Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas

doi: 10.3791/60843 Published: May 24, 2020

Summary

Neste protocolo, descrevemos uma estratégia de diferenciação estável e altamente eficiente para a geração de neurônios simpáticos pós-ganglionários a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este modelo disponibilizará neurônios para o uso de estudos de múltiplos distúrbios autônomos.

Abstract

As células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) tornaram-se uma poderosa ferramenta para a modelagem de doenças e o estudo do desenvolvimento embrionário humano in vitro. Anteriormente, apresentamos um protocolo de diferenciação para a derivação de neurônios autônomos com caráter simpático que tem sido aplicado a pacientes com neuropatia autônoma. No entanto, o protocolo foi construído sobre a Substituição de Soro Knock Out (KSR) e as condições de cultura baseadas em alimentadores, e para garantir alta eficiência de diferenciação, a classificação celular era necessária. Esses fatores causam alta variabilidade, alto custo e baixa reprodutibilidade. Além disso, não foram verificadas propriedades simpáticas maduras, incluindo a atividade elétrica. Aqui, apresentamos um protocolo otimizado onde a cultura e a diferenciação do PSC são realizadas em condições culturais livres de alimentadores e quimicamente definidas. Marcadores genéticos que identificam a crista neural do tronco são identificados. Outra diferenciação em neurônios simpáticos pós-ganglionários é alcançada após 20 dias sem a necessidade de classificação celular. A gravação eletrofisiológica mostra ainda a identidade funcional do neurônio. O disparo detectado a partir de nossos neurônios diferenciados pode ser aprimorado pela nicotina e suprimido pelo antagonista do receptor adrenérgico propranolol. Progenitores neurais simpáticos intermediários neste protocolo podem ser mantidos como esferóides neurais por até 2 semanas, o que permite a expansão das culturas. Em suma, nosso protocolo de diferenciação de neurônios simpáticos atualizados mostra alta eficiência de diferenciação, melhor reprodutibilidade, mais flexibilidade e melhor maturação neural em comparação com a versão anterior. Este protocolo fornecerá aos pesquisadores as células necessárias para estudar os distúrbios humanos que afetam o sistema nervoso autônomo.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Os neurônios simpáticos pós-ganglionários (simetrias) pertencem ao sistema nervoso autônomo (ANS) e têm múltiplos papéis importantes na resposta e regulação da homeostase do corpo independente da consciência. Por exemplo, o estresse estimula as simetrias e evoca a resposta de luta ou fuga que leva a um aumento na freqüência cardíaca, pressão arterial e sudorese. As SymNs são afetadas em múltiplas doenças humanas devido à genética, toxicidade/lesão, ou como acompanhantes de outras doenças. Um exemplo de neuropatia genética é o transtorno familiar Disautonomia (DF), onde uma grave desregulação de symNs causa crise disautônoma, evidente por sudorese, mancha da pele, ataques de vômito, hipertensão e ansiedade1. Um exemplo de toxicidade é o tratamento quimioterápico, que tem sido relatado ter efeitos colaterais tóxicos nos neurônios autônomos2. Sabe-se que a denervação autônoma e a hiper-inervação podem tanto levar, ou acompanhar, doenças como a doença de Parkinson ou a doença renal hipertensiva3,4. Assim, poder realizar pesquisas e entender os mecanismos da biologia symN e defeitos no contexto da doença é benéfico para a busca de tratamentos novos e eficazes.

Anatomia
O sistema nervoso periférico se ramifica em divisões sensoriais e autônomas. Os nervos afetuosos do sistema nervoso sensorial são responsáveis pela sensação de dor e tato, enquanto a ANS é responsável por repassar informações de todos os órgãos para o cérebro. A ANS é dividida no sistema nervoso entérico, interiorizando o trato gastrointestinal, o sistema nervoso parassimpático, importante para o relaxamento, e o sistema nervoso simpático (SNS), importante para ativação/regulação dos órgãos. O SNS adapta um sistema de dois neurônios5. Axônios neurais simpáticos pré-ganglionic na medula espinhal primeiro projetam os gânglios simpáticos, onde os corpos de células símn pós-ganglionárias estão localizados. Esses neurônios então enviam projeções longas para inervar os tecidos alvo de cada órgão do corpo. Os sinais transmitidos por neurônios pré-ganglionics são colinérgicos, enquanto as símns pós-ganglionárias são adrenérgicas e, portanto, expressam a norepinefrina (NE) como seu principal neurotransmissor. Há poucas exceções notáveis de neurônios pós-ganglionários e simpáticos que são colinérgicos, incluindo os que inervam os vasos sanguíneos. Os neurônios pós-ganglionários adrenérgicos expressam as enzimas tyrosine hydroxylase (TH), aromático L-aminoácido decarboxylase (AAAD), dopamina β-hidroxilase (DBH) e monoamina oxidase (MAO-A), todas responsáveis pela geração e metabolização do NE. Além disso, expressam os transportadores de reciclagem ne e/ou receptores α-adrenérgicos receptor (ADRA2), receptor β-adrenérgico (ADR2B), transportador de norepinefrina (NET1) e transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).

Desenvolvimento
Durante o desenvolvimento embrionário, as simens são derivadas da crista neural (NC), que emerge entre o tubo neural e o ectoderme de sobreposição6, e pode se diferenciar em múltiplas linhagens celulares, incluindo melanócitos, osteoblastos, adiócitos, glia, neurônios entéricos, neurônios sensoriais e neurônios autônomos7. Células de crista neural (NCCs) são células altamente migratórias que tomam várias rotas através do embrião. Nesta fase inicial do desenvolvimento do NC, as células expressam os marcadores SNAIL1/2, FOXD3 e SOX108,9,10,11. A rota de migração, juntamente com o local axial que eles adotam, determina o subtipo NC no qual eles se desenvolverão. Esses subtipos NC podem ser distinguidos por sua expressão genética hox específica: NCCs cranianos não expressam genes HOX, NCCs vagal expressam HOX 1-5, NCCs tronco expressam HOX 6-9, e NCCs sacral expressam HOX 10-1112. Entre eles, os NCCs tronco são reconhecidos como a principal fonte de symNs. Os precursores do SymN expressam o fator de transcrição MASH1/ASCL113, que promove a expressão de PHOX2B14 e INSM115. A família GATA de fatores de transcrição é expressa durante o desenvolvimento solidário tardio. GATA2 e GATA3 são expressos nos symNs, que por sua vez ativa o DBH16. O fator de transcrição HAND2 também é importante para a expressão e manutenção do DBH e th17.

Os HPSCs (por exemplo, células-tronco pluripotentes embrionárias e induzidas) são uma poderosa ferramenta18 para recapitular paradigmas de desenvolvimento e gerar simns que podem ser empregados para a modelagem de doenças de vários distúrbios humanos. Assim, ao gerar symNs a partir de hPSCs, é fundamental seguir as diretrizes de desenvolvimento e avaliar a expressão de marcadores apropriados ao longo do processo de diferenciação.

Protocolo symN anterior
Poucos grupos de pesquisa relataram anteriormente a geração de symNs a partir de hPSCs19,20,21. A comparação direta desses protocolos entre si e com o nosso foi revisada recentemente22. Em 201623, publicamos um protocolo de diferenciação para a geração de neurônios autônomos com caráter symN (Figura 1A). Este protocolo utilizou o meio baseado em KSR, que foi utilizado tanto na manutenção de hPSCs indiferenciados quanto na diferenciação celular. Além disso, os hPSCs foram mantidos em fibroblastos embrionários de camundongos (células alimentadoras de MEF). Utilizamos este protocolo e PSCs de pacientes com DF para modelar o transtorno23. Em 2019, descrevemos uma versão mais detalhada deste protocolo mais antigo24. Em resumo, o destino neural foi induzido pela inibição SMAD25 para bloquear a sinalização TGF-β e BMP nos primeiros 2 dias. A ativação wnt usando CHIR99021 promoveu progenitores neurais para se tornarem células NC. No dia 11, as células foram classificadas pelo FACS para as populações CD49D+ ou SOX10+ 26,23, que produziram cerca de 40% de eficiência de geração nc. Assim, a classificação foi necessária para garantir a eficiência e pureza para os próximos passos de diferenciação. Os NCCs foram mantidos e amplificados como esferóides com o tratamento combinado de FGF2 e CHIR. Após 4 dias, os esferóides NC de manutenção foram banhados e deram BDNF, GDNF e NGF para terminar a maturação symN. Embora esses simns expressem fortes marcadores de simegos como ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, os marcadores para simns mais maduros, incluindo a expressão do receptor de acetilcolina nicotínica (CHRNA3/CHRNB4) e transportador de vesícula (VMAT1/2), foram baixos mesmo após 70 dias de diferenciação. Os genes HOX neste protocolo não foram formalmente testados, e as propriedades neurais maduras, incluindo a atividade eletrofisiológica das células, não foram verificadas.

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para gerar symNs(Figura 1B). Os HPSCs são mantidos em condições livres de alimentadores, em pratos revestidos de vitronectina (VTN), utilizando a mídia Essential 8 (E8)27. A fórmula dos meios de diferenciação tem sido modificada a cada etapa, aumentando assim o percentual da população nc28. A maturação symN pode ser feita em populações de NCC cd49D+/SOX10+ classificadas ou não classificadas em massa. Ambos mostram altos níveis de expressão de marcador symN até o dia 30. Além disso, os symNs gerados com este protocolo respondem ao registro eletrofisiológico e aos tratamentos com ativos e compostos inibidores symN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NOTA: A linha de repórteres H9 PHOX2B:GFP foi fornecida por Oh et al.19. Alguns primers qPCR utilizados neste artigo foram obtidos da OriGene Technologies, enquanto algumas seqüências são obtidas a partir de Frith et al.20,30.

1. Configuração para revestimento de pratos, preparação de mídia e manutenção de hPSC

  1. Revestimento de pratos
    1. Revestimento de Vitronectina (VTN)
      1. Coloque frascos de VTN em um banho de água de 37 °C até descongelamento total e misture bem.
      2. Para uma placa de Petri de 100 mm, misture 7 mL de 1x de solução salina tamponada de fosfato (PBS) com 0,5 mg/mL VTN, adicione a solução VTN ao prato e incuba r$ 1 h.
    2. Revestimento da matriz da membrana do porão
      1. Descongele frascos da matriz de membrana do porão (ver Tabela de Materiais) no gelo a 4 °C durante a noite.
      2. Para um poço de uma placa de 6 poços, misture 2 mL de DMEM/F12 com 20 μL de matriz de membrana de porão de 100x, adicione a solução de matriz de membrana do porão ao prato, enrole o prato com filme de parafina e armazene em um recipiente limpo a 4 °C durante a noite. Trabalhe o mais rápido possível. Os pratos revestidos podem ser armazenados em 4 °C por até 2 semanas.
    3. Revestimento poliornino (PO)/laminin (LM)/fibronectina (FN)
      1. No primeiro dia, para um poço de 24 bem, misture 15 μg/mL de PO com 1 mL de 1x PBS, incubar a 37 °C, 5% CO2 durante a noite. Descongele tanto LM quanto FN a -20 °C durante a noite e armazene a 4 °C até descongelar totalmente.
      2. No segundo dia, solução PO aspirada, lave os poços 2x com 1x PBS, adicione 1 mL de 1x PBS contendo 2 μg/mL de LM e 2 μg/mL de FN e incubar a 37 °C em 5% DE CO2 durante a noite. Neste ponto o prato com a solução LM/FN pode ser mantido na incubadora por meses, desde que não seque. Adicione mais 1x PBS para evitar que o prato seque.
  2. Preparação da mídia
    1. Prepare o meio Essential 8 (E8) descongelando uma garrafa de suplemento E8 a 4 °C durante a noite. Misture o suplemento com 500 mL de meio E8 e antibióticos, se necessário.
      NOTA: A solução E8 de trabalho deve ser usada dentro de 2 semanas.
    2. Prepare o meio de congelamento hPSC misturando 90 mL de meio E8 completo com 10 mL de DMSO para um volume total de 100 mL. Filtrar.
    3. Prepare o meio de diferenciação dia 0 a dia 1 misturando 100 mL de médio essencial 6 (E6) com 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 e 10 μM Y27632 para um volume total de 100 mL.
    4. Prepare o meio de diferenciação do dia 2 ao dia 10 misturando 100 mL de Médio E6 com 10 μM SB e 0,75 μM CHIR99021 para um volume total de 100 mL.
    5. Prepare o dia 10 ao dia 14 meio esferoide misturando meio neurobasal com 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM L-Glutamate, 3 μM CHIR99021 e 10 ng/mL FGF2 para um volume total de 100 mL.
    6. Prepare o dia 14 ao dia 28 médio para manutenção de longo prazo esferoide adicionando 0,5 μM de RA fresco para o dia 10 a dia 14 meio esferóide para cada alimentação.
      NOTA: Mantenha sempre a RA a -80 °C.
    7. Prepare o meio de maturação SymN misturando meio neurobasal com 2 mL de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM L-glutamato, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM de ácido ascórbico e 0,2 mM dbcAMP para um volume total de 100 mL. A solução deve ser usada dentro de 2 semanas. Antes de cada alimentação, adicione 0,125 μM de RA fresco. Esta solução é utilizada a partir do dia 14 (opção 1) ou dia 28 (opção 2).
    8. Prepare o tampão FACS misturando DMEM com 2% de FBS, 2 mM L-glutamato e antibióticos, se necessário, para um volume total de 100 mL.
  3. manutenção hPSC
    1. Descongelamento e manutenção de hPSCs
      1. Prepare um prato de 100 mm revestido de VTN.
      2. Para descongelar um frasco de hPSCs diretamente do nitrogênio líquido, coloque o frasco em um banho de água de 37 °C, balançando cuidadosamente o tubo na água até que ele descongele. Transfira os hPSCs descongelados para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de 1x PBS, e centrífuga a 200 x g por 4 min.
      3. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de meio E8 ao tubo. Pipeta algumas vezes para resuspender totalmente a pelota e, em seguida, adicionar outros 9 mL de meio E8 para atingir o total de 10 mL.
      4. Aspirar a solução VTN do prato de 100 mm.
      5. Transfira os hPSCs para um prato de 100 mm, agite suavemente (para cima e para a esquerda-direita, não em círculos) para garantir que as células sejam distribuídas uniformemente no prato
      6. Incubar a 37 °C, em 5% de CO2.
      7. No dia seguinte, aspirar todos os meios e alimentação com 10 mL de E8.
      8. Alimente-se todos os dias durante os próximos 3-4 dias e, em seguida, prepare-se para dividir.
    2. Divisão de hPSCs
      NOTA: os hPSCs no ponto de divisão devem ser de 80% a 90% de confluentes. Grandes colônias com bordas lisas e brilhantes devem ser observadas. No entanto, o contato entre cada colônia deve ser evitado (Figura 2B,dia 0 e Figura 6B).
      1. Prepare pratos de 100 mm revestidos com VTN, conforme necessário.
      2. Apire o E8 e lave o prato que precisa ser dividido em 1x com 1x PBS.
      3. Apirate o 1x PBS e adicione 4 mL de 0,25 M EDTA. Incubar por 2 min a 37 °C, 5% CO2.
        NOTA: Os hPSCs devem ser divididos/rebobinados como pequenas colônias. Não trate com EDTA mais de 2 minutos para evitar a separação em células únicas. As células devem ser ainda anexadas à superfície do prato após o tratamento de 2 min.
      4. Apiratee o EDTA, desconecte as colônias com 10 mL de meio E8 na superfície do prato, e colete todos os meios e células em um tubo de 15 mL.
      5. Com hPSCs a 80%-90% de confluência, dividiu colônias por 1:15-1:20. Por exemplo, para dividir os hPSCs por 1:20 em um prato de 100 mm, pegue 500 μL de solução E8/hPSCs e misture com 9,5 mL de meio E8 fresco.
      6. Placa hPSCs em pratos de 100 mm revestidos com VTN.
        NOTA: É aconselhável estabelecer a razão de divisão ideal para cada pesquisador e linha celular de forma independente.
    3. Congelamento de hPSCs
      1. Para um prato de 100 mm de hPSCs que está pronto para ser dividido, prepare três crioviais e 3,5 mL de meio de congelamento.
        NOTA: A mídia e os frascos devem ser mantidos em 4 °C ou no gelo até o uso.
      2. Aspirar E8 e lavar o prato 2x com 1x PBS.
      3. Aspirar 1x PBS e adicionar 4 mL de 0,25 M EDTA, incubar por 2 min a 37 °C, em 5% de CO2.
        NOTA: os hPSCs devem ser congelados como pequenas colônias no momento em que seriam divididos. Não trate as células com EDTA por mais de 2 minutos para evitar a separação em células individuais. As células devem ser fixadas na superfície do prato após o tratamento de 2 min.
      4. Aspire o EDTA, desconecte as colônias com 10 mL de 1x PBS na superfície do prato, e colete todos os meios e células em um tubo de 50 mL.
      5. Adicione 20 mL de 1x PBS e centrífuga a 200 x g por 4 min para lavar o EDTA restante.
      6. Descarte o sobrenadante e resuspenda a pelota em 3 mL de meio de congelamento.
      7. Distribua hPSCs uniformemente nos três crioviais, 1 mL cada.
      8. Armazene a -80 °C durante a noite em uma caixa de congelamento controlada ou um sanduíche de isopor para garantir uma queda de temperatura lenta e, em seguida, transfira para um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.

2. Semeamento de hPSCs para iniciar a diferenciação (dia 0)

NOTA: os hPSCs devem estar prontos para diferenciação após serem estabilizados (ou seja, sendo divididos 2-3x após o descongelamento). Certifique-se de que as colônias são saudáveis, com bordas lisas e brilhantes e diferenciação mínima(Figura 2B).

  1. Prepare os pratos revestidos de matriz de membrana do porão (24 pratos de poço ou 6 bem) um dia antes do dia 0, conforme necessário. Leve os pratos para RT no início da diferenciação.
  2. Faça o dia 0-1 meio de diferenciação conforme necessário.
  3. Aspirar o E8 do confluente, pronto para dividir hPCSs, e lavar o prato 2x com 1x PBS.
  4. Adicione 7 mL de 0,25 M EDTA por prato de 100 mm, incubar a 37 °C, 5% CO2, por 15 min.
    NOTA: Neste ponto, o tratamento EDTA é prolongado para dispersar-se em células únicas.
  5. Pipet fora de todos os hPSCs (eles devem estar flutuando) e transferir para um tubo de 50 mL. Adicione a mesma quantidade ou mais de 1x PBS como solução EDTA para diluir o EDTA.
  6. Centrífuga a 200 x g por 4 min.
  7. Descarte o sobrenadante, adicione 1 mL do dia 0-1 meio de diferenciação e pipeta para homogeneizar as células. Siga adicionando mais meio e depois misture para diluir a solução celular a uma concentração ideal para contar as células.
    NOTA: Não diluir demais a solução celular. As células de um prato completo de 100 mm devem ser diluídas em 5 mL de meio para iniciar.
  8. Conte o número do celular usando um contador de celular automatizado ou hemocytometer.
  9. Diluir a solução celular conforme necessário para atingir 125.000 células/cm2 em um volume final baixo (por exemplo, 2 mL por poço para um prato de 6 poços ou 500 μL por poço para um prato de 24 poços).
    NOTA: Um volume baixo ajuda as células a se conectarem mais rapidamente.
  10. Atribua toda a solução da matriz de membrana do porão dos pratos revestidos e emplacre a solução celular nos poços.
  11. Incubar a 37 °C, em 5% de CO2.

3. Indução de células da crista neural (dia 1 ao dia 10, Figura 2A)

  1. No dia 1 alimentam as células com o meio de diferenciação do dia 0-1 (3 mL por poço para 6 pratos de poço e 1 mL por poço para 24 pratos de poço).
  2. No dia 2 alimentam as células com o meio de diferenciação dia 2-dia 10 (3 mL por poço para 6 pratos de poço e 1 mL por poço para 24 pratos de poço).
  3. A partir de agora, as células devem ser alimentadas dia não, dia não, até o dia 10 (ou seja, o próximo dia de alimentação será o dia 4).
    NOTA: A partir do dia 6, devem ser detectados cumes NC(Figura 2B). Para verificar se a diferenciação está ocorrendo, é aconselhável levar uma cultura de diferenciação paralela em poços menores (ou seja, 24 poços), que podem ser manchadas para SOX10/AP2a e usadas para expressão genética de marcadores ao longo do tempo de diferenciação(Figura 2B,C).
  4. Se as células de triagem, prossigam para a seção 4. Caso contrário, vá para a seção 5.

4. Classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para marcador de crista neural CD49D e agregação de células NC em esferóides

NOTA: Para a classificação FACS, as amostras devem ser mantidas no gelo e não expostas à luz após a coloração até a triagem.

  1. Prepare o buffer FACS se as células estiverem classificadas.
  2. Prepare o dia 10-14 meio esferóide.
  3. No dia 10, retire o meio e lave 1x com 1x PBS.
  4. Adicione a solução de dissociação (ver Tabela de Materiais) a 2 mL por poço para um prato de 6 poços ou 1 mL por poço para um prato de 24 poços, e incubar a 37 °C, 5% CO2 por 20 min.
  5. Pipet fora de todos os hPSCs e transferir para um tubo de 50 mL.
  6. Encha o resto do tubo com tampão FACS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
    NOTA: Cada tubo de 50 mL pode acomodar até 20 mL ou menos de solução celular. O volume do buffer FACS deve ser alto o suficiente para neutralizar a solução de dissociação.
  7. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com a quantidade apropriada de tampão FACS (~2 mL por poço de uma placa de 6 poços) e conte para determinar o número da célula.
  8. Prepare as seguintes amostras.
    1. Amostra 1 (controle não manchado): 1 x 106 células em 400 μL de tampão FACS. Filtre as células através de uma tampa de filtro de 20 μm e mantenha o tubo no gelo.
    2. Amostra 2 (controle somente DAPI): 1 x 106 células em 400 μL de tampão FACS contendo 0,5 ug/mL DAPI. Filtre as células através de um tubo FACS com uma tampa de coador e mantenha o tubo no gelo.
    3. Amostra 3 (etiquetac49d): Suspender o resto das células com tampão FACS contendo anticorpo CD49D conjugado com PE/Cy7 (5 μL para 1 x 106 células por 100 μL de tampão FACS) em um tubo de 15 mL e incubar no gelo por 20 min.
  9. Encha os tubos com tampão FACS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
  10. Descarte o sobrenadante e resuspenda todas as células 5-10 x 106 em 1 mL de buffer FACS contendo 0,5 ug/mL DAPI de acordo com as instruções do fabricante.
  11. Filtre as células através do tubo FACS com a tampa do coador e mantenha o tubo no gelo.
  12. Preparar tubos FACS de coleta contendo 2 mL de tampão FACS.
  13. Classifique através da máquina FACS com lasers que podem detectar DAPI e PE-Cy7 para isolar a população CD49D+.
  14. Depois de classificar, conte as células classificadas.
  15. Centrifugação todas as células classificadas e resuspender no dia 10-14 meio esferóide para uma concentração final de 0,5 x 106 células por 500 μL de meio.
  16. Placa 0,5 x 106 células por poço em anexo ultra-baixo 24 placas de poço.
  17. Incubar as células a 37 °C, em 5% de CO2.

5. Agregando células NC em esferóides

  1. Se não usar facs para isolar as células NC e, em vez disso, agregá-las diretamente em esferóides, primeiro prepare as células conforme descrito nas etapas 4.2-4.5.
  2. Encha o resto do tubo com 1x PBS e centrífuga a 200 x g por 4 min.
  3. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com uma quantidade apropriada do dia 10-14 meio esferóide (por exemplo, ~2 mL de meio por poço para uma placa de 6 poços) e conte para determinar o número da célula.
  4. Diluir as células no meio esferóide do dia 10-14 para 0,5 x 106 células por 500 μL de meio.
  5. Placa de 500 μL da suspensão celular por poço em fixação ultra-baixa 24 placas de poço.
  6. Incubar as células a 37 °C, em 5% de CO2.

6. Manutenção esferóide NC e indução progenitora simpática (dia 10 ao dia 14, Figura 4A)

  1. Opção 1: Cultura esferóide mínima
    1. No dia 11, adicione 500 μL do dia 10-14 meio esferóide sem aspirar meio existente a partir do dia 10. Incubar a 37 °C, em 5% de CO2.
    2. No dia 12, incline a placa para acumular os esferóides NC em um lado dos poços. Averie cuidadosamente e descarte o máximo de meio possível e alimente-se com 1 mL do dia 10-14 meio esferoide.
    3. Continue alimentando as células todos os dias até o dia 14.
    4. Opcional: Se os esferóides agregarem e gerarem uma grande moita, use uma pipeta para quebrar os aglomerados esferóides. Isso também garante que os esferóides individuais não fique muito grande.
      NOTA: A faixa de tamanho esferóide ideal deve ser em torno de 100-500 μm. Dentro desse intervalo, o tamanho dos esferóides individuais não é crítico. No entanto, a morfologia, como uma borda lisa e clara (Figura 3 e Figura 6) é importante para mais sucesso. No dia 14, cada placa de 24 poços contém idealmente cerca de 50-60 esferóides de diferentes tamanhos dentro da faixa de tamanho acima mencionada.
  2. Opção 2: Cultura esferóide expandida
    1. No dia 15, para manter os esferóides NC, alimente-se com 1,5 mL do dia 10-14 meio esferóide contendo 0,5 μM RA. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: A RA deve ser adicionada fresca para cada alimentação e ser sempre armazenada a -80 °C.
    2. A partir de agora, alimente-se a cada dois dias até o dia 28 e, em seguida, continue com o revestimento dos esferóides (seção 7.1).
      NOTA: Os esferóides em crescimento são divididos aproximadamente 1x por semana, pipetando-os com uma pipeta de 1 mL para separá-los. Eles são divididos em uma proporção aproximada de 1:2-1:4. Dentro do período de expansão de 2 semanas, as células devem quadruplicar em número.

7. Diferenciação e maturação do SymN (Opção 1: após o dia 14; Opção 2: após o dia 28)

  1. Chapeamento esferóides em pratos regulares
    1. Prepare 24 placas de poço revestidas de PO/LM/FM.
    2. Prepare o meio symN contendo 0,125 μM RA (adicionar fresco cada ração) e 10 μM Y27632 (somente dia 14).
    3. No dia 14, incline a placa para acumular esferóides NC em um lado dos poços. Aspirar cuidadosamente e descartar o máximo de meio possível, e alimentar com 1 mL de meio symN.
    4. Remova LM/FN das placas revestidas.
    5. Divida e emplacre cada um dos poços da placa de 24 poços em 4 poços separados do novo, revestido 24 bem. Cada poço original terá 1 mL, contendo ~50-60 esferóides. Isso rende 250 μL, contendo aproximadamente 10-15 esferóides para cada poço na nova placa.
    6. Adicione 250 μL de meio adicional por poço.
      NOTA: Esta é uma divisão de 1:4; certifique-se de que os esferóides sejam distribuídos corretamente dentro da solução para que a divisão seja relativamente uniforme. O número de esferóides não é contado porque o número final não afeta o sucesso da geração de symNs.
    7. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
    8. No dia 15 (ou dia 29 para a opção 2), alimente-se substituindo todos os meios por 1 mL de meio symN contendo 0,125 μM RA. A partir de agora, os neurônios devem ser alimentados a cada 2 dias até o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2).
    9. Após o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2), os neurônios devem ser alimentados substituindo cuidadosamente apenas metade do meio existente (500 μL). De agora em diante, alimente-se toda semana, a menos que o meio fique amarelo rapidamente.
    10. Continue se alimentando semanalmente até o ponto de tempo desejado.
      NOTA: simns tendem a agregar em estruturas semelhantes a gânglios e são propensos a se desprender dos pratos culturais. Para evitar isso, recomenda-se meia-alimentação e manuseio mínimo.
  2. Células de chapeamento para gravação eletrofisiológica
    1. Prepare as placas de eletrofisiologia de 96 poços revestidas de PO/LM/FM.
    2. Prepare o meio symN contendo 0,125 μM RA (adicionar fresco cada ração) e 10 μM Y27632 (somente dia 14).
    3. No dia 14, pegue todos os esferóides, depois centrifuga-los a 200 x g por 4 min.
    4. Descarte o sobrenadante, adicione 2 mL de solução de dissociação e transfira a mistura de volta para um dos poços da placa de fixação ultra-baixa. Incubar a 37 °C, em 5% de CO2 por 20-45 min.
      NOTA: Dependendo do tamanho dos esferóides, o período de dissociação pode ser maior que 20 min. Verifique a dissociação da célula a cada 10 min até 45 min. Opcionalmente, 0,1 mg/mL de DNase pode ser adicionado com solução de dissociação para evitar dna livre de células mortas tornando a solução pegajosa. Isso é opcional neste protocolo porque os esferóides não se agregam uma vez que estão totalmente dissociados.
    5. Pipet para dissociar totalmente os esferóides, em seguida, centrífuga a 200 x g por 4 min.
    6. Descarte o sobrenadante, resuspenda as células com a quantidade apropriada de meio symN e conte o número da célula.
    7. Emplacaas as células a 100.000/cm2 em poços de eletrofisiologia revestidos de PO/LM/FN em volume total de 200 μL por poço.
    8. No dia 15 (ou dia 29 para a opção 2), siga os mesmos processos de alimentação da seção 7.1. O volume total após o dia 15 (ou dia 29 para a opção 2) deve ser de 300 μL por poço.
    9. Meça os sinais elétricos usando uma máquina de matriz multieletrodo após o dia 20 (ou dia 35 para a opção 2).
      NOTA: Na opção 2, os esferóides podem ser banhados a qualquer momento entre o dia 14 e o dia 28. As primeiras medições de sinais elétricos podem ser realizadas 1 semana após o revestimento dos esferóides.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Neste protocolo, damos instruções sobre como gerar symNs a partir de hPSCs. As condições de cultura aqui demonstradas foram melhoradas de um protocolo publicadoanteriormente 23,24 (Figura 1A) para condições livres de alimentadores e quimicamente definidas(Figura 1B). Duas opções são fornecidas, uma em que os simns são feitos dentro de 20 dias, e outra onde os NCCs podem ser expandidos por 2 semanas para gerar mais células que podem então ser diferenciadas em simns(Figura 1B,Opção 1 e 2).

Para monitorar adequadamente as características simmN de células diferenciadas, a linha de repórteres PHOX2B-eGFP WA09 e a linha de PSCs WA09 pai19. Todas as diferenciações foram conduzidas em pelo menos três repetições biológicas, definidas como experimentos de diferenciação independenteapós pelo menos uma passagem e/ou derivadas de um frasco recém-descongelado de células. A diferenciação foi induzida quando a confluência de hPSCs indiferenciados atingiu 80%-90%. As colônias hPSC eram redondas, com bordas brilhantes e lisas e pouco ou nenhuma diferenciação. As colônias não devem se tocar(Figura 2B, dia 0). Em vez da inibição típica de SMAD duplo25, que foi anteriormente usada para indução de neurectoderme, a inibição TGF-β combinada com a sinalização WNT e BMP4 nos primeiros 2 dias levou a uma expressão robusta do marcador de crista neural inicial AP2a. O marcador de crista neural SOX10 foi expresso do dia 4 ao dia 10(Figura 2B). NcCs emergiram em cumes densos e escurecidos visíveis a partir do dia 6. Estes cumes expressam SOX10 (Figura 2B, setas). Foi mostrado anteriormente que sox10 no estágio NCC se correlaciona com o marcador de superfície celular CD49D23,26 e, portanto, CD49D pode ser utilizado para classificar células NC que não estão relatando nenhum fluoróforo do lócus SOX10. A Figura 2C mostra a expressão dos genes marcadores NCC ao longo do tempo. A Figura 2D indica que nossa eficiência de diferenciação foi superior a 80%. Para determinar a identidade das células remanescentes, qRT-PCR foi usado para testar tipos de células contaminantes, incluindo mesoderme expresso por BryT, endoderme expressor a SOX17 e neuroectoderm expressado por PAX6; todos foram encontrados ausentes ou expressos em níveis muito baixos (dados não mostrados; ver Tabela Suplementar 1 para todos os primers). No entanto, foi detectado algum placode SIX1/EYA1+ (dados não mostrados) que podem ser a fonte dos demais tipos de células. Além disso, é possível que os demais tipos de células sejam derivados de NCC que já estão mais diferenciados. O código HOX dos NCCs foi avaliado nesta fase (Figura 2E). No entanto, neste estágio inicial os sinais HOX eram muito baixos (note a escala), sugerindo que esses NCCs eram de caráter cranial-NC ou ainda não tinham adotado nenhum caractere de subtipo NCC.

No dia 10 os NCCs poderiam ser purificados usando facs, que renderam cerca de 80% CD49D+ NCCs(Figura 2D). Um exemplo de uma estratégia típica de gating é indicado na Figura 2D. Após a classificação, as células foram agregadas como esferóides NC(Figura 3A). Para expandir os NCCs e induzir propriedades semelhantes ao tronco-NC, as células foram tratadas com uma combinação de FGF2 e CHIR. Testamos se a classificação para a população cd49D+ rendeu culturas melhores ou mais puras de simns mais tarde. A Figura 3B compara-se unsorted versus CD49D+ classificada versus CD49D- populações de células classificadas. À esquerda, pode-se ver que as populações classificadas positivas e as não classificadas fizeram esferóides NC de forma semelhante, enquanto as células classificadas negativas não se agregaram adequadamente, não fizeram esferóides redondos, suaves e saudáveis e morreram dentro de 3-4 dias. Além disso, quando os esferóides NC foram comparados no dia 14 via qRT-PCR para marcadores progenitores NC e symN, não foram detectadas diferenças significativas entre células classificadas e não classificadas. Notavelmente, neste ponto a expressão de marcadores progenitores simpáticos ainda era baixa e os níveis sox10 permaneceram altos, sugerindo que os esferóides ainda eram compostos de células com propriedades NC. Um dia após o revestimento (dia 15), tanto os esferóides não classificados quanto os CD49D+ bem ligados aos pratos PO/LM/FN e o crescimento neurite poderia ser claramente observado(Figura 3B,D15 e Figura 3C, D29). As culturas não classificadas e classificadas foram levadas adiante até o dia 35 em paralelo, mas não foram observadas grandes diferenças (dados não mostrados). Assim, pode-se concluir que a etapa de classificação não foi essencial para a geração de simetrias e, portanto, é um passo opcional neste protocolo. No entanto, para diferenciações menos eficientes que não produzem 80% de células CD49D+, recomendamos o procedimento de classificação.

Em seguida, testamos se esses esferóides NC poderiam ser mantidos sem perder sua identidade NC(Figura 3A, opção 2). Os NCCs foram cultivados como esferóides por até 2 semanas(Figura 3C). A morfologia do dia 28 esferóides e células banhadas no dia 29 foram semelhantes quando comparadas com as células do dia 14 e 15 na opção 1. No dia 28, a expressão SOX10 foi mantida em níveis semelhantes aos do dia 14. No entanto, a expressão dos marcadores progenitores simpáticos precoces (ou seja, ASCL1, PHOX2B e GATA3) aumentou (Figura 3C, à direita), sugerindo que a cultura estendida na sinalização FGF2, WNT e RA levou à maturação e posteriorização(Figura 4C e F). Efeitos semelhantes foram relatados anteriormente por Kirino et al21.

Após a expansão do NC (opção 1 ou opção 2), os esferóides foram banhados em pratos revestidos de PO/LM/FN e fornecidos com múltiplos fatores neurais para amadurecer as simns(Figura 4A). Nos dias 20 e 35 (1 semana após o emplacamento nas opções 1 e 2, respectivamente), os neurites foram observados em um padrão radial que se estende dos esferóides anexados(Figura 4A,à direita). Além disso, foram expressos marcadores relacionados à síntese e transporte de norepinefrina (NE) (i.e., TH, AAAD, DBH)(Figura 4B). A presença de tipos de células contaminantes foi novamente examinada aqui, e a expressão de ChAT, que pode indicar neurônios parassimpáticos, foi encontrada (Figura 4B,E). No entanto, o ChAT também é expresso em symNs colinérgicos. Foram detectados níveis muito baixos de VIP, outro marcador parassimpático (dados não mostrados). Além disso, foram detectados baixos níveis de BRN3A, ISL1 e RUNX1 (Figura 4B,E),o que poderia indicar neurônios sensoriais ou neurônios trigêmeos, ou seja, derivados de placode. Foram detectados EDNRB mínimos (marcando neurônios entéricos) e OLIG2 (marcação de neurônios motorizados) (dados não mostrados). A identidade das células não neuronais ainda não está clara. No entanto, com base nos resultados do nosso protocolo symN anterior23, eles eram provavelmente αSMA+ miofibroblastos. A expressão dos genes HOX foi reexaminada, e verificou-se que hox5-9 foram expressos, sugerindo uma identidade tronco. HOX10 (indicativo de sacral-NC) não foi expresso(Figura 4C, F). Por último, foram expressos marcadores maduros, incluindo receptor de acetilcolina nicotínica (CHRNA3/4) e receptores relacionados com NE, incluindo receptores adrenérgicos (ADRA2A/B2)Figure 4DtransportadorGNE (NET, SCL6A2) e transportador de vesícula (VMAT1) Não foi encontrada diferença significativa na expressão desses genes em células derivadas da opção 2 em comparação com a opção 1 (Figura 4E-G).

Confirmamos ainda nossos resultados realizando este protocolo na linha de repórteres H9-PHOX2B:GFP(Figura 5). No dia 20, as células formavam um gramado denso de neurônios e agregavam-se em aglomerados de densidade ainda maior, indicando uma eficiência de diferenciação muito alta(Figura 5A,linha superior). A coloração mostrou que a maioria das simetrias se aglomeram nesses aglomerados, o que dificultou a avaliação e quantificação da eficiência geral de diferenciação. Para destacar a coloração e a colocalização de marcadores symN específicos, focamos nas áreas menos densas nos arredores dos clusters (ver caixa amarela na Figura 5A, à direita). Foi também onde a maioria das células contaminantes estava localizada, por isso não era uma boa área para julgar a eficiência geral. No entanto, marcadores típicos de symN; incluindo periferia (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronal), DBH e NET1 (expresso em pontoao longo de corpos e axônios, Figura 5A, fundo); foram detectados. Uma abordagem de matriz multieletroda (MEA) foi empregada para medir a atividade elétrica, e foi encontrado naquele dia 20 simns disparados em cerca de 3-5 picos por segundo em comparação com o controle negativo de hPSCs indiferenciados(Figura 5B). É importante que as células sejam distribuídas uniformemente no poço para que cada eletrodo (pontos pretos na Figura 5B,campo brilhante) registre corretamente. Dia 20 a dia 30 symNs também foram estimulados com 1 μM de nicotina, que imita a sinalização pré-ganglionária de símNs in vivo e aumentou a taxa média de disparo nas células. A inibição dos neurônios também foi medida. β2-adrenérgico receptor (ADRB2), localizado em terminais de axônio symN, cria um ciclo de feedback positivo para a secreção NE29. Tratar os simns com propranolol de 1 μM (um antagonista do receptor β2-adrenérgico) inibiu sua atividade(Figura 5C,direita). Esses resultados sugerem que os simns gerados por este protocolo estavam funcionalmente ativos.

Figure 1
Figura 1: Ilustração esquemática e comparação de protocolos de diferenciação symN. (A) Protocolo anterior de Zeltner et al.23. (B)Protocolo otimizado. A opção 1 tem 20 dias de duração e contém apenas 4 dias de cultura esferóide NC. A opção 2 tem 35 dias de duração e contém um estágio de expansão esferóide NC de 2 semanas que permite a produção de mais células NC. VTN = vitronectina, PO = poli-L-ornithine, LM = laminin, FN = fibronectina, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = ácido retinóico, AA = ácido ascórbico, NFs = NGF+BDNF+GDNF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: indução de NC. (A) Cronograma e tratamentos para indução de NC do dia 0 ao dia 10. (B) A morfologia e a formação de cristas NC foram monitoradas a cada 2 dias por microscopia de campo brilhante. As células em cada ponto de tempo após o dia 2 foram co-manchadas para AP2A (vermelho) e SOX10 (verde). Todas as imagens de imunofluorescência foram contrariadas com DAPI. Flechas vermelhas indicam as estruturas dos cumes. (C) análise qRT-PCR para o perfil de expressão dos marcadores NC do dia 2-10. (D) Parcela representativa da classificação FACS no dia 10 para as populações de CD49D+ NC (esquerda). Uma estratégia típica de gating e controle de isótipo é indicada nas quatro primeiras parcelas. Também foi realizada quantificação do Percentual de CD49D+ celular no dia 10. (E) análise qRT-PCR para o perfil de expressão dos genes HOX do dia 2-10. NC = crista neural. As barras de erro provêm de dados de n ≥ 3 repetições biológicas, definidas como experimentos de diferenciação independentes realizados em dias separados das culturas de PSC que foram pelo menos um separado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Manutenção e expansão da crista neural. (A) Cronograma e tratamentos para expansão nc durante o dia 10 ao dia 14 cultura para a opção 1 ou dia 10 ao dia 28 cultura para a opção 2. (B) A formação esferóide NC foi monitorada por microscopia de campo brilhante do dia 11 (1 dia após a formação esferóide) até o dia 14 (ou seja, o dia do revestimento). Foram comparadaspopulações não classificadas, CD49D+e CD49D. As células banhadas no dia 15 também são mostradas. As células não conseguiram formar esferóides adequadamente no CD49D- grupo e morreram após o revestimento. As células do dia 14 foram examinadas pela análise qRT-PCR (à direita) para o perfil de expressão dos progenitores de symN. Foram comparadas populações não classificadas e CD49D+ (n ≥ 3). (C) Os esferóides NC podem ser mantidos por até 2 semanas. Os esferóides foram monitorados por microscopia de campo brilhante do dia 15 ao dia 28 (dia do pouso). As células banhadas no dia 29 também são mostradas. Os esferóides do dia 28 foram examinados pela análise qRT-PCR para o perfil de expressão dos progenitores symN (à direita). As populações não classificadas e CD49D+ foram agrupadas (n ≥ 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Diferenciação e maturação de SymN. (A) Cronograma e tratamentos após o emplacamento no dia 14 para a opção 1 ou dia 28 para a opção 2. Fotos de microscopia de campo brilhante (à direita) mostram symNs no dia 20 e dia 35, respectivamente (1 semana após o revestimento para ambas as opções). (B-D) Opção 1 qRT-PCR análise para o perfil de expressão das propriedades symN entre os dias 20 e 30. As populações não classificadas e CD49D+ foram agrupadas. (E-G) Opção 2 qRT-PCR análise para o perfil de expressão das propriedades symN após o dia 35. As populações não classificadas e CD49D+ foram agrupadas (n ≥ 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Caracterização funcional de simegos. (A,linha superior) Imagem de campo brilhante de clusters symN no dia 20 e imagem manchada mostrando PRPH e TH células positivas duplas localizadas principalmente nos clusters. (A,fundo) Múltiplos marcadores de símn (canais separados) foram verificados por coloração de imunofluorescência no dia 20. O transportador de norepinefrina (NET1) foi localizado tanto na superfície dos corpos celulares quanto ao longo dos axônios e dendritos. Ele apareceu como pontuações nesta ampliação. Todas as imagens de imunofluorescência foram contrariadas com DAPI. (B) Mapas de calor representativos da análise de matriz multieletroda (MEA) para symNs no dia 20 (topo). A imagem de campo brilhante (inferior) mostra a densidade de simns e a distribuição de eletrodos (oito pontos pretos). Populações não classificadas e CD49D+ foram agrupadas aqui. (C) Quantificação das taxas médias de disparo para o dia 20-30 simns sob tratamentos de 1 μM de nicotina e 1 μM propranolol por 5 minutos, respectivamente (à direita). Os resultados das populações não classificadas e CD49d-positivas foram agrupados (n ≥ 3). Teste t de duas caudas sem par com correção de Welch, p-value:*<0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Exemplo de células em condições inadequadas para proceder com a diferenciação. (A) Cronograma da diferenciação com cada ponto de verificação para morfologias celulares indicadas como em BE. (B) hPSCs (a) com colônias saudáveis e muitas células diferenciadas, e (b) fronteiras mescladas e diferenciadas entre algumas colônias no dia 0. As setas vermelhas indicam as áreas fundidas. (C) NCCs no dia 10 com bolhas semelhantes a bolhas nos cumes. As setas vermelhas indicam as bolhas na linha superior. A linha inferior representa uma ampliação maior. Não conseguimos identificar a identidade celular das bolhas. No entanto, a presença de mais bolhas parece correlacionar-se com a menor expressão SOX10/CD49D. (D) Esferóides de aparência irregular sem bordas lisas e forma redonda no dia 14. (E)Symns insalubres e moribundos no dia 20. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Publicamos recentemente duas revisões, uma discutindo o uso de symNs derivados do hPSC para modelagem de doenças31, bem como uma comparação aprofundada dos protocolos de diferenciação disponíveis22. Assim, aqui nos concentramos em solucionar problemas do protocolo atual para ajudar o pesquisador interessado a ter sucesso na fabricação de symNs. Durante todo o processo de diferenciação, a fim de obter dados consistentes, bem como células diferenciadas saudáveis, a contaminação em todas as etapas deve ser cuidadosamente controlada. Na manutenção rotineira do hPSC, os testes de mycoplasma devem ser realizados quinzenalmente ou mensalmente. Se a triagem celular for realizada no dia 10, a adição de antibióticos a qualquer meio é altamente incentivada. Também é importante verificar a morfologia celular antes e depois de iniciar a diferenciação. Aqui, sugerimos vários pontos críticos de verificação(Figura 6A). Primeiro, as colônias ideais de hPSC prontas para diferenciação devem ter bordas brilhantes e lisas com pequenos espinhos. Colônias com espinhos semelhantes a engrenagens começaram a se diferenciar e não devem ser usadas. É altamente recomendável que as células no ponto de tempo perfeito devem ser usadas imediatamente, porque a morfologia pode mudar em poucas horas. O adiamento por apenas um dia pode quebrar as células (Figura 6B, a) ou levar ao contato entre colônias(Figura 6B, b),o que estimula a diferenciação nos hPSCs. É desafiador se livrar de todas as células diferenciadas de uma cultura, mas a população deve ser controlada para conter menos de 5% das colônias ruins. Ao seguir este protocolo, o segundo ponto de verificação durante a diferenciação é entre o dia 2 e o dia 10. Nesta fase, as cristas escuras de NC devem ser claramente observadas sob um microscópio de campo brilhante(Figura 2C). A espessura e distribuição das cristas podem ser utilizadas como indicadores de eficiência de NC: Como os NCCs são derivados principalmente de células que formam as cristas, cumes finos ou menos difundidos e bolhas nas cristas podem indicar baixa produção de NC e, portanto, devem ser marcados ou descartados no caso de resultados inconsistentes(Figura 6C). A amostragem de RNA é altamente recomendada no dia 10 para verificar os marcadores NC descritos acima. O terceiro ponto de verificação é durante o estágio esferóide NC, porque os esferóides podem agregar. É melhor encanar periodicamente o meio para quebrar e resuspender a agregação (as células não serão dispersas de volta para células únicas, mas apenas pequenos esferóides). Se os esferóides se expandirem muito rapidamente, divida-os por 1:2 ou 1:4 para deixar espaço e nutrientes suficientes para as células crescerem. Se os esferóides não tiverem formas lisas e redondas(Figura 6D),pode indicar que a eficiência do NC no dia 10 não foi alta o suficiente, podendo, portanto, arruinar a diferenciação final. Testando perfis de expressão para verificar as propriedades progenitoras symN é recomendado no dia de chapeamento esferóide desejado. O quarto posto de controle é depois de emplacar os esferóides. Os neurites devem ser claramente visíveis e os feixes devem começar a se formar após o dia 20. As células sem neurites e feixes generalizados devem ser consideradas contaminação (Figura 6E). Neste ponto, é importante alimentar os neurônios substituindo apenas metade do meio existente para manter o ambiente nutritivo criado por neurônios estáveis. Tenha cuidado ao alimentar as células, pois as símens de maturação são vulneráveis e podem facilmente se desprender. A razão para cada uma das morfologias mal-olosas descritas aqui ainda não é completamente compreendida. No entanto, fornece uma visão da natureza sensível dos hPSCs e da diferenciação in vitro. Uma fonte dessas irregularidades pode ser devido a reagentes de diferentes fornecedores. Por exemplo, os cumes finos com bolhas aparecem quando usam uma marca diferente de BMP4.

Para análise eletrofisiológica utilizando MEA, a fim de distribuir uniformemente simns nos poços de eletrodos, os esferóides são dissociados por Accutase. O tempo de tratamento deve ser de 20 min para começar. No entanto, como os esferóides são altamente compactados, o tempo de dissociação pode ser aumentado para 45 min para garantir que os esferóides estejam totalmente dissociados. Em geral, cada grupo experimental em uma placa MEA precisa ser executado em múltiplos de pelo menos seis para obter resultados consistentes. Notavelmente, porque nossa densidade para reemplacamento é muito menor do que as recomendações do fabricante32 (cerca de 500-700.000/cm2),as repetições do poço são cruciais. Em nossos resultados, tanto a expressão substancial do marcador symN quanto a atividade estável aparecem do dia 20 ao dia 30. Recomendamos este como o melhor ponto de tempo para começar a registrar as variáveis de escolha. Para cada diferenciação, o meio deve ser feito fresco e usado o mais rápido possível (não mais de um mês).

O protocolo de diferenciação symN apresentado aqui é livre de alimentadores, quimicamente definido, eficiente, expansível e produz symNs funcionais até o dia 20. Este protocolo de diferenciação simequim definido poderia ser usado para estudar os distúrbios humanos do sistema nervoso simpático, como uma plataforma para o rastreamento de medicamentos, para estudos de tumorigênese, como neuroblastoma/pheocromocitoma, ou para pesquisas básicas em regulação homeostática.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores não têm nada para revelar.

Acknowledgments

Gostaríamos de agradecer a Heidi Ulrichs pela leitura crítica e edição do manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13, (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30, (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6, (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23, (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76, (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18, (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244, (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139, (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57, (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75, (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399, (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135, (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277, (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19, (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8, (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50, (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22, (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49, (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531, (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21, (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89, (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49, (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29, (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
Diferenciação eficiente de neurônios simpáticos pós-ganglionários usando células-tronco pluripotentes humanas em condições de cultura sem alimentadores e quimicamente definidas
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter