Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

تمايز فعال من الخلايا العصبية المتعاطفة Postganglionic باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت ظروف الثقافة خالية من التغذية والمحددة كيميائيا

doi: 10.3791/60843 Published: May 24, 2020

Summary

في هذا البروتوكول، ونحن نصف مستقرة، استراتيجية تمايز عالية الكفاءة لتوليد الخلايا العصبية متعاطفة ما بعد ganglionic من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية. هذا النموذج سيجعل الخلايا العصبية المتاحة لاستخدام الدراسات من اضطرابات غير ذات سيادة متعددة.

Abstract

أصبحت الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) أداة قوية لنمذجة الأمراض ودراسة النمو الجنيني البشري في المختبر. قدمنا سابقا بروتوكول التمايز لاشتقاق الخلايا العصبية اللاإراية مع الطابع المتعاطف الذي تم تطبيقه على المرضى الذين يعانون من الاعتلال العصبي اللاإراجي. ومع ذلك ، تم بناء البروتوكول على استبدال مصل الضرب (KSR) وظروف الثقافة القائمة على التغذية ، ولضمان كفاءة التمايز العالية ، كان فرز الخلايا ضروريًا. هذه العوامل تسبب تقلب عالية، وارتفاع التكلفة، وانخفاض الاستنساخ. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقق من الخصائص المتعاطفة الناضجة، بما في ذلك النشاط الكهربائي. هنا ، نقدم بروتوكولًا مثاليًا حيث يتم تنفيذ ثقافة PSC والتمايز في ظروف ثقافة خالية من التغذية ومحددة كيميائيًا. يتم تحديد العلامات الوراثية التي تحدد قمة الجذع العصبية. ويتحقق مزيد من التمايز في الخلايا العصبية المتعاطفة ما بعد ganglionic بعد 20 يوما دون الحاجة إلى فرز الخلايا. تسجيل الكهربية تظهر كذلك هوية الخلايا العصبية الوظيفية. يمكن تعزيز إطلاق النار المكتشف ة من الخلايا العصبية المتمايزة لدينا عن طريق النيكوتين وقمعها من قبل مستقبلات الأدينرجية خصم بروبرانولول. يمكن الحفاظ على السلف العصبية المتعاطفة المتوسطة في هذا البروتوكول كسفيرات عصبية لمدة تصل إلى أسبوعين ، مما يسمح بتوسيع الثقافات. باختصار، لدينا تحديث بروتوكول التمايز العصبية المتعاطفة يظهر كفاءة التمايز عالية، واستنساخ أفضل، والمزيد من المرونة، وتحسين النضج العصبي مقارنة مع الإصدار السابق. هذا البروتوكول سوف توفر للباحثين مع الخلايا اللازمة لدراسة الاضطرابات البشرية التي تؤثر على الجهاز العصبي اللاإرادي.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الخلايا العصبية المتعاطفة بعد ganglionic (symNs) تنتمي إلى الجهاز العصبي اللاإراجي (ANS) ولها أدوار هامة متعددة في الاستجابة وتنظيم التوازن في الجسم مستقلة عن الوعي. على سبيل المثال، يحفز الإجهاد السمنون ويثير استجابة القتال أو الطيران التي تؤدي إلى زيادة في معدل ضربات القلب وضغط الدم والتعرق. تتأثر SymNs في اضطرابات بشرية متعددة بسبب علم الوراثة أو السمية / الإصابة ، أو كمرافقين لأمراض أخرى. مثال على الاعتلال العصبي الوراثي هو اضطراب الطفولة Dysautonomia (FD) ، حيث يؤدي خلل التنظيم الشديد للsymNs إلى أزمة dysautonomic ، واضحة من خلال التعرق ، لطخة الجلد ، نوبات القيء ، ارتفاع ضغط الدم ، والقلق1. مثال على السمية هو العلاج الكيميائي، الذي أفيد أن له آثار جانبية سامة على الخلايا العصبية اللاإراية2. ومن المعروف أن الإرادي اللاإرادي وفرط التعصيب يمكن أن يؤدي إلى، أو يرافق، أمراض مثل مرض باركنسون أو مرض الكلى ارتفاع ضغط الدم3,4. وبالتالي ، فإن القدرة على إجراء البحوث وفهم آليات علم الأحياء والعيوب في سياق المرض مفيد للبحث عن علاجات جديدة وفعالة.

تشريح
يتفرع الجهاز العصبي المحيطي إلى الانقسامات الحسية واللاإراسية. الأعصاب المنفأة في الجهاز العصبي الحسي هي المسؤولة عن الإحساس بالألم واللمس ، في حين أن ANS مسؤولة عن نقل المعلومات من جميع الأجهزة إلى الدماغ. وينقسم ANS إلى الجهاز العصبي المعوي، والداخلية في الجهاز الهضمي، والجهاز العصبي شبه متعاطف، وهو أمر مهم للاسترخاء، والجهاز العصبي المتعاطف (SNS)، وهو أمر مهم لتنشيط / تنظيم الأجهزة. SNS تتكيف مع نظام اثنين من الخلايا العصبية5. المحاور العصبية المتعاطفة قبل ganglionic في الحبل الشوكي المشروع الأول إلى ganglia متعاطفة، حيث توجد أجسام الخلية symN ما بعد ganglionic. ثم ترسل هذه الخلايا العصبية إسقاطات طويلة لإيوينال الأنسجة المستهدفة من كل عضو في الجسم. الإشارات التي تنتقل عن طريق الخلايا العصبية قبل الغانغليونية هي الكوليني، في حين أن symNs ما بعد الغانغليونية هي التحسسية وبالتالي التعبير عن النورادرينالين (NE) كناقل عصبي رئيسي. هناك استثناءات قليلة ملحوظة من الخلايا العصبية ما بعد ganglionic, متعاطفة التي هي الكوليني, بما في ذلك تلك الأوعية الدموية الداخلية. الخلايا العصبية الأيدرينرجية ما بعد ganglionic التعبير عن إنزيمات التيروزين هيدروكسيلاز (TH), العطرية L-الأمينية حمض decarboxylase (AAAD), الدوبامين α-هيدروكسيلاز (DBH), وأوكسيديز أحادي الأمين (MAO-A), جميع المسؤولة عن توليد واستقلاب NE. وعلاوة على ذلك، فإنها تعبر عن ناقلات إعادة التدوير NE و / أو مستقبلات α-adrenergic (ADRA2)، مستقبلات الأدريين (ADR2B)، الناقل النورادرينالين (NET1)، وناقل اليورياميني الفيمركب (VMAT1/2).

التنميه
خلال تطور الجنين ية يتم اشتقاق symNs من القمة العصبية (NC), الذي يظهر بين الأنبوب العصبي وتراكب ectoderm6,ويمكن أن تفرق في أنساب متعددة الخلايا, بما في ذلك الخلايا الصباغية, العظام الخلايا, الخلايا الدهنية, غليا, الخلايا العصبية المعوية, الخلايا العصبية الحسية, والخلايا العصبية اللاإروية7. خلايا القمم العصبية (NCCs) هي خلايا شديدة الارتحال تأخذ عدة طرق عبر الجنين. في هذه المرحلة المبكرة من NC التنمية، والخلايا التعبير عن علامات SNAIL1/2، FOXD3، وSOX108،9،10،11. يحدد مسار الترحيل مع الموقع المحوري الذي يتبنونه النوع الفرعي NC الذي ستتطور إليه. يمكن تمييز هذه الأنواع الفرعية NC من خلال التعبير الجيني HOX محددة: NCCs الجمجمة لا تعبر عن الجينات HOX, NCCs المبهمة التعبير HOX 1-5, NCCs الجذع التعبير HOX 6-9, وNCCs sacral التعبير HOX 10-1112. ومن بينها، يُعترف بمراكز الـ NCCs للجذع كمصدر رئيسي للسيومين. SymN السلائف التعبير عن عامل النسخ MASH1/ASCL113, الذي يعزز التعبير عن PHOX2B14 وINSM115. يتم التعبير عن عائلة GATA من عوامل النسخ أثناء التطور المتعاطف المتأخر. يتم التعبير عن GATA2 و GATA3 في symNs ، والتي بدورها ينشط DBH16. عامل النسخ HAND2 مهم أيضا للتعبير عن وصيانة DBH و TH17.

وخلايا HPSCs (مثل الخلايا الجذعية الجنينية والمستحثة) هي أداة قوية18 لتلخيص النماذج التنموية وتوليد الخلايا السلية التي يمكن استخدامها بعد ذلك لنمذجة الأمراض لمختلف الاضطرابات البشرية. وهكذا، فبينما تولد السيوم الوطني من المراكز الاستراتيجية الوطنية، من الأهمية بمكان اتباع المبادئ التوجيهية الإنمائية وتقييم التعبير عن العلامات المناسبة على طول عملية التمايز.

بروتوكول symN السابق
وقد ذكرت عدد قليل من مجموعات البحث سابقا توليد symNs من hPSCs19,20,21. المقارنة المباشرة لهذه البروتوكولات لبعضها البعض ولنا واستعرض مؤخرا22. في 201623, نشرنا بروتوكول التمايز لتوليد الخلايا العصبية اللاإراية مع حرف symN(الشكل 1A). استخدم هذا البروتوكول الوسيط القائم على KSR ، والذي تم استخدامه في كل من الحفاظ على hPSCs غير المتمايزة وتمايز الخلايا. وعلاوة على ذلك، تم الحفاظ على hPSCs على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (الخلايا المغذية MEF). لقد وظفنا هذا البروتوكول وPSCs من المرضى الذين يعانون من FD لنموذج اضطراب23. في عام 2019 ، وصفنا نسخة أكثر تفصيلاً من هذا البروتوكول القديم24. باختصار ، تم حث المصير العصبي عن طريق تثبيط SMAD المزدوج25 لمنع إشارات TGF-α و BMP في اليومين الأولين. تعزيز تفعيل WNT باستخدام CHIR99021 السلف العصبية لتصبح خلايا NC. في اليوم 11، تم فرز الخلايا من قبل FACS لCD49D+ أو SOX10+ السكان26،23، والتي أسفرت عن حوالي 40٪ كفاءة الجيل NC. ومن ثم، فإن الفرز ضروري لضمان الكفاءة والنقاء للخطوات التالية للتمايز. تم الحفاظ على NCCs وتضخيمها كspheroids مع المعالجة المشتركة من FGF2 وCHIR. بعد 4 أيام، تم مطلي spheroids NC من الصيانة وأعطيت BDNF، GDNF، وNGF لإنهاء نضوج symN. على الرغم من أن هذه symNs أعرب عن علامات symN قوية مثل ASCL1, TH, DBH, و PHOX2A, علامات لsymNs أكثر نضجا, بما في ذلك التعبير عن مستقبلات الأستيل كولين النيكوتين (CHRNA3/CHRNB4) والناقل الحويصلة (VMAT1/2), كانت منخفضة حتى بعد 70 يوما من التمايز. لم يتم اختبار جينات HOX في هذا البروتوكول رسميًا ، ولم يتم التحقق من الخصائص العصبية الناضجة ، بما في ذلك النشاط الكهربي الفسيولوجي للخلايا.

هنا، ونحن نقدم بروتوكول الأمثل لتوليد symNs(الشكل 1B). يتم الحفاظ على HPSCs في ظروف خالية من التغذية، على الأطباق المغلفة بالفيترونكتين (VTN)، باستخدام الوسائط الأساسية 8 (E8)27. وقد تم تعديل صيغة وسائل الإعلام التمايز في كل مرحلة، مما أدى إلى زيادة النسبة المئوية للسكان NC28. ويمكن القيام بنضوج symN على CD49D+/ SOX10+ فرزأو مجموعات NCC السائبة غير المصنفة. كلاهما تظهر مستويات عالية من التعبير علامة symN بحلول اليوم 30. وعلاوة على ذلك، فإن symNs ولدت مع هذا البروتوكول تستجيب للتسجيل الكهروفيزيولوجية والعلاجات مع المنشط symN والمركبات المثبطة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: تم توفير خط مراسل H9 PHOX2B:GFP من قبل Oh وآخرون19. تم الحصول على بعض التمهيديات qPCR المستخدمة في هذه الورقة من تقنيات OriGene ، في حين يتم الحصول على بعض التسلسلات من Frith et al.20،30.

1. إعداد لطلاء الأطباق، وإعداد وسائل الإعلام، وصيانة hPSC

  1. طلاء الطبق
    1. فيترونكتين (VTN) طلاء
      1. ضع قوارير VTN في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب بالكامل ، ثم يخلط جيدًا.
      2. لطبق بيتري 100 مم، اخلط يُمزج 7 مل من 1x الفوسفات المالحة العازلة (PBS) مع 0.5 ملغم/مل VTN، إضافة محلول VTN إلى الطبق، واحتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
    2. طلاء مصفوفة غشاء الطابق السفلي
      1. إذاثقوا قوارير مصفوفة غشاء الطابق السفلي (انظر جدول المواد)على الجليد عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      2. لبئر واحدة من لوحة بئر 6، مزيج 2 مل من DMEM/F12 مع 20 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي 100x، إضافة محلول مصفوفة غشاء الطابق السفلي إلى الطبق، التفاف الطبق مع فيلم البارافين، وتخزينها في حاوية نظيفة في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. العمل في أسرع وقت ممكن. يمكن تخزين الأطباق المغلفة في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
    3. البولييورنيثين (PO) / اللامينين (LM) / تليفيتكن (FN) الطلاء
      1. في اليوم الأول، لبئر واحد من لوحة بئر 24، مزيج 15 ميكروغرام / مل من PO مع 1 مل من 1x PBS، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. تذوب كل من LM وFN في -20 درجة مئوية بين عشية وضحاها وتخزينها في 4 درجة مئوية حتى إذابة تماما.
      2. في اليوم الثاني، استنسخ محلول PO، وغسل الآبار 2x مع 1x PBS، إضافة 1 مل من 1x PBS تحتوي على 2 ميكروغرام / مل من LM و 2 ميكروغرام / مل من الجبهة الوطنية واحتضان في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 بين عشية وضحاها. عند هذه النقطة يمكن أن تبقى الطبق مع حل LM / FN في الحاضنة لعدة أشهر طالما أنها لا تجف. إضافة أكثر 1x PBS لمنع الطبق من الجفاف.
  2. إعداد وسائل الإعلام
    1. إعداد المتوسط الأساسية 8 (E8) عن طريق إذابة زجاجة واحدة من ملحق E8 في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. مزيج الملحق مع 500 مل من متوسط E8 والمضادات الحيوية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: يجب استخدام حل E8 العامل في غضون أسبوعين.
    2. إعداد متوسط تجميد hPSC عن طريق خلط 90 مل من متوسط E8 الكامل مع 10 مل من DMSO لحجم إجمالي قدره 100 مل. تصفية تعقيم.
    3. إعداد اليوم 0 إلى يوم 1 تمايز المتوسطة عن طريق خلط 100 مل من 6 (E6) الأساسية المتوسطة مع 10 ميكرون SB431542، 1 نانوغرام / مل BMP4، 300 nM CHIR99021، و 10 ميكرومتر Y27632 لحجم إجمالي قدره 100 مل.
    4. إعداد اليوم 2 إلى اليوم 10 تمايز المتوسطة عن طريق خلط 100 مل من متوسط E6 مع 10 ميكرومتر SB و 0.75 ميكرومتر CHIR99021 لحجم إجمالي قدره 100 مل.
    5. إعداد اليوم 10 إلى اليوم 14 المتوسطة spheroid عن طريق خلط المتوسطة العصبية القاعدية مع 2 مل من B27 (50x) ، 1 مل من N2 (100x) ، 2 mM L-غلوتامات ، 3 ميكرون CHIR99021 ، و 10 نانوغرام / مل FGF2 لحجم إجمالي قدره 100 مل.
    6. إعداد اليوم 14 إلى اليوم 28 المتوسطة للصيانة على المدى الطويل spheroid عن طريق إضافة 0.5 ميكرومتر من RA الطازجة إلى اليوم 10 إلى اليوم 14 المتوسطة spheroid لكل تغذية.
      ملاحظة: احتفظ دائمًا بـ RA عند -80 درجة مئوية.
    7. قم بإعداد وسيط نضوج SymN عن طريق خلط الوسط العصبي القاعدي مع 2 مل من B27 (50x) ، 1 مل من N2 (100x) ، 2 mM L-glutamate ، 25 نانوغرام / مل GDNF ، 25 نانوغرام / مل BDNF ، 25 نانوغرام / مل NGF ، 200 ميكرومتر الأسكوربيك حمضي ، و 0.2 mM dbcAMP لحجم إجمالي قدره 100 متر وينبغي استخدام الحل في غضون 2 أسابيع. قبل كل تغذية، أضف 0.125 ميكرومتر RA الطازجة. يتم استخدام هذا الحل من اليوم 14 (الخيار 1) أو اليوم 28 (الخيار 2).
    8. قم بإعداد المخزن المؤقت FACS عن طريق خلط DMEM مع 2٪ FBS و 2 mM L-غلوتامات والمضادات الحيوية إذا لزم الأمر لحجم إجمالي قدره 100 مل.
  3. صيانة hPSC
    1. إذابة والحفاظ على hPSCs
      1. إعداد واحد VTN المغلفة طبق 100 ملم.
      2. لإذابة قارورة من hPSCs مباشرة من النيتروجين السائل، ووضع القارورة في حمام المياه 37 درجة مئوية، يتأرجح بعناية أنبوب في الماء حتى يذوب. نقل hPSCs المذابة إلى أنبوب 15 مل يحتوي على 10 مل من 1x PBS، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
      3. تجاهل supernatant وإضافة 1 مل من متوسط E8 إلى الأنبوب. Pipette عدة مرات لإعادة تعليق تماما بيليه ومن ثم إضافة آخر 9 مل من متوسط E8 للوصول إلى 10 مل المجموع.
      4. يُستنشق حل VTN من طبق 100 مم.
      5. نقل hPSCs إلى طبق 100 مم، يهز بلطف (صعودا إلى أسفل واليسار واليمين، وليس في الدوائر) للتأكد من توزيع الخلايا بالتساوي في الطبق
      6. احتضان في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.
      7. في اليوم التالي، استنشق جميع المتوسطة والأعلاف مع 10 مل من E8.
      8. إطعام بهذه الطريقة كل يوم لمدة 3-4 أيام القادمة ومن ثم الاستعداد لتقسيم.
    2. تقسيم hPSCs
      ملاحظة: hPSCs عند نقطة تقسيم يجب أن يكون 80%-90% confluent. وينبغي ملاحظة مستعمرات كبيرة مع حواف ناعمة ومشرقة. ومع ذلك ، يجب تجنب الاتصال بين كل مستعمرة(الشكل 2B، اليوم 0 والشكل 6B).
      1. إعداد الأطباق 100 ملم المغلفة VTN حسب الحاجة.
      2. يستنشق E8 وغسل الطبق الذي يحتاج إلى تقسيم 1x مع 1x PBS.
      3. يستنشق 1x PBS وإضافة 4 مل من 0.25 M EDTA. احتضان لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
        ملاحظة: يجب تقسيم hPSCs/replatedك كمستعمرات صغيرة. لا تعامل مع EDTA أطول من 2 دقيقة لمنع الانفصال إلى خلايا واحدة. يجب أن تكون الخلايا لا تزال تعلق على سطح الطبق بعد علاج 2 دقيقة.
      4. استنشق EDTA ، وفصل المستعمرات عن طريق الأنابيب بقوة 10 مل من متوسط E8 على سطح الطبق ، وجمع جميع المتوسطة والخلايا في أنبوب 15 مل.
      5. مع hPSCs في التقاء 80٪-90٪، وتقسيم المستعمرات من قبل 1:15-1:20. على سبيل المثال، لتقسيم hPSCs بنسبة 1:20 إلى طبق واحد 100 ملم، واتخاذ 500 ميكرولتر من محلول E8/hPSCs وتخلط مع 9.5 مل من متوسط E8 الطازجة.
      6. لوحة hPSCs في VTN المغلفة 100 ملم الأطباق.
        ملاحظة: ينصح بإنشاء نسبة الانقسام المثالية لكل باحث وخط الخلية بشكل مستقل.
    3. تجميد hPSCs
      1. لطبق واحد 100 ملم من hPSCs التي هي على استعداد لتقسيم, إعداد ثلاث cryovials و 3.5 مل من المتوسطة تجميد.
        ملاحظة: يجب الاحتفاظ بالوسائط والقنينات في 4 درجات مئوية أو على الجليد حتى الاستخدام.
      2. يُستنشق E8 ويُغسل الطبق 2x مع 1x PBS.
      3. استنق 1x PBS وإضافة 4 مل من 0.25 M EDTA، واحتضان لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.
        ملاحظة: يجب تجميد hPSCs كمستعمرات صغيرة في الوقت الذي سيتم تقسيمها. لا تعالج الخلايا مع EDTA أطول من 2 دقيقة لمنع الانفصال إلى خلايا واحدة. يجب أن تكون الخلايا لا تزال تعلق على سطح الطبق بعد علاج 2 دقيقة.
      4. يستنشق EDTA ، وفصل المستعمرات عن طريق الأنابيب بقوة 10 مل من 1x PBS على سطح الطبق ، وجمع جميع الخلايا المتوسطة والمتوسطة في أنبوب 50 مل.
      5. أضف 20 مل من 1x PBS والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقائق لغسل EDTA المتبقية.
      6. تجاهل supernatant وإعادة تعليق بيليه في 3 مل من المتوسط تجميد.
      7. توزيع hPSCs بالتساوي في الغريناين الثلاثة، 1 مل لكل منهما.
      8. تخزين هاوية في -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها في مربع تجميد تسيطر عليها أو شطيرة الستايروفوم لضمان انخفاض درجة الحرارة بطيئة، ومن ثم نقل إلى خزان النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

2. البذر hPSCs لبدء التمايز (اليوم 0)

ملاحظة: يجب أن تكون hPSCs جاهزة للتمايز بعد استقرارها (أي تقسيم 2-3x بعد الذوبان). تأكد من أن المستعمرات صحية ، مع حواف ناعمة ولامعة ، والحد الأدنى من التمايز(الشكل 2B).

  1. إعداد الأطباق المغلفة بمصفوفة غشاء الطابق السفلي (24 بئرًا أو 6 أطباق جيدة) قبل يوم واحد من اليوم 0 حسب الحاجة. جلب الأطباق إلى RT في بداية التمايز.
  2. جعل اليوم 0-1 التمايز المتوسطة حسب الحاجة.
  3. يستنشق E8 من confluent ، على استعداد لتقسيم hPCSs ، وغسل الطبق 2x مع 1x PBS.
  4. إضافة 7 مل من 0.25 M EDTA لكل طبق 100 ملم، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ COلمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يتم إطالة العلاج EDTA لتفريق في خلايا واحدة.
  5. Pipet قبالة جميع hPSCs (ينبغي أن تكون عائمة) ونقل إلى أنبوب 50 مل. إضافة نفس المبلغ أو أكثر من 1x PBS كحل EDTA لتخفيف EDTA.
  6. الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
  7. تجاهل supernatant، إضافة 1 مل من اليوم 0-1 تمايز المتوسطة والأنابيب لتجانس الخلايا. اتبع بإضافة المزيد من المتوسط ثم مزيج لتخفيف محلول الخلية إلى تركيز مثالي لحساب الخلايا.
    ملاحظة: لا تبالغ في حل الخلية. يجب تخفيف الخلايا من طبق واحد كامل 100 ملم في 5 مل من المتوسطة للبدء.
  8. عد رقم الخلية باستخدام عداد الخلية الآلي أو مقياس الهيموكيتومتر.
  9. تمييع محلول الخلية حسب الحاجة للوصول إلى 125,000 خلية/سم2 في حجم نهائي منخفض (على سبيل المثال، 2 مل لكل بئر لطبق 6 بئر أو 500 ميكرولتر لكل بئر لطبق بئر 24).
    ملاحظة: يساعد انخفاض مستوى الصوت الخلايا على إرفاق أسرع.
  10. يستنشق كل من محلول مصفوفة غشاء الطابق السفلي من الأطباق المغلفة ولوحة حل الخلية في الآبار.
  11. احتضان في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.

3. العصبية كريست الخلية التعريفي (اليوم 1 إلى اليوم 10، الشكل 2A)

  1. في اليوم 1 تغذية الخلايا مع يوم 0-1 تمايز المتوسطة (3 مل لكل بئر ل6 أطباق جيدة و 1 مل لكل بئر ل24 أطباق بئر).
  2. في اليوم 2 تغذية الخلايا مع يوم 2-يوم 10 تمايز المتوسطة (3 مل لكل بئر ل6 أطباق جيدة و 1 مل لكل بئر ل24 أطباق بئر).
  3. من الآن فصاعدا، ينبغي تغذية الخلايا كل يومين حتى اليوم 10 (أي أن يوم التغذية التالي سيكون اليوم 4).
    ملاحظة: من اليوم 6 على، يجب الكشف عن التلال NC(الشكل 2B). للتحقق مما إذا كان التمايز يحدث ، ينصح بحمل ثقافة تمايز موازية في الآبار الصغيرة (أي 24 بئرًا) ، التي يمكن أن تكون ملطخة لـ SOX10/AP2a وتستخدم للتعبير الجيني للعلامة على طول وقت التمايز(الشكل 2B،C).
  4. إذا فرز الخلايا، انتقل إلى القسم 4. خلاف ذلك، انتقل إلى القسم 5.

4. فلورسينس تنشيط فرز الخلايا (FACS) لعلامة قمة العصبية CD49D وتجميع خلايا NC في spheroids

ملاحظة: بالنسبة لفرز FACS، يجب الاحتفاظ بالعينات على الجليد وعدم التعرض للضوء بعد تلطيخها حتى الفرز.

  1. إعداد المخزن المؤقت FACS إذا تم فرز الخلايا.
  2. إعداد اليوم 10-14 المتوسطة spheroid.
  3. في اليوم 10، وإزالة المتوسطة، وغسل 1x مع 1x PBS.
  4. إضافة حل التفكك (انظر جدول المواد)في 2 مل لكل بئر لطبق جيدا 6 أو 1 مل جيدا لطبق بئر 24، واحتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 لمدة 20 دقيقة.
  5. Pipet قبالة جميع hPSCs ونقل إلى أنبوب 50 مل.
  6. املأ بقية الأنبوب بعازل FACS وطارد مركزي بسعر 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن أن يستوعب كل أنبوب 50 مل ما يصل إلى 20 مل أو أقل من محلول الخلية. وينبغي أن يكون حجم المخزن المؤقت للفاكس مرتفعاً بما يكفي لتحييد حل الانفصام.
  7. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق الخلايا مع كمية مناسبة من المخزن المؤقت FACS (~ 2 مل لكل بئر من لوحة بئر 6)، والعد لتحديد رقم الخلية.
  8. إعداد العينات التالية.
    1. العينة 1 (عنصر التحكم غير الملطخ): 1 × 106 خلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفاكس. تصفية الخلايا من خلال غطاء مصفاة 20 ميكرون والحفاظ على أنبوب على الجليد.
    2. العينة 2 (التحكم فقط DAPI): 1 × 106 خلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام/مل DAPI. تصفية الخلايا من خلال أنبوب FACS مع غطاء مصفاة والحفاظ على أنبوب على الجليد.
    3. العينة 3 (CD49d المسمى): تعليق بقية الخلايا مع المخزن المؤقت FACS التي تحتوي على PE/Cy7-مترافق CD49D الأجسام المضادة CD49D (5 ميكرولتر ل1 × 106 خلايا لكل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS) في أنبوب 15 مل واحتضان على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  9. املأ الأنابيب بالعازلة وأجهزة الطرد المركزي FACS عند 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
  10. تجاهل supernatant وإعادة تعليق كل 5-10 × 106 خلايا في 1 مل من المخزن المؤقت FACS تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل DAPI وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  11. تصفية الخلايا من خلال أنبوب FACS مع غطاء مصفاة والحفاظ على أنبوب على الجليد.
  12. إعداد مجموعة أنابيب FACS التي تحتوي على 2 مل من المخزن المؤقت FACS.
  13. فرز من خلال آلة FACS مع أشعة الليزر التي يمكن الكشف عن DAPI وPE-Cy7 لعزل CD49D+ السكان.
  14. بعد الفرز، عد الخلايا التي تم فرزها.
  15. الطرد المركزي جميع الخلايا فرزها وإعادة تعليق في اليوم 10-14 متوسط كروي إلى تركيز نهائي من 0.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من المتوسط.
  16. لوحة 0.5 × 106 خلايا لكل بئر في ملحق منخفض جدا 24 لوحات جيدا.
  17. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.

5. تجميع خلايا NC في spheroids

  1. إذا لم يكن استخدام FACS لعزل خلايا NC وبدلاً من تجميعها في spheroids مباشرة، قم أولاً بإعداد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 4.2-4.5.
  2. ملء بقية الأنبوب مع 1x PBS، والطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
  3. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق الخلايا مع كمية مناسبة من اليوم 10-14 المتوسطة spheroid (على سبيل المثال، ~ 2 مل من المتوسط لكل بئر للوحة بئر 6)، والعد لتحديد رقم الخلية.
  4. تمييع الخلايا في اليوم 10-14 متوسط كروي إلى 0.5 × 106 خلايا لكل 500 ميكرولتر من المتوسط.
  5. لوحة 500 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في مرفق منخفض جدا 24 لوحات جيدا.
  6. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.

6. NC الصيانة spheroid وتحريض السلف متعاطفة (اليوم 10 إلى اليوم 14، الشكل 4A)

  1. الخيار 1: الحد الأدنى من ثقافة السبرويد
    1. في اليوم 11، أضف 500 ميكرولتر من اليوم 10-14 متوسط كروي إلى spheroids NC دون تمييز المتوسط الموجود من اليوم 10. احتضان في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2.
    2. في اليوم 12، إمالة لوحة لتجميع spheroids NC على جانب واحد من الآبار. يستنشق بعناية ويتجاهل أكبر قدر ممكن من الوسط ، ويتغذى على 1 مل من اليوم 10-14 متوسط كروي.
    3. استمر في تغذية الخلايا كل يوم حتى اليوم 14.
    4. اختياري: إذا كانت السبوويدات مجمعة وتولد كتلة كبيرة، استخدم ماصة لكسر كتل الصنبور. وهذا يضمن أيضا أن spheroids الفردية لا تحصل كبيرة جدا.
      ملاحظة: يجب أن يكون نطاق حجم spheroid المثالي حوالي 100-500 ميكرومتر. ضمن هذا النطاق ، فإن حجم spheroids الفردية ليست حاسمة. ومع ذلك ، فإن مورفولوجيا ، مثل حواف ناعمة وواضحة(الشكل 3 والشكل 6)مهم لمزيد من النجاح. في اليوم 14، كل 24 لوحة جيدا يحتوي بشكل مثالي حول 50-60 spheroids من أحجام مختلفة ضمن نطاق الحجم المذكور أعلاه.
  2. الخيار 2: توسيع ثقافة السبرويد
    1. في اليوم 15، للحفاظ على السفية NC، تغذية مع 1.5 مل من اليوم 10-14 المتوسطة spheroid التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر RA. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
      ملاحظة: يجب إضافة RA جديدة لكل تغذية ويتم تخزينها دائماً عند -80 درجة مئوية.
    2. من الآن فصاعدا، تغذية كل يومين حتى اليوم 28 ومن ثم الاستمرار مع الطلاء من spheroids (القسم 7.1).
      ملاحظة: يتم تقسيم spheroids المتزايدة تقريبا 1x في الأسبوع عن طريق pipetting لهم مع ماصة 1 مل لتفريقها. يتم تقسيمها بنسبة تقريبية من 1:2-1:4. خلال فترة توسيع الأسبوع 2، يجب أن الخلايا رباعية تقريبا في العدد.

7- تمايز SymN ونضوجه (الخيار 1: بعد اليوم 14؛ الخيار الثاني: بعد اليوم 28)

  1. طلاء spheroids في الأطباق العادية
    1. إعداد PO / LM / FM المغلفة 24 لوحات جيدا.
    2. إعداد المتوسطة symN التي تحتوي على 0.125 μM RA (إضافة كل تغذية جديدة) و 10 ميكرومتر Y27632 (اليوم 14 فقط).
    3. في اليوم 14، إمالة لوحة لتجميع النفثالينات NC على جانب واحد من الآبار. نستنشق بعناية وتجاهل أكبر قدر ممكن من المتوسطة، وتغذية مع 1 مل من المتوسطة symN.
    4. إزالة LM / FN من لوحات المغلفة.
    5. تقسيم ولوحة كل بئر من لوحة بئر 24 إلى 4 آبار منفصلة من الجديد, المغلفة 24 لوحة جيدا. سيكون لكل بئر أصلي 1 مل ، تحتوي على 50-60 spheroids. هذا ينتج 250 ميكرولتر، تحتوي على ما يقرب من 10-15 spheroids لكل بئر على لوحة جديدة.
    6. إضافة 250 ميكرولتر من متوسطة إضافية لكل بئر.
      ملاحظة: هذا هو تقسيم 1:4; تأكد من أن يتم توزيع spheroids بشكل صحيح داخل الحل بحيث يكون الانقسام زوجيًا نسبيًا. لا يتم حساب عدد spheroids لأن الرقم النهائي لا يؤثر على نجاح إنشاء symNs.
    7. احتضان في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
    8. في اليوم 15 (أو اليوم 29 للخيار 2)، تغذية عن طريق استبدال جميع المتوسطة مع 1 مل من المتوسطة symN التي تحتوي على 0.125 ميكرومتر RA. من الآن فصاعدا، وينبغي تغذية الخلايا العصبية كل 2 أيام حتى اليوم 20 (أو اليوم 35 للخيار 2).
    9. بعد اليوم 20 (أو اليوم 35 للخيار 2), وينبغي تغذية الخلايا العصبية عن طريق استبدال بعناية نصف فقط من الوسط الحالي (500 ميكرولتر). من الآن فصاعدا، تغذية كل أسبوع إلا إذا المتوسطة يتحول بسرعة الأصفر.
    10. استمر في التغذية أسبوعيًا حتى النقطة الزمنية المطلوبة.
      ملاحظة: تميل symNs إلى التجميع في هياكل تشبه الغانج وهي عرضة للانفصال عن أطباق الثقافة. لمنع هذا، ينصح نصف التغذية والحد الأدنى من المناولة.
  2. خلايا الطلاء للتسجيل الكهروفيزيفسي
    1. إعداد PO / LM / FM المغلفة 96 لوحات الفيزيولوجيا الكهربائية جيدا.
    2. إعداد المتوسطة symN التي تحتوي على 0.125 μM RA (إضافة كل تغذية جديدة) و 10 ميكرومتر Y27632 (اليوم 14 فقط).
    3. في اليوم 14، جمع جميع spheroids، ثم طرد مركزي لهم في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
    4. تجاهل supernatant، إضافة 2 مل من محلول التفكك، ونقل الخليط مرة أخرى إلى واحدة من الآبار من لوحة مرفق منخفضة جدا. احتضان في 37 درجة مئوية، في 5٪ CO2 لمدة 20-45 دقيقة.
      ملاحظة: اعتمادا على حجم spheroids، يمكن أن تكون فترة التفكك أطول من 20 دقيقة. تحقق من انفصام الخلية كل 10 دقيقة تصل إلى 45 دقيقة. اختياريا، 0.1 ملغم/مل من DNase يمكن إضافتها مع حل التفكك لمنع الحمض النووي الحر من الخلايا الميتة مما يجعل الحل لزجة. هذا اختياري في هذا البروتوكول لأن spheroids لن تجميع بمجرد فصلها تماما.
    5. Pipet لفصل تماما spheroids، ثم الطرد المركزي في 200 × ز لمدة 4 دقيقة.
    6. تجاهل supernatant، وإعادة تعليق الخلايا مع كمية مناسبة من المتوسطة symN، وحساب رقم الخلية.
    7. لوحة الخلايا في 100،000/سم2 في PO / LM / FN المغلفة الآبار الفيزيولوجيا الكهربائية في 200 μL الحجم الإجمالي لكل بئر.
    8. في اليوم 15 (أو اليوم 29 للخيار 2)، اتبع نفس عمليات التغذية كما هو الحال في القسم 7.1. وينبغي أن يكون الحجم الإجمالي بعد اليوم 15 (أو اليوم 29 للخيار 2) 300 ميكرولتر لكل بئر.
    9. قياس الإشارات الكهربائية باستخدام جهاز صفيف متعدد الأقطاب بعد اليوم 20 (أو اليوم 35 للخيار 2).
      ملاحظة: في الخيار 2، يمكن مطلي spheroids في أي وقت بين اليوم 14-يوم 28. يمكن إجراء قياسات الإشارات الكهربائية الأولى بعد أسبوع واحد من طلاء السفيرود.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في هذا البروتوكول، نعطي تعليمات حول كيفية توليد symNs من hPSCs. تم تحسين ظروف الثقافة المثبتة هنا من بروتوكول نشر سابق23،24 (الشكل 1A)إلى شروط خالية من التغذية ومحددة كيميائيا(الشكل 1B). يتم توفير خيارين، واحد حيث يتم symNs في غضون 20 يوما، وآخر حيث يمكن توسيع NCCs لمدة 2 أسابيع لتوليد المزيد من الخلايا التي يمكن بعد ذلك أن تكون متمايزة في symNs(الشكل 1B،الخيار 1 و 2).

لمراقبة خصائص symN بشكل صحيح من الخلايا المتمايزة، وخط المراسل PHOX2B-eGFP WA09 وWA09 PSCs الأصل سطر19. أجريت جميع التمايزات في ثلاث عمليات تكرار بيولوجية على الأقل، عُرِّفت بأنها تجارب تمايز مستقلة بعد مرور واحد على الأقل و/أو مشتقة من قارورة تم إذابتها حديثاً من الخلايا. وكان التمييز مستحثاً عندما وصل التقاء المراكز غير المتمايزة إلى 80% إلى 90%. كانت مستعمرات hPSC مستديرة ، مع حواف لامعة وناعمة والقليل أو لا تمايز. يجب ألا تلمس المستعمرات بعضها البعض(الشكل 2B، اليوم 0). بدلا من نموذجي ة مزدوجة SMAD تثبيط25, الذي كان يستخدم سابقا لتحريض neurectoderm, TGF-α تثبيط جنبا إلى جنب مع WNT وBMP4 الإشارات في الأيام الأولى 2 أدى إلى تعبير قوي من علامة قمة عصبية في وقت مبكر AP2a. تم التعبير عن علامة كريست العصبيSOX10 من اليوم 4 إلى اليوم 10(الشكل 2B). ظهرت NCCs في التلال الكثيفة والمظلمة مرئية من اليوم 6 على. وأعرب عن هذه التلال SOX10(الشكل 2B، والسهام). وقد تبين سابقا أن SOX10 في مرحلة NCC يرتبط مع علامة سطح الخلية CD49D23،26 وبالتالي CD49D يمكن استخدامها لفرز الخلايا NC التي لا تبلغ عن أي fluorophore من LOCUS SOX10. الشكل 2C يظهر التعبير عن الجينات علامة NCC مع مرور الوقت. يشير الشكل 2D إلى أن كفاءة التمايز لدينا كانت أعلى من 80٪. لتحديد هوية الخلايا المتبقية، تم استخدام qRT-PCR لاختبار أنواع الخلايا الملوثة، بما في ذلك bryT-التعبير عن mesoderm، SOX17 التعبير عن endoderm، وPAX6 التعبير عن neuroectoderm; ووجد أن جميع الأحيان غائبة أو معبرا عنها بمستويات منخفضة جدا (البيانات غير مبينة؛ انظر الجدول التكميلي 1 لجميع البادئات). ومع ذلك، تم الكشف عن بعض SIX1/EYA1+ placode (البيانات غير مبين) التي قد تكون مصدر أنواع الخلايا المتبقية. بالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن أن أنواع الخلايا المتبقية هي مشتقات NCC التي تم تمييزها بالفعل. تم تقييم رمز HOX للNCCs في هذه المرحلة(الشكل 2E). ومع ذلك، في هذه المرحلة المبكرة كانت إشارات HOX منخفضة جداً (لاحظ المقياس)، مما يشير إلى أن هذه NCCs كانت إما من حرف الجمجمة NC أو لم تعتمد أي حرف SUBType NCC حتى الآن.

في اليوم 10 يمكن تنقية NCCs باستخدام FACS ، والتي أسفرت عن حوالي 80 ٪ CD49D+ NCCs(الشكل 2D). ومن الأمثلة على استراتيجية الجاتينغ النموذجية في الشكل 2D. بعد الفرز ، تم تجميع الخلايا كـ NC spheroids(الشكل 3A). لتوسيع NCCs والحث على الجذع NC مثل الخصائص، تم التعامل مع الخلايا مع مزيج من FGF2 وCHIR. اختبرنا إذا الفرز لCD49D+ السكان أسفرت عن ثقافات أفضل أو أنقى من symNs في وقت لاحق. يقارن الشكل 3B غير مصنف مقابل CD49D+ مرتبة مقابل CD49D- مجموعات الخلايا المصنفة. على اليسار، يمكن أن نرى أن الإيجابية فرزها والسكان غير المصنفة جعلت NC spheroids بطريقة مماثلة، في حين أن الخلايا السلبية فرزلم تجميع ها هو صحيح، لم يجعل مستديرة، على نحو سلس، صحية يبحث spheroids وتوفي في غضون 3-4 أيام. وعلاوة على ذلك، عندما تمت مقارنة الخلايا الخارقة NC في اليوم 14 عبر qRT-PCR لعلامات السلف NC وsymN، لا يمكن الكشف عن اختلافات كبيرة بين الخلايا المصنفة وغير المصنفة. بشكل ملحوظ ، في هذه المرحلة كان التعبير عن علامات السلف المتعاطفة لا يزال منخفضًا وظلت مستويات SOX10 عالية ، مما يشير إلى أن السفيرويدات كانت لا تزال تتكون من خلايا ذات خصائص NC. بعد يوم واحد من الطلاء (اليوم 15) ، سواء غير مصنفة وCD49D+ spheroids تعلق بشكل جيد على الأطباق PO / LM / FN ويمكن ملاحظة بوضوح على نمو neurite(الشكل 3B، D15 والشكل 3C، D29). تم نقل الثقافات غير المصنفة والمصنفة إلى اليوم 35 بالتوازي ، ولكن لم يتم رؤية اختلافات كبيرة (لم تظهر البيانات). وبالتالي، يمكن استنتاج أن خطوة الفرز لم تكن ضرورية لتوليد الـ symNs، وبالتالي فهي خطوة اختيارية في هذا البروتوكول. ومع ذلك، للتمايز أقل كفاءة التي لا تسفر عن 80٪ CD49D+ الخلايا، نوصي إجراء الفرز.

بعد ذلك ، اختبرنا ما إذا كان يمكن الحفاظ على هذه السفية NC دون فقدان هويتها NC(الشكل 3A، الخيار 2). تم استزراع NCCs كspheroids لمدة تصل إلى 2 أسابيع(الشكل 3C). كانت مورفولوجيا اليوم 28 spheroids والخلايا المطلية في اليوم 29 متشابهة بالمقارنة مع اليوم 14 و 15 خلية في الخيار 1. في اليوم 28، تم الحفاظ على تعبير SOX10 عند مستويات مماثلة لليوم 14. ومع ذلك ، فإن التعبير عن علامات السلف المتعاطفة المبكرة (أي ASCL1 و PHOX2B و GATA3) زاد(الشكل 3C، يمين) ، مما يشير إلى أن الثقافة الممتدة في FGF2 و WNT و إشارات RA أدت إلى النضج والخلفية(الشكل 4C و F). وقد سبق أن أبلغ كيرينو وآخرونعنآثار مماثلة.

بعد توسع NC (الخيار 1 أو الخيار 2) ، تم مطلي السبريويدعلى الأطباق المغلفة PO / LM / FN وزودت بعوامل عصبية متعددة لتنضج symNs(الشكل 4A). في اليوم 20 و 35 (أسبوع واحد بعد الطلاء في الخيار 1 و 2، على التوالي)، لوحظ تشعبات في نمط شعاعي يمتد من spheroids المرفقة(الشكل 4A،إلى اليمين). وعلاوة على ذلك، تم التعبير عن علامات تتعلق بتركيب النورادرينالين (NE) والنقل (أي TH، AAAD، DBH)(الشكل 4B). تم فحص وجود أنواع الخلايا الملوثة هنا مرة أخرى ، وتم العثور على تعبير ChAT ، الذي يمكن أن يشير إلى الخلايا العصبية شبه المتعاطفة (الشكل 4B،E). ومع ذلك، يتم التعبير عن ChAT أيضا في symNs الكوليني. تم الكشف عن مستويات منخفضة جدا من كبار الشخصيات ، علامة أخرى شبه متعاطفة ( البيانات غير مبينة). وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن مستويات منخفضة من BRN3A، ISL1، وRUNX1(الشكل 4B،E)،والتي يمكن أن تشير إما الخلايا العصبية الحسية أو الخلايا العصبية ثلاثية التوائم، أي مشتقات placode. تم الكشف عن الحد الأدنى من EDNRB (وضع علامات على الخلايا العصبية المعوية) وOLIG2 (وضع علامات على الخلايا العصبية الحركية) (لم تظهر البيانات). ولا تزال هوية الخلايا غير العصبية غير واضحة. ومع ذلك، استنادا ً إلى نتائج بروتوكول symN السابق23،كانت على الأرجح αSMA+ الخلايا الليفية. تم إعادة فحص التعبير عن جينات HOX، ووجد أنه تم التعبير عن HOX5-9، مما يشير إلى هوية الجذع. HOX10 (يدل على sacral-NC) لم يتم التعبير عنها(الشكل 4C، F). وأخيرا، تم التعبير عن علامات ناضجة، بما في ذلك مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية (CHRNA3/4) ومستقبلات NE ذات الصلة، بما في ذلك مستقبلات الأدريني (ADRA2A/B2) الناقل NE (NET، SCL6A2)، والناقل الحويصلة (VMAT1)(الشكل 4D،G). لم يتم العثور على فرق كبير في التعبير عن هذه الجينات في الخلايا التي تم اشتقاقها مع الخيار 2 بالمقارنة مع الخيار 1(الشكل 4E-G).

وأكدنا كذلك نتائجنا من خلال تنفيذ هذا البروتوكول على H9-PHOX2B:GFP خط مراسل(الشكل 5). بحلول اليوم 20 ، شكلت الخلايا حديقة كثيفة من الخلايا العصبية وتجميعها في مجموعات من كثافة أعلى ، مما يشير إلى كفاءة تمايز عالية جدًا(الشكل 5A، الصف العلوي). وأظهر تلطيخ أن معظم symNs تتجمع في تلك المجموعات، مما جعل تقييم وقياس كفاءة التمايز العام أمرا صعبا. لتسليط الضوء على تلطيخ وتوطين علامات symN محددة، ركزنا على المناطق الأقل كثافة على مشارف الكتل (انظر مربع أصفر في الشكل 5A،والحق). وكان هذا هو أيضا حيث توجد معظم الخلايا الملوثة، لذلك لم يكن مجالا جيدا للحكم على الكفاءة العامة. ومع ذلك، علامات symN نموذجية. بما في ذلك الأطراف (PRPH) ، ASCL1 ، TH ، PHOX2B ، TUJ1 (عموم العصبية) ، DBH ، وNET1 (معبرا عنها في النقاط على طول الهيئات symN ومحاور عصبية ، الشكل 5A، أسفل) ؛ تم الكشف عنها. تم استخدام نهج صفيف متعدد الأقطاب (MEA) لقياس النشاط الكهربائي ، ووجد في ذلك اليوم 20 symNs أطلقت في حوالي 3-5 المسامير في الثانية مقارنة مع السيطرة السلبية من hPSCs غير متمايزة(الشكل 5B). من المهم أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي في البئر من أجل كل قطب كهربائي (النقاط السوداء في الشكل 5B، حقل مشرق) لتسجيل بشكل صحيح. كما تم تحفيز اليوم 20 إلى اليوم 30 symNs مع 1 ميكرومتر النيكوتين، الذي يقلد الإشارات قبل الغانغليونية من symNs في الجسم الحي وزيادة متوسط معدل إطلاق النار في الخلايا. كما تم قياس تثبيط الخلايا العصبية. α2-مستقبلات adrenergic (ADRB2), تقع على محطات محاور symN, يخلق حلقة ردود فعل إيجابية لإفراز NE29. علاج symNs مع 1 ميكرون بروبرانولول (خصم مستقبلات الأدينرجية α2) منعت نشاطها(الشكل 5C،والحق). تشير هذه النتائج إلى أن symNs التي تم إنشاؤها بواسطة هذا البروتوكول كانت نشطة وظيفياً.

Figure 1
الشكل 1: التوضيح التخطيطي والمقارنة بين بروتوكولات التمايز symN. (أ)البروتوكول السابق لزيلتنر وآخرون23. (ب)بروتوكول الأمثل. الخيار 1 هو 20 يوما طويلة ويحتوي على 4 أيام فقط من ثقافة NC spheroid. الخيار 2 هو 35 يوما طويلة ويحتوي على 2 أسبوع NC مرحلة التوسع السفية التي تسمح بإنتاج المزيد من خلايا NC. VTN = vitronectin, PO = بولي-L-ornithine, LM = الصفيحة, FN = fibronectin, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = حمض الشبكية، AA = حمض الأسكوربيك, NFs = NGF+BDNF+GDNF. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التعريفي NC. (أ)الجدول الزمني والعلاجات لNC التعريفي من اليوم 0 إلى اليوم 10. (ب)تم رصد مورفولوجيا وتشكيل سلاسل NC كل 2 أيام عن طريق المجهر الميداني الساطع. الخلايا في كل نقطة زمنية بعد يوم 2 كانت ملطخة بـ AP2A (أحمر) وSOX10 (أخضر). جميع الصور المناعية الفلورية كانت مضادة مع DAPI. تشير الأسهم الحمراء إلى هياكل التلال. (C)تحليل qRT-PCR لملف تعريف التعبير لعلامات NC من اليوم 2-10. (D)مؤامرة تمثيلية لفرز FACS في اليوم 10 لـ CD49D+ NC (يسار). يشار إلى استراتيجية نموذجية للجاتينغ والتحكم في النمط الإيزوتايب في المؤامرات الأربع الأولى. كما تم إجراء قياس النسبة المئوية لـ CD49D+ خلية في اليوم 10. (E)تحليل qRT-PCR لصورة التعبير لجينات HOX من اليوم 2-10. NC = قمة العصبية. وتنبع أشرطة الخطأ من بيانات التكرارات البيولوجية n ≥ 3، التي تعرف بأنها تجارب تمايز مستقلة تتم في أيام منفصلة عن ثقافات PSC التي كانت منفصلة عن واحدة على الأقل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صيانة القمة العصبية والتوسع. (أ)الجدول الزمني والعلاجات لتوسيع NC خلال اليوم 10 إلى اليوم 14 ثقافة للخيار 1 أو اليوم 10 إلى اليوم 28 ثقافة للخيار 2. (ب)تم رصد تشكيل سفيرويد NC بواسطة المجهر الميداني الساطع من اليوم 11 (1 يوم بعد تشكيل كروي) إلى اليوم 14 (أي يوم الطلاء). تم مقارنةمجموعات السكان غير المصنفة وCD49D+و CD49D. كما تظهر الخلايا المطلية في اليوم 15. فشلت الخلايا في تشكيل spheroids بشكل صحيح في CD49D- المجموعة وتوفي بعد الطلاء. تم فحص خلايا اليوم 14 من خلال تحليل qRT-PCR (يمين) للملف الجانبي للتعبير عن السلف symN. تمت مقارنة السكان غير المصنفين وCD49D+ (n ≥ 3). (C)يمكن الحفاظ على السفيودات الوطنية لمدة تصل إلى 2 أسابيع. تم رصد السفيرويدات عن طريق المجهر الميداني الساطع من اليوم 15 إلى اليوم 28 (يوم الهبوط). كما تظهر الخلايا المطلية في اليوم 29. تم فحص السفيرويدات اليوم 28 من قبل تحليل qRT-PCR لملامح التعبير من السلف symN (يمين). تم تجميع مجموعات غير مصنفة وCD49D+ السكان (n ≥ 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تمايز SymN والنضج. (أ)الجدول الزمني والعلاجات بعد الطلاء في اليوم 14 للخيار 1 أو اليوم 28 للخيار 2. صور المجهر حقل مشرق (يمين) تظهر symNs في اليوم 20 واليوم 35، على التوالي (1 بعد أسبوع من الطلاء لكلا الخيارين). -د) تحليل الخيار 1 qRT-PCR لملف تعريف التعبير لخصائص symN بين الأيام 20-30. تم تجميع مجموعات غير مصنفة وCD49D+ . (E-G) تحليل الخيار 2 qRT-PCR لملف تعريف التعبير لخصائص symN بعد اليوم 35. تم تجميع مجموعات غير مصنفة وCD49D+ السكان (n ≥ 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: التوصيف الوظيفي للسمنونات. (A،الصف العلوي) صورة حقل مشرق من مجموعات symN في اليوم 20 وصورة ملونة تظهر PRPH وTH خلايا إيجابية مزدوجة تقع في الغالب في المجموعات. (أ،أسفل) تم التحقق من علامات symN المتعددة (القنوات المنفصلة) عن طريق تلطيخ الفلور المناعي في اليوم 20. كان الناقل النورادرينالين (NET1) يقع على سطح أجسام الخلية وكذلك على طول المحاور وdendrites. ظهرت كنقاط في هذا التكبير. جميع الصور المناعية الفلورية كانت مضادة مع DAPI. (ب)خرائط الحرارة التمثيلية لتحليل صفيف الأقطاب المتعددة (MEA) لsymNs في اليوم 20 (أعلى). تُظهر الصورة الميدانية الساطعة (أسفل) كثافة السمنون وتوزيع الأقطاب الكهربائية (ثماني نقاط سوداء). تم تجميع مجموعات غير مصنفة وCD49D+ السكانية هنا. (C)القياس الكمي لمتوسط معدلات إطلاق النار لليوم 20-30 symNs تحت علاجات 1 ميكرومتر النيكوتين و1 ميكرومتر بروبرانولول لمدة 5 دقيقة، على التوالي (يمين). تم تجميع النتائج من السكان غير المصنفين وCD49d إيجابية (ن ≥ 3). غير مقترنة، اثنين من الذيل تي اختبار مع تصحيح ويلش، ف القيمة:*<0.05. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: مثال على الخلايا في ظل ظروف غير ملائمة للمضي قدما في التمايز. (أ)الجدول الزمني للتمايز مع كل نقطة تفتيش لمورفولوجيا الخلية المشار إليه كما هو الحال في B-E. (ب)hPSCs (أ) مع مستعمرات صحية والكثير من الخلايا المتمايزة، و (ب) دمج وتمييز الحدود بين بعض المستعمرات في اليوم 0. تشير الأسهم الحمراء إلى المناطق المدمجة. (C)NCCs في اليوم 10 مع بثور تشبه الفقاعة في التلال. تشير الأسهم الحمراء إلى البثور في الصف العلوي. الصف السفلي يمثل تكبير أعلى. لم نتمكن من تحديد هوية الخلية للبثور. ومع ذلك ، يبدو أن وجود المزيد من البثور يرتبط مع تعبير SOX10/CD49D أقل. (D)السبّان غير المنتظم الذي يفتقر إلى الحواف الناعمة والشكل المستدير في اليوم 14. (E)symNs غير صحية وينغ في اليوم 20. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لقد نشرنا مؤخرا استعراضين، واحد مناقشة استخدام symNs المشتقة من hPSC لنمذجة المرض31، فضلا عن مقارنة متعمقة من بروتوكولات التمايز المتاحة22. وهكذا، هنا نركز على استكشاف الأخطاء وإصلاحها البروتوكول الحالي لمساعدة الباحث المهتم على النجاح في صنع symNs. خلال عملية التمايز بأكملها ، من أجل الحصول على بيانات متسقة وكذلك خلايا متمايزة صحية ، يجب التحكم بعناية في التلوث في جميع المراحل. في الصيانة الروتينية hPSC، يجب إجراء اختبار الميكوبلازما كل أسبوعين أو شهري. إذا تم إجراء فرز الخلايا في اليوم 10 ، يتم تشجيع إضافة المضادات الحيوية إلى أي وسيلة. من المهم أيضًا التحقق من مورفولوجيا الخلية قبل وبعد بدء التمايز. هنا ، نقترح عدة نقاط تفتيش حرجة(الشكل 6A). أولاً، يجب أن يكون لمستعمرات hPSC المثالية الجاهزة للتمايز حواف مشرقة وناعمة مع مسامير صغيرة. وقد بدأت المستعمرات مع المسامير مثل العتاد للتمييز وينبغي عدم استخدامها. يوصى بشدة باستخدام الخلايا في النقطة الزمنية المثالية على الفور ، لأن المورفولوجيا يمكن أن تتغير في غضون ساعات. تأجيل ليوم واحد فقط قد تحطم الخلايا(الشكل 6B، أ)أو يؤدي إلى الاتصال بين المستعمرات(الشكل 6B، ب)،مما يحفز التمايز في hPSCs. من الصعب التخلص من كل خلية متمايزة في الثقافة ، ومع ذلك يجب التحكم في السكان لاحتواء أقل من 5٪ من المستعمرات السيئة. عند اتباع هذا البروتوكول، تكون نقطة الاختيار الثانية أثناء التمايز بين اليوم 2 واليوم 10. في هذه المرحلة ، يجب ملاحظة التلال NC الداكنة بوضوح تحت مجهر حقل مشرق(الشكل 2C). ويمكن استخدام سمك وتوزيع التلال كمؤشرات لكفاءة الـ NC: لأن الNCCs مشتقة بشكل رئيسي من الخلايا التي تشكل التلال، فإن التلال والبثور الرقيقة أو الأقل انتشاراً في التلال قد تشير إلى انخفاض إنتاج NC، وبالتالي ينبغي وضع علامة عليها أو التخلص منها في حالة النتائج غير المتسقة(الشكل 6C). يوصى بشدة بأخذ عينات الحمض النووي الريبي في اليوم 10 للتحقق من علامات NC المذكورة أعلاه. نقطة التفتيش الثالثة أثناء مرحلة nc spheroid، لأن spheroids قد تجميع. فمن الأفضل لpipet دوريا المتوسطة لتفريق وإعادة تعليق التجميع (لن يتم تفريق الخلايا مرة أخرى إلى خلايا واحدة ولكن spheroids الصغيرة فقط). إذا توسعت السفيرويدات بسرعة كبيرة، قم بتقسيمها بمقدار 1:2 أو 1:4 لتترك مساحة كافية ومغذيات للخلايا لتنمو. إذا لم يكن لدى spheroids أشكال سلسة ومستديرة(الشكل 6D)، فقد يشير إلى أن كفاءة NC في اليوم 10 لم تكن عالية بما فيه الكفاية ، وبالتالي قد تدمر التمايز النهائي. يوصى باختبار ملفات تعريف التعبير للتحقق من خصائص السلف symN في يوم الطلاء الكروي المطلوب. نقطة التفتيش الرابعة هي بعد طلاء spheroids. يجب أن تكون Neurites مرئية بوضوح ويجب أن تبدأ الحزم في التشكل بعد اليوم 20. وينبغي اعتبار الخلايا التي لا تحتوي على نتريت وباقات واسعة الانتشار تلوثاً(الشكل 6E). عند هذه النقطة، من المهم لتغذية الخلايا العصبية عن طريق استبدال فقط نصف الوسط الحالي للحفاظ على البيئة المغذية التي أنشأتها الخلايا العصبية مستقرة. كن حذرا عند تغذية الخلايا، لأن symNs النضج ية عرضة للخطر ويمكن فصل بسهولة. السبب في كل من الأشكال سيئة المظهر الموصوفة هنا ليست مفهومة تماما حتى الآن. ومع ذلك، فإنه يقدم نظرة ثاقبة للطبيعة الحساسة للمراكز المنسقة للبيئة والتمايز المختبري. وقد يعزى أحد مصادر هذه المخالفات إلى الكواشف من بائعين مختلفين. على سبيل المثال ، تظهر التلال الرقيقة مع بثور عند استخدام علامة تجارية مختلفة من BMP4.

للتحليل الكهروفيزيفباستخدام MEA ، من أجل توزيع symNs بالتساوي في آبار القطب ، يتم فصل السفيرويدات بواسطة Accutase. يجب أن يكون وقت العلاج 20 دقيقة لتبدأ. ومع ذلك ، لأن السفيرويدات مضغوطة للغاية ، يمكن زيادة وقت الانفصام إلى 45 دقيقة لضمان انفصال السفيرويدات تمامًا. بشكل عام ، يجب تشغيل كل مجموعة تجريبية على لوحة MEA بمضاعفات لا تقل عن ستة للحصول على نتائج متسقة. وتجدر الإشارة إلى أن كثافتنا لإعادة الطلاء أقل بكثير من توصيات الشركة المصنعة32 (حوالي 500-700,000/cm2)، فإن تكرار البئر أمر بالغ الأهمية. في نتائجنا، كل من تعبير علامة symN كبيرة والنشاط المستقر تظهر من اليوم 20 إلى اليوم 30. نوصي بهذا كأفضل نقطة زمنية لبدء تسجيل المتغيرات المفضلة. لكل تمايز ، يجب جعل الوسط طازجًا واستخدامه في أسرع وقت ممكن (لا يزيد عن شهر واحد).

بروتوكول التمايز symN المعروض هنا هو خالية من التغذية، محددة كيميائيا، فعالة، قابلة للتوسيع، وتسفر symNs وظيفية بحلول اليوم 20. يمكن استخدام بروتوكول التمايز symN المحدد هذا لدراسة الاضطرابات البشرية في الجهاز العصبي المتعاطف ، كمنصة لفحص الدواء ، لدراسات تكوين الورم مثل الورم الأرومي العصبي / الورم الفيوكروموسيتوم ، أو للأبحاث الأساسية في التنظيم المثلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر هايدي أولريش على القراءة النقدية وتحرير المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13, (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30, (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6, (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23, (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76, (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18, (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244, (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139, (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57, (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75, (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399, (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135, (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277, (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19, (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8, (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50, (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22, (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49, (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531, (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21, (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89, (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49, (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29, (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
تمايز فعال من الخلايا العصبية المتعاطفة Postganglionic باستخدام الخلايا الجذعية البشرية المتعددة القدرات تحت ظروف الثقافة خالية من التغذية والمحددة كيميائيا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter