajo) fueron los primeros indicadores de los cambios químicos que estaban teniendo lugar en la superficie de las nanopartículas magnéticas en cada paso de la síntesis.

Difractograma XRD

La Figura 1 muestra el análisis XRD utilizado para confirmar la composición y estructura cristalina de las nanopartículas magnéticas sintéticas (MNP) de magnetita en comparación con el archivo JCPDS 00-003-0863.

Análisis TEM

La Figura 2C muestra puntos brillantes del patrón de difracción de electrones que coinciden con los planos de difracción (111), (220), (311), (400), (422), (511) y (440) de magnetita correspondientes a los espaciados d de 4,9, 2.9, 2.4, 2.0, 1.7, 1.6 y 1.4, respectivamente. Por otro lado, la Figura 2D y la Figura 4E muestran imágenes TEM de MNP@SiO2@NH2@Fa correspondientes a partículas MNP dispersas (10 nm) incrustadas en el material inorgánico-orgánico amorfo. El espesor del recubrimiento es superior a 10 nm.

Análisis EDX

Los mapas EDX muestran la distribución de los elementos Fe, O, Si y C en la superficie. La Figura 3A muestra claramente la presencia de Si en la superficie de MNP@SiO2. Después de la funcionalización y conjugación de aminas con feroxamina, el incremento de C en la superficie de las nanopartículas para MNP@SiO2@NH@Fa se muestra en la Figura 3B como evidencia de una conjugación exitosa.

Análisis IR

Los espectros FTIR de MNP desnudo, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 y MNP@SiO2@NH@Fa se muestran en la Figura 4. Todos los espectros FTIR muestran el comienzo de una banda dentro del rango espectral del análisis a 600 cm-1 que estaba relacionado con las vibraciones Fe-O. La presencia de una banda ancha a 1050 cm-1—atribuido a la vibración de estiramiento Si-O-Si— en los espectros FTIR de MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 y MNP@SiO2@NH@Fa confirmó el recubrimiento de sílice.

El espectro FTIR de MNP@SiO2 (Figura 4) muestra una banda ancha entre 830 y 1275 cm-1 (enlace Si-O); se vuelve más intenso después de su funcionalización con APTES en el espectro FTIR de MNP@SiO2@NH2, probablemente debido al enlace Si-C (esperado entre 1175 y 1250 cm-1). Finalmente, las bandas a 2995 cm-1 (enlaces de estiramiento C-H), 1640 cm-1 (vibración O-C-NH amida II) y 1577 cm-1 (vibración de ácido hidroxámico O-C-N) observadas en el espectro FTIR de MNP@SiO2@NH@Fa confirmó la conjugación de feroxox con los nanopartículos10.

Análisis de termogravimetría

Los datos de termogravimetría se muestran en la Figura 5,que muestra la pérdida de peso debido a la adición de material orgánico y agua.

Análisis de Raman

El recubrimiento de sílice y la funcionalización del MNP desnudo también fueron confirmados por el análisis Raman de cada intermedio y MNP@SiO2@NH@Fa (Figura 6). Todos los espectros de Raman muestran picos en 305,8, 537,2 y 665,6 cm-1, correspondientes a las vibraciones Fe-O (Figura 6A)11, y un hombro en el pico de 713,5 cm-1, en relación con las vibraciones Si-O-Si (Figura 6B)12. Después de la funcionalización APTES, el espectro Raman de MNP@SiO2@NH2 muestra picos intensos en 1001.5 y 1027.4 cm-1, correspondientes a la presencia de SiO2,y en 1578.6 y 1597.9 cm-1, confirmando la formación de enlaces Si-C. Además, la presencia de un hombro del pico a 703,0 cm-1 también confirmó la presencia de APTES (Figura 6C)13,14. Por último, el pico amplio entre 1490 y 1700 cm-1 (centrado en 1581 cm-1), correspondiente a los enlaces Si-C y amida en el espectro Raman de MNP@SiO2@NH@Fa, está de acuerdo con la formación del conjugado (Figura 6D)14.

Análisis XPS

El estudio del estado de oxidación de los átomos en la superficie se realizó mediante el análisis XPS y confirmó la formación de enlaces en las estructuras. El cuadro 7 muestra los espectros XPS de los MNP funcionalizados desnudos y diferentes. Para MNP, un pico estrecho en C1s puede deberse a impurezas en el manejo de la muestra durante la síntesis. La introducción del carbono se observa como enlaces C-C y C-H en MNP@SiO2@NH2 y MNP@SiO2@NH@Fa espectros. El análisis del pico a 399 eV en los espectros N1s junto con su atenuación observada para MNP@SiO2@NH@Fa confirma la formación de enlaces de amida entre el MNP@SiO2@NH2 y la feroxamina. Además, la existencia de un enlace N-O de mitades hidroxámicas está en acuerdo con la presencia de un pico en 402 eV. La presencia de un pico a 102 eV en espectros estrechos de Si2p en todos los intermedios y el conjugado está de acuerdo con la energía de unión para el grupo de siloxano15,16.

Z Potencial

Los valores potenciales Z se muestran en la Tabla 1. Los resultados son negativos, -25,21 y -29,35 mV, para MNP y MNP@SiO2,respectivamente. Funcionalización con APTES para dar MNP@SiO2@NH2 cambió la carga de la superficie de negativa a positiva. Este hecho se atribuyó a los grupos de aminas y la carga superficial sigue siendo positiva durante MNP@SiO2@NH@Fa. El potencial positivo de la superficie Z podría explicar la interacción entre las bacterias (cuya superficie es negativa) y el conjugado17,18,19.

Ensayo de captura de bacterias

El número de células de Y. enterocolitica WC-A y FoxA WC-A 12-8 capturadas con intermedios MNP y MNP@SiO2@NH@Fa se cuantificaron en aquellas diluciones donde se separaron y visualizaron fácilmente colonias de 40o 201260. El número de celdas capturadas por bare, MNP@SiO2y MNP@SiO2@NH2 no muestra diferencias significativas entre ellas (Figura 8). Las fuerzas electrostáticas debidas a grupos de aminas libres en MNP@SiO2@NH2 y la baja concentración de receptores de membrana de feroxamina en bacterias podrían justificar la falta de especificidad de unión esperada.

Este protocolo podría aplicarse en la síntesis de diferentes tipos de conjugados, principalmente aquellos que utilizan la química de carbodiimida. Es lo suficientemente versátil como para introducir modificaciones con el fin de obtener mejores resultados. La caracterización completa de todos los intermedios y el conjugado final, utilizando las técnicas descritas, permite seguir cada paso de la síntesis y confirmar la formación del vínculo de deseo. El recuento de colonias en el ensayo de captura de bacterias, utilizando una caída de 10 l, permite probar todas las muestras al mismo tiempo en una placa que facilita la obtención de réplicas y la realización de ensayos en diferentes condiciones.

Figure 1
Figura 1: Comparación de difractogramas de MNP (Fe3O4) (púrpura) y patrón de magnetita (negro).
Esta cifra ha sido modificada de Martínez-Matamoros et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: TeM de campo brillante e imágenes de difracción de electrones de MNP desnudo (A, B y C), y de MNP@SiO2@NH@Fa (D, E y F).
Las imágenes son de resolución media y alta. Esta cifra ha sido modificada de Martínez-Matamoros et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Mapas EDX de MNP@SiO2:imagen HAADF y los mapas Fe, Si, O y C correspondientes de A. MNP@SiO2 y B. MNP@SiO2@NH@Fa.
Esta cifra ha sido modificada de Martínez-Matamoros et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Espectros FT-IR de óxido de hierro desnudo (Fe3O4) MNP, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 y MNP@SiO2@NH@Fa (4).
Esta cifra ha sido modificada de Martínez-Matamoros et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Análisis termogravimétrico de MNP, MNP@SiO2@NH2y MNP@SiO2@NH@Fa.
Esta cifra ha sido modificada de Martínez-Matamoros et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Espectros raman de óxido de hierro desnudo (Fe3O4) MNP (A), MNP@SiO2 (B), MNP@SiO2@NH2 (C) y MNP@SiO2@NH@Fa (D).
(*) APTES, (**) Otras fases de óxido de hierro, probablemente formadas a partir de la transformación de magnetita por la potencia láser. Esta cifra ha sido modificada de Martínez-Matamoros et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Espectros estrechos XPS de MNP, MNP@SiO2@NH2 y MNP@SiO2@NH@Fa. Esta cifra ha sido modificada de Martínez-Matamoros et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: CFU de Y. enterocolitica capturada por cada 100 g de nanopartículas magnéticas: desnuda, MNP@SiO2, MNP@SiO2@NH2 y MNP@SiO2@NH@Fa.
(A) WC-A (tipo salvaje) (B) FoxA WC-A 12-8 (mutante carente de receptor de feroxamina FoxA) e imagen SEM de MNP@SiO2@NH@Fa interactuando con Y. enterocolitica. Esta cifra ha sido modificada de Martínez-Matamoros et al.9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Muestra Z Potencial
Mnp -25.21
MNP@SiO2 -29.35
MNP@SiO2@NH2 17.03
MNP@SiO2@NH@Fa 22.14
MNP@SiO2@NHBoc@Fa 19.16
MNP@SiO2@NHCOOH@Fa 10.96

Tabla 1: Mediciones potenciales Z. Esta tabla se ha obtenido de Martínez-Matamoros et al.9.

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Discussion

Este protocolo describe la síntesis de un conjugado entre nanopartículas magnéticas y la feroxamina siderofore mediante unión covalente. La síntesis de magnetita se llevó a cabo utilizando el protocolo reportado por Pinna et al.5 seguido de recubrimiento de sílice para proteger el núcleo magnético de la corrosión en sistemas acuosos, minimizar la agregación y proporcionar una superficie adecuada para la funcionalización6. Se modificó el proceso de recubrimiento de sílice. En lugar de llevar a cabo tres recubrimientos según lo informado por Li et al.6, los MNP fueron recubiertos con dos capas de sílice en este método (Figura 2D) que fue suficiente para continuar con el paso de funcionalización con APTES7.

La deferoxamina se alezó con hierro (III) porque es susceptible a la degradación en pocas horas a temperatura ambiente. La mejor manera de obtener el complejo de hierro es utilizando acetil acetil de hierro porque su purificación por extracción líquido-líquido es muy simple y la feroxamina se obtiene en un rendimiento cuantitativo. La feroxamina es estable y podría modificarse para dar N-succinilferoxamina usando anhídrido succínico para agregar un grupo ácido terminal como un vinculador. La cromatografía de exclusión de tamaño por tamaño permite eliminar el exceso de anhídrido succínico y ácido succínico de N-succiniferoxamina.

El nanocompuesto de amina se utilizó para unir N-succinilferoxamine covalentemente en la superficie. La resonancia magnética nuclear (RMN) no se puede utilizar para el esclarecimiento estructural de los productos debido al comportamiento paramagnético del óxido de hierro. Por esta razón, cada paso de reacción fue monitoreado por FT-IR y luego confirmado por espectroscopia Raman. La desconvolución y el ajuste de picos se hicieron con un práctico software teniendo en cuenta que los espectros Raman incluían diez medidas de 300 s con un tiempo de medida total de 3.000 s. La morfología y el tamaño se midieron mediante TEM observando la magnetita de forma pseudoesférica con una distribución de tamaño homogénea de 10 nm (Figura 2A,B). La medida de espesor de recubrimiento conjugado muestra una capa homogénea de 10 nm(Figura 2D,E).

Es muy difícil obtener un campo TEM donde las nanopartículas se pueden observar individualmente debido a su carácter magnético y su tendencia a aglomerar. Se utilizó la asignación EDX para obtener información sobre la composición de cada elemento en la superficie (Figura 3A). La densidad de carbono se incrementó claramente en el MNP@SiO conjugado2@NHfa(Figura 3B) en relación con la del MNP@SiO intermedio2.

El ensayo de captura de bacterias fue diseñado con el fin de probar la capacidad del conjugado para capturar bacterias a través del receptor de proteína de membrana externa de feroxamina. Yersinia enterocolitica La cepa WC-A fue seleccionada porque expresa el receptor de feroxamina FoxA y es fácil de cultivar. El paso crítico en este procedimiento fue la eliminación de bacterias no capturadas. Esto se logró enjuagando y vórtices con PBS estéril dos veces seguido de la recuperación de los agregados bacteria conjugados usando un imán. Los números de células capturadas por cada uno de los intermedios MNP, utilizados como control, y el conjugado MNP@SiO2@NH@Fa fueron determinados por el conteo de colonias a partir del método de dilución. El uso de gotas de 10 l facilita el procedimiento experimental y permite manejar más de cuatro muestras reduciendo el costo de la prueba en términos de tiempo y material en comparación con el método clásico de colonias de recuento de placas.

La limitación más importante de la síntesis del MNP@SiO2@NH@Fa conjugado es que no es posible confirmar la formación de la unión por RMN. Aunque la preparación de MNP@SiO2@NH@Fa parece simple, el uso de las técnicas de caracterización estructural es crucial para confirmar la vinculación entre el sideroforo y el MNP a través de un enlace covalente.

Siguiendo el presente protocolo, es posible generar conjugados utilizando la química de carbodiimida. Para lograr esto, la presencia de grupos amino en la superficie MNP y una funcionalidad de ácido carboxílico en el compuesto de interés son necesarias. Probar diferentes enlaces y recubrir la superficie de los MNP con otros grupos funcionales para evitar crear cargas positivas en ella podría mejorar la discriminación de captura bacteriana.

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Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores agradecen al profesor Klaus Hantke (Universidad de Tubinga, Alemania) por suministrar amablemente las cepas Yersinia enterocolitica utilizadas en esta obra. Este trabajo fue apoyado por las subvenciones AGL2015-63740-C2-1/2-R y RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) de la Agencia Estatal de Investigación (AEI) de España, cofinanciada por el Programa FEDER de la Unión Europea. Los trabajos en la Universidad de Santiago de Compostela y la Universidad de A Coruña también contaron con el apoyo de las becas GRC2018/018, GRC2018/039 y ED431E 2018/03 (grupo estratégico CICA-INIBIC) de Xunta de Galicia. Por último, queremos agradecer a Nuria Calvo su gran colaboración haciendo la voz de este protocolo de vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Hydroxybenzotriazole hydrate
HOBT
Acros 300561000
2,2′-Bipyridyl Sigma Aldrich D216305
3-Aminopropyltriethoxysilane 99% Acros 151081000
Ammonium hydroxide solution 28% NH3 Sigma Aldrich 338818
Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent Acros 209800050
Benzyl alcohol Sigma Aldrich 822259
Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) Sigma Aldrich D9533
Ethanol, anhydrous, 96% Panreac 131085
Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical
Iron(III) acetylacetonate 97% Sigma Aldrich F300
LB Broth (Lennox) Sigma Aldrich L3022
N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal Acros 459591000
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal Acros 326871000
Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal Acros 339421000
Sephadex LH-20 Sigma Aldrich LH20100
Succinic anhydride >99% Sigma Aldrich 239690
Tetraethyl orthosolicate >99,0% Sigma Aldrich 86578

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References

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Síntesis de nanopartículas magnéticas funcionalizadas, su conjugación con el Siderophore Feroxamine y su Evaluación para la Detección de Bacterias
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Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).More

Martínez-Matamoros, D., Castro-García, S., Ojeda Romano, G., Balado, M., Rodríguez, J., Lemos, M. L., Jiménez, C. Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection. J. Vis. Exp. (160), e60842, doi:10.3791/60842 (2020).

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