Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Эффективная дифференциация постгонглионических симпатических нейронов с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток в соответствии с безкормовыми и химически определенными условиями культуры

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/60843
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

Summary

В этом протоколе мы описываем стабильную, высокоэффективную стратегию дифференциации для генерации постганглионических симпатических нейронов из человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Эта модель сделает нейроны доступными для использования исследований множественных вегетативных расстройств.

Abstract

Плюрипотентные стволовые клетки человека (HPSCs) стали мощным инструментом для моделирования заболеваний и изучения эмбрионального развития человека в пробирке. Ранее мы представили протокол дифференциации для производности вегетативных нейронов с симпатическим характером, который был применен к пациентам с вегетативной невропатией. Тем не менее, протокол был построен на Knock Out Сыворотки Замена (KSR) и фидер основе условий культуры, и для обеспечения высокой эффективности дифференциации, сортировка клеток была необходима. Эти факторы вызывают высокую изменчивость, высокую стоимость и низкую воспроизводимость. Кроме того, не были проверены зрелые симпатические свойства, в ключая электрическая активность. Здесь мы представляем оптимизированный протокол, в котором культура и дифференциация PSC выполняются в условиях культуры, свободной от фидера и химически определенных. Идентифицированы генетические маркеры, идентифицирующие нервный гребень ствола. Дальнейшая дифференциация на постгнилионические симпатические нейроны достигается через 20 дней без необходимости сортировки клеток. Электрофизиологическая запись дополнительно показывает функциональную идентичность нейронов. Стрельба, обнаруженная у наших дифференцированных нейронов, может быть усилена никотином и подавлена атранергическим антагонистом-антагонистом. Промежуточные симпатические нейронные прародители в этом протоколе могут быть сохранены в качестве нейронных сфероидов на срок до 2 недель, что позволяет расширить культуры. В целом, наш обновленный протокол дифференциации нейронов показывает высокую эффективность дифференциации, лучшую воспроизводимость, большую гибкость и лучшее созревание нейронов по сравнению с предыдущей версией. Этот протокол предоставит исследователям клетки, необходимые для изучения человеческих расстройств, которые влияют на вегетативную нервную систему.

Introduction

Постганглионические симпатические нейроны (симны) принадлежат к вегетативной нервной системе (ANS) и играют несколько важных ролей в реагировании и регулировании гомеостаза тела, независимого от сознания. Например, стресс стимулирует симны и вызывает ответ на борьбу или полет, что приводит к увеличению частоты сердечных приступов, артериального давления и потоотделения. Символы страдают от множественных расстройств человека из-за генетики, токсичности / травмы, или в качестве компаньонов к другим заболеваниям. Примером генетической невропатии является детское расстройство семейной дисавтотомии (FD), где тяжелая дисрегуляция симн вызывает дистостентомический кризис, очевидный потливость, пятно кожи, рвота приступы, гипертония, и тревога1. Примером токсичности является химиотерапия, которая, как сообщается, имеют токсические побочные эффекты на вегетативные нейроны2. Известно, что вегетативная денервация и гипериннервация могут привести к или сопровождать такие заболевания, как болезнь Паркинсона или гипертоническая почечная болезнь3,4. Таким образом, возможность проводить исследования и понимать механизмы симН биологии и дефектов в контексте болезни полезно для поиска новых и эффективных методов лечения.

Анатомии
Периферическая нервная система ветвится в сенсорные и вегетативные деления. Афферентные нервы сенсорной нервной системы отвечают за ощущение боли и прикосновения, в то время как ANS отвечает за передачу информации из всех органов в мозг. АНС делится на кишечную нервную систему, иннерватирующую желудочно-кишечный тракт, парасимпатическую нервную систему, что важно для расслабления, и симпатическую нервную систему (СНС), что важно для активации/регулирования органов. SNS адаптирует двухнейронную систему5. Преганглионические симпатические нейронные аксоны в спинном мозге сначала проект симпатической ганглиев, где postganglionic симН клеточные тела расположены. Эти нейроны затем отправить длинные прогнозы для innervate целевых тканей каждого органа в организме. Сигналы, передаваемые преганглионическими нейронами, являются холинергическими, в то время как постганглионические симнявляются являются адренергическими и, таким образом, выражают норадреналин (NE) в качестве основного нейромедиатора. Есть несколько заметных исключений постгонглионических, симпатических нейронов, которые холинергических, в том числе те, иннервируя кровеносные сосуды. Adrenergic postganglionic нейроны выражают ферменты тирозин гидроксилаза (TH), ароматические L-аминокислоты декарбоксилаза (AAAD), допамина - гидроксилаза (DBH), и моноамин оксидаза (МАО-А), все отвечает за генерацию и метаболизацию NE. Кроме того, они выражают NE рециркуляции транспортеров и / или рецепторов - adrenergic рецепторов (ADRA2), к-адренергический рецептор (ADR2B), норадреналин транспортер (NET1), и везикулярный моноамин транспортер (VMAT1/2).

Развития
Во время эмбрионального развития симны являются производными от нервного гребня (NC), который возникает между нервной трубки и наложения эктодерм6, и может дифференцировать в нескольких клеточных линий, в том числе меланоцитов, остеобластов, адипоцитов, глия, энтерические нейроны, сенсорные нейроны, и вегетативые нейроны7. Нейронные клетки гребня (NCCs) высоки мигрирующие клетки которые принимают несколько путей через зародыш. На этой ранней стадии развития NC, клетки выражают маркеры SNAIL1'2, FOXD3, и SOX108,,9,,10,11. Маршрут миграции вместе с их осевым местоположением определяет подтип NC, в который они будут развиваться. Эти подтипы NC можно отличить по их специфической экспрессии генов HOX: крякные NCCs не выражают гены HOX, неисправные NCCs выражают HOX 1-5, хоботные NCCs выражают HOX 6-9, и сакральные NCCs выражают HOX 10-1112. Среди них магистральные НКК признаны основным источником симнов. Предшественники SymN выражают транскрипционный фактор MASH1/ASCL113, который способствует выражению PHOX2B14 и INSM115. Семейство транскрипционных факторов GATA выражается во время позднего сочувственного развития. GATA2 и GATA3 выражены в симнях, которые, в свою очередь, активируют DBH16. Коэффициент транскрипции HAND2 также важен для выражения и поддержания DBH и TH17.

HPSCs (например, эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) являются мощным инструментом18 для повторения парадигм развития и создания симнов, которые затем могут быть использованы для моделирования заболеваний различных человеческих расстройств. Таким образом, создавая симнизмы из HPSC, крайне важно следовать руководящим принципам развития и оценивать выражение соответствующих маркеров в процессе дифференциации.

Предыдущий протокол symN
Немногие исследовательские группы ранее сообщали о генерации симнов из hPSCs19,,20,,21. Прямое сравнение этих протоколов друг с другом и нашими был рассмотрен недавно22. В 2016 году23, мы опубликовали протокол дифференциации для поколения вегетативных нейронов с символом symN(рисунок 1A). В этом протоколе использовалась среда на основе КСР, которая использовалась как в поддержании недифференцированных hPSCs, так и в дифференциации клеток. Кроме того, hPSCs были сохранены на мыши эмбриональных фибробластов (MEF фибробластов). Мы использовали этот протокол и PSCs от пациентов с FD для моделирования расстройства23. В 2019 году мы описали более подробную версию этого старогопротокола 24. Таким образом, нервная судьба была вызвана двойным ингибированием SMAD25, чтобы блокировать TGF-я и BMP сигнализации в первые 2 дня. Активация WNT с использованием CHIR99021 способствовала нейронных прародителей, чтобы стать nc-клетками. На 11-й день, клетки были отсортированы FACS для CD49D+ или SOX10- популяций26,23, что дало около 40% NC эффективности генерации. Таким образом, сортировка была необходима для обеспечения эффективности и чистоты для следующих шагов дифференциации. NCCs были сохранены и усилены как сфероиды с комбинированным лечением FGF2 и CHIR. После 4 дней, NC сфероидов обслуживания были покрыты и с учетом BDNF, GDNF, и NGF, чтобы закончить созревание symN. Хотя эти символы выразили сильные символы, такие как ASCL1, TH, DBH и PHOX2A, маркеры для более зрелых симнов, включая выражение никотинового ацетилхолина (CHRNA3/CHRNB4) и везикальный транспортер (VMAT1/2), были низкими даже после 70 дней дифференциации. Гены HOX в этом протоколе не были официально протестированы, а зрелые нервные свойства, включая электрофизиологическую активность клеток, не были проверены.

Здесь мы представляем оптимизированный протокол для генерации симнов(рисунок 1B). HPSCs поддерживаются в условиях фидер-бесплатно, на витронектин (VTN) покрытием блюда, используя Основные 8 (E8) СМИ27. Формула дифференциации средств массовой информации была изменена на каждом этапе, тем самым увеличивая процент населения NC28. Созревание symN может быть выполнено на+CD49D /SOX10- отсортированных или несортированных популяциях NCC. Оба показывают высокий уровень выражения маркера symN к 30-му дню. Кроме того, симны, генерируемые с помощью этого протокола, реагируют на электрофизиологическую запись и на лечение симН-активатором и ингибиторными соединениями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: H9 PHOX2B: GFP репортер линия была предоставлена Oh et al.19. Некоторые праймеры qPCR, используемые в этой работе, были получены от OriGene Technologies, в то время как несколько последовательностей получены из Frith et al.20,30.

1. Настройка для посуды, подготовки средств массовой информации и обслуживания hPSC

  1. Блюдо покрытие
    1. Покрытие витронектина (ВТН)
      1. Поместите флаконы VTN в воду 37 градусов по Цельсию до полного размораживания, а затем тщательно перемешайте.
      2. Для 100 мм Петри блюдо, смешать 7 мл 1x фосфат буферного соления (PBS) с 0,5 мг/мл VTN, добавить раствор VTN к блюду, и инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч.
    2. Подвал мембранного матричного покрытия
      1. Оттепель флаконы подвала мембранной матрицы (см. Таблица материалов) на льду при 4 градусах Цельсия в одночасье.
      2. Для одной скважины из 6 хорошо пластины, смешать 2 мл DMEM / F12 с 20 зл 100x подвал мембранной матрицы, добавить подвальные мембраны маминтарии раствор блюдо, оберните блюдо с парафина пленкой, и хранить в чистом контейнере на 4 кв к в одночасье. Работайте как можно быстрее. Помятые блюда можно хранить в 4 градусах Цельсия в течение 2 недель.
    3. Полиорнитин (PO)/ламинин (LM)/фибронектин (FN) покрытие
      1. В первый день, для одного колодца из 24 хорошо пластины, смешать 15 мкг /мл PO с 1 мл 1x PBS, инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 ночь. Оттепель как LM и FN на -20 градусов по Цельсию на ночь и хранить при 4 градусах Цельсия до полного оттаять.
      2. На второй день, аспиратpo PO решение, мыть скважины 2x с 1x PBS, добавить 1 мл 1x PBS, содержащий 2 мкг/мл LM и 2 мкг/мл FN и инкубировать при 37 градусах По в 5% CO2 ночь. На данный момент блюдо с раствором LM/FN можно хранить в инкубаторе в течение нескольких месяцев, пока оно не высохнет. Добавьте больше 1x PBS для того чтобы предотвратить тарелку от высыхания вне.
  2. Подготовка средств массовой информации
    1. Подготовка Основные 8 средних (E8) путем оттаивания одной бутылки E8 дополнения на 4 КС в одночасье. Смешайте дополнение с 500 мл E8 средних и антибиотиков, если это необходимо.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работа E8 решение должно быть использовано в течение 2 недель.
    2. Подготовьте замораживающую среду hPSC, смешивая 90 мл полной среды E8 с 10 мл DMSO общим объемом 100 мл. Фильтр стерилизовать.
    3. Подготовьте среду дифференциации от 0 до дня 1, смешав 100 мл основного 6 (E6) носителя с 10 мкм SB431542, 1 нг/мл BMP4, 300 нМ CHIR99021 и 10 мкм Y27632 при общем объеме 100 мл.
    4. Подготовьте день 2 к дню 10 дифференциации среды путем смешивания 100 мл E6 среды с 10 мкм SB и 0,75 мкм CHIR99021 для общего объема 100 мл.
    5. Подготовьте день 10 к дню 14 сфероидной среды путем смешивания нейробазальной среды с 2 мл B27 (50x), 1 мл N2 (100x), 2 мМ L-глутамата, 3 мкм CHIR99021, и 10 нг/мл FGF2 для общего объема 100 мл.
    6. Подготовка день 14 на день 28 средних для сфероидов долгосрочного обслуживания, добавив 0,5 мкм свежего РА в день 10 на день 14 сфероидных среды для каждого кормления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите РА при -80 градусах по Цельсию.
    7. Подготовка среды созревания SymN путем смешивания нейробазальной среды с 2 мл B27 (50x), 1 мл N2 (100x), 2 мМ L-глутамат, 25 нг/мл GDNF, 25 нг/мл BDNF, 25 нг/мл NGF, 200 мкм аскорбиновой кислоты, и 0,2 мм dbcAMP для общего объема 100 мл. Раствор следует использовать в течение 2 недель. Перед каждым кормлением добавьте 0,125 мкм свежего РА. Это решение используется с 14-го дня (вариант 1) или 28-го дня (вариант 2).
    8. Подготовьте буфер FACS, смешивая DMEM с 2% FBS, 2 мМ L-глютамат и антибиотики, если это необходимо для общего объема 100 мл.
  3. hPSC техническое обслуживание
    1. Таяние и хранение hPSCs
      1. Приготовьте одну тарелку с покрытием VTN с покрытием 100 мм.
      2. Чтобы разморозить флакон hPSCs непосредственно из жидкого азота, положить флакон в воду 37 градусов, тщательно размахивая трубки в воде, пока он не оттаивает. Перенесите оттаять hPSCs на трубку 15 мл, содержащую 10 мл 1x PBS, и центрифугу на 200 х г в течение 4 мин.
      3. Отбросьте супернатант и добавьте 1 мл среды E8 в трубку. Pipette несколько раз, чтобы полностью приостановить гранулы, а затем добавить еще 9 мл E8 среды для достижения 10 мл общей сложности.
      4. Аспирируйте раствор VTN из 100-мм блюда.
      5. Перенесите hPSCs на 100-мм блюдо, осторожно встряхните (вверх и влево-вправо, а не по кругу), чтобы убедиться, что клетки равномерно распределены в блюде
      6. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.
      7. На следующий день, аспирировать все средние и корма с 10 мл E8.
      8. Кормите таким образом каждый день в течение следующих 3-4 дней, а затем подготовиться к расколу.
    2. Разделение hPSCs
      ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs в точке расщепления должно быть 80%-90% слияния. Следует наблюдать большие колонии с гладкими и яркими краями. Тем не менее, контакт между каждой колонией следует избегать(рисунок 2B, день 0 и рисунок 6B).
      1. Приготовьте посуду с покрытием VTN на 100 мм по мере необходимости.
      2. Аспирировать E8 и мыть блюдо, которое должно быть разделено 1x с 1x PBS.
      3. Аспирировать 1x PBS и добавить 4 мл 0,25 М EDTA. Инкубировать в течение 2 мин при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: HPSCs должны быть разделены / replated как небольшие колонии. Не лечите ЭДТА дольше 2 мин, чтобы предотвратить разделение на одиночные клетки. Клетки должны быть по-прежнему прикреплены к поверхности блюда после 2 мин лечения.
      4. Аспирировать EDTA, отсоединить колонии, сильно pipetting 10 мл E8 среды на поверхности тарелки, и собрать все средние и клетки в 15 мл трубки.
      5. С hPSCs на 80%-90% стопроцентной, разделить колонии 1:15-1:20. Например, чтобы разделить hPSCs на 1:20 на одну тарелку 100 мм, возьмите 500 л раствора E8/hPSCs и смешайте с 9,5 мл свежей среды E8.
      6. Плита hPSCs в VTN покрытием 100 мм блюд.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется установить идеальное соотношение сплит для каждого исследователя и клеточной линии самостоятельно.
    3. Замораживание hPSCs
      1. Для одной 100-мм тарелки hPSCs, которая готова к разделению, приготовьте три криовиала и 3,5 мл замораживания среды.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Средства массовой информации и флаконы должны храниться в 4 градусах Цельсия или на льду до использования.
      2. Аспир E8 и мыть блюдо 2x с 1x PBS.
      3. Аспир 1x PBS и добавить 4 мл 0,25 М EDTA, инкубировать в течение 2 мин при 37 кв с, в 5% CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть заморожены, как небольшие колонии в то время, что они будут разделены. Не лечите клетки с ЭДТА дольше, чем 2 мин, чтобы предотвратить разделение на одиночные клетки. Клетки должны быть по-прежнему прилагается на поверхности блюда после 2 мин лечения.
      4. Аспирируйте ЭДТА, отсоединяйте колонии, сильно протянив 10 мл 1x PBS на поверхности блюда, и соберите все средние и клетки в трубке 50 мл.
      5. Добавьте 20 мл 1x PBS и центрифугу на 200 x g в течение 4 минут, чтобы промыть оставшиеся ЭДТА.
      6. Откажитесь от супернатанта и отрепретите гранулы в 3 мл замораживания среды.
      7. Равномерно распределите hPSCs на три криовиала, по 1 мл каждый.
      8. Хранить при -80 градусов на ночь в контролируемой коробке для замораживания или сэндвиче из пенополистирола, чтобы обеспечить медленное падение температуры, а затем перенести в резервуар с жидким азотом для длительного хранения.

2. Посев hPSCs, чтобы начать дифференциацию (день 0)

ПРИМЕЧАНИЕ: hPSCs должны быть готовы к дифференциации после стабилизации (т.е. быть разделенным 2-3x после оттаивания). Убедитесь, что колонии здоровы, с гладкими, блестящими краями и минимальной дифференциацией(рисунок 2B).

  1. Приготовьте помемную мембранную матричную посуду (24 хорошо или 6 хорошо посуды) за день до дня 0 по мере необходимости. Принесите посуду на RT в начале дифференциации.
  2. Сделать день 0-1 дифференциации среды по мере необходимости.
  3. Аспирировать E8 от слияния, готовы разделить hPCSs, и мыть блюдо 2x с 1x PBS.
  4. Добавить 7 мл 0,25 М EDTA на 100 мм блюдо, инкубировать при 37 кв С, 5% CO2, в течение 15 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент, лечение ЭДТА затягивается, чтобы разойтись в одиночные клетки.
  5. Снисшие все hPSCs (они должны быть плавающими) и перенесите на трубку 50 мл. Добавьте такое же количество или больше 1x PBS как разрешение EDTA для того чтобы разбавить вне EDTA.
  6. Центрифуга при 200 х г в течение 4 мин.
  7. Откажитесь от супернатанта, добавьте 1 мл дня 0-1 дифференциации среды и пипетки для гомогенизации клеток. Следуйте, добавив больше среднего, а затем смешать, чтобы разбавить клеточный раствор в концентрации идеально подходит для подсчета клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не разбавляйте клеточный раствор. Клетки из одной полной 100-мм тарелки следует разбавлять в 5 мл среднего для начала.
  8. Подсчитайте номер ячейки с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоситометра.
  9. Разбавить клеточный раствор по мере необходимости для достижения 125000 клеток / см2 в низком окончательном объеме (например, 2 мл на хорошо для 6 хорошо блюдо или 500 л на хорошо для 24 хорошо блюдо).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Низкий объем помогает клеткам прикрепляться быстрее.
  10. Аспирируй весь мембранный матримный раствор из посуды с покрытием и натарелки клеточном раствором в колодцы.
  11. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.

3. Нейронная индукция клеток гребня (день 1 к дню 10, Рисунок 2A)

  1. На 1 день кормите клетки со средним дифференциацией 0-1 (3 мл на скважину для 6 хорошо посуды и 1 мл на скважину для 24 хорошо посуды).
  2. На 2-й день кормят клетки 2-дневным 10 дифференциацией (3 мл на колодец для 6 хорошо посуды и 1 мл на скважину для 24 хорошо посуды).
  3. Отныне клетки следует кормить через день до 10-го дня (т.е. следующий день кормления будет 4-м днем).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С 6-го дня, NC хребты должны быть обнаружены(рисунок 2B). Чтобы проверить, происходит ли дифференциация, рекомендуется проводить параллельную культуру дифференциации в небольших скважинах (т.е. 24 скважин), которые могут быть окрашены для SOX10/AP2a и использованы для экспрессии генов маркера во время дифференциации(рисунок 2B,C).
  4. Если сортировка ячеек, перейдите к разделу 4. В противном случае перейдите к разделу 5.

4. Флуоресценция активированная сортировка клеток (FACS) для нейро-маркера гребня CD49D и агрегирования NC-клеток в сфероидах

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сортировки FACS образцы должны храниться на льду и не подвергаться воздействию света после окрашивания до сортировки.

  1. Подготовьте буфер FACS, если ячейки сортируются.
  2. Подготовка день 10-14 сфероидной среде.
  3. На 10 день, удалить среду, и мыть 1x с 1x PBS.
  4. Добавить диссоциационный раствор (см. Таблицу Материалов)по 2 мл на хорошо для 6 хорошо блюдо или 1 мл в хорошо для 24 хорошо блюдо, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 в течение 20 мин.
  5. Снимите все hPSCs и перенесите на трубку 50 мл.
  6. Заполните остальную часть трубки с FACS буфера и центрифуги на 200 х г в течение 4 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая трубка 50 мл может вместить до 20 мл или менее клеточного раствора. Объем буфера FACS должен быть достаточно высоким, чтобы нейтрализовать решение диссоциации.
  7. Откажитесь от супернатанта, отрептите клетки с соответствующим количеством буфера FACS (2 мл на скважину из 6 скважинной пластины) и подсчитайте, чтобы определить число клеток.
  8. Подготовьте следующие образцы.
    1. Образец 1 (неокрашенный контроль): 1 х 106 ячеек в 400 л буфера FACS. Фильтр клетки через 20 мкм крышка ситечко и держать трубку на льду.
    2. Образец 2 (DAPI только контроль): 1 х 106 ячеек в 400 л буфера FACS, содержащий 0,5 мкг/мл DAPI. Фильтр клетки через трубку FACS с крышкой ситечко и держать трубку на льду.
    3. Образец 3 (CD49d-маркирован): Приостановить остальные клетки с FACS буфер, содержащий PE / Cy7-конъюгированных CD49D антитела (5 qL для 1 х 106 ячеек на 100 л буфера FACS) в 15 мл трубки и инкубировать на льду в течение 20 минут.
  9. Заполните трубки с FACS буфера и центрифуги на 200 х г в течение 4 мин.
  10. Откажитесь от супернатанта и отбросьте каждые 5-10 х 106 ячеек в 1 мл буфера FACS, содержащего 0,5 мкг/мл DAPI в соответствии с инструкциями производителя.
  11. Фильтр клетки через трубку FACS с крышкой ситечко и держать трубку на льду.
  12. Подготовьте коллекционные трубки FACS, содержащие 2 мл буфера FACS.
  13. Сортируйте машину FACS с лазерами, которые могут обнаружить DAPI и PE-Cy7, чтобы изолироватьпопуляцию CD49D.
  14. После сортировки подсчитайте отсортированные ячейки.
  15. Centrifuge все отсортированные клетки и resuspend в день 10-14 сфероидной среде до окончательной концентрации 0,5 х 106 клеток на 500 qL среды.
  16. Плита 0,5 х 106 ячеек на хорошо в ультра-низких вложений 24 хорошо пластин.
  17. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.

5. Агрегирование NC-клеток в сфероидах

  1. Если не использовать FACS для изоляции NC-клеток и вместо их агрегирования в сфероиды напрямую, сначала подготовьте клетки, как описано в шагах 4.2-4.5.
  2. Заполните остальную часть трубки с 1x PBS, и центрифуга на 200 х г в течение 4 мин.
  3. Откажитесь от супернатанта, resuspend клетки с соответствующим количеством день 10-14 сфероидной среде (например, 2 мл среднего для 6 хорошо пластины), и рассчитывать, чтобы определить номер клетки.
  4. Разбавить клетки в день 10-14 сфероидной среды до 0,5 х 106 клеток на 500 л среднего.
  5. Плита 500 л клеточной подвески на скважину в ультра-низкой крепления 24 хорошо пластин.
  6. Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.

6. NC сфероид обслуживания и симпатической индукции прародителя (день 10 на день 14, Рисунок 4A)

  1. Вариант 1: Минимальная культура сфероидов
    1. На 11-й день, добавить 500 л дня 10-14 сфероидов среды nc сфероидов без аспирации существующей среде с 10-го дня. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2.
    2. На 12-й день наклоните пластину, чтобы накопить NC сфероиды на одной стороне скважин. Тщательно аспирируйте и отбрасывайте как можно больше средств и кормите 1 мл дня 10-14 сфероидной среды.
    3. Продолжайте кормить клетки каждый день до 14-го дня.
    4. Дополнительно: Если сфероиды агрегируют и генерируют большой комок, используйте пипетку, чтобы разбить сфероидные комки вверх. Это также гарантирует, что отдельные сфероиды не становятся слишком большими.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальный диапазон размеров сфероидов должен быть около 100-500 мкм. В этом диапазоне размер отдельных сфероидов не является критическим. Тем не менее, морфология, такие как гладкие и четкие края(рисунок 3 и рисунок 6) имеет важное значение для дальнейшего успеха. На день 14, каждая 24 хорошо пластины идеально содержит около 50-60 сфероидов различных размеров в пределах вышеупомянутого диапазона размеров.
  2. Вариант 2: Расширенная сфероидная культура
    1. На 15-й день, чтобы сохранить NC сфероидов, кормить с 1,5 мл дня 10-14 сфероидной среды, содержащей 0,5 мкм РА. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РА следует добавлять свежими для каждого кормления и всегда храниться при -80 градусах Цельсия.
    2. Отныне кормите через день до 28-го дня, а затем продолжайте направлять сфероиды (раздел 7.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растущие сфероиды делятся примерно 1 раз в неделю, пайпетируя их с 1 мл пипетки, чтобы разбить их. Они делятся при приблизительном соотношении 1:2-1:4. В течение 2-недельного периода расширения, клетки должны примерно в четыре раза в количестве.

7. Дифференциация и созревание SymN (Вариант 1: после 14-го дня; Вариант 2: после 28-го дня)

  1. Покрытие сфероидов в обычных блюдах
    1. Подготовка PO / LM / FM покрытием 24 хорошо пластин.
    2. Подготовьте среду symN, содержащую 0,125 мкм РА (добавляйте свежий каждый корм) и 10 мкм Y27632 (только день 14).
    3. На 14-й день наклоните пластину, чтобы накопить NC сфероиды на одной стороне колодцев. Тщательно аспирируйте и отбросьте как можно больше средств и покормите 1 мл симН-среды.
    4. Снимите LM/FN с покрытых пластин.
    5. Сплит и пластины каждый колодец из 24 хорошо пластины в 4 отдельных колодцев из новых, покрытием 24 хорошо пластины. Каждая оригинальная скважина будет иметь 1 мл, содержащий 50-60 сфероидов. Это дает 250 л, содержащий примерно 10-15 сфероидов для каждой скважины на новой пластине.
    6. Добавьте 250 л дополнительной среды на скважину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это раскол 1:4; убедитесь, что сфероиды распределяются должным образом в рамках решения, так что раскол относительно равномерно. Количество сфероидов не учитывается, так как окончательное число не влияет на успешность генерации симнов.
    7. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
    8. На день 15 (или день 29 для варианта 2), корма, заменив все среды с 1 мл симН среды, содержащей 0,125 мкм РА. Отныне нейроны следует кормить каждые 2 дня до 20-го дня (или 35-го дня для варианта 2).
    9. После 20-го дня (или дня 35 для варианта 2) нейроны следует кормить, тщательно заменяя только половину существующей среды (500 л). Отныне кормите каждую неделю, если среда быстро не пожелтеет.
    10. Продолжайте кормить еженедельно до желаемого момента времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: symNs, как правило, агрегируются в ганглиеподобных структурах и склонны к отъезду от культурных блюд. Для предотвращения этого рекомендуется полукормления и минимальная управляемость.
  2. Покрытие клеток для электрофизиологической записи
    1. Подготовка PO /LM/FM-покрытием 96 хорошо электрофизиологии пластин.
    2. Подготовьте среду symN, содержащую 0,125 мкм РА (добавляйте свежий каждый корм) и 10 мкм Y27632 (только день 14).
    3. На 14-й день соберите все сфероиды, затем центрифуги их на 200 х г в течение 4 мин.
    4. Откажитесь от супернатанта, добавьте 2 мл раствора диссоциации и перенесите смесь обратно в одну из скважин ультра-низкой пластины крепления. Инкубировать при 37 градусах Цельсия, в 5% CO2 в течение 20-45 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера сфероидов, период диссоциации может быть длиннее 20 мин. Проверьте диссоциацию клетки каждые 10 минут до 45 мин. Дополнительно, 0,1 мг/мл DNase может быть добавлен с диссоциационным раствором, чтобы предотвратить свободную ДНК от мертвых клеток, делая раствор липким. Это необязательно в этом протоколе, потому что сфероиды не будут агрегироваться, как только они полностью разобщены.
    5. Pipet полностью разъединить сфероиды, затем центрифугу на 200 х г в течение 4 мин.
    6. Откажитесь от супернатанта, отрепримите клетки с соответствующим количеством симН-среды и подсчитайте номер ячейки.
    7. Плита клеток на 100000/см2 в PO / LM / FN покрытием электрофизиологии скважин в 200 Л Л общего объема на скважину.
    8. На 15 день (или день 29 для варианта 2), следуйте тем же процессам кормления, как в разделе 7.1. Общий объем после 15-го дня (или дня 29 для варианта 2) должен составят 300 л за скважину.
    9. Измерьте электрические сигналы с помощью машины с помощью мультиэлектродного массива после 20-го дня (или 35-го дня для варианта 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В варианте 2, сфероиды могут быть покрыты в любое время между днем 14-дневный 28. Первые измерения электрических сигналов могут быть проведены через неделю после покрытия сфероидов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В этом протоколе мы даем инструкции о том, как генерировать симнизмы из hPSCs. Культурные условия, продемонстрировавшиеся здесь, были улучшены по мимо ранее опубликованного протокола23,,24 (рисунок 1A)до условий, не связанных с подачей и химически определенных условий(рисунок 1B). Предусмотрены два варианта, один из которых, в течение чем делаются симнс, составляется в течение 20 дней, а другой, где НКК могут быть расширены на 2 недели для генерации большего количества ячеек, которые затем могут быть дифференцированы в символы(рисунок 1B,вариант 1 и 2).

Для правильного мониторинга характеристик симН дифференцированных ячеек, линия репортера PHOX2B-eGFP WA09 и родительская линия WA09 PSCs19. Все дифференциации были проведены по крайней мере в трех биологических повторах, определяемых как независимые эксперименты дифференциации после по крайней мере одного прохода и/или полученных из свежеоттая флакона клеток. Дифференциация была индуцирована, когда выпуклость недифференцированных hPSCs достигла 80%-90%. Колонии hPSC были круглыми, с блестящими, гладкими краями и практически никакой дифференциации. Колонии не должны касаться друг друга(рисунок 2B,день 0). Вместо типичного двойного ингибирования SMAD25, который ранее использовался для индукции невректодерма, ингибирование TGF-я в сочетании с WNT и BMP4 сигнализации в первые 2 дня привело к надежному выражению раннего нейрогребмаркер AP2a. Нейронный маркер гребня SOX10 был выражен с 4-го дня по 10 день(рисунок 2B). НКК появились в плотных, затемненных хребтах, видимых с шестого дня. Эти хребты выразили SOX10(Рисунок 2B,стрелки). Ранее было показано, что SOX10 на этапе NCC коррелирует с маркером поверхности клетки CD49D23,,26 и, таким образом, CD49D может быть использован для сортировки NC-клеток, которые не сообщают о фторороре из локуса SOX10. На рисунке 2C показано выражение генов маркера NCC с течением времени. Рисунок 2D указывает на то, что наша эффективность дифференциации была выше 80%. Для определения идентичности остальных клеток, qRT-PCR был использован для тестирования на загрязняющие типы клеток, в том числе BryT-выражения мезодерм, SOX17-выражения эндодерм, и PAX6-выражения нейроэктторм; все они были признаны отсутчными или выраженными на очень низких уровнях (данные не показаны; см. Дополнительную таблицу 1 для всех грунтовок). Тем не менее, был обнаружен некийиндекс SIX1/EYA1 (данные не показаны), которые могут быть источником остальных типов клеток. Кроме того, возможно, что остальные типы клеток являются производными NCC, которые уже еще более дифференцированы. На данном этапе был оценен код HOX NCCs(рисунок 2E). Тем не менее, на этой ранней стадии сигналы HOX были очень низкими (обратите внимание на шкалу), предполагая, что эти НКК были либо черепно-NC характер или не принял какой-либо nCC подтип характер еще.

На 10 день NCCs может быть очищен с помощью FACS, который дал около 80% CD49DNCCs (рисунок 2D). Пример типичной стратегии gating указан на рисунке 2D. После сортировки, клетки были агрегированы как NC сфероидов(рисунок 3A). Для расширения NCCs и индуцирования ствола-NC-подобных свойств, клетки были обработаны с сочетанием FGF2 и CHIR. Мы проверили, если сортировка для CD49D- население дали лучше или чище культур symNs позже. Рисунок 3B сравнивает несортированные по сравнению с CD49Dи отсортированы по сравнению с CD49D- отсортированные популяции клеток. Слева видно, что положительные отсортированные и несортированные популяции сделали NC сфероидами аналогичным образом, в то время как отрицательные отсортированные клетки не агрегировались должным образом, не делали круглые, гладкие, здоровые сфероиды и умерли в течение 3-4 дней. Кроме того, когда NC сфероиды были сравнены в день 14 через qRT-PCR для NC и symN-маркеров,значительные различия между отсортированными и несортированных клеток не могут быть обнаружены. Примечательно, что в этот момент выражение симпатических маркеров-прародителей было все еще низким, а уровни SOX10 оставались высокими, что свидетельствует о том, что сфероиды по-прежнему состоят из клеток со свойствами NC. На следующий день после покрытия (день 15), как несортированные и CD49Dи сфероиды прилагается также PO / LM / FN блюд и неврит нарост может быть четко наблюдается(Рисунок 3B, D15 и Рисунок 3C, D29). Несортированные и отсортированные культуры были перенесены далее на 35-й день параллельно, но никаких существенных различий замечено не было (данные не показаны). Таким образом, можно сделать вывод, что шаг сортировки не был существенным для генерации симнов, и поэтому он является факультативным шагом в этом протоколе. Тем не менее, для менее эффективных дифференциаций, которые не дают 80%клеток CD49D, мы рекомендуем процедуру сортировки.

Далее, мы проверили ли эти NC сфероиды могут быть сохранены, не теряя их NC идентичности(рисунок 3A, вариант 2). NCCs были культивированы как сфероиды на срок до 2 недель(рисунок 3C). Морфология дня 28 сфероидов и покрытых клеток на 29-й день были похожи по сравнению с днем 14 и 15 клеток в варианте 1. На 28-й день выражение SOX10 сохранялось на том же уровне, что и 14-й день. Тем не менее, выражение ранних симпатических маркеров-прародителей (т.е. ASCL1, PHOX2B и GATA3) увеличилось(рисунок 3C, справа), предполагая, что расширенная культура в FGF2, WNT и RA сигнализации привели к созреванию и задней (Рисунок 4C и F). Аналогичные эффекты ранее сообщалось Кирино и др.21.

После расширения NC (вариант 1 или вариант 2), сфероиды были покрыты po/LM/FN покрытой посудой и поставляются с несколькими нейронными факторами для созревания симн(рисунок 4A). На 20 и 35 день (1 неделя после покрытия в варианте 1 и 2, соответственно), нейриты наблюдались в радиальной схеме, простирающейся от прикрепленных сфероидов(рисунок 4A, справа). Кроме того, были выражены маркеры, связанные с синтезом норадреналина (NE) и транспортировки (т.е. TH, AAAD, DBH)(рисунок 4B). Присутствие загрязняющих типов клеток были рассмотрены здесь снова, и выражение CHAT, который может указывать парасимпатической нейронов, был найден(Рисунок 4B,E). Тем не менее, ChAT также выражается в холинергических симн. Были обнаружены очень низкие уровни VIP, еще одного парасимпатического маркера (данные не показаны). Кроме того, были обнаружены низкие уровни BRN3A, ISL1 и RUNX1(рисунок 4B,E),которые могут указывать либо на сенсорные нейроны, либо тригемминальные нейроны, т.е. производные плакода. Обнаружены минимальные EDNRB (маркировка энтерических нейронов) и OLIG2 (маркировка motorneurons) (данные не показаны). Личность ненейрональных клеток остается неясной. Тем не менее, на основе результатов нашего предыдущего протокола symN23, они были, скорее всего, SMAи myofibroblasts. Выражение генов HOX было пересмотрено, и было установлено, что HOX5-9 были выражены, предполагая, что ствол идентичности. HOX10 (показатель сакрального NC) не был выражен(рисунок 4C, F). Наконец, зрелые маркеры, в том числе никотиновые рецепторы ацетилхолина (CHRNA3/4) и связанные с NE рецепторы, в том числе адренергические рецепторы (ADRA2A/B2) NEGтранспортер (NET, SCL6A2) и везикуловый транспортер (VMAT1)Figure 4D Не было обнаружено существенной разницы в экспрессии этих генов в клетках, которые были получены с вариантом 2 по сравнению с вариантом 1(Рисунок 4E-G).

Мы также подтвердили наши результаты, выполнив этот протокол на линии репортера H9-PHOX2B:GFP(рисунок 5). К 20-му дню клетки образуют плотный газон нейронов и агрегируются в кластерах еще более высокой плотности, что указывает на очень высокую эффективность дифференциации(рисунок 5A, верхнийряд). Окрашивание показало, что большинство симн-кодов в этих кластерах, что затрудняет оценку и количественную оценку общей эффективности дифференциации. Чтобы подчеркнуть окрашивание и колокализацию конкретных маркеров symN, мы сосредоточились на менее плотных участках на окраинах кластеров (см. желтую коробку на рисунке 5A, справа). Это было также, где большинство загрязняющих клеток были расположены, так что это не является хорошей областью, чтобы судить об общей эффективности. Тем не менее, типичные маркеры symN; включая периферийный (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (пан нейрональный), DBH и NET1 (выраженные в точках вдоль тел симн и аксонов, Рисунок 5A, дно); были обнаружены. Для измерения электрической активности был использован мультиэлектродный массив (МЭА), и в тот день было обнаружено 20 симнов со степенью 3-5 шипов в секунду по сравнению с негативным контролем недифференцированных hPSCs(рисунок 5B). Важно, чтобы клетки равномерно распределялись в скважине для того, чтобы каждый электрод (черные точки на рисунке 5B,яркое поле) правильно записывался. День 20 к дню 30 симн также стимулировали с 1 мкм никотина, который имитирует preganglionic сигнализации симн in vivo и увеличивает средний скорости стрельбы в клетках. Также был измерен ингибирование нейронов. Рецептор No2-Adrenergic (ADRB2), расположенный на терминалах аксонов symN, создает положительную обратную связь для секреции NE29. Лечение симн с 1 ММ пропранолол (антагонист рецепторов No 2-adrenergic) ингибирует их активность(рисунок 5C, справа). Эти результаты позволяют предположить, что симны, генерируемые этим протоколом, были функционально активны.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическая иллюстрация и сравнение протоколов дифференциации symN. (A) Предыдущий протокол Зельтнера и др.23. (B) Оптимизированный протокол. Вариант 1 составляет 20 дней и содержит только 4 дня NC сфероидной культуры. Вариант 2 составляет 35 дней и содержит 2 недели NC сфероид расширения этапе, что позволяет производство более NC клеток. ВТН - витронектин, PO - поли-L-орнитин, ЛМ и ламинин, FN - фибронектин, SB - SB 431542, CHIR - CHIR 99021, РА - ретиноиновая кислота, АА - аскорбиновая кислота, NFs - NGF-BDNF Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: ИНДукция NC. (A) Сроки и лечения для индукции NC с 0 дня до дня 10. (B) Морфология и образование nc хребтов отслеживались каждые 2 дня с помощью яркой полевой микроскопии. Клетки в каждый момент времени после дня 2 были совместно окрашенные для AP2A (красный) и SOX10 (зеленый). Все иммунофлуоресцентные снимки были противопоставлены DAPI. Красные стрелы указывают на структуры хребтов. (C) qRT-PCR анализ для профиля выражения маркеров NC со дня 2-10. (D) Представитель сюжет сортировки FACS на 10 день для CD49Dи NC населения (слева). Типичная стратегия gating и контроль изоттипа указаны в первых четырех участках. Также была проведена количественная оценка процентного показателя клеток CD49Dна 10-й день. (E) qRT-PCR анализ для экспрессии профиля генов HOX со дня 2-10. NC - нейронный гребень. Ошибки баров вытекают из данных n No 3 биологических повторов, определяется как независимые эксперименты дифференциации, сделанные в отдельные дни из культур PSC, которые были по крайней мере один раскол на части. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Обслуживание и расширение нейронного гребня гребня. (A) Сроки и процедуры для расширения NC в течение дня 10 в день 14 культуры для варианта 1 или день 10 в день 28 культуры для варианта 2. (B) NC сфероид образования наблюдался яркой микроскопии поля с 11 дня (1 день после образования сфероидов) в день 14 (т.е. день покрытия). Несортированные, CD49DиCD49D- популяции были сравнены. Также показаны покрыные клетки на 15-й день. Клетки не смогли сформировать сфероиды должным образом в CD49D- группа и умер после покрытия. 14 клеток дня были исследованы анализом qRT-PCR (справа) для профиля выражения симН-прародителей. Были сравнены+ несортированные и CD49D популяции (n No 3). (C) NC сфероиды могут быть сохранены на срок до 2 недель. Сфероиды отслеживались яркой полевой микроскопией с 15-го дня до 28-го дня (день посадки). Также показаны покрыные клетки на 29-й день. 28 день сфероидов были рассмотрены qRT-PCR анализа для выражения профиля symN прародителей (справа). Несортированные и+ CD49D популяции были объединены (n No 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Дифференциация и созревание SymN. (A) Сроки и процедуры после покрытия на 14-й день для варианта 1 или день 28 для варианта 2. Яркие полевые микроскопии (справа) показывают симны на 20-й день и 35-й день, соответственно (1 неделя после покрытия для обоих вариантов). (B-D) Вариант 1 qRT-PCR для профиля выражения свойств symN между днями 20-30. Несортированные и+ CD49D популяции были объединены. (E-G) Вариант 2 qRT-PCR анализ для профиля выражения свойств symN после дня 35. Несортированные и+ CD49D популяции были объединены (n No 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Функциональная характеристика симнов. (A,верхний ряд) Яркое полевое изображение кластеров symN на 20-й день и окрашенные изображения, показывающие PRPH и TH двойные положительные ячейки, в основном расположенные в кластерах. (A,дно) Несколько маркеров symN (разделенных каналов) были проверены иммунофлуоресценции окрашивания на 20-й день. Норадреналин транспортер (NET1) был расположен как на поверхности тел клеток, а также вдоль аксонов и дендритов. Он показал, как точки на этом увеличении. Все иммунофлуоресцентные снимки были противопоставлены DAPI. (B) Представитель тепловые карты мультиэлектродного массива (MEA) анализа для симнов на 20-й день (вверху). Яркое полевая картинка (внизу) показывает плотность симнов и распределение электродов (восемь черных точек). Здесь были объединены+ несортированные и CD49D популяции. (C)Количественная оценка средних показателей стрельбы за день 20-30 симн при лечении 1 мкм никотина и 1 мкм пропранолол в течение 5 мин, соответственно (справа). Были объединены результаты несортированных и CD49d-положительных популяций (n No 3). Неспаренный, двуххвостый t-тест с коррекцией Уэлча, р-значение: Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Пример ячеек в условиях, которые не уместны для продолжения дифференциации. (A) Хронология дифференциации с каждой контрольной точкой для клеточных морфологий, указанных как в B-E. (B) hPSCs (a) со здоровыми колониями и большим количеством дифференцированных клеток, и (b) слились и дифференцировали границы между некоторыми колониями в день 0. Красные стрелки указывают на объединенные области. (C) NCCs на день 10 с пузырь-как волдыри в хребтах. Красные стрелки указывают на волдыри в верхнем ряду. Нижний ряд представляет собой более высокое увеличение. Мы не смогли определить клеточную идентичность волдырей. Тем не менее, наличие более волдыри, кажется, коррелируют с более низким sOX10/CD49D выражение. (D) Нерегулярные глядя сфероидов не хватает гладких краев и круглой формы на 14-й день. (E) Нездоровые и умирающие симны на 20-й день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Недавно мы опубликовали два обзора, один из которых обсуждал использование симн-симнов, полученных hPSC, для моделирования заболеваний31, а также углубленное сравнение доступных протоколов дифференциации22. Таким образом, здесь мы сосредоточимся на устранении неполадок текущего протокола, чтобы помочь заинтересованному исследователю преуспеть в создании симнов. В течение всего процесса дифференциации, для того, чтобы получить последовательные данные, а также здоровые дифференцированные клетки, загрязнение на всех этапах должно быть тщательно контролируется. В обычном обслуживании hPSC, mycoplasma тестирование должно быть выполнено раз в две недели или ежемесячно. Если сортировка клеток проводится на 10-й день, добавление антибиотиков в любую среду настоятельно рекомендуется. Важно также проверить морфологию клеток до и после начала дифференциации. Здесь мы предлагаем несколько критических контрольно-пропускных пунктов(рисунок 6A). Во-первых, идеальные колонии hPSC, готовые к дифференциации, должны иметь яркие и гладкие края с крошечными шипами. Колонии с шестерн-как шипы начинали дифференцировать и не должны быть использованы. Настоятельно рекомендуется, чтобы клетки в идеальной точке времени должны быть использованы немедленно, потому что морфология может измениться в течение нескольких часов. Отсрочка всего на один день может разбить клетки(Рисунок 6B, a) или привести к контакту между колониями(Рисунок 6B, b),который стимулирует дифференциацию в hPSCs. Это сложно, чтобы избавиться от каждой дифференцированной ячейки в культуре, но население должно контролироваться, чтобы содержать менее 5% плохих колоний. При соблюдении этого протокола второй контрольно-пропускной пункт во время дифференциации находится между днем 2 и 10-м днем. На этом этапе темные хребты NC должны быть четко соблюдены под ярким полевым микроскопом(рисунок 2C). Толщина и распределение хребтов могут быть использованы в качестве индикаторов эффективности NC: Потому что NCCs в основном получены из клеток, которые образуют хребты, тонкие или менее распространенные хребты и волдыри в хребтах может указывать на низкую производство NC, и, следовательно, должны быть отмечены или отбрасываются в случае несовместимых результатов(рисунок 6C). ВЫБОРка РНК настоятельно рекомендуется на 10-й день, чтобы проверить NC маркеры, описанные выше. Третий контрольно-пропускной пункт находится на этапе nc сфероид, потому что сфероиды могут агрегироваться. Лучше всего периодически пайпетировать среду, чтобы разбить и повторно приостановить агрегацию (клетки не будут рассеяны обратно в одиночные клетки, но только небольшие сфероиды). Если сфероиды расширяются слишком быстро, разделите их на 1:2 или 1:4, чтобы оставить достаточно места и питательных веществ для клеток расти. Если сфероиды не имеют гладких и круглых форм(рисунок 6D), это может означать, что эффективность NC в день 10 не была достаточно высокой, и, таким образом, может разрушить окончательную дифференциацию. Тестирование профилей выражений для проверки свойств прародителей symN рекомендуется в нужный день сфероидного покрытия. Четвертый контрольно-пропускной пункт после покрытия сфероидов. Нейриты должны быть хорошо видны и пучки должны начать формироваться после 20-го дня. Клетки без широко распространенных невритов и пучков следует рассматривать как загрязнение(рисунок 6E). На данный момент, важно кормить нейронов, заменив только половину существующей среды для поддержания питательной среды, созданной стабильными нейронами. Будьте осторожны при кормлении клеток, потому что созревание симнов уязвимы и может легко отделить. Причина каждой из описанных здесь дурацких морфологий до конца не понята. Это, однако, обеспечить понимание чувствительного характера hPSCs и in vitro дифференциации. Одним из источников таких нарушений могут быть реагенты различных поставщиков. Например, тонкие хребты с волдырями появляются при использовании другой марки BMP4.

Для электрофизиологического анализа с помощью MEA, для равномерного распределения симнов в электродных скважинах, сфероиды разъединяются Аккутазой. Время лечения должно быть 20 минут, чтобы начать с. Однако, поскольку сфероиды очень уплотняются, время диссоциации может быть увеличено до 45 минут, чтобы обеспечить полное разобщение сфероидов. В целом, каждая экспериментальная группа на пластине MEA должна быть запущена в кратных по крайней мере шесть, чтобы получить последовательные результаты. Примечательно, что наша плотность для повторного отвода намного ниже рекомендаций производителя32 (около 500-700 000/см2),хорошо повторяется решающее значение. В наших результатах, как существенное выражение маркера symN и стабильная активность отображаются с 20-го дня до 30-го дня. Мы рекомендуем это как лучший момент времени, чтобы начать запись переменных выбора. Для каждой дифференциации среда должна быть свежей и использоваться как можно быстрее (не более одного месяца).

Представленный здесь протокол дифференциации symN не обеспечивает подачу, химически определяемый, эффективный, расширяемый и дает функциональные симны к 20-му дню. Этот определенный протокол дифференциации симН может быть использован для изучения человеческих расстройств симпатической нервной системы, как платформа для скрининга наркотиков, для исследований опухолевого генезеза, таких как нейробластома / феохромоцитома, или для фундаментальных исследований в гомеостатической регуляции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Хайди Ульрихс за критическое чтение и редактирование рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Tags

Биология развития Выпуск 159 человеческие плюрипотентные стволовые клетки нервный гребень симпатические нейроны вегетативная нервная система симпатическая нервная система без фидера химически определенная культура стволовых клеток
Эффективная дифференциация постгонглионических симпатических нейронов с использованием человеческих плюрипотентных стволовых клеток в соответствии с безкормовыми и химически определенными условиями культуры
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient… More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter