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Developmental Biology

Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/60843
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

Summary

In questo protocollo, descriviamo una strategia di differenziazione stabile e altamente efficiente per la generazione di neuroni simpatici postganglionici dalle cellule staminali pluripotenti umane. Questo modello renderà i neuroni disponibili per l'uso di studi di disturbi autonomici multipli.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono diventate un potente strumento per la modellazione della malattia e lo studio dello sviluppo embrionale umano in vitro. In precedenza abbiamo presentato un protocollo di differenziazione per la derivazione dei neuroni autonomi con carattere simpatico che è stato applicato ai pazienti con neuropatia autonomica. Tuttavia, il protocollo è stato costruito su Knock Out Serum Replacement (KSR) e sulle condizioni di coltura basate sull'alimentatore, e per garantire un'elevata efficienza di differenziazione, lo smistamento cellulare era necessario. Questi fattori causano un'elevata variabilità, costi elevati e bassa riproducibilità. Inoltre, le proprietà simpatiche mature, compresa l'attività elettrica, non sono state verificate. Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato in cui la cultura e la differenziazione del PSC vengono eseguite in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente. Sono identificati marcatori genetici che identificano la cresta neurale del tronco. Un'ulteriore differenziazione nei neuroni simpatici postganglionici si ottiene dopo 20 giorni senza la necessità di smistamento cellulare. La registrazione elettrofisiologica mostra ulteriormente l'identità del neurone funzionale. La cottura rilevata dai nostri neuroni differenziati può essere potenziata dalla nicotina e soppressa dall'antagonista del recettore adrenergico. I progenitori neurali simpatici intermedi in questo protocollo possono essere mantenuti come sferoidi neurali fino a 2 settimane, il che consente l'espansione delle colture. In sintesi, il nostro protocollo di differenziazione del neurone simpatico aggiornato mostra un'elevata efficienza di differenziazione, una migliore riproducibilità, una maggiore flessibilità e una migliore maturazione neurale rispetto alla versione precedente. Questo protocollo fornirà ai ricercatori le cellule necessarie per studiare i disturbi umani che colpiscono il sistema nervoso autonomo.

Introduction

I neuroni simpatici postganglionici (symN) appartengono al sistema nervoso autonomo (ANS) e hanno molteplici ruoli importanti nel rispondere e regolare l'omeostasi del corpo indipendente dalla coscienza. Ad esempio, lo stress stimola i simN ed evoca la risposta di lotta o volo che porta ad un aumento della frequenza cardiaca, della pressione sanguigna e della sudorazione. Le simn sono colpite da molteplici disturbi umani a causa di genetica, tossicità/lesioni o come compagni di altre malattie. Un esempio di neuropatia genetica è il disturbo infantile Familial Dysautonomia (FD), dove una grave disregolazione delle simile provoca crisi disautonomica, evidente sudorazione, slottatura della pelle, attacchi di vomito, ipertensione e ansia1. Un esempio di tossicità è il trattamento chemioterapico, che è stato segnalato per avere effetti collaterali tossici sui neuroni autonomici2. È noto che la denervazione autonoma e l'iperinnervazione possono sia portare, o accompagnare, malattie come il morbo di Parkinson o la malattia renale ipertensiva3,4. Pertanto, essere in grado di condurre ricerche e comprendere i meccanismi della biologia symN e dei difetti nel contesto della malattia è utile per la ricerca di trattamenti nuovi ed efficaci.

Anatomia
Il sistema nervoso periferico si dirama in divisioni sensoriali e autonomiche. I nervi afferenti del sistema nervoso sensoriale sono responsabili della sensazione di dolore e tatto, mentre l'ANS è responsabile della raccolta di informazioni da tutti gli organi al cervello. L'ANS è diviso nel sistema nervoso enterico, innervanendo il tratto gastrointestinale, il sistema nervoso parasimpatico, che è importante per il rilassamento, e il sistema nervoso simpatico (SNS), che è importante per l'attivazione / regolazione degli organi. Il SNS adatta un sistema a due neuroni5. Preganglionico simpatico assoni neurali simpatici nel primo progetto del midollo spinale ai gangli simpatici, dove si trovano i corpi cellulari symN postganglionico. Questi neuroni inviano quindi lunghe proiezioni per innervare i tessuti bersaglio di ogni organo nel corpo. I segnali trasmessi dai neuroni preganglioni sono colinergici, mentre le simpatie postganglioniche sono adrenergiche e quindi esprimono noradrenalina (NE) come neurotrasmettitore principale. Ci sono poche eccezioni notevoli di neuroni postganglionici e simpatici che sono colinergici, compresi quelli innervati vasi sanguigni. I neuroni postganglionici adrenergici esprimono gli enzisi drossidi idrossido di tirosina (TH), la decarboxylasi aromatica di amminoacido L (AAAD), la dopamina-idrossilasi (DBH) e l'ossidasi monoamina (MAO-A), tutti responsabili della generazione e della metabolizzazione di NE. Inoltre, esprimono i trasportatori NE che riciclano e/o i recettori del recettore adrenergico (ADRA2), il recettore z-adrenergico (ADR2B), il trasportatore di noradrenalina noradrenalina (NET1) e il trasportatore di monoamina vescicolare (VMAT1/2).

Sviluppo
Durante lo sviluppo embrionale i symN sono derivati dalla cresta neurale (NC), che emerge tra il tubo neurale e l'ectoderma sovrapposto6, e può differenziarsi in linee multiple cellulari, tra cui melanociti, osteoblasti, adipociti, glia, neuroni enterici, neuroni sensoriali e neuroni autonomi7 . Le cellule di cresta neurale (NCC) sono cellule altamente migratorie che prendono diverse rotte attraverso l'embrione. In questa fase iniziale dello sviluppo NC, le celle esprimono i marcatori SNAIL1/2, FOXD3 e SOX108,9,10,11. Il percorso di migrazione insieme alla posizione assiale che adottano determina il sottotipo NC in cui si svilupperanno. Questi sottotipi NC possono essere distinti per la loro specifica espressione genica HOX: le CNC craniali non esprimono geni HOX, i cCI vagali esprimono HOX 1–5, i CCI trunk esprimono HOX 6–9 e le CPC sacrali esprimono HOX 10–1112. Tra questi, le NCC trunk sono riconosciute come la principale fonte di symN. I precursori di SymN esprimono il fattore di trascrizione MASH1/ASCL113, che promuove l'espressione di PHOX2B14 e INSM115. La famiglia GATA di fattori di trascrizione è espressa durante lo sviluppo di qualsiasi simpatia tardiva. GATA2 e GATA3 sono espressi nelle simine, che a loro volta attiva NOC16. Il fattore di trascrizione HAND2 è importante anche per l'espressione e la manutenzione di DBH e TH17.

Le HPCC (ad esempio, cellule staminali pluripotenti embrionali e indotte) sono un potente strumento18 per ricapitolare i paradigmi dello sviluppo e generare simN che possono poi essere impiegati per la modellazione della malattia di vari disturbi umani. Pertanto, generando simN da hPSC, è fondamentale seguire le linee guida di sviluppo e valutare l'espressione dei marcatori appropriati lungo il processo di differenziazione.

Protocollo symN precedente
Pochi gruppi di ricerca hanno precedentemente segnalato la generazione di simN da hPSC19,20,21. Il confronto diretto di questi protocolli tra loro e il nostro è stato esaminato di recente22. Nel 201623, abbiamo pubblicato un protocollo di differenziazione per la generazione di neuroni autonomi con carattere symN (Figura 1A). Questo protocollo ha utilizzato il mezzo basato su KSR, che è stato utilizzato sia nella manutenzione di hPSC indifferenziati che nella differenziazione cellulare. Inoltre, gli hPSC sono stati mantenuti su fibroblasti embrionali di topo (cellule feeder MEF). Abbiamo impiegato questo protocollo e PSC da pazienti con FD per modellare il disturbo23. Nel 2019, abbiamo descritto una versione più dettagliata di questo protocollo precedente24. In sintesi, il destino neurale è stato indotto dalla doppia inibizione SMAD25 per bloccare la segnalazione TGF-e BMP nei primi 2 giorni. L'attivazione WNT con CHIR99021 ha promosso i progenitori neurali a diventare cellule NC. Il giorno 11, le cellule sono state ordinate da FACS per CD49D, o SOX10, popolazioni26,23, che ha prodotto circa 40% NC efficienza di generazione. Pertanto, lo smistamento era necessario per garantire l'efficienza e la purezza per le prossime fasi di differenziazione. Gli NCC sono stati mantenuti e amplificati come sferoidi con il trattamento combinato di FGF2 e CHIR. Dopo 4 giorni, gli sferoidi NC di manutenzione sono stati placcati e dato BDNF, GDNF, e NGF per completare la maturazione symN. Sebbene queste simN abbiano espresso forti marcatori simbolici come ASCL1, TH, DBH e PHOX2A, i marcatori per le simN più mature, inclusa l'espressione del recettore dell'acetilcolina nicotinica (CHRNA3/CHRNB4) e del trasportatore di vescicole (VMAT1/2), erano bassi anche dopo 70 giorni di differenziazione. I geni HOX in questo protocollo non sono stati testati formalmente e le proprietà neurali mature, compresa l'attività elettrofisiologica delle cellule, non sono state verificate.

In questo caso, presentiamo un protocollo ottimizzato per generare symN (Figura 1B). Le HPSC sono mantenute in condizioni di assenza di alimentatori, su piatti rivestiti di vitronectin (VTN), utilizzando i supporti Essential 8 (E8)27. La formula dei mezzi di differenziazione è stata modificata in ogni fase, aumentando così la percentuale della popolazione NC28. La maturazione della simN può essere eseguita su CD49D-/SOX10- popolazioni NCC di massa ordinate o non ordinate. Entrambi mostrano alti livelli di espressione del marcatore symN per giorno 30. Inoltre, i symN generati con questo protocollo sono sensibili alla registrazione elettrofisiologica e ai trattamenti con composti di attivazione e inibitori.

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Protocol

NOTA: la linea di reporter H9 PHOX2B:GFP è stata fornita da Oh etal. Alcuni primer qPCR utilizzati in questo articolo sono stati ottenuti da OriGene Technologies, mentre alcune sequenze sono ottenute da Frith et al.20,30.

1. Set-up per il rivestimento dei piatti, la preparazione dei supporti e la manutenzione hPSC

  1. Rivestimento per piatti
    1. Rivestimento vitronectina (VTN)
      1. Mettere le fiale di VTN in un bagno d'acqua a 37 gradi fino a completa scongelazione, quindi mescolare accuratamente.
      2. Per una parabola Petri da 100 mm, mescolare 7 mL di 1x fosfato buffered salina (PBS) con 0,5 mg/mL VTN, aggiungere la soluzione VTN alla parabola e incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 h.
    2. Rivestimento a matrice a membrana del seminterrato
      1. Scongelare le fiale della matrice della membrana del seminterrato (vedi Tabella dei materiali)sul ghiaccio a 4 gradi durante la notte.
      2. Per un pozzo di un 6 pozzetto, mescolare 2 mL di DMEM/F12 con 20 -L di 100x matrice di membrana seminterrato, aggiungere la soluzione di matrice di membrana seminterrato al piatto, avvolgere il piatto con pellicola di paraffina, e conservare in un contenitore pulito a 4 gradi durante la notte. Lavora il più velocemente possibile. I piatti rivestiti possono essere conservati in 4 gradi centigradi per un massimo di 2 settimane.
    3. Rivestimento poliornitina (PO)/lamininina (LM)/fibronectina (FN)
      1. Il primo giorno, per un pozzo di 24 pozzetto, mescolare 15 g/mL di PO con 1 mL di 1x PBS, incubare a 37 gradi centigradi, 5% di CO2 durante la notte. Scongelare sia LM che FN a -20 gradi durante la notte e conservare a 4 gradi centigradi fino a completa scongelazione.
      2. Il secondo giorno, aspirare la soluzione PO, lavare i pozzetti 2x con 1x PBS, aggiungere 1 mL di 1x PBS contenente 2 g/mL di LM e 2 g/mL di FN e incubare a 37 gradi centigradi nel 5% di COdurante la notte. A questo punto il piatto con la soluzione LM/FN può essere conservato nell'incubatrice per mesi, purché non si asciughi. Aggiungere più 1x PBS per evitare che il piatto si secchi.
  2. Preparazione dei supporti
    1. Preparare il mezzo Essential 8 (E8) scongelando una bottiglia di supplemento E8 a 4 gradi durante la notte. Mescolare il supplemento con 500 mL di E8 medio e antibiotici se necessario.
      NOTA: la soluzione Working E8 deve essere utilizzata entro 2 settimane.
    2. Preparare il supporto di congelamento hPSC mescolando 90 mL di supporto E8 completo con 10 mL di DMSO per un volume totale di 100 mL. Filtrare sterilizzare.
    3. Preparare il mezzo di differenziazione del giorno 0 al giorno 1 mescolando 100 mL di mezzo essenziale 6 (E6) con 10 SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 e 10 Y27632 per un volume totale di 100 mL.
    4. Preparare il mezzo di differenziazione dal giorno 2 al giorno 10 mescolando 100 mL di mezzo E6 con 10 SB e 0,75 M CHIR99021 per un volume totale di 100 mL.
    5. Preparare il giorno 10 al giorno 14 sferoide medio mescolando mezzo neurobasal con 2 mL di B27 (50x), 1 mL di N2 (100x), 2 mM L-Glutamate, 3 CHIR99021 e 10 ng/mL FGF2 per un volume totale di 100 mL.
    6. Preparare il giorno 14 al giorno 28 medio per la manutenzione a lungo termine sferoide aggiungendo 0,5 M di RA fresca al giorno 10 al giorno 14 sferoide medio per ogni alimentazione.
      NOTA: Mantenere sempre RA a -80 gradi centigradi.
    7. Preparare il mezzo di maturazione SymN mescolando il mezzo neurobasale con 2 mL di B27 (50x), 1 mL di N2 (100x), 2 mM L-glutamate, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ngF ng/mL, 200 m acido ascorbico e 0,2 mm dbc amp per un volume totale di 10 m. La soluzione deve essere utilizzata entro 2 settimane. Prima di ogni alimentazione, aggiungere ra fresca di 0,125 M. Questa soluzione viene utilizzata dal giorno 14 (opzione 1) o dal giorno 28 (opzione 2).
    8. Preparare il buffer FACS mescolando DMEM con 2% FBS, 2 mM l-glutammato e antibiotici se necessario per un volume totale di 100 mL.
  3. Manutenzione hPSC
    1. Scongelamento e mantenimento di hPSC
      1. Preparare un piatto VTN rivestito 100 mm.
      2. Per scongelare una fiala di hPSC direttamente dall'azoto liquido, mettere la fiala in un bagno d'acqua a 37 gradi centigradi, oscillando con cura il tubo nell'acqua fino a quando non si scongela. Trasferire gli hPSCs scongelati su un tubo da 15 mL contenente 10 mL di 1x PBS e centrifugare a 200 x g per 4 min.
      3. Scartare il supernatante e aggiungere 1 mL di Mezzo E8 al tubo. Pipette un paio di volte per risospendere completamente il pellet e quindi aggiungere altri 9 mL di mezzo E8 per raggiungere 10 mL totali.
      4. Aspirare la soluzione VTN dal piatto da 100 mm.
      5. Trasferire gli hPSC in un piatto da 100 mm, agitare delicatamente (su e sinistra-destra, non in cerchio) per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente nel piatto
      6. Incubare a 37 gradi centigradi, in 5% CO2.
      7. Il giorno successivo, aspirare tutto il mezzo e alimentazione con 10 mL di E8.
      8. Alimenta in questo modo ogni giorno per i prossimi 3-4 giorni e poi preparati a dividerti.
    2. Suddivisione di hPSC
      NOTA: gli hPSC nel punto di divisione devono essere confluenti dell'80%-90%. Grandi colonie con bordi lisci e luminosi dovrebbero essere osservate. Tuttavia, il contatto tra ogni colonia deve essere evitato (Figura 2B, giorno 0 e Figura 6B).
      1. Preparare i piatti rivestiti VTN da 100 mm in base alle esigenze.
      2. Aspirati l'E8 e lavate il piatto che deve essere diviso 1x con 1x PBS.
      3. Aspirate il 1x PBS e aggiungere 4 mL di 0.25 M EDTA. Incubare per 2 min a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
        NOTA: gli hPSC devono essere divisi/riplaccati come piccole colonie. Non trattare con EDTA più di 2 min per evitare la separazione in singole cellule. Le cellule devono essere ancora attaccate alla superficie del piatto dopo il trattamento di 2 min.
      4. Aspirati l'EDTA, staccate le colonie con un tubo di 10 mL di mezzo E8 sulla superficie del piatto e raccogliete tutto il mezzo e le cellule in un tubo da 15 mL.
      5. Con hPSC con una confluenza dell'80%-90%, dividi le colonie per 1:15-1:20. Ad esempio, per dividere gli hPSCs per 1:20 in un piatto da 100 mm, prendere 500 L di soluzione E8/hPSCs e mescolare con 9,5 mL di mezzo E8 fresco.
      6. Piatto hPSCs in piatti VTN rivestiti 100 mm.
        NOTA: Si consiglia di stabilire il rapporto di divisione ideale per ogni ricercatore e linea cellulare in modo indipendente.
    3. Congelamento di hPSC
      1. Per un piatto da 100 mm di hPSCs pronto per essere diviso, preparare tre crioviali e 3,5 mL di mezzo di congelamento.
        NOTA: I supporti e le fiale devono essere conservati in 4 gradi centigradi o sul ghiaccio fino all'uso.
      2. Aspirate E8 e lavare il piatto 2x con 1x PBS.
      3. Aspirate 1x PBS e aggiungere 4 mL di 0,25 M EDTA, incubare per 2 min a 37 gradi centigradi, nel 5% di CO2.
        NOTA: gli hPSC dovrebbero essere congelati come piccole colonie nel momento in cui sarebbero stati divisi. Non trattare le cellule con EDTA più lungo di 2 min per evitare la separazione in singole cellule. Le cellule devono essere ancora attaccate sulla superficie del piatto dopo il trattamento di 2 min.
      4. Aspirate l'EDTA, staccarle le colonie con un tubo di 10 mL di 1x PBS sulla superficie del piatto e raccogliere tutti i mezzi e le cellule in un tubo da 50 mL.
      5. Aggiungere 20 mL di 1x PBS e centrifugare a 200 x g per 4 min per lavare il restante EDTA.
      6. Scartare il supernatante e risospendere il pellet in 3 mL di mezzo di congelamento.
      7. Distribuire gli hPSC in modo uniforme nei tre crioviali, 1 mL ciascuno.
      8. Conservare a -80 gradi durante la notte in una scatola di congelamento controllata o in un panino al polistirolo per garantire un calo lento della temperatura, e poi trasferirlo in un serbatoio di azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine.

2. Seeding hPSCs per avviare la differenziazione (giorno 0)

NOTA: gli hPSC devono essere pronti per la differenziazione dopo essere stati stabilizzati (cioè essere divisi 2-3 volte dopo lo scongelamento). Assicurarsi che le colonie siano sane, con bordi lisci e lucidi e una differenziazione minima (Figura 2B).

  1. Preparare piatti rivestiti a matrice di membrana seminterrato (24 bene o 6 piatti ben) un giorno prima del giorno 0, se necessario. Portare i piatti in RT all'inizio della differenziazione.
  2. Rendere il giorno medio di differenziazione da 0 a 1 in base alle esigenze.
  3. Aspirare l'E8 dal confluente, pronto a dividere hPCS, e lavare il piatto 2x con 1x PBS.
  4. Aggiungete 7 mL di 1,25 M EDTA per un piatto da 100 mm, incubate a 37 gradi centigradi, 5% CO2,per 15 min.
    NOTA: A questo punto, il trattamento EDTA si sta prolungando per disperdersi in singole cellule.
  5. Pipet off tutti gli hPSC (dovrebbero essere galleggianti) e trasferire in un tubo 50 mL. Aggiungere la stessa quantità o più di 1x PBS come soluzione EDTA per diluire l'EDTA.
  6. Centrifuga a 200 x g per 4 min.
  7. Scartare il supernatante, aggiungere 1 mL del giorno 0–1 mezzo di differenziazione e pipet per omogeneizzare le cellule. Seguire aggiungendo più mezzo e poi mescolare per diluire la soluzione cellulare ad una concentrazione ideale per contare le cellule.
    NOTA: non esanéela soluzione cellulare. Le celle di un piatto completo da 100 mm devono essere diluite in 5 mL di media partenza.
  8. Contare il numero di cella utilizzando un contatore cellulare automatico o un emocitometro.
  9. Diluire la soluzione cellulare in base alle esigenze per raggiungere 125.000 celle/cm2 in un volume finale basso (ad esempio, 2 mL per pozzo per un piatto di 6 pozzetti o 500 l per pozzo per un piatto di 24 pozzetti).
    NOTA: Un basso volume aiuta le cellule ad attaccarsi più velocemente.
  10. Aspirati tutta la soluzione di matrice di membrana seminterrato dai piatti rivestiti e piastra la soluzione cellulare nei pozzi.
  11. Incubare a 37 gradi centigradi, in 5% CO2.

3. Induzione delle cellule di cresta neurale (giorno 1 al giorno 10, Figura 2A)

  1. Il giorno 1 alimentano le celle con il mezzo di differenziazione giorno 0–1 (3 mL per pozzo per 6 piatti ben e 1 mL per pozzo per 24 piatti ben).
  2. Il giorno 2 alimentano le cellule con il giorno 10 supporto di differenziazione (3 mL per pozzo per 6 piatti ben e 1 mL per pozzo per 24 piatti ben).
  3. D'ora in poi, le cellule dovrebbero essere nutrite a giorni alterni fino al giorno 10 (cioè, il giorno di alimentazione successivo sarà il giorno 4).
    NOTA: Dal giorno 6 in giorno, le creste NC devono essere rilevate (Figura 2B). Per verificare se è in corso la differenziazione, si consiglia di portare una coltura di differenziazione parallela in pozzi più piccoli (ad esempio, 24 pozzi), che può essere macchiata per SOX10/AP2a e utilizzata per l'espressione genica del marcatore lungo il tempo della differenziazione (Figura 2B,C).
  4. Se si ordinano le celle, passare alla sezione 4. In caso contrario, passare alla sezione 5.

4. Fluorescenza attivato smistamento delle cellule (FACS) per marcatore cresta neurale CD49D e aggregando le cellule NC in sferoidi

NOTA: Per lo smistamento FACS, i campioni devono essere tenuti sul ghiaccio e non essere esposti alla luce dopo la colorazione fino allo smistamento.

  1. Preparare il buffer FACS se le celle sono ordinate.
  2. Preparare giorno 10–14 sferoide medio.
  3. Il giorno 10, rimuovere il mezzo e lavare 1x con 1x PBS.
  4. Aggiungere la soluzione di dissociazione (vedi Tabella dei materiali)a 2 mL per pozzo per un piatto 6 pozzetti o 1 mL per pozzo per un piatto di 24 pozzetti, e incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2 per 20 min.
  5. Strappare via tutti gli hPSC e trasferire in un tubo da 50 mL.
  6. Riempire il resto del tubo con tampone FACS e centrifuga a 200 x g per 4 min.
    NOTA: Ogni tubo da 50 mL può ospitare fino a 20 mL o meno di soluzione cellulare. Il volume del buffer FACS dovrebbe essere sufficientemente alto da neutralizzare la soluzione di dissociazione.
  7. Eliminare il supernatante, risospendere le celle con la quantità appropriata di buffer FACS (2 mL per pozzo di un 6 piastra di pozzo), e contare per determinare il numero di cella.
  8. Preparare gli esempi seguenti.
    1. Esempio 1 (controllo non colorato): 1 x 106 celle in 400 - L di buffer FACS. Filtrare le cellule attraverso un tappo di 20 m e tenere il tubo sul ghiaccio.
    2. Esempio 2 (controllo solo DAPI): 1 x 106 celle in 400 - L di buffer FACS contenente 0,5 ug/mL DAPI. Filtrare le cellule attraverso un tubo FACS con un tappo di colino e mantenere il tubo sul ghiaccio.
    3. Campione 3 (etichettato CD49d): sospendere il resto delle celle con buffer FACS contenente anticorpi CD49D coniugati PE/Cy7 (5 -L per 1 x 106 celle per 100 buffer FACS) in un tubo da 15 mL e incubare sul ghiaccio per 20 min.
  9. Riempire i tubi con tampone FACS e centrifugare a 200 x g per 4 min.
  10. Eliminare il supernatante e risospendere nuovamente ogni 5–10 x 106 celle in 1 mL di buffer FACS contenente 0,5 ug/mL DAPI secondo le istruzioni del produttore.
  11. Filtrare le cellule attraverso il tubo FACS con il tappo del colino e mantenere il tubo sul ghiaccio.
  12. Preparare la raccolta di tubi FACS contenenti 2 mL di buffer FACS.
  13. Ordinare la macchina FACS con laser in grado di rilevare DAPI e PE-Cy7 per isolare lapopolazione CD49D.
  14. Dopo l'ordinamento, contare le celle ordinate.
  15. Centrifugare tutte le cellule ordinate e risospendere nel giorno 10–14 mezzo sferoide ad una concentrazione finale di 0,5 x 106 cellule per 500 .
  16. Piastra 0,5 x 106 celle per ben in accessorio ultra-basso 24 piastre ben.
  17. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi, nel 5% di CO2.

5. Aggregazione di cellule NC in sferoidi

  1. Se non si utilizza NOCER per isolare le cellule NC e invece di aggregarle direttamente in sferoidi, preparare prima le cellule come descritto nei passaggi da 4.2 a 4.5.
  2. Riempire il resto del tubo con 1x PBS, e centrifugare a 200 x g per 4 min.
  3. Eliminare il supernatante, riutilizzare le cellule con una quantità appropriata di giorno 10–14 sferoidmedio sferoide (ad esempio, 2 mL di media per bene per un 6 piastra di pozzo), e contare per determinare il numero di cella.
  4. Diluire le cellule nel giorno 10–14 sferoide medio a 0,5 x 106 celle per 500 - L di media.
  5. Piastra 500 - L delle sospensioni cellulari per bene in accessoriultra-basso 24 piastre ben.
  6. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi, nel 5% di CO2.

6. Manutenzione sferoide NC e induzione progenitore simpatico (giorno 10 al giorno 14, Figura 4A)

  1. Opzione 1: coltura minima degli sferoidi
    1. Il giorno 11, aggiungere il mezzo sferoide 10–14 all'uomo dal giorno 10. Incubare a 37 gradi centigradi, in 5% CO2.
    2. Il giorno 12, inclinare la piastra per accumulare gli sferoidi NC su un lato dei pozzi. Aspirare con attenzione e scartare il più mezzo possibile, e nutrire con 1 mL del giorno 10–14 sferoidmedio.
    3. Continuare a nutrire le cellule ogni giorno fino al giorno 14.
    4. Facoltativo: se gli sferoidi si aggregano e generano un grosso grumo, utilizzare una pipetta per rompere gli sferoidi. Questo assicura anche che i singoli sferoidi non si ingrandiscano.
      NOTA: La gamma ideale di dimensioni sferoidi dovrebbe essere di circa 100-500 m. All'interno di tale intervallo, la dimensione dei singoli sferoidi non è critica. Tuttavia, la morfologia, ad esempio un bordo liscio e chiaro (Figura 3 e Figura 6) è importante per un ulteriore successo. Al giorno 14, ogni 24 bene piatto contiene idealmente circa 50-60 sferoidi di diverse dimensioni all'interno della gamma di dimensioni di cui sopra.
  2. Opzione 2: cultura degli sferoidi espansa
    1. Il giorno 15, per mantenere gli sferoidi NC, nutrire con 1,5 mL del giorno 10–14 mezzo sferoide contenente 0,5 .M RA. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
      NOTA: RA deve essere aggiunto fresco per ogni alimentazione ed essere sempre conservato a -80 gradi centigradi.
    2. D'ora in poi, nutriti ogni due giorni fino al giorno 28 e poi continua con la placcatura degli sferoidi (sezione 7.1).
      NOTA: Gli sferoidi in crescita vengono divisi circa 1 volte a settimana convogliandoli con una pipetta da 1 mL per romperli. Sono divisi con un rapporto approssimativo di 1:2–1:4. Entro il periodo di espansione di 2 settimane, le celle dovrebbero approssimativamente quadruplicare in numero.

7. Differenziazione e maturazione SymN (Opzione 1: dopo il giorno 14; Opzione 2: dopo il giorno 28)

  1. Placcatura sferoidi in piatti regolari
    1. Preparare 24 lastre di PO/LM/FM rivestite.
    2. Preparare il supporto symN contenente 0,125 RA M (aggiungere ogni mangime fresco) e 10 -M Y27632 (solo il giorno 14).
    3. Il giorno 14, inclinare la piastra per accumulare sferoidi NC su un lato dei pozzi. Aspirare con attenzione e scartare il più mezzo possibile, e nutrire con 1 mL di supporto symN.
    4. Rimuovere LM/FN dalle piastre rivestite.
    5. Dividere e piastra ogni bene dal 24 piastra di bene in 4 pozze separate del nuovo, rivestito 24 pozzetto. Ogni pozzo originale avrà 1 mL, contenente sferoidi da 50 a 60 dollari. Questo produce 250 l, contenenti circa 10-15 sferoidi per ogni pozzo sulla nuova piastra.
    6. Aggiungere 250 l di mezzo aggiuntivo per pozzo.
      NOTA: Questa è una divisione di 1:4; assicurarsi che gli sferoidi siano distribuiti correttamente all'interno della soluzione in modo che la divisione sia relativamente uniforme. Il numero di sferoidi non viene conteggiato perché il numero finale non influisce sul successo della generazione di symN.
    7. Incubare a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
    8. Il giorno 15 (o il giorno 29 per l'opzione 2), effettuare l'alimentazione sostituendo tutto il supporto con 1 mL di supporto symN contenente 0,125 RA M. D'ora in giù, i neuroni dovrebbero essere alimentati ogni 2 giorni fino al giorno 20 (o giorno 35 per l'opzione 2).
    9. Dopo il giorno 20 (o il giorno 35 per l'opzione 2), i neuroni devono essere alimentati sostituendo con attenzione solo la metà del mezzo esistente (500 . D'ora in e' ora, nutriti ogni settimana a meno che il mezzo diventi rapidamente giallo.
    10. Continuare l'alimentazione settimanale fino al momento desiderato.
      NOTA: le simin tendono ad aggregarsi in strutture simili a gangli a gangli e sono inclini a staccarsi dai piatti della cultura. Per evitare questo, si raccomanda la mezza alimentazione e la manipolazione minima.
  2. Cellule di placcatura per la registrazione elettrofisiologica
    1. Preparare piastre di elettrofisiologia ben rivestite di PO/LM/FM.
    2. Preparare il supporto symN contenente 0,125 RA M (aggiungere ogni mangime fresco) e 10 -M Y27632 (solo il giorno 14).
    3. Il giorno 14, raccogliere tutti gli sferoidi, quindi centrifugarli a 200 x g per 4 min.
    4. Scartare il supernatante, aggiungere 2 mL di soluzione di dissociazione e trasferire la miscela su uno dei pozze della piastra di fissaggio ultra-bassa. Incubare a 37 gradi centigradi, in 5% CO2 per 20-45 min.
      NOTA: A seconda delle dimensioni degli sferoidi, il periodo di dissociazione può essere più lungo di 20 min. Controllare la dissociazione della cellula ogni 10 min fino a 45 min. O facoltativamente, 0,1 mg/mL di DNase può essere aggiunto con soluzione di dissociazione per evitare che il DNA libero da cellule morte rende la soluzione appiccicosa. Questo è facoltativo in questo protocollo perché gli sferoidi non verranno aggregati una volta completamente dissociati.
    5. Pipet per dissociare completamente gli sferoidi, quindi centrifugare a 200 x g per 4 min.
    6. Eliminare il supernatante, risospendere le celle con la quantità appropriata di supporto symN e contare il numero di cella.
    7. Placcare le cellule a 100.000/cm2 nei pozzi di elettrofisiologia rivestiti po/LM/FN in 200 - volume totale per pozzo.
    8. Il giorno 15 (o il giorno 29 per l'opzione 2), seguire gli stessi processi di alimentazione della sezione 7.1. Il volume totale dopo il giorno 15 (o il giorno 29 per l'opzione 2) deve essere di 300 -L per pozzo.
    9. Misurare i segnali elettrici utilizzando una macchina a matrice multielettrodi dopo il giorno 20 (o il giorno 35 per l'opzione 2).
      NOTA: Nell'opzione 2, gli sferoidi possono essere placcati in qualsiasi momento tra il giorno 14 e il giorno 28. Le prime misurazioni dei segnali elettrici possono essere effettuate 1 settimana dopo la placcatura degli sferoidi.

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Representative Results

In questo protocollo vengono fornite istruzioni su come generare symN da hPSCs. Le condizioni di coltura qui illustrate sono state migliorate da un protocollo pubblicato in precedenza23,24 (Figura 1A) a condizioni prive di alimentatore e definite chimicamente ( Figura1B). Vengono fornite due opzioni, una in cui le simN vengono realizzate entro 20 giorni e un'altra in cui le CNC possono essere espanse per 2 settimane per generare più celle che possono quindi essere differenziate in simboli (Figura 1B, Opzione 1 e 2).

Per monitorare correttamente le caratteristiche delle cellule differenziate, la linea di reporter PHOX2B-eGFP WA09 e la linea di psC WA09 padre19. Tutte le differenziazioni sono state condotte in almeno tre ripetizioni biologiche, definite come esperimenti di differenziazione indipendenti dopo almeno un passaggio e/o derivati da una fiala appena scongelata di cellule. La differenziazione è stata indotta quando la confluenza di hPSC indifferenziati ha raggiunto l'80%-90%. Le colonie hPSC erano rotonde, con bordi lisci e lisci e poco o nessuna differenziazione. Le colonie non devono toccarsi(Figura 2B, giorno 0). Invece della tipica inibizione sinistra25, che in precedenza veniva utilizzata per l'induzione del neurectodermi, l'inibizione tGF-z combinata con la segnalazione WNT e BMP4 nei primi 2 giorni ha portato alla robusta espressione del marcatore della cresta neurale precoce AP2a. Il marcatore di cresta neurale SOX10 è stato espresso dal giorno 4 al giorno 10 (Figura 2B). I CBC emersero in creste dense e oscurate visibili dal sesto giorno in poi. Queste creste hanno espresso SOX10 (Figura 2B, frecce). È stato dimostrato in precedenza che IL SOX10 allo stadio NCC è correlato al marcatore di superficie della cella CD49D23,26 e quindi CD49D può essere utilizzato per ordinare le celle NC che non segnalano alcun fluoroforo dal locus SOX10. La figura 2C mostra l'espressione dei geni marcatori NCC nel tempo. La figura 2D indica che l'efficienza di differenziazione era superiore all'80%. Per determinare l'identità delle cellule rimanenti, qRT-PCR è stato utilizzato per testare i tipi di cellule contaminanti, tra cui il mesoderma che esprime BryT, l'endodermo che esprime SOX17 e il neuroectoderma che esprime PAX6; tutti sono stati trovati assenti o espressi a livelli molto bassi (dati non mostrati; vedi tabella supplementare 1 per tutti i primer). Tuttavia, è stato rilevato+ un placode SIX1/EYA1 (dati non visualizzati) che potrebbero essere l'origine dei tipi di cella rimanenti. Inoltre, è possibile che i tipi di cellule rimanenti siano derivati NCC che sono già ulteriormente differenziati. Il codice HOX degli NCC è stato valutato in questa fase(Figura 2E). Tuttavia, in questa fase iniziale i segnali HOX erano molto bassi (notare la scala), suggerendo che questi CCC erano o di carattere cranico-NC o non avevano ancora adottato alcun carattere di sottotipo NCC.

Il giorno 10 gli NCC potevano essere purificati con FACS, che producevano circa l'80% CD49D( CNC). Un esempio di una tipica strategia di gating è indicato nella Figura 2D. Dopo l'ordinamento, le celle sono state aggregate come sferoidi NC (Figura 3A). Per espandere gli NCC e indurre proprietà simili a trunk-NC, le cellule sono state trattate con una combinazione di FGF2 e CHIR. Abbiamo testato se l'ordinamento per il CD49D- popolazione ha prodotto colture migliori o più pure di simN in seguito. Figura 3B confronta le popolazioni di celluleordinate in modo non ordinato rispetto a CD49D, in ordine e CD49D.+ A sinistra, si può vedere che le popolazioni ordinate in modo positivo e quelle non ordinate hanno fatto sferoidi NC in modo simile, mentre le cellule ordinate negative non si aggregavano correttamente, non hanno fatto sferoidi rotondi, lisci e sani e sono morte entro 3-4 giorni. Inoltre, quando gli sferoidi NC sono stati confrontati al giorno 14 tramite qRT-PCR per marcatori progenitrici NC e symN, non è stato possibile rilevare differenze significative tra cellule ordinate e non ordinate. Notevolmente, a questo punto l'espressione di marcatori progenitore simpatici era ancora bassa e i livelli di SOX10 sono rimasti alti, suggerendo che gli sferoidi erano ancora composti da cellule con proprietà NC. Un giorno dopo la placcatura (giorno 15), sia non ordinati e CD49D- sferoidi attaccati bene ai piatti PO/ LM / FN e la crescita neurite potrebbe essere chiaramente osservato (Figura 3B, D15 e Figura 3C, D29). Le culture indifferenziate e ordinate sono state portate avanti fino al giorno 35 in parallelo, ma non sono state osservate grandi differenze (dati non mostrati). Pertanto, si può concludere che il passaggio di ordinamento non era essenziale per la generazione di simboli, e quindi è un passaggio facoltativo in questo protocollo. Tuttavia, per differenziazioni meno efficienti che non producono 80% CD49D- celle, si consiglia la procedura di ordinamento.

Successivamente, abbiamo testato se questi sferoidi NC potevano essere mantenuti senza perdere la loro identità NC (Figura 3A, opzione 2). Le BCN sono state coltivate come sferoidi per un massimo di 2 settimane (Figura 3C). La morfologia dei 28 sferoidi del giorno e delle cellule placcate il giorno 29 erano simili rispetto alle cellule del giorno 14 e 15 nell'opzione 1. Il giorno 28, l'espressione SOX10 è stata mantenuta a livelli simili a quello del giorno 14. Tuttavia, l'espressione dei primi marcatori progenitivi simpatici (ad esempio ASCL1, PHOX2B e GATA3) è aumentata(Figura 3C, right), suggerendo che la cultura estesa nella segnalazione FGF2, WNT e RA ha portato alla maturazione e alla posteriorizzazione (Figura 4C e F). Effetti simili sono stati precedentemente segnalati da Kirino et al21.

Dopo l'espansione NC (opzione 1 o opzione 2), gli sferoidi sono stati placcati su piatti rivestiti PO/LM/FN e forniti con più fattori neurali per maturare le simn (Figura 4A). Il giorno 20 e 35 (1 settimana dopo la placcatura nelle opzioni 1 e 2, rispettivamente), neuriti sono stati osservati in un modello radiale che si estende dagli sferoidi collegati (Figura 4A, a destra). Inoltre, sono stati espressi marcatori relativi alla sintesi e al trasporto di noradrenalina (NE) (ad esempio, TH, AAAD, DBH)(Figura 4B). La presenza di tipi di cellule contaminanti sono stati esaminati di nuovo qui, e l'espressione di ChAT, che può indicare neuroni parasimpatici, è stata trovata (Figura 4B,E). Tuttavia, ChAT è espressa anche in siminco colinergiche. Sono stati rilevati livelli molto bassi di VIP, un altro marcatore parasimpatico, (dati non mostrati). Inoltre, sono stati rilevati bassi livelli di BRN3A, ISL1 e RUNX1 (Figura 4B,E), che potrebbero indicare neuroni sensoriali o neuroni trigemini, cioè derivati del placode. Sono stati rilevati edNRB minimi (marcatura neuroni enterici) e OLIG2 (marcatura dei motoneuroni) (dati non mostrati). L'identità delle cellule non neuronali rimane poco chiara. Tuttavia, sulla base dei risultati del nostro precedente protocollo symN23, erano molto probabilmente sMA- miofibromi. L'espressione dei geni HOX è stata riesaminata, ed è stato scoperto che HOX5-9 sono stati espressi, suggerendo un'identità del tronco. HOX10 (indicativo di sacrale-NC) non è stato espresso (Figura 4C, F). Infine, sono stati espressi marcatori maturi, tra cui il recettore dell'acetilcolina nicotinica (CHRNA3/4) e i recettori correlati al NE, compresi i recettori adrenergici (ADRA2A/B2) NE transporter (NET, SCL6A2) e il trasportatore di vescicole (VMAT1) (Figura 4D,G). Non è stata riscontrata alcuna differenza significativa nell'espressione di questi geni nelle cellule derivate con l'opzione 2 rispetto all'opzione 1 (Figura 4E-G).

Abbiamo ulteriormente confermato i nostri risultati eseguendo questo protocollo sulla linea di reporter H9-PHOX2B:GFP (Figura 5). Entro il giorno 20, le cellule formavano un prato denso di neuroni e aggregato in gruppi di densità ancora più alta, indicando un'efficienza di differenziazione molto elevata (Figura 5A, riga superiore). La colorazione ha mostrato che la maggior parte delle simn si ammassaino in questi cluster, il che ha reso difficile la valutazione e la quantificazione dell'efficienza di differenziazione complessiva. Per evidenziare la colorazione e la co-localizzazione di marcatori symN specifici, ci siamo concentrati sulle aree meno dense alla periferia dei cluster (vedere la casella gialla in Figura 5A, a destra). Questo è stato anche dove si trovavano la maggior parte delle cellule contaminanti, quindi non era una buona area per giudicare l'efficienza complessiva. Ciò nonostante, marcatori symN tipici; tra cui periferia (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronale), DBH e NET1 (espressi in punti lungo corpi e assoni simpatici, Figura 5A, fondo); sono stati rilevati. Un approccio a matrice multielettrodi (MEA) è stato impiegato per misurare l'attività elettrica, ed è stato trovato quel giorno 20 simpatie sparavano a circa 3-5 picchi al secondo rispetto al controllo negativo di hPSC indifferenziati (Figura 5B). È importante che le cellule siano distribuite uniformemente nel pozzo in modo che ogni elettrodo (punti neri in Figura 5B, campo luminoso) per registrare correttamente. Dal giorno 20 al giorno 30 simin sono stati stimolati anche con 1 nicotina M, che imita la segnalazione preganglionica dei symN in vivo e ha aumentato il tasso medio di cottura nelle cellule. È stata misurata anche l'inibizione dei neuroni. Il recettore adrenergico (ADRB2), situato sui terminali con assi symN, crea un ciclo di feedback positivo per la secrezione NE29. Il trattamento delle simine con 1 propranolololo (un antagonista del recettore adrenergico da 2 a 2 gradi) ha inibito la loro attività(Figura 5C, a destra). Questi risultati suggeriscono che le simN generate da questo protocollo erano funzionalmente attive.

Figure 1
Figura 1: Illustrazione schematica e confronto dei protocolli di differenziazione symN. (A) Precedente protocollo di zeltner et al.23. (B) Protocollo ottimizzato. L'opzione 1 dura 20 giorni e contiene solo 4 giorni di cultura degli sferoidi NC. L'opzione 2 dura 35 giorni e contiene una fase di espansione dello sferoide NC di 2 settimane che consente la produzione di più celle NC. VTN - vitronectina, PO - poli-l-orninizzazione, LM - laminina, FN - fibronectina, SB - SB 431542, CHIR - CHIR 99021, RA - acido retinoico, AA - acido ascoreco, NFs , BDNF , GDNF . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: induzione NC. (A) Cronologia e trattamenti per l'induzione NC dal giorno 0 al giorno 10. (B) La morfologia e la formazione delle creste NC sono state monitorate ogni 2 giorni da microscopia da campo luminoso. Le cellule in ogni momento dopo il giorno 2 sono state co-macchiate per AP2A (rosso) e SOX10 (verde). Tutte le immagini immunofluorescenza sono state contrastate con DAPI. Le frecce rosse indicano le strutture delle creste. (C) analisi qRT-PCR per il profilo di espressione dei marcatori NC dal giorno 2-10. (D) Rappresentazione trama rappresentativa dello smistamento FACS il giorno 10 per le popolazioni CD49De NC (a sinistra). Una tipica strategia di gating e controllo isotipo è indicata nei primi quattro grafici. Quantificazione del CD49D: è stata eseguita anche la percentuale di cellule al giorno 10. (E) analisi qRT-PCR per il profilo di espressione dei geni HOX dal giorno 2-10. NC - cresta neurale. Le barre di errore derivano da dati di n - 3 ripetizioni biologiche, definite come esperimenti di differenziazione indipendenti effettuati in giorni separati dalle colture PSC che sono state almeno una divisa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Manutenzione ed espansione della cresta neurale. (A) Cronologia e trattamenti per l'espansione NC durante il giorno 10 al giorno 14 cultura per l'opzione 1 o giorno 10 al giorno 28 cultura per l'opzione 2. (B) La formazione di sferoidi NC è stata monitorata da una microscopia da campo luminoso dall'un giorno 11 (1 giorno dopo la formazione degli sferoidi) al giorno 14 (cioè il giorno della placcatura). Non ordinato, CD49DeCD49D- sono state confrontate le popolazioni. Vengono visualizzate anche le cellule placcate al giorno 15. Le cellule non sono riuscite a formare correttamente sferoidi nel CD49D- gruppo e sono morti dopo la placcatura. Le cellule del giorno 14 sono state esaminate dall'analisi qRT-PCR (a destra) per il profilo di espressione dei progenitori symN. Lepopolazioni non ordinate e CD49D sono state confrontate (n - 3). (C) gli sferoidi NC potevano essere mantenuti fino a 2 settimane. Gli sferoidi sono stati monitorati da microscopia da campo luminoso dal giorno 15 al giorno 28 (il giorno dell'atterraggio). Vengono visualizzate anche le cellule placcate il giorno 29. Giorno 28 sferoidi sono stati esaminati dall'analisi qRT-PCR per il profilo di espressione dei progenitori symN (a destra). Non ordinato e CD49D- popolazioni sono state raggruppate (n x 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: differenziazione e maturazione SymN. (A) Cronologia e trattamenti dopo la placcatura il giorno 14 per l'opzione 1 o giorno 28 per l'opzione 2. Le foto di microscopia da campo luminoso (a destra) mostrano le simN rispettivamente al giorno 20 e al giorno 35 (1 settimana dopo la placcatura per entrambe le opzioni). (B–D) Opzione 1 analisi qRT-PCR per il profilo di espressione delle proprietà symN tra i giorni 20-30. Lepopolazioni non ordinate e CD49D sono state raggruppate. (E–G) Opzione 2 analisi qRT-PCR per il profilo di espressione delle proprietà symN dopo il giorno 35. Non ordinato e CD49D- popolazioni sono state raggruppate (n x 3). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: caratterizzazione funzionale delle simm. (A, riga superiore) Immagine di campo luminoso di cluster symN al giorno 20 e immagine macchiata che mostra PRPH e TH cellule doppio positivo per lo più situati nei cluster. (A, in basso) Più marcatori symN (canali separati) sono stati verificati mediante colorazione immunofluorescenza il giorno 20. Il trasportatore di noradrenalina norepinefrina (NET1) era situato sia sulla superficie dei corpi cellulari che lungo gli assoni e i dendriti. Si presentò come punti a questo ingrandimento. Tutte le immagini immunofluorescenza sono state contrastate con DAPI. (B) Mappe di calore rappresentative dell'analisi dei multielettrodi (MEA) per le simN del giorno 20 (in alto). L'immagine del campo luminoso (in basso) mostra la densità delle simn e la distribuzione degli elettrodi (otto punti neri). Lepopolazioni non differenziate e CD49D sono state raggruppate qui. (C) Quantificazione dei tassi di cottura medi per il giorno 20-30 in trattamenti di 1 nicotina M e 1 propranolololo per 5 min, rispettivamente (a destra). I risultati delle popolazioni non differenziate e del CD49d sono stati raggruppati (n - 3). Test t a due code non accoppiato con la correzione di Welch, valore p: Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Esempio di celle in condizioni inadeguate per procedere con la differenziazione. (A) Cronologia della differenziazione con ogni punto di controllo per le morfologie cellulari indicato come in B–E. (B) hPSC (a) con colonie sane e un sacco di cellule differenziate, e (b) confini uniti e differenziati tra alcune colonie il giorno 0. Le frecce rosse indicano le aree unite. (C) NCC al giorno 10 con vesciche a forma di bolla nelle creste. Le frecce rosse indicano le vesciche nella riga superiore. La riga inferiore rappresenta un ingrandimento più alto. Non siamo stati in grado di identificare l'identità cellulare delle vesciche. Tuttavia, la presenza di più vesciche sembra essere correlata con un'espressione SOX10/CD49D inferiore. (D) Sferoidi dall'aspetto irregolare privo di bordi lisci e forma rotonda il giorno 14. (E) SymN non sani e morenti il giorno 20. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Recentemente abbiamo pubblicato due recensioni, una che discute l'uso di symN derivati da hPSC per la modellazione delle malattie31, nonché un confronto approfondito dei protocolli di differenziazione disponibili22. Così, qui ci concentriamo sulla risoluzione dei problemi del protocollo attuale per aiutare il ricercatore interessato a riuscire a fare simN. Durante l'intero processo di differenziazione, al fine di ottenere dati coerenti e cellule differenziate sane, la contaminazione in tutte le fasi deve essere attentamente controllata. Nella manutenzione hPSC di routine, il test del micoplasma deve essere eseguito bisettimanale o mensile. Se lo smistamento cellulare viene eseguito il giorno 10, l'aggiunta di antibiotici a qualsiasi mezzo è altamente incoraggiata. È anche importante controllare la morfologia cellulare prima e dopo l'inizio della differenziazione. In questo caso, è possibile suggerire diversi punti di controllo critici (Figura 6A). In primo luogo, colonie hPSC ideali pronte per la differenziazione dovrebbero avere bordi luminosi e lisci con piccole punte. Le colonie con punte simili a ingranaggi hanno iniziato a differenziarsi e non devono essere utilizzate. Si raccomanda vivamente di utilizzare immediatamente le cellule nel punto di tempo perfetto, perché la morfologia può cambiare in poche ore. Il rinvio per un solo giorno può bloccare le celle (Figura 6B, a) o portare a un contatto tra colonie ( Figura6B, b), che stimola la differenziazione negli hPSC. È difficile sbarazzarsi di ogni cellula differenziata in una cultura, ma la popolazione dovrebbe essere controllata per contenere meno del 5% delle colonie cattive. Quando si segue questo protocollo, il secondo punto di controllo durante la differenziazione è compreso tra il giorno 2 e il giorno 10. In questa fase, le creste NC scure devono essere chiaramente osservate al microscopio di campo luminoso (Figura 2C). Lo spessore e la distribuzione delle creste possono essere utilizzati come indicatori dell'efficienza NC: poiché le NCC derivano principalmente da cellule che formano le creste, le creste e le vesciche sottili o meno diffuse nelle creste potrebbero indicare una bassa produzione di NC, e pertanto dovrebbero essere contrassegnate o eliminate in caso di risultati incoerenti (Figura 6C). Il campionamento dell'RNA è altamente raccomandato il giorno 10 per controllare i marcatori NC descritti in precedenza. Il terzo checkpoint è durante la fase di sferoide NC, perché gli sferoidi possono aggregarsi. È meglio eseguire periodicamente la disgregazione del mezzo e risospendere l'aggregazione (le celle non verranno disperse in singole celle ma solo sferoidi piccoli). Se gli sferoidi si espandono troppo rapidamente, dividili di 1:2 o 1:4 per lasciare abbastanza spazio e sostanze nutritive per far crescere le cellule. Se gli sferoidi non hanno forme lisce e rotonde (Figura 6D), può indicare che l'efficienza NC al giorno 10 non era abbastanza alta, e quindi può rovinare la differenziazione finale. Il test dei profili di espressione per controllare le proprietà del progenitore symN è consigliato nel giorno di placcatura sferoide desiderato. Il quarto checkpoint è dopo aver placcato gli sferoidi. I neuriti dovrebbero essere chiaramente visibili e i fasci dovrebbero iniziare a formarsi dopo il giorno 20. Le cellule senza neuriti e fasci diffusi devono essere considerate contaminazioni(Figura 6E). A questo punto, è importante nutrire i neuroni sostituendo solo la metà del mezzo esistente per mantenere l'ambiente nutriente creato da neuroni stabili. Prestare attenzione quando si alimentano le cellule, perché le simN in maturazione sono vulnerabili e possono facilmente staccarsi. La ragione di ciascuna delle morfologie dall'aspetto negativo qui descritte non è ancora del tutto compresa. Tuttavia, fornisce informazioni sulla natura sensibile degli hPSC e sulla differenziazione in vitro. Una fonte di tali irregolarità potrebbe essere dovuta a reagenti di fornitori diversi. Ad esempio, le creste sottili con vesciche si presentano quando si utilizza una marca diversa di BMP4.

Per l'analisi elettrofisiologica utilizzando MEA, al fine di distribuire uniformemente le simine nei pozzi degli elettrodi, gli sferoidi sono dissociati da Accutase. Il tempo di trattamento dovrebbe essere di 20 min per cominciare. Tuttavia, poiché gli sferoidi sono altamente compattati, il tempo di dissociazione può essere aumentato a 45 min per garantire che gli sferoidi siano completamente dissociati. In generale, ogni gruppo sperimentale su una piastra MEA deve essere eseguito in multipli di almeno sei per ottenere risultati coerenti. In particolare, poiché la nostra densità per la riplaccatura è molto inferiore alle raccomandazioni del produttore32 (circa 500-700,000/cm2), le ripetizioni del pozzo sono cruciali. Nei nostri risultati, sia l'espressione sostanziale del marcatore symN che l'attività stabile vengono visualizzati dal giorno 20 al giorno 30. Si consiglia questo come il miglior punto di tempo per iniziare a registrare le variabili di scelta. Per ogni differenziazione, il mezzo deve essere reso fresco e utilizzato il più rapidamente possibile (non più di un mese).

Il protocollo di differenziazione symN qui presentato è privo di alimentatori, definito chimicamente, efficiente, espandibile e produce symN funzionali entro il giorno 20. Questo protocollo di differenziazione della simpatia definita potrebbe essere utilizzato per studiare i disturbi umani del sistema nervoso simpatico, come piattaforma per lo screening farmacologico, per gli studi di tumorigenesi come il neuroblastoma/feocromocitoma, o per la ricerca di base nella regolazione omeostatica.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Heidi Ulrichs per la lettura critica e l'editing del manoscritto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

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References

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Biologia dello sviluppo numero 159 cellule staminali pluripotenti umane cresta neurale neuroni simpatici sistema nervoso autonomo sistema nervoso simpatico coltura di cellule staminali chimicamente definite
Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postganglionici utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura senza alimentatore e definite chimicamente
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Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

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