Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv differentiering av postganglitoniska sympatiska nervceller med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller under Feeder-fria och kemiskt definierade kulturförhållanden

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/60843
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

Summary

I detta protokoll beskriver vi en stabil, mycket effektiv differentiering strategi för generering av postganglionic sympatiska nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller. Denna modell kommer att göra nervceller tillgängliga för användning av studier av flera autonoma sjukdomar.

Abstract

Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) har blivit ett kraftfullt verktyg för sjukdomsmodellering och studiet av människans embryonala utveckling in vitro. Vi presenterade tidigare en differentiering protokoll för härledning av autonoma nervceller med sympatisk karaktär som har tillämpats på patienter med autonoma neurotoxiskt. Protokollet byggdes dock på Knock Out Serum Replacement (KSR) och feeder-baserade odlingsförhållanden, och för att säkerställa hög differentieringseffektivitet var cellsortering nödvändig. Dessa faktorer orsakar hög variation, höga kostnader och låg reproducerbarhet. Dessutom har mogna sympatiska egenskaper, inklusive elektrisk aktivitet, inte verifierats. Här presenterar vi ett optimerat protokoll där PSC-kultur och differentiering utförs i matarfria och kemiskt definierade kulturförhållanden. Genetiska markörer identifiera bålen neurala krönet identifieras. Ytterligare differentiering i postganglionic sympatiska nervceller uppnås efter 20 dagar utan behov av cellsortering. Elektrofysiologisk inspelning visar ytterligare den funktionella neuronidentiteten. Bränning upptäcks från våra differentierade nervceller kan förbättras genom nikotin och undertrycks av adrenerga receptorn antagonist propranolol. Mellanliggande sympatiska neurala stamceller i detta protokoll kan upprätthållas som neurala sfäroider i upp till 2 veckor, vilket möjliggör expansion av kulturerna. Sammanfattningsvis visar vår uppdaterade sympatiska neuron differentiering protokoll hög differentiering effektivitet, bättre reproducerbarhet, mer flexibilitet, och bättre neural mognad jämfört med den tidigare versionen. Detta protokoll kommer att ge forskarna de celler som behövs för att studera mänskliga sjukdomar som påverkar det autonoma nervsystemet.

Introduction

Postganglionic sympatiska nervceller (symNs) tillhör det autonoma nervsystemet (ANS) och har flera viktiga roller i att svara och reglera homeostas i kroppen oberoende av medvetande. Till exempel stimulerar stress symNs och framkallar kampen-eller-flykt svar som leder till en ökning av hjärtfrekvens, blodtryck, och svettning. SymNs påverkas i flera mänskliga sjukdomar på grund av genetik, toxicitet / skada, eller som följeslagare till andra sjukdomar. Ett exempel på en genetisk neuropati är barndomssjukdomen Familjär Dysautonomia (FD), där en allvarlig dysregulation av symNs orsakar dysautonomisk kris, uppenbart genom svettning, blotching av huden, kräkningar attacker, hypertoni, och ångest1. Ett exempel på toxicitet är kemoterapi behandling, som har rapporterats ha toxiska biverkningar på autonoma nervceller2. Det är känt att autonoma denervation och hyper-innervation kan både leda till, eller åtfölja, sjukdomar som Parkinsons sjukdom eller hypertensiv njursjukdom3,4. Således är det fördelaktigt att kunna forska och förstå mekanismerna för symN-biologi och defekter i samband med sjukdom för att söka nya och effektiva behandlingar.

Anatomi
Det perifera nervsystemet förgrena sig i sensoriska och autonoma divisioner. De afferent nerverna i det sensoriska nervsystemet är ansvariga för känsla av smärta och beröring, medan ANS är ansvarig för att vidarebefordra information från alla organ till hjärnan. ANS är indelat i det enteriska nervsystemet, innervating av mag-tarmkanalen, det parasympatiska nervsystemet, vilket är viktigt för avkoppling, och det sympatiska nervsystemet (SNS), vilket är viktigt för aktivering/reglering av organ. SNS anpassar ett två-neuron system5. Preganglionic sympatiska neurala axoner i ryggmärgen första projektet till sympatiska ganglier, där postganglionic symN cell organ finns. Dessa nervceller skickar sedan långa projektioner för att innervera målvävnaderna i varje organ i kroppen. Signaler som överförs av preganglionic nervceller är kolinerga, medan postganglionic symNs är adrenerga och därmed uttrycka noradrenalin (NE) som deras huvudsakliga signalsubstans. Det finns några anmärkningsvärda undantag av postganglionic, sympatiska nervceller som är kolinerga, inklusive de innervating blodkärl. Adrenerga postganglionic nervceller uttrycka enzymer tyrosin hydroxylase (TH), aromatiska L-aminosyra decarboxylase (AAAD), dopamin β-hydroxylas (DBH), och monoamin oxidas (MAO-A), alla ansvariga för att generera och metabolisera NE. Dessutom uttrycker de NE återvinning transportörer och/eller receptorer α-adrenerga receptor (ADRA2), β-adrenerga receptor (ADR2B), noradrenalin transportör (NET1), och vesikulär monoamin transportör (VMAT1/2).

Utveckling
Under embryonal utveckling symNs härrör från neurala krönet (NC), som framträder mellan neuralröret och överlagra ectoderm6, och kan skilja i flera cell härstamningar, inklusive melanocyter, osteoblaster, adipocyter, glia, enteriska nervceller, sensoriska nervceller, och autonoma nervceller7. Neurala crest celler (NCCs) är långvandrande celler som tar flera vägar genom embryot. I detta tidiga skede av NC utveckling, cellerna uttrycka markörer SNAIL1/2, FOXD3, och SOX108,9,10,11. Migreringsvägen tillsammans med den axiella plats som de antar bestämmer den NC-undertyp som de kommer att utvecklas till. Dessa NC subtyper kan särskiljas genom deras specifika HOX genuttryck: Cranial NCCs inte uttrycka HOX gener, vagal NCCs express HOX 1-5, trunk NCCs express HOX 6-9, och sakrala NCCs express HOX 10-1112. Bland dem är trunk NCCs erkända som den viktigaste källan till symNs. SymN prekursorer uttrycka transkriptionsfaktorn MASH1/ASCL113, som främjar uttryck för PHOX2B14 och INSM115. Gata familjen av transkriptionsfaktorer uttrycks under sen sympatisk utveckling. GATA2 och GATA3 uttrycks i symNs, som i sin tur aktiverar DBH16. Transkriptionsfaktorn HAND2 är också viktig för uttryck och underhåll av DBH och TH17.

HPS (t.ex. embryonala och inducerade pluripotenta stamceller) är ett kraftfullt verktyg18 för att rekapitalitulera utvecklingsparadigm och generera symN som sedan kan användas för sjukdomsmodellering av olika mänskliga sjukdomar. Samtidigt som symNs skapas från hPSC är det därför viktigt att följa utvecklingsriktlinjerna och bedöma uttryck för lämpliga markörer längs differentieringen.

Tidigare symN-protokoll
Få forskargrupper har tidigare rapporterat generering av symNs från hPSCs19,20,21. Den direkta jämförelsen av dessa protokoll till varandra och vår granskades nyligen22. I 201623, Vi publicerade en differentiering protokoll för generering av autonoma nervceller med symN karaktär (Figur 1A). Detta protokoll används KSR-baserade medium, som användes i både underhåll av odifferentierade hPSCs och cell differentiering. Dessutom bibehölls hPSCs på mus embryonala fibroblaster (MEF feeder celler). Vi använde detta protokoll och PSCs från patienter med FD att modellera sjukdomen23. Under 2019 beskrev vi en mer detaljerad version av detta äldre protokoll24. Sammanfattningsvis var neurala ödet framkallas av dubbla SMAD hämning25 att blockera TGF-β och BMP signalering under de första 2 dagarna. WNT aktivering med CHIR99021 främjas neurala förfäder att bli NC celler. På dag 11, celler sorterades av FACS för CD49D+ eller SOX10+ populationer26,23, som gav cirka 40% NC generation effektivitet. Det behövdes därför sortering för att säkerställa effektiviteten och renhetsgraden för nästa steg i differentiering. NCCs bibehölls och förstärktes som sfäroider med kombinerad behandling av FGF2 och CHIR. Efter 4 dagar var NC sfäroider av underhåll pläterade och ges BDNF, GDNF och NGF att avsluta symN mognad. Även om dessa symNs uttryckt starka symN markörer såsom ASCL1, TH, DBH och PHOX2A, markörer för mer mogna symNs, inklusive uttryck för nikotinacetylkolin receptorn (CHRNA3/CHRNB4) och vesicle transportör (VMAT1/2), var låga även efter 70 dagars differentiering. HOX gener i detta protokoll testades inte formellt, och mogna neurala egenskaper, inklusive elektrofysiologisk aktivitet av cellerna, kontrollerades inte.

Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att generera symNs(Figur 1B). HPSCs underhålls i matarfria förhållanden, på vitronectin (VTN)-belagda rätter, med Essential 8 (E8) media27. Formeln för differentieringsmedierna har ändrats i varje steg, vilket ökar andelen av NC-befolkningen28. Den symN mognad kan göras på CD49D+/SOX10+ sorterade eller osorterade bulk NCC populationer. Båda visar höga nivåer av symN markör uttryck av dag 30. Dessutom är de symN som genereras med detta protokoll lyhörda för elektrofysiologisk inspelning och behandlingar med symN aktivator och hämmare föreningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: H9 PHOX2B: GFP reporter linje tillhandahölls av Oh et al.19. Vissa qPCR primers som används i detta dokument erhölls från OriGene Technologies, medan några sekvenser erhålls från Frith et al.20,30.

1. Set-up för skålbeläggning, mediaberedning och hPSC-underhåll

  1. Skål beläggning
    1. Vitronectinbeläggning (VTN)
      1. Placera injektionsflaska med VTN i ett 37 °C vattenbad tills de är helt upptinad och blanda sedan noggrant.
      2. För en 100 mm petriskål, blanda 7 ml fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med 0,5 mg/ml VTN, tillsätt VTN-lösning till skålen och inkubera i rumstemperatur (RT) i 1 h.
    2. Källare membran matris beläggning
      1. Tina injektionsflaska med källarmembranmatris (se Tabell över material) på is vid 4 °C över natten.
      2. För en brunn av en 6 brunnsplatta, blanda 2 ml DMEM/F12 med 20 μL 100x källarmembranmatris, tillsätt källarmembranmatrislösning till skålen, linda skålen med paraffinfilm och förvara i en ren behållare vid 4 °C över natten. Arbeta så fort som möjligt. Belagda rätter kan förvaras i 4 °C i upp till 2 veckor.
    3. Beläggning mellan polyornitin (PO)/laminin (LM)/fibronectin (FN)
      1. På den första dagen, för en brunn av en 24 brunnsplatta, blanda 15 μg/ml PO med 1 ml 1x PBS, inkubera vid 37 °C, 5% CO2 över natten. Tina både LM och FN vid -20 °C över natten och förvara vid 4 °C tills den är helt upptinad.
      2. På den andra dagen, aspirate PO-lösning, tvätta brunnarna 2x med 1x PBS, tillsätt 1 ml 1x PBS som innehåller 2 μg/ml LM och 2 μg/ml FN och inkubera vid 37 °C i 5% CO2 över natten. Vid denna punkt skålen med LM / FN-lösning kan förvaras i inkubatorn i månader så länge det inte torkar ut. Tillsätt mer 1x PBS för att förhindra att skålen torkar ut.
  2. Förberedelser i media
    1. Förbered Essential 8 medium (E8) genom att tina upp en flaska E8-tillägg vid 4 °C över natten. Blanda tillägget med 500 ml E8 medium och antibiotika om det behövs.
      OBS: Fungerande E8-lösning ska förbrukas inom 2 veckor.
    2. Förbered hPSC-frysmediet genom att blanda 90 ml komplett E8 medium med 10 ml DMSO för en total volym på 100 ml. Filtrera sterilisera.
    3. Förbered dag 0 till dag 1 differentieringsmedium genom att blanda 100 ml essentiella 6 (E6) medium med 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 och 10 μM Y27632 för en total volym på 100 mL.
    4. Förbered dag 2 till dag 10 differentieringsmedium genom att blanda 100 ml E6 medium med 10 μM SB och 0,75 μM CHIR99021 för en total volym på 100 ml.
    5. Förbered dagen 10 till dag 14 sfäroid medium genom att blanda neurobasal medium med 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutamat, 3 μM CHIR99021 och 10 ng/mL FGF2 för en total volym på 100 mL.
    6. Förbered dagen 14 till dag 28 medium för sfäroid långsiktigt underhåll genom att lägga till 0,5 μM färsk RA till dagen 10 till dag 14 sfäroid medium för varje utfodring.
      OBS: Håll alltid RA vid -80 °C.
    7. Förbered mognadsmediet SymN genom att blanda neurobasalmedium med 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutamat, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM askorbinsyra och 0,2 mM dbcAMP för en total volym på 100 ml. Lösningen ska användas inom 2 veckor. Före varje utfodring, tillsätt 0,125 μM färsk RA. Denna lösning används från dag 14 (alternativ 1) eller dag 28 (alternativ 2).
    8. Förbered FACS-bufferten genom att blanda DMEM med 2% FBS, 2 mM L-glutamat och antibiotika om det behövs för en total volym på 100 ml.
  3. hPSC-underhåll
    1. Upptining och förvaring av hPSC
      1. Förbered en VTN-belagd 100 mm skål.
      2. För att tina upp en flaska hPSC direkt från flytande kväve, lägg injektionsflaskan i ett 37 °C vattenbad och sväng försiktigt röret i vattnet tills den tinar. Överför de tinade hPSC:erna till ett 15 ml-rör som innehåller 10 ml 1x PBS och centrifug vid 200 x g i 4 min.
      3. Kasta supernatanten och tillsätt 1 ml E8 medium till röret. Pipett ett par gånger för att helt återsuspend pelleten och sedan lägga till ytterligare 9 ml E8 medium för att nå 10 ml totalt.
      4. Sug upp VTN-lösningen från 100 mm-skålen.
      5. Överför hPSCs till en 100 mm skål, skaka försiktigt (upp-ner och vänster-höger, inte i cirklar) för att se till att cellerna fördelas jämnt i skålen
      6. Inkubera vid 37 °C, i 5% CO2.
      7. Följande dag, aspirera alla medium och foder med 10 ml E8.
      8. Mata detta sätt varje dag under de kommande 3-4 dagarna och förbered dig sedan på att dela.
    2. Dela hPSCs
      OBS: hPSCs vid tidpunkten för uppdelningen bör vara 80%-90% konfluent. Stora kolonier med släta och ljusa kanter bör observeras. Kontakt mellan varje koloni bör dock undvikas (figur 2B,dag 0 och figur 6B).
      1. Förbered VTN-belagda 100 mm rätter efter behov.
      2. Aspirera E8 och tvätta skålen som behöver delas 1x med 1x PBS.
      3. Sug upp 1x PBS och tillsätt 4 ml 0,25 M EDTA. Inkubera i 2 min vid 37 °C, 5% CO2.
        HPSC:erna bör delas/repleras som små kolonier. Behandla inte med EDTA längre än 2 min för att förhindra separation i enstaka celler. Cellerna bör fortfarande fästas på skålen ytan efter 2 min behandling.
      4. Aspirera EDTA, lossa kolonierna genom att starkt pipettera 10 ml E8 medium på skålen ytan, och samla alla medium och celler i en 15 ml rör.
      5. Med hPSCs på 80%-90% sammanflödet, dela kolonier med 1:15-1:20. Till exempel, för att dela hPSCs med 1:20 i en 100 mm maträtt, ta 500 μL E8/hPSCs lösning och blanda med 9,5 ml färsk E8 medium.
      6. Platta hPSCs i VTN-belagda 100 mm rätter.
        OBS: Det rekommenderas att fastställa den idealiska split ratio för varje forskare och cellinje självständigt.
    3. Frysning hPSCs
      1. För en 100 mm maträtt av hPSCs som är redo att delas, förbereda tre cryovials och 3,5 ml iskalla medium.
        OBS: Media och injektionsflaska bör förvaras i 4 °C eller på is tills de används.
      2. Sug E8 och tvätta skålen 2x med 1x PBS.
      3. Sug 1x PBS och tillsätt 4 ml 0,25 M EDTA, inkubera i 2 min vid 37 °C, i 5% CO2.
        OBS: hPSCs bör frysas som små kolonier vid den tidpunkt då de skulle delas. Behandla inte cellerna med EDTA längre än 2 minuter för att förhindra separation i enstaka celler. Cellerna bör fortfarande fästas på skålens yta efter 2 min behandling.
      4. Aspirera EDTA, lossa kolonierna genom att starkt pipettera 10 ml 1x PBS på skålens yta, och samla alla medium och celler i ett 50 ml-rör.
      5. Tillsätt 20 ml 1x PBS och centrifug vid 200 x g i 4 min för att tvätta bort resterande EDTA.
      6. Kasta supernatanten och resuspend pelleten i 3 ml iskalla medium.
      7. Fördela hPSCs jämnt i de tre cryovials, 1 ml vardera.
      8. Förvaras vid -80 °C över natten i en kontrollerad fryslåda eller en frigolitsmörgås för att säkerställa en långsam temperaturfall, och sedan överföra till en flytande kvävetank för långsiktig förvaring.

2. Sådd hPSCs att starta differentiering (dag 0)

OBS: hPSCs bör vara redo för differentiering efter att ha stabiliserats (dvs. delas 2-3x efter upptining). Se till att kolonierna är friska, med släta, blanka kanter och minimal differentiering (figur 2B).

  1. Förbered källarmembranmatrisbelagda rätter (24 bra eller 6 brunnsrätter) en dag före dag 0 efter behov. Ta med disken till RT i början av differentiering.
  2. Gör dagen 0–1 till differentiering efter behov.
  3. Sug e8 från konfluenten, redo att dela hPCSs, och tvätta skålen 2x med 1x PBS.
  4. Tillsätt 7 ml 0,25 M EDTA per 100 mm skål, inkubera vid 37 °C, 5% CO2, i 15 min.
    OBS: Vid denna punkt, EDTA behandling förlängs för att sprida sig till enstaka celler.
  5. Pipet av alla hPSCs (de bör flytande) och överföra till en 50 ml rör. Lägg till samma mängd eller mer av 1x PBS som EDTA-lösning för att späda ut EDTA.
  6. Centrifug på 200 x g i 4 min.
  7. Kasta supernatanten, tillsätt 1 ml dag 0–1 differentieringsmedium och pipet för att homogenisera cellerna. Följ genom att lägga till mer medium och blanda sedan för att späda ut celllösningen till en koncentration som är idealisk för att räkna cellerna.
    OBS: Överspäd inte celllösningen. Celler från en full 100 mm skål ska spädas i 5 ml medium för att starta.
  8. Räkna cellnumret med hjälp av en automatiserad cellräknare eller hemocytometer.
  9. Späd celllösningen efter behov för att nå 125 000 celler/cm2 i en låg slutvolym (t.ex. 2 ml per brunn för en 6-brunnsskål eller 500 μL per brunn för en 24-brunnsskål).
    En låg volym hjälper cellerna att fästa snabbare.
  10. Sug upp alla källarmembranmatrislösning från de belagda diskarna och plattan celllösningen i brunnarna.
  11. Inkubera vid 37 °C, i 5% CO2.

3. Neural crest cell induktion (dag 1 till dag 10, figur 2A)

  1. På dag 1 mata cellerna med dag 0-1 differentiering medium (3 ml per brunn för 6 väl rätter och 1 ml per brunn för 24 väl rätter).
  2. På dag 2 mata cellerna med dag 2-dag 10 differentiering medium (3 ml per brunn för 6 väl rätter och 1 ml per brunn för 24 väl rätter).
  3. Från och med nu bör cellerna matas varannan dag fram till dag 10 (dvs nästa utfodring dag kommer att vara dag 4).
    OBS: Från dag 6 på bör NC åsar detekteras(figur 2B). För att kontrollera om differentiering sker rekommenderas att du bär en parallell differentieringskultur i mindre brunnar (dvs. 24 brunnar), som kan färgas för SOX10/AP2a och användas för markörgenuttryck längs tidpunkten för differentiering (figur 2B,C).
  4. Om du sorterar celler fortsätter du till avsnitt 4. Annars går du vidare till avsnitt 5.

4. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för neuralcrestmarkör CD49D och aggregering av NC-celler i sfäroider

OBS: Vid FACS-sortering ska proverna förvaras på is och inte utsättas för ljus efter färgning förrän sortering.

  1. Förbered FACS-bufferten om cellerna är sorterade.
  2. Förbered dag 10–14 sfäroidmedium.
  3. På dag 10, ta bort mediet och tvätta 1x med 1x PBS.
  4. Tillsätt dissociationslösning (se Tabell över material) vid 2 ml per brunn för en 6-brunnsskål eller 1 ml per brunn för en 24-brunnsskål och inkubera vid 37 °C, 5% CO2 för 20 min.
  5. Pipet av alla hPSCs och överför till en 50 ml rör.
  6. Fyll resten av röret med FACS buffert och centrifug på 200 x g i 4 min.
    OBS: Varje 50 ml-rör rymmer upp till 20 ml eller mindre av celllösning. Volymen på FACS-bufferten bör vara tillräckligt hög för att neutralisera dissociationslösningen.
  7. Kasta supernatanten, återsuspend cellerna med lämplig mängd FACS buffert (~ 2 ml per brunn av en 6-brunnsplatta) och räkna för att bestämma cellnumret.
  8. Förbered följande prover.
    1. Prov 1 (ofläckad kontroll): 1 x 106 celler i 400 μL facs-buffert. Filtrera cellerna genom ett 20 μm sillock och håll röret på is.
    2. Prov 2 (DAPI-kontroll): 1 x 106 celler i 400 μL FACS-buffert som innehåller 0,5 ug/mL DAPI. Filtrera cellerna genom ett FACS-rör med en sillock och håll röret på is.
    3. Prov 3 (CD49d-märkt): Suspendera resten av cellerna med FACS-buffert som innehåller PE/Cy7-konjugerad CD49D-antikropp (5 μL för 1 x 106 celler per 100 μl FACS-buffert) i ett 15 ml-rör och inkubera på is i 20 min.
  9. Fyll rören med FACS buffert och centrifug på 200 x g i 4 min.
  10. Kassera supernatanten och resuspend varje 5-10 x 106 celler i 1 ml FACS buffert som innehåller 0,5 ug/mL DAPI enligt tillverkarens anvisningar.
  11. Filtrera cellerna genom FACS-röret med sillocket och håll röret på is.
  12. Förbered insamling FACS rör som innehåller 2 ml FACS buffert.
  13. Sortera igenom FACS-maskinen med lasrar som kan upptäcka DAPI och PE-Cy7 för att isolera CD49D+ befolkningen.
  14. Räkna de sorterade cellerna efter sortering.
  15. Centrifugera alla sorterade celler och återsuspend i dag 10–14 sfäroidmedium till en slutlig koncentration av 0,5 x 106 celler per 500 μl medium.
  16. Platta 0,5 x 106 celler per brunn i ultralåga tillbehör 24 brunnsplattor.
  17. Inkubera cellerna vid 37 °C, i 5% CO2.

5. Aggregera NC-celler i sfäroider

  1. Om du inte använder FACS för att isolera NC-cellerna och i stället samla dem i sfäroider direkt, förbered först cellerna enligt beskrivningen i steg 4.2–4.5.
  2. Fyll resten av röret med 1x PBS och centrifug på 200 x g i 4 min.
  3. Kasta supernatanten, återsuspend cellerna med en lämplig mängd dag 10-14 sfäroid medium (t.ex. ~ 2 ml medium per brunn för en 6 brunnsplatta), och räkna för att bestämma cellnumret.
  4. Späd cellerna i dag 10–14 sfäroidmedium till 0,5 x 106 celler per 500 μl medium.
  5. Platta 500 μL av cellfjädringen per brunn i ultralåga tillbehör 24 brunnsplattor.
  6. Inkubera cellerna vid 37 °C, i 5% CO2.

6. NC sfäroid underhåll och sympatisk progenitor induktion (dag 10 till dag 14, figur 4A)

  1. Alternativ 1: Minimal sfärisk kultur
    1. På dag 11, tillsätt 500 μL dag 10–14 sfäroidmedium till NC-sfäroiderna utan att aspirera på befintligt medium från dag 10. Inkubera vid 37 °C, i 5% CO2.
    2. På dag 12, luta plattan för att ackumulera NC sfäroider på ena sidan av brunnarna. Sug försiktigt och kasta så mycket medium som möjligt, och foder med 1 ml dag 10-14 sfäroid medium.
    3. Fortsätt mata cellerna varje dag fram till dag 14.
    4. Valfritt: Om sfäroiderna aggregat och generera en stor klump, använd en pipett för att bryta sfäroid klumpar upp. Detta säkerställer också att enskilda sfäroider inte blir för stora.
      OBS: Det idealiska sfäroidstorleksområdet bör vara cirka 100–500 μm. Inom detta intervall är storleken på enskilda sfäroider inte kritisk. Morfologin, såsom en slät och klar kanter (figur 3 och figur 6) är dock viktig för ytterligare framgång. Dag 14 innehåller varje 24 brunnsplatta helst ca 50–60 sfäroider av olika storlekar inom det ovan nämnda storleksintervallet.
  2. Alternativ 2: Utökad sfärisk kultur
    1. På dag 15, för att hålla NC sfäroider, foder med 1,5 ml dag 10-14 sfäroid medium som innehåller 0,5 μM RA. Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2.
      OBS: RA bör tillsättas färskt för varje utfodring och alltid förvaras vid -80 °C.
    2. Från och med nu, mata varannan dag fram till dag 28 och fortsätt sedan med plätering av sfäroiderna (avsnitt 7.1).
      OBS: De växande sfäroiderna delas cirka 1x per vecka genom pipettering dem med en 1 ml pipett för att bryta upp dem. De är uppdelade med ett ungefärligt förhållande på 1:2–1:4. Inom 2 veckors expansionsperiod bör cellerna ungefär fyrdubblas i antal.

7. SymN differentiering och mognad (Alternativ 1: efter dag 14; Alternativ 2: efter dag 28)

  1. Plätering sfäroider i vanliga rätter
    1. Förbered PO/LM/FM-belagda 24 brunnsplattor.
    2. Förbered symN-medium som innehåller 0,125 μM RA (tillsätt färska alla foder) och 10 μM Y27632 (endast dag 14).
    3. På dag 14, luta plattan för att ackumulera NC sfäroider på ena sidan av brunnarna. Sug försiktigt och kasta så mycket medium som möjligt, och foder med 1 ml symN medium.
    4. Ta bort LM/FN från de belagda plattorna.
    5. Dela och platta varje brunn från 24 väl plattan i 4 separata brunnar av den nya, belagda 24 väl platta. Varje original brunn kommer att ha 1 ml, som innehåller ~ 50-60 sfäroider. Detta ger 250 μL, innehållande cirka 10–15 sfäroider för varje brunn på den nya plattan.
    6. Tillsätt 250 μL extra medium per brunn.
      OBS: Detta är en uppdelning av 1:4; se till att sfäroiderna fördelas ordentligt i lösningen så att uppdelningen är relativt jämn. Antalet sfäroider räknas inte eftersom det slutliga numret inte påverkar framgången med att generera symNs.
    7. Inkubera vid 37 °C, 5 % CO2.
    8. På dag 15 (eller dag 29 för alternativ 2), foder genom att ersätta alla medium med 1 ml symN medium som innehåller 0,125 μM RA. Från och med nu, nervceller bör matas varannan dag fram till dag 20 (eller dag 35 för alternativ 2).
    9. Efter dag 20 (eller dag 35 för alternativ 2) bör nervcellerna matas genom att endast hälften av det befintliga mediet (500 μL) ersätts noggrant. Från och med nu, mata varje vecka om inte mediet snabbt blir gult.
    10. Håll utfodring varje vecka tills önskad tidpunkt.
      OBS: symNs tenderar att samla i ganglier-liknande strukturer och är benägna att lossna från kulturen rätter. För att förhindra detta rekommenderas halvmatning och minimal hantering.
  2. Pläteringsceller för elektrofysiologisk registrering
    1. Förbered PO/LM/FM-belagda 96 brunns elektrofysiologiska plattor.
    2. Förbered symN-medium som innehåller 0,125 μM RA (tillsätt färska alla foder) och 10 μM Y27632 (endast dag 14).
    3. På dag 14, samla alla sfäroider, sedan centrifugera dem på 200 x g i 4 min.
    4. Kasta supernatanten, tillsätt 2 ml dissociationslösning och överför blandningen tillbaka till en av brunnarna på den extremt låga fästplattan. Inkubera vid 37 °C, i 5% CO2 för 20-45 min.
      OBS: Beroende på storleken på sfäroiderna kan dissociationsperioden vara längre än 20 min. Kontrollera cellens dissociation var 10:e minut upp till 45 minuter. Eventuellt kan 0,1 mg/ml DNase läggas till med dissociationslösning för att förhindra att fritt DNA från döda celler gör lösningen klibbig. Detta är valfritt i det här protokollet eftersom sfäroiderna inte kommer att aggregera när de är helt separerade.
    5. Pipet att helt separera sfäroider, sedan centrifug på 200 x g i 4 min.
    6. Kasta supernatanten, återanvända cellerna med lämplig mängd symN-medium och räkna cellnumret.
    7. Platta cellerna på 100 000/cm2 i PO/LM/FN-belagda elektrofysiologibrunnar i 200 μl total volym per brunn.
    8. På dag 15 (eller dag 29 för alternativ 2), följ samma utfodringsprocesser som i avsnitt 7.1. Den totala volymen efter dag 15 (eller dag 29 för alternativ 2) bör vara 300 μL per brunn.
    9. Mät de elektriska signalerna med hjälp av en flerelektrodmatrismaskin efter dag 20 (eller dag 35 för alternativ 2).
      OBS: I alternativ 2 kan sfäroider pläteras när som helst mellan dag 14-dag 28. De första mätningarna av elektriska signaler kan utföras 1 vecka efter plätering av sfäroiderna.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I det här protokollet ger vi instruktioner om hur du genererar symN från hPSC. De kulturförhållanden som demonstrerades här förbättrades från ett tidigare publicerat protokoll23,,24 (figur 1A)till matarfria och kemiskt definierade förhållanden (figur 1B). Två alternativ finns, ett där symN görs inom 20 dagar, och ett annat där de nationella centralbankerna kan utökas i 2 veckor för att generera fler celler som sedan kan differentieras till symN(figur 1B, alternativ 1 och 2).

För att korrekt övervaka symN-egenskaperna hos differentierade celler, PHOX2B-eGFP WA09 reporterlinje och den överordnade WA09 PSCs linje19. Alla differentieringar utfördes i minst tre biologiska repetitioner, definierade som oberoende differentieringsexperiment efter minst en passage och/eller härrör från en nytinad flaska celler. Differentiering föranleddes när sammanflödet av odifferentierade hPSCs nådde 80%-90%. HPSC kolonierna var runda, med blanka, släta kanter och liten eller ingen differentiering. Kolonierna bör inte röra varandra (figur 2B, dag 0). I stället för typiska dubbla SMAD hämning25, som tidigare användes för neurectoderm induktion, TGF-β hämning i kombination med WNT och BMP4 signalering under de första 2 dagarna ledde till robust uttryck för den tidiga neurala crest markör AP2a. Den neurala crest markör SOX10 uttrycktes från dag 4 till dag 10 (Figur 2B). NCCs uppstod i täta, mörka åsar synliga från dag 6 på. Dessa åsar uttryckt SOX10 (figur 2B, pilar). Det har tidigare visats att SOX10 på NCC-stadiet korrelerar med cellytans markör CD49D23,26 och därmed CD49D kan användas för att sortera NC-celler som inte rapporterar någon fluorofor från SOX10 locus. Figur 2C visar uttrycket av NCC markör gener över tiden. Figur 2D visar att vår differentieringseffektivitet var över 80 %. För att fastställa identiteten på de återstående cellerna, qRT-PCR användes för att testa för kontaminerande celltyper, inklusive BryT-uttrycker mesoderm, SOX17-uttrycker endoderm och PAX6-uttrycker neuroectoderm; alla befanns vara frånvarande eller uttryckta på mycket låga nivåer (uppgifter som inte visas, se tilläggstabell 1 för alla grundfärger). Vissa SIX1/EYA1+ placode upptäcktes dock (data visades inte) som kan vara källan till de återstående celltyperna. Dessutom är det möjligt att de återstående celltyperna är NCC-derivat som redan är ytterligare differentierade. De nationella kontaktpunkternas HOX-kod bedömdes i detta skede(figur 2E). I detta tidiga skede var dock HOX-signalerna mycket låga (notera skalan), vilket tyder på att dessa nccs var antingen av kranial-NC karaktär eller inte hade antagit någon NCC subtyp karaktär ännu.

Dag 10 kunde de nationella kontaktpunkterna renas med facs, vilket gav omkring 80 % CD49D+ NCCs(figur 2D). Ett exempel på en typisk gatingstrategi anges i figur 2D. Efter sorteringen aggregerades cellerna som NC-sfäroider (figur 3A). För att expandera NCCs och inducera bålen-NC-liknande egenskaper, cellerna behandlades med en kombination av FGF2 och CHIR. Vi testade om sortering för CD49D+ befolkningen gav bättre eller renare kulturer av symNs senare. Figur 3B jämför osorterade jämfört med CD49D+ sorterade jämfört med CD49D- sorterade cellpopulationer. Till vänster kan man se att de positiva sorterade och de osorterade populationerna gjorde NC-sfäroider på ett liknande sätt, medan de negativa sorterade cellerna inte aggregerade ordentligt, inte gjorde runda, släta, friska ser sfäroider och dog inom 3-4 dagar. När NC-sfäroiderna jämfördes dag 14 via qRT-PCR för NC- och symN-stammarkörer kunde dessutom signifikanta skillnader mellan sorterade och osorterade celler inte upptäckas. Märkbart, på denna punkt uttrycket av sympatiska stamceller markörer var fortfarande låg och SOX10 nivåer förblev hög, vilket tyder på att sfäroider fortfarande bestod av celler med NC egenskaper. En dag efter plätering (dag 15), både osorterade och CD49D+ sfäroider fäst väl till PO / LM / FN rätter och neurite utväxt kunde tydligt observeras (figur 3B, D15 och figur 3C, D29). De osorterade och sorterade kulturerna fördes vidare till dag 35 parallellt, men inga större skillnader sågs (uppgifter visades inte). Man kan därför dra slutsatsen att sorteringssteget inte var nödvändigt för att skapa symN, och därför är det ett frivilligt steg i detta protokoll. Men för mindre effektiva differentieringar som inte ger 80% CD49D+ celler, rekommenderar vi sorteringsproceduren.

Därefter testade vi om dessa NC sfäroider kunde upprätthållas utan att förlora sin NC identitet(Figur 3A, alternativ 2). De nationella kontaktpunkterna odlades som sfäroider i upp till 2 veckor (figur 3C). Morfologi dag 28 sfäroider och pläterade celler på dag 29 var liknande jämfört med dag 14 och 15 celler i alternativ 1. På dag 28, SOX10 uttryck hölls på liknande nivåer som dag 14. Uttrycket för tidiga sympatiska progenitormarkörer (dvs. ASCL1, PHOX2B och GATA3) ökade dock (figur 3C, höger), vilket tyder på att den utökade kulturen i FGF2, WNT och RA signalering ledde till mognad och posteriorization (Figur 4C och F). Liknande effekter har tidigare rapporterats av Kirino et al21.

Efter NC expansion (alternativ 1 eller alternativ 2), var sfäroider pläterade på PO / LM / FN belagda rätter och levereras med flera neurala faktorer för att mogna symNs (Figur 4A). Dag 20 och 35 (1 vecka efter plätering i alternativ 1 respektive 2) observerades neuriter i ett radiellt mönster som sträcker sig från de bifogade sfäroiderna (figur 4A, höger). Dessutom uttrycktes markörer relaterade till noradrenalin (NE) syntes och transport (dvs. TH, AAAD, DBH)(Figur 4B). Förekomsten av förorenande celltyper undersöktes här igen, och uttryck för ChAT, som kan indikera parasympatiska nervceller, hittades (figur 4B,E). Emellertid, ChAT uttrycks också i kolinerga symNs. Mycket låga nivåer av VIP, en annan parasympatisk markör, upptäcktes (data visas inte). Dessutom upptäcktes låga nivåer av BRN3A, ISL1 och RUNX1 (figur 4B,E), vilket kan tyda på antingen sensoriska nervceller eller trigeminal nervceller, dvs derivat av placode. Minimal EDNRB (märkning enteriska nervceller) och OLIG2 (märkning motorneuron) upptäcktes (data visas inte). Identiteten på icke-neuronala celler är fortfarande oklart. Men baserat på resultat från vår tidigare symN protokoll23, de var troligen αSMA+ myofibroblasts. Uttryck för HOX gener granskades på nytt, och det konstaterades att HOX5-9 uttrycktes, vilket tyder på en stam identitet. HOX10 (ett tecken på sakral-NC) uttrycktes inte (figur 4C, F). Slutligen uttrycktes mogna markörer, inklusive nikotinacetylkolinreceptor (CHRNA3/4) och NE-relaterade receptorer, inklusive adrenerga receptorer (ADRA2A/B2) NE-transportör (NET, SCL6A2) och vesicletransportör (VMAT1)(figur 4D,G). Ingen signifikant skillnad konstaterades i uttrycket av dessa gener i celler som härleddes med alternativ 2 jämfört med alternativ 1 (figur 4E–G).

Vi bekräftade ytterligare våra resultat genom att utföra detta protokoll på H9-PHOX2B: GFP reporter linje (Figur 5). Vid dag 20 bildade cellerna en tät gräsmatta av nervceller och aggregerade i kluster med ännu högre densitet, vilket indikerar en mycket hög differentieringseffektivitet (figur 5A, översta raden). Färgningen visade att de flesta symNs klump i dessa kluster, vilket gjorde bedömningen och kvantifieringen av den övergripande differentieringseffektiviteten svår. För att markera färgning och samlokalisering av specifika symN-markörer fokuserade vi på de mindre täta områdena i utkanten av kluster (se gul ruta i figur 5A, höger). Det var också där de flesta förorenande celler var belägna, så det var inte ett bra område att bedöma övergripande effektivitet. Icke desto mindre, typiska symN markörer; inklusive periferin (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronal), DBH och NET1 (uttryckt i punkter längs symN organ och axoner, figur 5A, botten); upptäcktes. En multielectrode array (MEA) strategi användes för att mäta elektrisk aktivitet, och det konstaterades att dag 20 symNs sköt på ca 3-5 spikar per sekund jämfört med den negativa kontrollen av odifferentierade hPSCs (Figur 5B). Det är viktigt att cellerna fördelas jämnt i brunnen för att varje elektrod (svarta prickar i figur 5B, ljust fält) ska kunna registreras korrekt. Dag 20 till dag 30 symNs stimulerades också med 1 μM nikotin, som imiterar preganglionic signalering av symNs in vivo och ökade den genomsnittliga bränning i cellerna. Hämning av nervceller mättes också. β2-adrenerga receptor (ADRB2), som ligger på symN axon terminaler, skapar en positiv återkoppling slinga för NE sekretion29. Behandling av symN med 1 μM propranolol (en β2-adrenerga receptorantagonist) hämmade deras aktivitet (figur 5C, höger). Dessa resultat tyder på att de symN som genereras av detta protokoll var funktionellt aktiva.

Figure 1
Figur 1: Schematisk illustration och jämförelse av symN differentiering protokoll. a)Tidigare protokoll från Zeltner et al.23. (B) Optimerat protokoll. Alternativ 1 är 20 dagar lång och innehåller endast 4 dagar nc sfäroid kultur. Alternativ 2 är 35 dagar lång och innehåller en 2 veckors NC sfäroid expansion skede som möjliggör produktion av fler NC celler. VTN = vitronectin, PO = poly-L-ornitin, LM = laminin, FN = fibronectin, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = retinoinsyra, AA = askorbinsyra, NFs = NGF+BDNF+GDNF. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: NC-induktion. (A)Tidslinje och behandlingar för NC induktion från dag 0 till dag 10. (B)Morfologi och bildandet av NC åsar övervakades varannan dag med ljus fältmikroskopi. Celler vid varje tidpunkt efter dag 2 var co-färgade för AP2A (röd) och SOX10 (grön). Alla immunofluorescens bilder var mothållna med DAPI. Röda pilar indikerar åsens strukturer. (C)qRT-PCR-analys för uttrycksprofilen för NC-markörer från dag 2–10. D)Representativt område för FACS-sortering dag 10 för CD49D+ NC-populationer (vänster). En typisk gating strategi och isotyp kontroll anges i de fyra första tomterna. Kvantifiering av CD49D+ cell procent på dag 10 utfördes också. (E)qRT-PCR analys för uttrycksprofilen för HOX gener från dag 2-10. NC = neurala krön. Felstaplar härrör från data från n ≥ 3 biologiska repetitioner, definierade som oberoende differentieringsexperiment som görs på separata dagar från PSC-kulturer som var minst en uppdelade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Underhåll och expansion av neurala vapen. (A)Tidslinje och behandlingar för NC expansion under dag 10 till dag 14 kultur för alternativ 1 eller dag 10 till dag 28 kultur för alternativ 2. B)NC-sfäroidbildningen övervakades av ljus fältmikroskopi från dag 11 (1 dag efter sfäroidbildning) till dag 14 (dvs. pläteringsdagen). Osorterade, CD49D+och CD49D- populationer jämfördes. De pläterade cellerna på dag 15 visas också. Celler misslyckades med att bilda sfäroider ordentligt i CD49D- gruppen och dog efter plätering. Dag 14 celler undersöktes av qRT-PCR analys (höger) för uttrycket profilen för symN stamfader. Osorterade och CD49D+ populationer jämfördes (n ≥ 3). (C)NC-sfäroider kan bibehållas i upp till 2 veckor. Sfäroider övervakades av ljusa fältmikroskopi från dag 15 till dag 28 (landningsdagen). De pläterade cellerna dag 29 visas också. Dag 28 sfäroider undersöktes av qRT-PCR analys för uttrycket profilen för symN stamfader (höger). Osorterade och CD49D+ populationer poolades (n ≥ 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: SymN differentiering och mognad. (A)Tidslinje och behandlingar efter plätering på dag 14 för alternativ 1 eller dag 28 för alternativ 2. Ljusa fältmikroskopi bilder (höger) visar symNs på dag 20 och dag 35, respektive (1 vecka efter plätering för båda alternativen). (B–D) Alternativ 1 qRT-PCR-analys för uttrycksprofilen för symN-egenskaper mellan dag 20–30. Osorterade och CD49D+ populationer poolades. (E–G) Alternativ 2 qRT-PCR-analys för uttrycksprofilen för symN-egenskaper efter dag 35. Osorterade och CD49D+ populationer poolades (n ≥ 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Funktionell karakterisering av symNs. (A, översta raden) Ljus fältbild av symN-kluster dag 20 och färgade bilder som visar PRPH och TH dubbla positiva celler mestadels belägna i kluster. (A, botten) Flera symN markörer (separerade kanaler) kontrollerades av immunofluorescence färgning på dag 20. Noradrenalin transportören (NET1) var belägen både på ytan av cellkropparna samt längs axoner och dendriter. Det dök upp som prickar vid denna förstoring. Alla immunofluorescens bilder var mothållna med DAPI. (B)Representativa värmekartor för flerelektrodgraf (MEA) analys för symNs dag 20 (överst). Den ljusa fältbilden (botten) visar densiteten hos symNs och fördelningen av elektroder (åtta svarta prickar). Osorterade och CD49D+ populationer samlades här. CKvantifiering av genomsnittliga eldningshastigheter för dag 20–30 symN under behandling av 1 μM nikotin och 1 μM propranolol i 5 min (höger). Resultat från osorterade och CD49d-positiva populationer samlades (n ≥ 3). Obetald, tvåstjärtad t-test med Welchs korrigering, p-värde:*<0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Exempel på celler under förhållanden som är olämpliga att gå vidare med differentieringen. (A)Tidslinje för differentieringen med varje kontrollpunkt för cellmorfologier som anges i B–E. b)hPSCs (a) med friska kolonier och många differentierade celler, och b) sammanslagna och differentierade gränser mellan vissa kolonier dag 0. Röda pilar anger de sammanfogade områdena. (C)NCCs på dag 10 med bubbla-liknande blåsor i åsarna. Röda pilar visar blåsorna i den översta raden. Den nedre raden representerar en högre förstoring. Vi har inte kunnat identifiera blåsornas cellidentitet. Förekomsten av fler blåsor verkar dock korrelera med lägre SOX10/CD49D uttryck. (D)Oregelbundna spheroids saknar släta kanter och rund form på dag 14. (E)Ohälsosamma och döende symNs på dag 20. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi publicerade nyligen två recensioner, en diskuterar användningen av hPSC-härledda symNs för sjukdom modellering31 samt en djupgående jämförelse av tillgängliga differentiering protokoll22. Således fokuserar vi här på felsökning av det nuvarande protokollet för att hjälpa den intresserade forskaren att lyckas göra symNs. Under hela differentieringsprocessen, för att få konsekventa data samt friska differentierade celler, bör kontaminering i alla steg kontrolleras noggrant. Vid rutinmässigt hPSC-underhåll bör mykoplasmatestning utföras varannan vecka eller månadsvis. Om cellsortering utförs på dag 10, uppmuntras tillsats av antibiotika till vilket medium som helst. Det är också viktigt att kontrollera cellmorfologi före och efter att ha startat differentieringen. Här föreslår vi flera kritiska kontrollpunkter (figur 6A). För det första bör idealiska hPSC kolonier redo för differentiering ha ljusa och släta kanter med små spikar. Kolonier med kugghjulsliknande spikar har börjat differentiera och bör inte användas. Det rekommenderas starkt att celler vid den perfekta tidpunkten ska användas omedelbart, eftersom morfologin kan förändras inom några timmar. Att skjuta upp cellerna (figur 6B, a) eller leda till kontakt mellan kolonier ( figur6B, b), vilket stimulerar differentiering i hPSC. Det är en utmaning att bli av med varje differentierad cell i en kultur, men befolkningen bör kontrolleras för att innehålla mindre än 5% av dåliga kolonier. När du följer detta protokoll är den andra kontrollpunkten under differentiering mellan dag 2 och dag 10. I detta skede bör mörka NC-åsar tydligt observeras under ett ljust fältmikroskop (figur 2C). Tjockleken och fördelningen av åsar kan användas som indikatorer på NC effektivitet: Eftersom NCCs huvudsakligen härrör från celler som bildar åsar, tunna eller mindre utbredda åsar och blåsor i åsarna kan tyda på låg NC produktion, och därför bör märkas eller kasseras i händelse av inkonsekventa resultat (figur 6C). RNA-provtagning rekommenderas starkt dag 10 för att kontrollera nc-markörer som beskrivs ovan. Den tredje kontrollpunkten är under NC sfäroid skede, eftersom sfäroider kan aggregera. Det är bäst att regelbundet pipet mediet för att bryta upp och återsuspend aggregering (celler kommer inte att spridas tillbaka till enstaka celler men små sfäroider bara). Om sfäroiderna expanderar för snabbt, dela dem med 1:2 eller 1:4 för att lämna tillräckligt med utrymme och näringsämnen för cellerna att växa. Om sfäroider inte har släta och runda former (figur 6D), kan det tyda på att NC effektivitet på dag 10 inte var tillräckligt hög, och därmed kan förstöra den slutliga differentieringen. Testning uttryck profiler för att kontrollera symN stamfader egenskaper rekommenderas på önskad sfäroid plätering dag. Den fjärde kontrollpunkten är efter plätering sfäroiderna. Neuriter bör vara väl synliga och buntar bör börja bildas efter dag 20. Celler utan utbredda neuriter och buntar bör betraktas som kontaminering (figur 6E). Vid denna punkt, Det är viktigt att mata nervceller genom att ersätta endast hälften av det befintliga mediet för att upprätthålla näringsrik miljö som skapats av stabila nervceller. Var försiktig när du matar celler, eftersom mognande symNs är sårbara och kan lätt lossna. Resonera för varje av dåligan-ser morphologies som här beskrivas, är inte fullständigt förstådd ännu. Det ger dock insikt i hPSCs känsliga natur och in vitro-differentiering. En källa till sådana oegentligheter kan bero på reagenser från olika leverantörer. Till exempel, de tunna åsar med blåsor dyker upp när du använder ett annat märke av BMP4.

För elektrofysiologisk analys med MEA, för att jämnt fördela symN i elektrodbrunnarna, separeras sfäroider av Accutase. Behandlingstiden bör vara 20 min till att börja med. Men eftersom sfäroider är mycket komprimerade, kan tiden för dissociation ökas till 45 min för att säkerställa att sfäroiderna är helt separerade. I allmänhet måste varje experimentell grupp på en MEA-platta köras i multiplar av minst sex för att få konsekventa resultat. Noterbart är att eftersom vår densitet för replating är mycket lägre än tillverkarensrekommendationer 32 (ca 500–700 000/cm2),är brunnsrepetitionerna avgörande. I våra resultat, både betydande symN markör uttryck och stabil aktivitet dyker upp från dag 20 till dag 30. Vi rekommenderar detta som den bästa tiden för att börja registrera de variabler som du väljer. För varje differentiering bör mediet göras färskt och användas så snabbt som möjligt (inte längre än en månad).

SymN differentiering protokoll som presenteras här är feeder-fri, kemiskt definierade, effektiv, utbyggbar, och ger funktionella symNs av dag 20. Denna definierade symN differentiering protokoll kan användas för att studera mänskliga störningar i det sympatiska nervsystemet, som en plattform för läkemedelsscreening, för tumorigenesis studier såsom neuroblastom/feokromocytom, eller för grundforskning i homeostatisk reglering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Vi vill tacka Heidi Ulrichs för kritisk läsning och redigering av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Tags

Utvecklingsbiologi Nummer 159 mänskliga pluripotenta stamceller neurala vapen sympatiska nervceller autonoma nervsystemet sympatiskt nervsystem matarfri kemiskt definierad stamcellskultur
Effektiv differentiering av postganglitoniska sympatiska nervceller med hjälp av mänskliga pluripotenta stamceller under Feeder-fria och kemiskt definierade kulturförhållanden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient… More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter