Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/60843
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

Summary

בפרוטוקול זה, אנו מתארים אסטרטגיה יציבה, בידול יעיל מאוד עבור הדור של נוירונים האוהדים הסימפתטית של האדם בתאי גזע בעלי עוצמה גבוהה. מודל זה יעשה הנוירונים זמינים לשימוש במחקרים של הפרעות אוטונומיות מרובות.

Abstract

תאי גזע בעלי עוצמה אנושית (hPSCs) הפכו כלי רב עצמה למידול מחלות ולחקר התפתחות עובריים אנושית בתחום החוץ. בעבר הצגנו פרוטוקול בידול לנגזרת של נוירונים אוטונומית עם אופי סימפטי שהוחל על חולים עם נוירופתיה אוטונומית. עם זאת, הפרוטוקול נבנה על החלפת סרום החוצה (KSR) ומאכיל מבוססי תנאי התרבות, ועל מנת להבטיח יעילות גבוהה בידול, מיון התא היה הכרחי. גורמים אלה גורמים לשונות גבוהה, עלות גבוהה והשתנות נמוכה. יתרה מזאת, תכונות סימפטיות בוגרות, כולל פעילות חשמלית, לא אומתו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב שבו תרבות PSC ובידול מתבצעים בתנאי תרבות המוגדרים ללא מאכיל וכימית. סמנים גנטיים מזהים את ציצה. העצבים העצבית מזוהים בידול נוסף לתוך הנוירונים הסימפתטית הפוסט מושגת לאחר 20 ימים ללא צורך מיון התא. הקלטה אלקטרופיסיולוגית מראה. את זהות הנוירונים התפקודית הירי זוהה מן הנוירונים שלנו הבדיל יכול להיות משופר על ידי ניקוטין מדוכאים על ידי היריב קולטן אדרפרוכולינרגיות propranolol. ושלתי עצבי ביניים אוהדים בפרוטוקול זה ניתן לשמור כספרואידים עצביים עד 2 שבועות, אשר מאפשר הרחבה של התרבויות. בסכום, הפרוטוקול המעודכן שלנו הבחנה הקוד מראה יעילות גבוהה בידול, מיותר להתגלות, גמישות יותר, והתבגרות עצבית טובה יותר לעומת הגירסה הקודמת. פרוטוקול זה יספק לחוקרים את התאים הנחוצים לחקר הפרעות אנושיות המשפיעות על מערכת העצבים האוטונומית.

Introduction

הנוירונים הסימפוניים הסימפתטית (סימטריות) שייכים למערכת העצבים האוטונומית (ANS) ויש להם תפקידים חשובים מרובים בתגובה ויסות הומאוסטזיס של הגוף ללא תלות של התודעה. לדוגמה, המתח מעורר סימטריות ומעורר את תגובת הקרב או הטיסה שמובילה לעלייה בקצב הלב, לחץ דם והזעה. סימטריות מושפעים בהפרעות אנושיות מרובות בשל גנטיקה, רעילות/פציעה, או כמו לוויה למחלות אחרות. דוגמה של נוירופתיה גנטית היא הפרעת ילדות Dysautonomia (FD), שם חוסר התקנה חמורה של סימטריות גורמת משבר dysautonomia, ברור על ידי הזעה, blotching של העור, הקאות התקפות, יתר לחץ דם, וחרדה1. דוגמה של רעילות היא טיפול כימותרפיה, אשר דווחה יש תופעות לוואי רעילות על נוירונים אוטונומית2. ידוע כי הדבציה אוטונומית ו-hyper-אינבציה יכול להוביל, או ללוות, מחלות כגון מחלת פרקינסון או מחלת כליות יתר לחץ דם3,4. לפיכך, היכולת לערוך מחקר ולהבין את המנגנונים של הביולוגיה הסימטרית ופגמים בהקשר של מחלות, מועילים לחיפוש אחר טיפולים חדשניים ויעילים.

אנטומיה
מערכת העצבים ההיקפית מסתעף לחטיבות חושיות ואוטונומיות. עצבי הגוף של מערכת העצבים החושית אחראים לתחושת הכאב והמגע, ואילו ה-ANS אחראי לממסר מידע מכל האברים למוח. ה-ANS מחולק למערכת העצבים המעית, מinnervating במערכת העיכול, מערכת העצבים הפאראסימפתטית, החשובה להרפיה ומערכת העצבים הסימפתטית (SNS), החשובה להפעלה/לוויסות איברים. מערכת ההגירה מתאימה. למערכת דו-תא5 האקסון העצבי הסימפתטית מקדם בחוט השדרה הראשון בעמוד השידרה לגנגוליה הסימפתטית, שם ממוקמות הגופים הסלולאריים של תאי הדואר הנכנס. נוירונים אלה ולאחר מכן לשלוח התחזיות הארוכות כדי לinnervate את רקמות היעד של כל איבר בגוף. אותות ששודרו על ידי נוירונים טרום-הפרה הם cholinergic, ואילו הסימטרי הפוסט הם אדרלירגיות ובכך לבטא נוראדרנלין (NE) כמו מוליך עצבי הראשי שלהם. ישנם מספר חריגים בולטים של postganglionic, הנוירונים הסימפוניים כי הם cholinergic, כולל אלה innervating כלי הדם. הנוירונים באנגנגלייונים מביעים את אנזימי טירולך הידרוקסילז (TH), חומצה אמינית לחומצות אמינו (AAAD), דופמין β-הידרוקסילז (DBH), ומונואמין אוקסידאז (מאו-א), האחראים להפקת ולחילוף חומרים NE. יתר על כן, הם מבטאים את הטרנספורטי מיחזור מחזור ו/או קולטני α-אדרארדירגיות קולטן (ADRA2), β-אדרארדירגיות קולטן (ADR2B), נוראדרנלין טרנספורטר (NET1), ו-והמשלח מונואמין (VMAT1/2).

פיתוח
במהלך התפתחות מעובריים מופק הרכס העצבי (NC), אשר עולה בין הצינור העצבי והנחת העור העליון6, והוא יכול להבדיל לתוך שורה של תאים מרובים, כולל מלנוציטים, אוסטאופתית, adipocytes, גליה, נוירונים בידור, נוירונים חושים, ונוירונים אוטונומית7. התאים ציצה עצבית (NCCs ') הם תאים נודדים מאוד כי לנקוט מספר נתיבים דרך העובר. בשלב זה מוקדם של התפתחות NC, התאים לבטא את סמנים SNAIL1/2, FOXD3, ו SOX108,9,10,11. תוואי ההעברה יחד עם מיקום הציר שהם מאמצים קובע את תת-הסוג של NC שאליו הם יתפתחו. אלה תת-סוגי NC יכול להיות מכובד על ידי הביטוי הספציפי שלהם hox גנים: nccs הגולגולת לא לבטא גנים hox, אגל nccs ק express hox 1 – 5, טרונק nccs ק express hox 6-9, ו-nccs ' ו-n-לבטא hox 10 – 1112. ביניהם, NCCs טרונק מזוהים כמקור העיקרי של סימטריות. סימון מקדים מבטא את גורם התמלול MASH1/ASCL113, אשר מקדם את הביטוי של PHOX2B14 ו INSM115. משפחת טה של גורמי התמלול באה לידי ביטוי במהלך התפתחות אוהדת מאוחרת. GATA2 ו GATA3 מבוטאים באופן סימטרי, אשר בתורו מפעיל DBH16. התמלול גורם HAND2 חשוב גם לביטוי ותחזוקה של DBH ו-TH17.

HPSCs (למשל, עובריים והמושרה מושרה בתאי גזע) הם כלי רב עוצמה18 כדי תבניות התפתחותיות לכידה וליצור סימטריות כי ניתן לאחר מכן להיות מועסק עבור דוגמנות המחלה של הפרעות אנושיות שונות. כך, תוך יצירת סימטריות מ hPSCs, זה חיוני לעקוב אחר הנחיות התפתחותיות להעריך את הביטוי של סמנים המתאימים לאורך תהליך הבידול.

פרוטוקול סימטרי קודם
מספר קבוצות מחקר דיווחו בעבר על הדור של סימטריות מ hPSCs19,20,21. ההשוואה הישירה של הפרוטוקולים האלה אחד לשני ושלנו נבדקה לאחרונה22. בשנת2016,פרסמנו פרוטוקול בידול לדור הנוירונים האוטונומית עם תו סימטרי (איור 1a). פרוטוקול זה השתמש במדיום מבוסס KSR, ששימש הן בתחזוקת hPSCs מובחן ובידול התא. יתר על כן, hPSCs היו שמרו על העכבר מעובריים מתחלקים (ממזין MEF תאים). אנו המועסקים בפרוטוקול זה ו PSCs מחולים עם FD כדי לדגמן את ההפרעה23. בשנת 2019, תיארנו גרסה מפורטת יותר של הפרוטוקול הישן הזה24. לסיכום, הגורל העצבי המושרה על ידי עיכוב SMAD כפול25 לחסום tgf-β ו-BMP איתות ב 2 הימים הראשונים. הפעלת WNT באמצעות CHIR99021 ושלתי העצבית הקודמת להפוך לתאי NC. ביום 11, התאים היו ממוינים על ידי facs עבור CD49D+ או SOX10+ אוכלוסיות26,23, אשר הניב כ 40% NC הדור יעילות. לפיכך, היה צורך במיון כדי להבטיח את היעילות והטוהר לשלבים הבאים של בידול. ה-NCCs ' היו מתוחזקים ומוחזקים כספרואידים עם הטיפול המשולב של FGF2 ו-CHIR. לאחר 4 ימים, spheroids NC של תחזוקה היו מצופים וניתנה BDNF, GDNF, ו NGF לסיים את ההבשלה סימטרי. למרות הסימטריות הללו הביע סמנים הסימטרי החזקים כגון ASCL1, TH, dbh, ו PHOX2A, סמנים עבור סימטריות בוגרת יותר, כולל ביטוי של קולטן אצטילכולין ניקטימית (CHRNA3/CHRNB4) ו-שלפוחית טרנספורטר (VMAT1/2), היו נמוכים גם לאחר 70 ימים של בידול. גנים HOX בפרוטוקול זה לא נבדקו רשמית, ותכונות עצביות בוגרת, כולל פעילות אלקטרופיזיולוגית של התאים, לא אומתו.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב ליצירת סימטריות (איור 1B). HPSCs נשמרים בתנאים ללא מאכיל, ב vitronectin (VTN) מנות מצופות, באמצעות Essential 8 (E8) מדיה27. הנוסחה של מדיית הבידול השתנתה בכל שלב ובכך מגבירה את אחוז האוכלוסיה ב-NC28. את ההבשלה הסימטרי ניתן לעשות על CD49D+/Sox10+ מיון או ממוין אוכלוסייה ncc בצובר. שניהם מציגים רמות גבוהות של ביטוי סמן ביום 30. יתר על כן, הסימפנים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מגיבים להקלטה אלקטרופיזיולוגית ולטיפולים עם סימטריות activator ותרכובות מעכבי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: קו הכתב הH9 PHOX2B: GFP מסופק על ידי הו ואח '19. כמה התחל qpcr בשימוש בנייר זה התקבלו מטכנולוגיות origene, בעוד רצפים מעטים מתקבלים מן frith et אל.20,30.

1. הגדרת ציפוי הכלים, הכנת המדיה ותחזוקת hPSC

  1. ציפוי מכלים
    1. ציפוי ויטרואקטין (VTN)
      1. מניחים בבקבוקונים של VTN באמבטיה מים 37 ° c עד מלא הופכה, ואז לערבב ביסודיות.
      2. עבור צלחת פטרי 100 מ"מ, מערבבים 7 מ ל של מלוחים באגירה של 1 x פוספט (PBS) עם 0.5 mg/mL VTN, להוסיף פתרון VTN לצלחת, ו דגירה בטמפרטורת החדר (RT) עבור 1 h.
    2. ציפוי מטריצות ממברנה של מרתפים
      1. הפשרת מבחנות של מטריצת קרום המרתף (ראה טבלת חומרים) על הקרח ב -4 ° c בלילה.
      2. עבור אחד טוב של 6 צלחת הבאר, לערבב 2 מ ל/F12 עם 20 μL של מטריקס קרום 100x מטריצות, להוסיף מרתף ממברנה פתרון מטריקס לצלחת, לעטוף את התבשיל עם סרט פרפין, ולאחסן במיכל נקי ב 4 ° c לילה. עבוד במהירות האפשרית. ניתן לאחסן מנות מצופות ב -4 ° c עד 2 שבועות.
    3. פוליונילך (פו)/למינציה (LM)/fibronectin (FN) ציפוי
      1. ביום הראשון, עבור הבאר אחת של 24 צלחת הבאר, לערבב 15 μg/mL של PO עם 1 מ ל של 1x PBS, מודקת ב 37 ° c, 5% CO2 לילה. הפשרת הן LM ו-FN ב-20 ° c בלילה, והחנות ב -4 ° c עד שהיא הופפה במלואה.
      2. ביום השני, מטפי את הפתרון PO, לשטוף את הבארות 2x עם 1 x PBS, להוסיף 1 מ ל של 1x PBS המכיל 2 μg/mL של LM ו-2 μg/mL של FN ו-דגירה ב 37 ° צ' ב 5% CO2 לילה. בשלב זה הצלחת עם פתרון LM/FN ניתן לשמור בחממה במשך חודשים, כל עוד היא אינה מייבשת. הוסף עוד 1x PBS כדי למנוע את הצלחת מתייבש.
  2. הכנת מדיה
    1. להכין את Essential 8 בינוני (E8) על ידי היפליד בקבוק אחד של תוספת E8 ב 4 ° c בלילה. מערבבים את התוספת עם 500 mL של E8 בינוני ואנטיביוטיקה במידת הצורך.
      הערה: יש להשתמש בפתרון E8 עבודה בתוך שבועיים.
    2. להכין את ההקפאה hPSC בינוני על ידי ערבוב 90 Ml של E8 בינוני מלא עם 10 מ ל של dmso עבור נפח כולל של 100 ml. סינון מחטא.
    3. להכין את היום 0 ליום 1 בידול בינוני על ידי ערבוב 100 mL של החיוניות 6 (E6) בינונית עם 10 ΜM SB431542, 1 Ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021, ו 10 Μm Y27632 עבור נפח כולל של 100 mL.
    4. להכין את היום 2 עד יום 10 הבדלה בינונית על ידי ערבוב 100 ML של E6 בינונית עם 10 ΜM SB ו 0.75 ΜM CHIR99021 עבור נפח כולל של 100 mL.
    5. להכין את היום 10 עד יום 14 ספרואיד בינונית על ידי ערבוב מדיום נוירוסיס עם 2 מ ל של B27 (50x), 1 מ ל של N2 (100x), 2 מ"מ L גלוטמט, 3 ΜM CHIR99021, ו 10 Ng/mL FGF2 עבור נפח כולל של 100 mL.
    6. להכין את היום 14 עד יום 28 בינוני עבור תחזוקה לטווח ארוך ספרואיד על ידי הוספת 0.5 ΜM של רה טרי ליום 10 עד יום 14 בינונית ספרואיד עבור כל האכלה.
      הערה: יש לשמור תמיד RA ב-80 ° c.
    7. להכין את ההבשלה בינונית התבגרות על ידי ערבוב בינונית נוירוסיס עם 2 מ ל של B27 (50x), 1 מ ל של N2 (100x), 2 מ"מ L-גלוטמט, 25 Ng/ML gdnf, 25 Ng/ML BDNF, 25 Ng/ML ngf, 200 μm חומצה אסקורבית, ו 0.2 MM dbcamp עבור נפח 100 כולל הפתרון צריך להיות בשימוש בתוך 2 שבועות. לפני כל האכלה, להוסיף 0.125 μM טרי RA. פתרון זה משמש מיום 14 (אפשרות 1) או יום 28 (אפשרות 2).
    8. להכין את מאגר FACS על ידי ערבוב dmem עם 2% fbs, 2 מ"מ L-גלוטמט ו אנטיביוטיקה אם יש צורך בנפח כולל של 100 mL.
  3. תחזוקת hPSC
    1. הhPSCs והשמירה
      1. הכן אחד VTN מצופה 100 mm צלחת.
      2. כדי להפשיר בקבוקון של hPSCs ישירות מן החנקן הנוזלי, לשים את המבחנה לתוך מרחץ מים 37 ° c, בזהירות מניף את הצינור במים עד שהוא הופך. העבר את hPSCs המוסדר לצינור 15 מ"ל המכיל 10 מ ל של 1x PBS, ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
      3. השמט את הסופרנטאנט והוסף 1 מ ל E8 בינונית לשפופרת. פיפטה כמה פעמים כדי להשהות לחלוטין את הגלולה ולאחר מכן להוסיף עוד 9 מ ל של E8 בינונית כדי להגיע 10 mL סך הכל.
      4. מנושף את התמיסה של VTN ממנה 100 mm.
      5. העבר את hPSCs למנה 100 מ"מ, טלטל בעדינות (למעלה-למטה ושמאלה-ימינה, לא במעגלים) כדי לוודא שהתאים מופצים באופן שווה במנה
      6. מודטה ב 37 ° c, ב 5% CO2.
      7. ביום שלמחרת, האכילו את כל המדיום ומזינים 10 מ ל של E8.
      8. האכילו בדרך זו כל יום במשך 3 – 4 ימים ולאחר מכן היכונו להתפצל.
    2. פיצול hPSCs
      הערה: hPSCs בנקודת הפיצול צריך להיות 80% – 90% שוטפת. יש להקפיד על מושבות גדולות עם קצוות חלקים ובהירים. עם זאת, יש להימנע ממגע בין כל מושבה (איור 2b, יום 0 ואיור 6b).
      1. הכינו מנות 100 מ"מ מצופות מצופי VTN לפי הצורך.
      2. מE8 ושוטפים את התבשיל שצריך לפצל 1x עם 1 x PBS.
      3. משף את ה-PBS 1 x ולהוסיף 4 מ ל של 0.25 M EDTA. מודטה עבור 2 דקות ב 37 ° c, 5% CO2.
        הערה: hPSCs יש לפצל/לציפוי מחדש כמושבות קטנות. אין לטפל ב-EDTA יותר מ-2 דקות כדי למנוע הפרדה לתאים בודדים. התאים צריכים להיות עדיין מחוברים למשטח הכלים לאחר הטיפול 2 דקות.
      4. לאחר מכן, לנתק את המושבות על ידי ליטוף בחוזקה 10 מ ל של E8 בינוני על משטח הצלחת, ולאסוף את כל המדיום ואת התאים בצינור 15 מ ל.
      5. עם hPSCs של 80%-90% שליטה, פיצול מושבות על ידי 1:15-1:20. לדוגמה, כדי לפצל hPSCs על-ידי 1:20 לתוך המנה 1 100 מ"מ, לקחת 500 μL של E8/hPSCs פתרון ולערבב עם 9.5 mL של מדיום E8 טריים.
      6. צלחת hPSCs ב VTN מצופה מאכלים 100 מ"מ.
        הערה: מומלץ להקים את היחס המפוצל האידאלי לכל חוקר ולקו התאים באופן עצמאי.
    3. הקפאת hPSCs
      1. עבור 1 100 מילימטר מנה של hPSCs כי הוא מוכן להתפצל, להכין שלושה קריודיש ו 3.5 mL של הקפאה בינונית.
        הערה: יש לשמור מדיה ומבחנות ב-4 ° צ' או בקרח עד לשימוש.
      2. מE8 ושוטפים את התבשיל 2x עם PBS 1x.
      3. משף 1 x PBS ולהוסיף 4 מ"ל של 0.25 M EDTA, מודטה עבור 2 דקות ב 37 ° c, ב 5% CO2.
        הערה: hPSCs צריך להיות קפוא כמו מושבות קטנות בזמן שהם היו לפצל. אין לטפל בתאים עם EDTA יותר מ-2 דקות כדי למנוע הפרדה לתאים בודדים. תאים צריכים להיות מחוברים עדיין על פני הצלחת לאחר 2 דקות הטיפול.
      4. משמת את EDTA, לנתק את המושבות על ידי ליטוף בחוזקה 10 מ ל של 1x PBS על פני השטח של המנה, ולאסוף את כל בינוני ותאים בצינור 50 mL.
      5. הוסף 20 מ ל של ה-PBS 1 x ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות כדי לשטוף את edta הנותרים.
      6. השמט את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה ב -3 מ ל של קיפאון בינוני.
      7. פזר hPSCs באופן שווה לשלושת הקריובקבוקונים, 1 מ ל כל אחד.
      8. חנות ב-80 ° c לילה בתיבת הקפאה מבוקרת או כריך קלקר כדי להבטיח ירידה בטמפרטורה איטית, ולאחר מכן להעביר למיכל חנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך.

2. זריעת hPSCs כדי להתחיל את הבידול (יום 0)

הערה: hPSCs צריך להיות מוכן לבידול לאחר ייצוב (כלומר, להיות מפוצל 2 – 3x לאחר הפשרה). ודאו שהמושבות בריאות, בקצוות מבריקים וחלקים, ובידול מינימלי (איור 2B).

  1. הכינו מנות מצופות ממברנה למרתף (24 היטב או 6 מנות) יום אחד לפני יום 0 לפי הצורך. הביאו את הכלים ל-RT בתחילת הבידול.
  2. הפוך את היום 0 – 1 בידול בינוני לפי הצורך.
  3. מE8 את הכלים מתוך הכלי, מוכן לפצל את hPCSs, ולשטוף את המנה 2x באמצעות 1x PBS.
  4. הוסף 7 מ ל של 0.25 M EDTA לכל 100 מ"מ צלחת, מודחת ב 37 ° צ', 5% CO2, עבור 15 דקות.
    הערה: בשלב זה, טיפול EDTA ממושך להתפזר לתוך תאים בודדים.
  5. להדוף את כל hPSCs (הם צריכים להיות צפים) ולהעביר לצינור 50 mL. הוסף את אותה כמות או יותר של 1 x PBS כפתרון EDTA כדי לדלל את EDTA.
  6. צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
  7. להיפטר supernatant, להוסיף 1 mL של היום 0 – 1 בידול בינוני ו pipet כדי המגון את התאים. לעקוב על ידי הוספת בינוני יותר ולאחר מכן לערבב כדי לדלל את פתרון התא לריכוז אידיאלי כדי לספור את התאים.
    הערה: אל דלל את פתרון התא ביתר מינון. תאים ממנה אחת מלא 100 mm צריך להיות מדולל ב 5 מ ל של בינוני כדי להתחיל.
  8. ספור את מספר התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או הומוציטומטר.
  9. לדלל את הפתרון הסלולרי כנדרש כדי להגיע 125,000 תאים/cm2 בנפח סופי נמוך (למשל, 2 mL לכל טוב עבור 6 היטב צלחת או 500 μl לכל טוב עבור 24 היטב צלחת).
    הערה: אמצעי אחסון נמוך מסייע לתאים להיות מתחברים מהר יותר.
  10. מנושף את כל תמיסת מטריקס ממברנה מתוך מנות מצופות וצלחת פתרון התא לתוך הבארות.
  11. מודטה ב 37 ° c, ב 5% CO2.

3. סוללת הרכס העצבי (יום 1 עד יום 10, איור 2A)

  1. ביום 1 האכילו את התאים ביום 0 – 1 בידול בינוני (3 מ ל לכל היותר עבור 6 מנות היטב ו-1 mL לכל טוב עבור 24 מנות היטב).
  2. ביום 2 להאכיל את התאים עם יום 2 – יום 10 בידול בינוני (3 מ"ל לכל טוב עבור 6 מנות היטב ו-1 mL לכל טוב עבור 24 מנות היטב).
  3. מעכשיו, את התאים יש להאכיל כל יום אחר עד יום 10 (כלומר, יום ההזנה הבא יהיה יום 4).
    הערה: החל מיום 6 על, יש לזהות את הרכסים של NC (איור 2B). כדי לבדוק אם הבידול מתרחש, מומלץ לשאת תרבות בידול מקביל בבארות קטנות יותר (כלומר, 24 בארות), כי ניתן לוכתם עבור SOX10/AP2a ומשמש סמן גנים לאורך זמן בידול (איור 2B,C).
  4. אם מיון תאים, המשך לסעיף 4. . אחרת, המשך לאגף 5

4. מיון תא פלואורסצנטית המופעל (FACS) עבור סמן ציצה עצבית CD49D וצובר תאים NC ב spheroids

הערה: לצורך מיון FACS, יש לשמור את הדגימות על הקרח ולא להיחשף לאור לאחר הצביעת עד למיון.

  1. הכן מאגר FACS אם התאים ממוינים.
  2. הכן את היום 10 – 14 ספרואיד מדיום.
  3. ביום 10, להסיר את המדיום, ולשטוף 1x עם 1 x PBS.
  4. הוסף פתרון דיסוציאציה (ראה טבלת חומרים) ב 2 מ"ל לכל טוב עבור 6 היטב צלחת או 1 ml לכל טוב עבור מאכל 24 היטב, ו דגירה ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 20 דקות.
  5. הhPSCs את כל הצינורות. והעבירו אותו לצינור 50 מ ל
  6. למלא את שאר הצינור עם מאגר FACS ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
    הערה: כל צינור 50 mL יכול להכיל עד 20 מ"ל או פחות של פתרון תאים. נפח מאגר ה-FACS צריך להיות גבוה דיו כדי לנטרל את פתרון הדיסוציאציה.
  7. השמט את הסופרנטאנט, השהה מחדש את התאים עם הכמות המתאימה של מאגר FACS (~ 2 מ"ל לכל היותר בצלחת של 6 מעלות), וספור כדי לקבוע את מספר התא.
  8. הכן את הדגימות הבאות.
    1. לדוגמה 1 (שליטה בלתי מוכתמת): 1 x 106 תאים 400 μl של מאגר facs. לסנן את התאים דרך כובע מסננת 20 יקרומטר ולשמור את הצינור על הקרח.
    2. לדוגמה 2 (בקרת DAPI בלבד): 1 x 106 תאים ב 400 μl של מאגר facs המכיל 0.5 לארג/ML dapi. לסנן את התאים דרך צינור FACS עם כובע מסננת ולשמור את הצינור על הקרח.
    3. לדוגמה 3 (CD49d-התווית): להשעות את שאר התאים עם מאגר FACS המכיל PE/Cy7-מצוב CD49D נוגדן (5 μL עבור 1 x 106 תאים לכל 100 μl של מאגר facs) ב 15 מ ל שפופרת ו דגירה על הקרח עבור 20 דקות.
  9. למלא את הצינורות עם מאגר FACS ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
  10. להיפטר supernatant ולהשעות מחדש כל 5 – 10 x 106 תאים 1 מ ל של מאגר facs המכיל 0.5/ML dapi על פי הוראות היצרן.
  11. לסנן את התאים דרך צינור ה-FACS עם כובע מסננת ולשמור את הצינור על הקרח.
  12. הכינו צינורות FACS המכילים 2 מ ל של מאגר FACS.
  13. למיין דרך מכונת FACS עם לייזרים שיכולים לזהות DAPI ו-PE-Cy7 כדי לבודד את CD49D+ אוכלוסיה.
  14. לאחר המיון, ספור את התאים הממוינים.
  15. צנטריפוגה את כל התאים ממוינים ולהשעות מחדש ביום 10 – 14 ספרואיד בינונית לריכוז הסופי של 0.5 x 106 תאים לכל 500 μl של בינוני.
  16. צלחת 0.5 x 106 תאים לכל טוב לתוך מצורף אולטרה נמוך 24 לוחות טוב.
  17. מודאת התאים ב 37 ° c, ב 5% CO2.

5. מצובר תאים NC בספרואידים

  1. אם לא באמצעות FACS כדי לבודד את תאי NC ובמקום זאת צובר אותם לתוך spheroids ישירות, ראשית להכין תאים כמתואר בשלבים 4.2 – 4.5.
  2. מלאו את שאר הצינור עם PBS 1x, ו צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
  3. להיפטר supernatant, להשעות מחדש את התאים עם כמות מתאימה של היום 10 – 14 ספרואיד בינונית (למשל, ~ 2 מ ל של בינונית לכל טוב עבור 6 צלחת לוחית), ולספור כדי לקבוע את מספר התא.
  4. לדלל את התאים ביום 10 – 14 בינוני ספרואיד כדי 0.5 x 106 תאים לכל 500 μl של בינוני.
  5. צלחת 500 μL של התא השעיה לכל טוב באולטרה-נמוך אביזר 24 לוחות היטב.
  6. מודאת התאים ב 37 ° c, ב 5% CO2.

6. NC תחזוקה ספרואיד השראה מחולל קדמון (יום 10 עד יום 14, איור 4A)

  1. אפשרות 1: תרבות ספרואיד מינימלית
    1. ביום 11, להוסיף 500 μL של היום 10 – 14 ספרואיד בינונית כדי spheroids NC ללא מתיז מדיום קיים מיום 10. מודטה ב 37 ° c, ב 5% CO2.
    2. ביום 12, להטות את הצלחת לצבור spheroids NC בצד אחד של הבארות. בזהירות למחוק ולהשליך כמו מדיום ככל האפשר, ולהאכיל עם 1 mL של היום 10 – 14 ספרואיד בינונית.
    3. תמשיך להאכיל את התאים. כל יום עד יום 14
    4. אופציונלי: אם הרורואידים מצטברים ויוצרים גוש גדול, השתמשו בפיפטה כדי לשבור את הגושים הספרואיד. הדבר מבטיח גם כי הספרואידים בודדים לא לקבל גדול מדי.
      הערה: טווח הגודל האידיאלי של ספרואיד צריך להיות סביב 100 – 500 μm. בתוך טווח זה, גודל המירואידים הבודדים אינו קריטי. עם זאת, המבנה, כגון קצוות חלקים וברורים (איור 3 ואיור 6) חשוב להצלחה נוספת. ביום 14, כל 24 צלחת באופן אידיאלי מכיל כ 50-60 spheroids של גדלים שונים בתוך טווח הגודל הנ ל.
  2. אפשרות 2: תרבות ספרואידית מורחבת
    1. ביום 15, כדי לשמור על spheroids NC, להאכיל עם 1.5 mL של היום 10 – 14 ספרוoid בינונית המכילה 0.5 μM RA. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2.
      הערה: RA יש להוסיף טרי עבור כל האכלה תמיד להיות מאוחסן ב-80 ° c.
    2. מעכשיו, להאכיל כל יום אחר עד יום 28 ולאחר מכן להמשיך עם ציפוי של spheroids (סעיף 7.1).
      הערה: הספירואידים הגדלים מתחלקים כ-1x בשבוע על ידי ליטוף אותם עם פיפטה משנת mL בכדי להפריד ביניהן. הם מפוצלים ביחס משוער של 1:2 – 1:4. בתוך 2 השבוע תקופת ההתרחבות, התאים צריכים להיות מרובעת בערך מספר.

7. סימון בידול והתבגרות (אפשרות 1: לאחר יום 14; אופציה 2: לאחר יום 28)

  1. ציפוי מספרי בצלחות רגילות
    1. הכינו לוחות מצופים ומצופי FM.
    2. הכנת בינונית סימטרית המכילה 0.125 μM RA (להוסיף טרי כל הזנה) ו 10 μM Y27632 (יום 14 בלבד).
    3. ביום 14, להטות את הצלחת לצבור spheroids NC בצד אחד של הבארות. מאכיף בזהירות ולהשליך כמה שיותר מדיום, ולהאכיל עם 1 מ ל של סימטרי בינונית.
    4. הסר LM/FN מלוחות מצופים.
    5. לפצל את הצלחת כל באר מ 24 צלחת לתוך 4 בארות נפרדות של חדש, מצופה לוחית 24 טוב. כל טוב מקורי יהיה 1 מ ל, המכיל ~ 50-60 spheroids. זה תשואות 250 μL, המכיל כ 10 – 15 spheroids עבור כל טוב על הלוח החדש.
    6. הוסף 250 μL של בינוני נוסף בכל טוב.
      הערה: מדובר בפיצול של 1:4; ודא כי הspheroids מופצים כראוי בתוך הפתרון כך הפיצול הוא יחסית אפילו. מספר הspheroids אינו נספר מכיוון שהמספר הסופי אינו משפיע על ההצלחה של יצירת סימטריות.
    7. מודטה ב 37 ° c, 5% CO2.
    8. ביום 15 (או יום 29 עבור אופציה 2), להאכיל על ידי החלפת כל בינוני עם 1 מ ל של סימטרי בינונית המכילה 0.125 μM RA. מעכשיו, הנוירונים יש להאכיל כל יומיים עד יום 20 (או יום 35 עבור אופציה 2).
    9. לאחר יום 20 (או יום 35 עבור אופציה 2), הנוירונים יש להאכיל על ידי החלפת בזהירות רק חצי של המדיום הקיים (500 μL). מעתה והלאה, האכילו כל שבוע, אלא אם כן המדיום פונה במהירות לצהוב.
    10. המשיכו להאכיל שבועי עד לנקודת הזמן הרצויה.
      הערה: הסימפנים נוטים לצבור מבנים כמו גנגליה ונוטים להתנתק ממאכלי התרבות. כדי למנוע זאת, מומלץ לעשות חצי הארוחות וטיפול מינימלי.
  2. תאי ציפוי להקלטות אלקטרופיזיולוגיות
    1. הכינו את מ96 החשמל לוחות אלקטרופיזיולוגיה של המשרד.
    2. הכנת בינונית סימטרית המכילה 0.125 μM RA (להוסיף טרי כל הזנה) ו 10 μM Y27632 (יום 14 בלבד).
    3. ביום 14, לאסוף את כל spheroids, ואז לצנטריפוגה אותם ב 200 x g עבור 4 דקות.
    4. השמט את הסופרנטאנט, הוסף 2 מ ל של פתרון הדיסוציאציה, והעבר את התערובת חזרה לאחת הבארות של לוחית ההחזקה הנמוכה במיוחד. מודטה ב 37 ° c, ב 5% CO2 עבור 20 – 45 דקות.
      הערה: בהתאם לגודל הspheroids, תקופת הדיסוציאציה יכולה להיות ארוכה מ-20 דקות. בדוק את הדיסוציאציה של התא כל 10 דקות עד 45 דקות. באופן אופציונלי, 0.1 mg/mL של DNase ניתן להוסיף עם פתרון הדיסוציאציה כדי למנוע DNA חינם מתאים מתים עושה את הפתרון דביק. אפשרות זו היא אופציונלית בפרוטוקול זה מאחר שה-spheroids לא יצטבר ברגע שהוא לא יהיה מנתק לחלוטין.
    5. Pipet לחלוטין לנתק את spheroids, ואז צנטריפוגה ב 200 x g עבור 4 דקות.
    6. השמט את הסופרנטאנט, השהה מחדש את התאים עם הכמות המתאימה של המדיום הסימטרי, וספור את מספר התא.
    7. צלחת התאים ב-100,000/ס"מ2 פו/LM/FN-מצופה אלקטרופיזיולוגיה בארות ב 200 μl הכולל נפח לכל הטוב.
    8. ביום 15 (או יום 29 עבור אופציה 2), בצע את אותם תהליכי האכלה כמו בסעיף 7.1. אמצעי האחסון הכולל לאחר יום 15 (או יום 29 עבור אופציה 2) צריך להיות 300 μL לכל טוב.
    9. למדוד את האותות החשמליים באמצעות מחשב מערך רב אלקטרודה לאחר יום 20 (או יום 35 עבור אופציה 2).
      הערה: באפשרות 2, ניתן לציפוי spheroids בכל עת בין יום 14 – יום 28. מדידות אותות חשמליים הראשון ניתן לנהל 1 שבוע לאחר ציפוי spheroids.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בפרוטוקול זה, אנו מעניקים הוראות כיצד ליצור סימטריות מ hPSCs. תנאי התרבות שהווכחו כאן השתפרו מפרוטוקול23,24 (איור 1a) לתנאים המוגדרים בפני מאכיל וכימיים (איור 1a). שתי אפשרויות מסופקות, אחד שבו סימטריות מיוצרים בתוך 20 ימים, ועוד במקום NCCs ' יכול להיות מורחב עבור 2 שבועות כדי ליצור תאים נוספים שיכולים אז להיות מובחנת לתוך סימטריות (איור 1B, אופציה 1 ו-2).

כדי לנטר כיאות את המאפיינים הסימפניים של תאים מובחנים, שורת הכתב PHOX2B-eGFP WA09 והאב WA09 PSCs קו19. כל הדיפרנצירים נערכו לפחות שלוש חזרות ביולוגיות, המוגדרות כניסויים בידול עצמאי לאחר לפחות מעבר אחד ו/או נגזר ממבחנה טרייה של תאים. בידול המושרה כאשר השטף של מובחן hPSCs הגיע 80% – 90%. מושבות hPSC היו עגול, עם קצוות מבריק, חלקה מעט ללא בידול. המושבות לא צריכים לגעת אחד בשני (איור 2B, יום 0). במקום כפול האופייני SMAD עיכוב25, אשר שימש בעבר השראה עור האינדוקציה, tgf-β עכבות בשילוב עם wnt ו BMP4 איתות ב 2 הימים הראשונים הוביל ביטוי חזק של הסמן הראשוני העצבים העצבית AP2a. סמן הרכס העצבי SOX10 ביטא מיום 4 עד יום 10 (איור 2B). NCCs ' הגיח הרכסים צפוף, החשוך נראה מיום 6 על. רכסים אלה הביעו SOX10 (איור 2B, חיצים). בעבר הוכח כי SOX10 בשלב ncc התואם עם סמן פני התא CD49D23,26 וכך CD49D יכול להיות מנוצל למיין NC תאים שאינם מדווחים כל fluorophore מן הSOX10 לוקוס. איור 2C מציג את הביטוי של גנים סמן ncc לאורך זמן. איור 2D מציין כי יעילות הבידול שלנו היה מעל 80%. כדי לקבוע את זהותו של התאים הנותרים, השתמשו ברביעיית ה-PCR כדי לבדוק סוגי תאים מזהם, כולל ביטוי מזוכי עור, SOX17-ביטוי, ו-PAX6-ביטוי נוירוטי. כולם נמצאו נעדרים או מבוטאים ברמות נמוכות מאוד (הנתונים אינם מוצגים; ראה טבלה משלימה 1 עבור כל התחל). עם זאת, זוהו כמה SIX1/EYA1+ פלאודה (נתונים לא מוצגים) שעשויים להיות המקור של סוגי התאים הנותרים. בנוסף, ייתכן שסוגי התאים הנותרים הם נגזרים NCC שכבר הובלו עוד. קוד HOX של NCCs הוערך בשלב זה (איור 2E). עם זאת, בשלב מוקדם זה אותות HOX היו נמוכים מאוד (לשים לב לקנה המידה), הרומז כי NCCs אלה היו או של דמות הגולגולת-NC או לא אימץ דמות תת-סוג NCCS עדיין.

ביום 10 NCCs ' יכול להיות מטוהר באמצעות FACS, אשר הניב סביב 80% CD49D+ nccs ' (איור 2d). דוגמה לאסטרטגיית בנייה טיפוסית מצוינת באיור 2D. לאחר המיון, התאים היו מצטברים כspheroids NC (איור 3A). כדי להרחיב את המאפיינים NCCs ו לגרום טרונק-NC כמו מאפיינים, התאים טופלו עם שילוב של FGF2 ו CHIR. בדקנו אם מיון עבור CD49D+ האוכלוסייה הניבה תרבויות יותר טוב או טהור של סימטריות מאוחר יותר. איור 3B השוואת לא ממוין+ לעומת CD49D +מיון לעומת אוכלוסיות תאים CD49D ממוינות. מצד שמאל, ניתן לראות כי מיון חיובי האוכלוסיות שאינן ממוינות עשה spheroids בצורה דומה, ואילו תאים שליליים מיון לא הצטבר כראוי, לא לעשות עגול, חלק, מראה בריא spheroids ומת בתוך 3 – 4 ימים. יתר על כן, כאשר spheroids NC הושוו ביום 14 באמצעות רביעיית-PCR עבור סמנים NC ו-סימטרי מחולל קדמון, הבדלים משמעותיים בין תאים ממוינים ולא ממוינים לא היתה אפשרות לזהות. באופן ניכר, בשלב זה הביטוי של סמנים של מחולל קדמון היה עדיין נמוך ורמות SOX10 נשארו גבוהות, ומציע כי המירואידים עדיין היו מורכבים מתאים עם מאפייני NC. יום אחד לאחר ציפוי (יום 15), הן לא ממוינות ו CD49D+ spheroids המצורפת היטב PO/LM/מנות FN ו מוצלח neurite יכול להיות נצפתה בבירור (איור 3b, D15 ו איור 3b, D29). התרבויות שאינן ממוינות וממוינות נשאו עוד ביום 35 במקביל, אך לא נראו הבדלים משמעותיים (הנתונים אינם מוצגים). לפיכך, ניתן להסיק ששלב המיון לא היה חיוני ליצירת הסימטריות, ולכן הוא צעד אופציונלי בפרוטוקול זה. עם זאת, עבור החלקה פחות יעילה שאינה מתשואה 80% CD49D+ תאים, אנו ממליצים על הליך המיון.

לאחר מכן, בדקנו אם ניתן לשמור על spheroids אלה מבלי לאבד את זהות ה-NC שלהם (איור 3A, אפשרות 2). NCCs ק היו מתורבתים כספרואידים עד 2 שבועות (איור 3C). המבנה של היום 28 spheroids ותאים מצופים ביום 29 היו דומים בהשוואה ליום 14 ו 15 תאים באפשרות 1. ביום 28, SOX10 ביטוי נשמר ברמות דומות כיום 14. עם זאת, הביטוי של סמנים מוקדמים של האוהדים (כלומר, ASCL1, PHOX2B, ו GATA3) גדל (איור 3C, ימין), הרומז כי התרבות המורחבת FGF2, wnt, ו-RA איתות הובילו התבגרות ופווריזציה (איור 4c ו- F). השפעות דומות דווחו בעבר על ידי Kirino et al21.

לאחר התרחבות NC (אפשרות 1 או אופציה 2), spheroids היו מצופה מנות מצופות PO/LM/FN וסיפק גורמים עצביים מרובים כדי להבשיל את הסימטריות (איור 4A). ביום 20 ו 35 (1 שבוע לאחר ציפוי באפשרות 1 ו-2, בהתאמה), neurites נצפו בתבנית רדיאלי המשתרעת מתוך ההרואידים המצורפים (איור 4A, ימין). יתר על כן, סמנים הקשורים נוראדרנלין (NE) סינתזה ותחבורה (כלומר, TH, AAAD, DBH) ביטאו (איור 4B). הנוכחות של סוגי תאים מזהם נבדקו כאן שוב, וביטוי של צ'אט, אשר יכול להצביע על נוירונים הפאראסימפתטית, נמצא (איור 4B,E). עם זאת, צ'אט מתבטא גם ב-cholinergic סימטריות. רמות נמוכות מאוד של VIP, עוד סמן פארא-פתטי, זוהו (נתונים לא מוצגים). יתר על כן, רמות נמוכות של BRN3A, ISL1, ו RUNX1 זוהו (איור 4B,E), אשר יכול להצביע על הנוירונים חושים או נוירונים מטריתיים, כלומר נגזרות של הפלדה. מינימלי EDNRB (לסימון הנוירונים בידור) ו OLIG2 (סימון מוטורי) זוהו (נתונים לא מוצגים). זהותו של התאים הלא-עצביים נותרת בלתי ברורה. עם זאת, בהתבסס על תוצאות של פרוטוקול סימטרי הקודם שלנו23, הם היו כנראה αSMA+ מיופיברופיצוצים. ביטוי של גנים HOX נבדק מחדש, והוא נמצא כי HOX5-9 הביעו, מציע זהות טרונק. HOX10 (הרומז על סאקרא-NC) לא ביטא (איור 4C, F). לבסוף, סמנים בוגרים, כולל קולטן אצטילכולין ניקטימית (CHRNA3/4) ו-ne הקשורות קולטנים, כולל קולטנים אדרררגיות (ADRA2A/B2) ne טרנספורטר (NET, SCL6A2), ו-שלפוחית טרנספורטר (VMAT1) היו ביטא (איור 4d,G). לא נמצא הבדל משמעותי בביטוי של גנים אלה בתאים שנגזרו עם אפשרות 2 לעומת אופציה 1 (איור 4E – G).

אנו מאשרים את התוצאות שלנו על ידי ביצוע פרוטוקול זה על H9-PHOX2B: GFP הכתב קו (איור 5). ביום 20, התאים יצרו מדשאה צפופה של נוירונים ומצטברים אשכולות של צפיפות גבוהה עוד יותר, המציין יעילות גבוהה מאוד בידול (איור 5A, השורה העליונה). הצביעת הראה כי רוב הסימטריות ביותר באשכולות אלה, אשר עשה את ההערכה ואת הקוונפיקציה של היעילות בידול הכולל קשה. כדי להדגיש כתמים ולוקליזציה של סמנים מסוימים מסוימים, התמקדנו באזורים הצפופים פחות בפאתי האשכולות (ראה תיבה צהובה באיור 5A, ימין). זה היה גם איפה התאים הזיהום ביותר היו ממוקמים, אז זה לא היה אזור טוב לשפוט את היעילות הכוללת. עם זאת, סמני סימטרי אופייני; כולל peripherin (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (עצבי פאן), DBH, ו-NET1 (מבוטא בנקודות לאורך סימטריות גופים ואקסונים, איור 5A, למטה); זוהו. מערך רב אלקטרודה (MEA) הגישה הועסק כדי למדוד את פעילות החשמל, והוא נמצא כי יום 20 הסימטרי ירו בערך 3 – 5 קוצים לשנייה בהשוואה לשליטה שלילית של מובחן hPSCs (איור 5B). חשוב כי התאים להיות מופץ באופן שווה בבאר על מנת כל אלקטרודה (נקודות שחורות באיור 5B, שדה בהיר) כדי להקליט כראוי. יום 20 עד יום 30 הסימטריות היו גם מגורה עם ניקוטין 1 μM, אשר מחקה את האיתות preganglionic של סימטריות ב vivo והגדיל את קצב הירי הממוצע בתאים. עיכוב של הנוירונים נמדד גם. β2-אדרארדירגיות קולטן (ADRB2), הממוקם על מסופים סימטרי, יוצר לולאה משוב חיובית עבור הפרשה NE29. טיפול סימטרי עם 1 μm פרופראנולול (β2-אדראררגיות היריב הקולטן) מעכבות את פעילותם (איור 5c, ימין). תוצאות אלה מרמזות על כך שהסימטריות שנוצרה על-ידי פרוטוקול זה היו פעילים מבחינה פונקציונלית.

Figure 1
איור 1: אילוסטרציה סכמטית והשוואה בין פרוטוקולי בידול סימטרי. (א) הפרוטוקול הקודםשל זלטנר ואח '23. (ב) הפרוטוקול הממוטב. אפשרות 1 היא לאורך 20 ימים ומכילה רק 4 ימים של תרבות הספרואיד NC. אפשרות 2 היא 35 ימים ומכילה בשלב 2 שבוע NC ספרוoid הרחבה המאפשרת ייצור של תאים יותר NC. VTN = vitronectin, PO = פולי-L-האורלך, LM = למינציה, FN = fibronectin, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = חומצה retinoic, AA = חומצה אסקורבית, NFs = NGF + BDNF + GDNF. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: האינדוקציה NC. (א) ציר זמן וטיפולים עבור אינדוקציה NC מיום 0 עד יום 10. (ב) המבנה והיווצרות הרכסים של NC היו מנוטרים בכל 2 ימים על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר. תאים בכל פעם נקודה 2 היתה מוכתמת במשותף עבור AP2A (אדום) ו SOX10 (ירוק). כל התמונות האימונולואונסורתמוכתמות באמצעות DAPI. חיצים אדומים מציינים את המבנים של רכסים. (ג) רביעיית מחקר-PCR לפרופיל הביטוי של סמני NC מיום 2 – 10. (ד) מזימה ייצוגית של מיון facs ביום 10 לאוכלוסיות CD49D+ NC (משמאל). אסטרטגיה ושליטה באמצעות הסדר מצוין בארבע החלקות הראשונות. בוצעה גם הכמת של CD49D+ אחוז תא ביום 10. (ה) רביעיית-PCR לפרופיל הביטוי של גנים hox מיום 2 – 10. NC = ציצה עצבית. קווי שגיאה נובעים מנתונים של n ≥ 3 חוזר ביולוגי, המוגדר כניסויים בידול עצמאי שנעשו בימים נפרדים מתרבויות PSC שהיו לפחות אחד להפריד בנפרד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התפשטות ותחזוקה של ציצה עצבית. (א) ציר זמן וטיפולים להרחבת NC במהלך היום 10 עד יום 14 התרבות עבור אופציה 1 או יום 10 עד יום 28 תרבות עבור אפשרות 2. (ב) המבנה הספרואיד של NC היה מפוקח על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר מיום 11 (1 יום לאחר היווצרות הספרואיד) עד יום 14 (כלומר, יום הציפוי). לא ממוין, CD49D+, ו-CD49D- אוכלוסיות הושוו. התאים המצופים ביום 15 מוצגים אף הם. תאים לא הצליחו ליצור spheroids כראויבקבוצה CD49D ונפטר לאחר ציפוי. יום 14 תאים נבדקו על ידי ניתוח של רביעיית ה-PCR (מימין) עבור פרופיל הביטוי של סימפן ושלתי. אוכלוסיות לא ממוינות ו CD49D+ הושוו (n ≥ 3). (ג) NC spheroids יכול להישמר עד 2 שבועות. הספרואידים הנוטרים על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר מיום 15 ליום 28 (יום הנחיתה). התאים מצופים ביום 29 מוצגים גם. יום 28 הספרואידים נבדקו על ידי ניתוח של רביעיית ה-PCR עבור פרופיל הביטוי של סימאן ושלתי (מימין). ממוינות ו CD49D+ אוכלוסיות היו במאגר (n ≥ 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: סימאן בידול והתבגרות. (א) ציר זמן וטיפולים לאחר ציפוי ביום 14 עבור אופציה 1 או יום 28 עבור אפשרות 2. מיקרוסקופ שדה בהיר תמונות (מימין) להראות סימטריות ביום 20 ויום 35, בהתאמה (1 שבוע לאחר ציפוי עבור שתי האפשרויות). (ב–ד) אפשרות 1 ניתוח-PCR עבור פרופיל הביטוי של מאפייני סימטרי בין ימים 20 – 30. המאגר לא ממוין ו CD49D+ אוכלוסיות. (E–G) ניתוח-PCR של אופציה 2 עבור פרופיל הביטוי של מאפייני סימפרן לאחר יום 35. ממוינות ו CD49D+ אוכלוסיות היו במאגר (n ≥ 3). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: אפיון פונקציונלי של סימטריות. (A, בשורה העליונה) תמונת שדה מוארת של אשכולות סימפאן ביום 20 ותמונה צבעונית המציגה PRPH ו-TH תאים חיוביים כפולים ממוקם בעיקר אשכולות. (A, למטה) סמנים מרובים מרובי סימטריות (ערוצים מופרדים) אומתו על-ידי כתמים immunofluorescence ביום 20. מוביל נוראדרנלין (NET1) נמצא גם על פני השטח של הגופים הסלולאריים וכן לאורך האקסונים והדנדטים. . זה הופיע כנקודות בהגדלה הזו כל התמונות האימונולואונסורתמוכתמות באמצעות DAPI. (ב) ייצוג מפות החום של מערך רב-אלקטרודה (MEA) ניתוח לסימטריות ביום 20 (למעלה). תמונת השדה הבהיר (למטה) מציגה את צפיפות הסימטריות ואת התפלגות האלקטרודות (שמונה נקודות שחורות). במקום נמצאו כאןמCD49D ואוכלוסיות שאינן ממוינות. (ג) קוונפיקציה של שיעורי ירי מרושע ליום 20 – 30 סימטריות תחת טיפולים של 1 μm ניקוטין ו 1 μm פרופראנולול עבור 5 דקות, בהתאמה (מימין). תוצאות של אוכלוסיות לא ממוינות ו-CD49d-חיוביים היו במאגר (n ≥ 3). לא מזווג, דו-זנבי-מבחן עם תיקון של וולש, ערך p: * < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: דוגמה של תאים בתנאים שאינם מתאימים להמשיך בבידול. (א) ציר הזמן של הבידול עם כל נקודת בדיקה עבור תא מורפולוגיות המצוין כמו ב- B-E. (ב) hPSCs (א) עם מושבות בריאות הרבה תאים הבדיל, ו (ב) ממוזג והבדיל גבולות בין כמה מושבות ביום 0. חיצים אדומים מציינים את האזורים הממוזגים. (C) nccs ' ביום 10 עם שלפוחיות כמו בועה ברכסים. חיצים אדומים מצביעים על. השלפוחיות בשורה העליונה השורה התחתונה מייצגת הגדלה גבוהה יותר. לא הצלחנו לזהות את. זהות התא של השלפוחיות עם זאת, נוכחות של שלפוחיות יותר נראה לתאם עם נמוך SOX10/CD49D ביטוי. (ד) מראה לא סדיר של הספרואידים נטולי קצוות חלקים וצורה עגולה ביום 14. (ה) סימטרי וגוסס ביום 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרסמנו לאחרונה שתי חוות דעת, אחד דן בשימוש ב-hPSC-הנגזרות של המחלה עבור מידול מחלות31 , כמו גם השוואה מעמיקה של פרוטוקולי בידול זמין22. כך, כאן אנו מתמקדים בפתרון בעיות הפרוטוקול הנוכחי כדי לעזור חוקר המעוניינים להצליח לעשות סימטריות. במהלך כל תהליך הבידול, על מנת לצבור נתונים עקביים, כמו גם תאים מובחנים בריאים, הזיהום בכל השלבים צריך להיות נשלט בקפידה. בתחזוקת hPSC שגרתית, יש לבצע בדיקות mycoplasma בשבוע או בחודש. אם מיון התאים מבוצע ביום 10, הוספת אנטיביוטיקה למדיום כלשהי מומלצת ביותר. חשוב גם לבדוק את המבנה התאי לפני ואחרי התחלת הבידול. כאן, אנו מציעים מספר נקודותביקורת קריטיות (איור 6a). ראשית, אידיאלי hPSC המושבות מוכן לבידול צריך קצוות בהירים וחלקים עם קוצים זעירים. מושבות עם קוצים כמו הילוך החלו להבדיל ואין להשתמש בהם. מומלץ מאוד כי תאים בנקודת הזמן המושלמת יש להשתמש באופן מיידי, כי המבנה יכול להשתנות בתוך שעות. דחיית יום אחד עלולה לקרוס את התאים (איור 6ב', א) או להוביל ליצירת קשר בין מושבות (איור 6b, ב), המעוררת הבדלה בhPSCs. זה מאתגר להיפטר כל תא הבדיל בתרבות, אך האוכלוסייה צריכה להיות נשלטת כדי להכיל פחות מ 5% של מושבות רע. בעת ביצוע פרוטוקול זה, נקודת הסימון השנייה במהלך הבידול היא בין יום 2 ליום 10. בשלב זה, רכסים מצפון קרוליינה צריך להיות נצפתה בבירור תחת מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 2C). עובי והפצה של רכסים ניתן להשתמש כאינדיקטורים של היעילות NC: מכיוון NCCs ' הם נגזר בעיקר מתאים היוצרים את הרכסים, רכסים דקים או פחות ושלפוחיות ברכסים עשוי להצביע על הפקה נמוכה של NC, ולכן יש לסמן או נמחק במקרה של תוצאות לא עקביות (איור 6C). דגימת RNA מומלצת מאוד ביום 10 כדי לבדוק את סמני NC המתוארים לעיל. המחסום השלישי הוא במהלך השלב הספרואיד של צפון קרוליינה, מכיוון שניתן לצבור הספרואידים. מומלץ לעבור באופן תקופתי כדי להפריד את המדיום לפרק ולהשעות מחדש את הצבירה (התאים לא יהיו מפוזרים בחזרה לתאים בודדים אך מספרי מחזור קטנים בלבד). אם הספרואידים להתרחב מהר מדי, לפצל אותם על ידי 1:2 או 1:4 להשאיר מספיק מקום וחומרים מזינים עבור התאים לצמוח. אם spheroids אין צורות חלקות ועגולות (איור 6D), זה יכול להעיד כי היעילות NC ביום 10 לא היה מספיק גבוה, ולכן עלול להרוס את הבידול הסופי. בדיקת פרופילי ביטויים לבדיקת מאפייני מחולל שכבה מומלצת ביום הציפוי הרצוי. המחסום הרביעי הוא לאחר הציפוי של הספרואידים. Neurites צריך להיות גלוי בבירור צרורות צריך להתחיל להרכיב אחרי יום 20. תאים ללא neurites וחבילות נרחב צריך להיחשב זיהום (איור 6E). בשלב זה, חשוב להאכיל את הנוירונים על ידי החלפת רק חצי המדיום הקיים כדי לשמור על הסביבה מזינה שנוצר על ידי נוירונים יציבים. להיות זהיר בעת האכלה תאים, מכיוון התבגרות סימטריות פגיעים והוא יכול בקלות להתנתק. הסיבה לכל אחד מהמוורפולוגיות השגויות שתוארה כאן לא הובנה עדיין לחלוטין. עם זאת, הוא מספק תובנה לתוך האופי הרגיש של hPSCs ובידול מבחנה. מקור אחד של אי סדרים כאלה עשוי להיות עקב ריאגנטים מספקים שונים. למשל, הרכסים הדק עם השלפוחיות מופיעים כאשר משתמשים במותג שונה של BMP4.

עבור ניתוח אלקטרולוגי באמצעות ה-MEA, על מנת להפיץ באופן שווה את הסימטריות בבארות האלקטרודות, הספרואידים מנוכה בידי המאאז. זמן הטיפול צריך להיות 20 דקות להתחיל. עם זאת, מכיוון spheroids הם מאוד דחוס, זמן הדיסוציאציה יכול להיות גדל כדי 45 דקות כדי להבטיח את הspheroids הם הנתק המלא. באופן כללי, כל קבוצה ניסיונית על לוחית MEA צריך להיות מופעל בכפולות של לפחות 6 כדי לקבל תוצאות עקביות. בעיקר, כי הצפיפות שלנו לציפוי מחדש הוא הרבה יותר נמוך מאשר ההמלצות של היצרן32 (כ 500 – 700000/cm2), חוזר היטב הם קריטיים. בתוצאות שלנו, ביטוי משמעותי בסימון הסמן ופעילות יציבה להופיע מיום 20 עד יום 30. אנו ממליצים על כך כנקודת הזמן הטובה ביותר להתחיל להקליט את משתני הבחירה. עבור כל בידול, יש לעשות את המדיום טרי ולהשתמש בו מהר ככל האפשר (לא יותר מחודש אחד).

פרוטוקול הבידול המוצג כאן הוא נטול ממזין, מוגדר כימית, יעיל, ניתן להרחבה ומניב סימטריות פונקציונלית ביום 20. פרוטוקול זה בידול מוגדר ניתן להשתמש כדי לחקור את ההפרעות האנושיות של מערכת העצבים הסימפתטית, כפלטפורמה לסינון סמים, עבור מחקרים בטווריגנזה כגון נוירובלסטומה/פאוכרוציטומה, או עבור מחקר בסיסי בתחום הומסטטי רגולציה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

אנו רוצים להודות להיידי אולריצ'ס על קריאה ועריכה ביקורתית של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Tags

ביולוגיה התפתחותית סוגיה 159 תאי גזע בעלי עוצמה אנושית ציצה עצבית הנוירונים מערכת העצבים האוטונומית מערכת העצבים הסימפתטית ללא מאכיל מוגדר כימית בתרבות תא גזע
יעיל הבידול של הנוירונים האוהדים הסימפתטית באמצעות בתאי גזע האדם Pluriפוטנטי תחת ממזין-חינם ומוגדר כימית תנאים תרבות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient… More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter