Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/60843
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

Summary

Bu protokolde, postgangliyonik sempatik nöronların insan pluripotent kök hücrelerinden üretimi için istikrarlı ve yüksek verimli bir ayırım stratejisi tanımlıyoruz. Bu model nöronlar birden fazla otonom bozuklukların çalışmalarının kullanımı için kullanılabilir hale getirecek.

Abstract

İnsan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) hastalık modelleme ve in vitro insan embriyonik gelişim çalışması için güçlü bir araç haline gelmiştir. Daha önce otonom nöropatili hastalara uygulanan sempatik karakterli otonom nöronların türemesi için bir ayırım protokolü sunmuştuk. Ancak protokol Knock Out Serum Replasmanı (KSR) ve besleyici tabanlı kültür koşulları üzerine inşa edildi ve yüksek farklılaşma verimliliği sağlamak için hücre sıralamagerekliydi. Bu faktörler yüksek değişkenlik, yüksek maliyet ve düşük tekrarlanabilirlik neden olur. Ayrıca, elektriksel aktivite de dahil olmak üzere olgun sempatik özellikleri doğrulanmamıştır. Burada, PSC kültürünün ve farklılaşmasının besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarında gerçekleştirildiği optimize edilmiş bir protokol salıyoruz. Gövde nöral ibikini tanımlayan genetik belirteçler tanımlanır. Postgangliyonik sempatik nöronlar içine daha fazla farklılaşma hücre sıralama gerek kalmadan 20 gün sonra elde edilir. Elektrofizyolojik kayıt fonksiyonel nöron kimliğini daha da gösterir. Bizim farklılaşmış nöronlar tespit Ateş nikotin tarafından geliştirilmiş ve adrenerjik reseptör antagonist propranolol tarafından bastırılmış olabilir. Bu protokoldeki orta sempatik nöral atalar, kültürlerin genişlemesine olanak sağlayan 2 haftaya kadar nöral küresel olarak muhafaza edilebilir. Özetle, bizim güncellenmiş sempatik nöron farklılaşma protokolü yüksek farklılaşma verimliliği gösterir, daha iyi tekrarlanabilirlik, daha fazla esneklik, ve önceki sürüme göre daha iyi nöral olgunlaşma. Bu protokol otonom sinir sistemini etkileyen insan bozuklukları incelemek için gerekli hücreleri ile araştırmacılar sağlayacaktır.

Introduction

Postganglionik sempatik nöronlar (symNs) otonom sinir sistemine ait (ANS) ve yanıt ve bilinç bağımsız vücudun homeostaz düzenlenmesinde birden fazla önemli rolleri vardır. Örneğin, stres symNs uyarır ve kalp hızı, kan basıncı ve terleme bir artışa yol açan mücadele-veya-uçuş yanıtı çağrıştırıyor. SymNs genetik nedeniyle birden fazla insan bozuklukları etkilenir, toksisite / yaralanma, ya da diğer hastalıklara yardımcı olarak. Genetik nöropati nin bir örneği çocukluk çağı bozukluğu Ailesel Disotonomi (FD), symNs şiddetli bir disregülasyon disotonomik krize neden olur, terleme ile belirgin, cilt lekeleme, kusma atakları, hipertansiyon, ve anksiyete1. Toksisite bir örnek kemoterapi tedavisi, hangi otonom nöronlar üzerinde toksik yan etkileri olduğu bildirilmiştir2. Bu otonom denervasyon ve hiper-innervasyon hem yol açabilir bilinmektedir, ya da eşlik, Parkinson hastalığı veya hipertansif böbrek hastalığı gibi hastalıklar3,4. Bu nedenle, symN biyolojisi ve hastalıkları bağlamında kusurların mekanlarını araştırabilmek ve anlayabilmek, yeni ve etkili tedavilerin araştırılmasında faydalıdır.

Anatomi
Periferik sinir sistemi duyusal ve otonom bölünmeleriçine dallar. Duyusal sinir sisteminin afferent sinirler ağrı ve dokunma hissi sorumludur, ANS beyne tüm organlardan bilgi geçişi sorumludur ise. ANS enterik sinir sistemi ayrılır, gastrointestinal sistem innerve, parasempatik sinir sistemi, hangi gevşeme için önemlidir, ve sempatik sinir sistemi (SNS), hangi aktivasyon / organların düzenlenmesi için önemlidir. SNS iki nöronlu bir sistem5uyarlar. Omurilikte preganglionik sempatik nöral aksonlar ilk olarak postganglionik symN hücre organlarının bulunduğu sempatik ganglia'ya proje lenir. Bu nöronlar daha sonra vücuttaki her organın hedef dokuları innerve etmek için uzun projeksiyonlar göndermek. Preganglionik nöronlar tarafından iletilen sinyaller kolinerjiktir, postganglionik symNs adrenerjik ve böylece ekspres norepinefrin (NE) ana nörotransmitter olarak. Postgangliyonik birkaç önemli istisnalar vardır, kolinerjik sempatik nöronlar, kan damarları innerve olanlar da dahil olmak üzere. Adrenerjik postgangliyonik nöronlar tirozin hidroksilaz (TH), aromatik L-amino asit dekarboksilaz (AAAD), dopamin β-hidroksilaz (DBH) ve monoamin oksidaz (MAO-A), tüm üreten ve metabolize NE sorumlu enzimleri ifade. Ayrıca, ne geri dönüşüm taşıyıcıları ve /veya reseptörleri α-adrenerjik reseptör (ADRA2), β-adrenerjik reseptör (ADR2B), norepinefrin taşıyıcı (NET1) ve vesiküler monoamin taşıyıcı (VMAT1/2) ifade ederler.

Geliştirme
Embriyonik gelişim symNs sırasında nöral tepecik türetilmiştir (NC), hangi nöral tüp ve overlaying ektoderm arasında ortaya çıkar6, ve birden fazla hücre soyları ayırt edebilirsiniz, melanositler de dahil olmak üzere, osteoblastlar, adipositler, glia, enterik nöronlar, duyusal nöronlar, ve otonom nöronlar7. Nöral krest hücreleri (NVR) embriyo ile çeşitli yolları almak son derece göçmen hücrelerdir. NC gelişiminin bu erken aşamasında, hücreler işaretleri SNAIL1/2, FOXD3 ve SOX108,9,,10,11ifade . Benimsedikleri eksenel konumla birlikte geçiş rotası, geliştirecekleri NC alt türünü belirler. Bu NC alt tipleri kendi özel HOX gen ekspresyonu ile ayırt edilebilir: Kranial NCC'ler HOX genlerini ifade etmez, vagal NCC'ler HOX 1-5 ekspres, gövde NCCs ekspres HOX 6-9, ve sakral NCCs ekspres HOX 10-1112. Bunlar arasında, gövde NCCs symNs ana kaynağı olarak kabul edilmektedir. SymN öncüleri transkripsiyon faktörü MASH1/ASCL113ifade , PHOX2B14 ve INSM115ifade teşvik . GATA ailesi transkripsiyon faktörleri geç sempatik gelişim sırasında ifade edilir. GATA2 ve GATA3 symNs ifade edilir, hangi sırayla DBH16aktive . Transkripsiyon faktörü HAND2 de ifade ve DBH ve TH17bakım için önemlidir.

HPSCs (örneğin, embriyonik ve indüklenen pluripotent kök hücreler) güçlü bir araç18 gelişimsel paradigmalar özetlemek ve daha sonra çeşitli insan bozukluklarının hastalık modelleme için istihdam edilebilir symNs oluşturmak. Bu nedenle, hPSCs gelen symNs oluştururken, gelişimsel yönergeleri takip etmek ve farklılaşma süreci boyunca uygun belirteçleri ifade değerlendirmek çok önemlidir.

Önceki symN protokolü
Birkaç araştırma grupları daha önce hPSCs19,,20,,21gelen symNs nesil bildirdin. Birbirlerine bu protokollerin doğrudan karşılaştırma ve bizim son zamanlarda22gözden geçirildi . 201623yılında symN karakterli otonom nöronların üretimi için bir ayırım protokolü yayınladık (Şekil 1A). Bu protokol, hem farklılaşmamış hPSC'lerin bakımında hem de hücre farklılaşmasında kullanılan KSR tabanlı ortam kullanılmıştır. Ayrıca fare embriyonik fibroblastlarında (MEF besleyici hücreler) hPSC'ler tutuldu. Biz bozukluğu modellemek için FD hastalarından bu protokol ve PSCs istihdam23. 2019 yılında, bu eski protokol24daha ayrıntılı bir sürümünü açıkladı. Özetle, nöral kader ilk 2 gün içinde TGF-β ve BMP sinyalini engellemek için çift SMAD inhibisyonu25 ile indüklendi. CHIR99021 kullanarak WNT aktivasyonu NC hücreleri haline nöral ataları terfi etti. 11. günde hücreler, CD49D+ veya SOX10+ popülasyonlar26,23için FACS tarafından sıralandırıldı, bu da yaklaşık %40 NC üretim verimliliği elde etti. Böylece, farklılaşma sonraki adımlar için verimlilik ve saflık sağlamak için sıralama gerekli oldu. NNC'ler FGF2 ve CHIR kombine tedavisi ile küresel olarak muhafaza edildi ve güçlendirilmiş. 4 gün sonra, bakım NC spheroids kaplama ve BDNF verildi, GDNF, ve NGF symN olgunlaşma bitirmek için. Bu symN'ler ASCL1, TH, DBH ve PHOX2A gibi güçlü symN belirteçlerini ifade etse ler de, nikotinik asetilkolin reseptörünün (CHRNA3/CHRNB4) ve vezikül taşıyıcısının (VMAT1/2) ekspresyonu da dahil olmak üzere daha olgun symN'ler için belirteçler 70 günlük farklılaşmadan sonra bile düşüktü. Bu protokoldeki HOX genleri resmi olarak test edilmedi ve hücrelerin elektrofizyolojik aktivitesi de dahil olmak üzere olgun nöral özellikler doğrulanmadı.

Burada, symNs oluşturmak için optimize edilmiş bir protokol salıyoruz (Şekil 1B). HPSC'ler besleyicisiz koşullarda, vitronektin (VTN) kaplamalı yemeklerde, Essential 8 (E8) media27kullanılarak muhafaza edilir. Farklılaşma ortamının formülü her aşamada değiştirilerek NC popülasyonunun yüzdesi28'dir. SymN olgunlaşma CD49D+/SOX10+ sıralanmış veya sıralanmamış toplu NCC popülasyonları üzerinde yapılabilir. Her ikisi de 30. Ayrıca, bu protokol ile oluşturulan symNs elektrofizyolojik kayıt ve symN aktivatör ve inhibitör bileşikleri ile tedavilere duyarlıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: H9 PHOX2B:GFP muhabir hattı Oh ve ark.19tarafından sağlanmıştır. Bu yazıda kullanılan bazı qPCR astarları OriGene Technologies'den, birkaç sekans ise Frith ve ark. 20,30'danelde edilebilir.30

1. Bulaşık kaplama, ortam hazırlama ve hPSC bakımı için kurulum

  1. Çanak kaplama
    1. Vitronectin (VTN) kaplama
      1. VTN şişelerini 37 °C'lik bir su banyosuna tamamen eriyene kadar yerleştirin ve iyice karıştırın.
      2. 100 mm Petri kabı için 7 mL 1x fosfat tamponlu salini (PBS) ile 0,5 mg/mL VTN karıştırın, kabın vtn çözeltisini ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat kuluçkaya yatırın.
    2. Bodrum membran matris kaplama
      1. Bir gecede 4 °C'de buz üzerinde bodrum membran matrisinin (Bkz. Malzeme Tablosu)çözülme şişeleri.
      2. 6 kuyuplakadan biri için 2 mL DMEM/F12'yi 20 μL 100x bodrum membran matrisiyle karıştırın, tabağa bodrum membran matris çözeltisi ekleyin, yemeği parafin filmle sarın ve bir gecede 4 °C'de temiz bir kapta saklayın. Mümkün olduğunca çabuk çalışın. Kaplamalı yemekler 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
    3. Poliornitin (PO)/laminin (LM)/fibronektin (FN) kaplama
      1. İlk gün, 24 kuyuplakasının bir kuyusu için 15 μg/mL PO ile 1 mL 1x PBS'yi karıştırın, 37 °C'de % 5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Lm ve FN'yi bir gecede -20 °C'de eritin ve tamamen çözülene kadar 4 °C'de saklayın.
      2. İkinci gün, aspire PO çözeltisi, kuyuları 1x PBS ile yıkayın, 1 mL 1x PBS 2 μg/mL LM ve 2 μg/mL FN içeren ekleyin ve %5 CO2 gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Bu noktada LM/FN çözeltisi içeren çanak, kuruması sürece aylarca kuvözde tutulabilir. Yemeğin kurumasını önlemek için daha fazla 1x PBS ekleyin.
  2. Medya hazırlığı
    1. Bir şişe E8 takviyesini bir gecede 4 °C'de eriterek Essential 8 ortamını (E8) hazırlayın. E8 orta 500 mL ve gerekirse antibiyotik ile ek karıştırın.
      NOT: Çalışma E8 çözümü 2 hafta içinde kullanılmalıdır.
    2. Toplam 100 mL hacim için 10 mL DMSO ile 90 mL tam E8 ortamı karıştırarak hPSC dondurma ortamını hazırlayın. Filtre sterilize.
    3. 10 μM SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 ve 10 μM Y27632 toplam 100 mL hacim için 100 mL temel 6 (E6) orta karıştırılarak günü 0'dan güne 1 farklılaştırma ortamına hazırlayın.
    4. 100 mL E6 orta sını 10 μM SB ve 0,75 μM CHIR99021 ile karıştırarak günü 2'den güne 10 farklılaştırma ortamına hazırlayın.
    5. Toplam 100 mL hacim için 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 3 μM CHIR99021 ve 10 ng/mL FGF2 ile nörobazal ortamı karıştırarak günü 10 gün 14 küresel orta ile hazırlayın.
    6. Her besleme için güne 10 gün 14 küresel orta 0.5 μM taze RA ekleyerek küresel uzun süreli bakım için gün 14 gün 28 orta hazırlayın.
      NOT: RA'yı her zaman -80 °C'de tutun.
    7. Nörobazal ortamı 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-glutamat ile karıştırarak SymN olgunlaşma ortamını hazırlayın, Toplam 100 mL hacim için 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 μM askorbik asit ve 0.2 mM dbcAMP. Çözelti 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Her beslemeden önce 0,125 μM taze RA ekleyin. Bu çözüm 14.(seçenek 1) veya 28.gün (seçenek 2) ile kullanılır.
    8. Toplam 100 mL hacim için gerekirse DMEM'i %2 FBS, 2 mM L-glutamat ve antibiyotiklerle karıştırarak FACS tamponu hazırlayın.
  3. hPSC bakım
    1. HPSC'lerin çözülmesi ve tutulması
      1. Bir Adet VTN kaplamalı 100 mm çanak hazırlayın.
      2. Doğrudan sıvı nitrojenden gelen bir hPSC şişesini eritmek için şişeyi 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve tüpü eriyene kadar dikkatlice suda sallayın. Çözülmüş hPSC'leri 10 mL 1x PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe ve 4 dk için 200 x g'de santrifüje aktarın.
      3. Supernatant atın ve tüp e8 orta 1 mL ekleyin. Pipet birkaç kez tamamen pelet yeniden askıya almak ve daha sonra 10 mL toplam ulaşmak için E8 orta başka bir 9 mL ekleyin.
      4. 100 mm çanak VTN çözeltisi aspire.
      5. Hücrelerin çanakta eşit olarak dağıtıldıklarından emin olmak için hPSC'leri 100 mm'lik bir tabağa aktarın, yavaşça sallayın (yukarı-aşağı ve sol-sağ, daireler halinde değil)
      6. 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
      7. Ertesi gün, tüm orta aspire ve E8 10 mL ile yem.
      8. Önümüzdeki 3-4 gün boyunca her gün bu şekilde besleyin ve sonra ayrılmaya hazırlanın.
    2. HPSC'lerin bölünmesi
      NOT: Bölünme noktasındaki hPSC'ler %80-%90 eşzamanlı olmalıdır. Pürüzsüz ve parlak kenarları olan büyük koloniler gözlemlenmelidir. Ancak, her koloni arasındaki temastan kaçınılmalıdır(Şekil 2B, gün 0 ve Şekil 6B).
      1. Gerektiğinde VTN kaplamalı 100 mm tabakları hazırlayın.
      2. E8 aspire ve 1x PBS ile 1x bölünmesi gereken çanak yıkayın.
      3. 1x PBS aspire ve 0,25 M EDTA 4 mL ekleyin. 37 °C'de 2 dk, %5 CO2kuluçka .
        NOT: HPSC'ler küçük koloniler halinde bölünmelidir/doldurulmalıdır. Tek hücrelere ayrılmasını önlemek için EDTA ile 2 dakikadan uzun süre tedavi etmeyin. Hücreler 2 dk tedaviden sonra hala çanak yüzeyine takılmalıdır.
      4. EDTA'yı aspire edin, 10 mL E8 ortamını çanak yüzeyine güçlü bir şekilde borulandırarak kolonileri ayırın ve tüm ortam ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
      5. %80-%90 birleşmede hPSC'ler ile kolonileri 1:15-1:20'ye bölün. Örneğin, hPSC'leri 1:20'ye bölmek için 500 μL E8/hPSCs çözeltisi alın ve 9,5 mL taze E8 ortamıile karıştırın.
      6. VTN kaplamalı 100 mm tabaklarda plaka lı hPSC'ler.
        NOT: Her araştırmacı ve hücre hattı için ideal bölme oranını bağımsız olarak oluşturman tavsiye edilir.
    3. Dondurucu hPSC'ler
      1. Bölünmeye hazır 100 mm'lik bir hPSC çanak için üç kriyon ve 3,5 mL dondurucu ortam hazırlayın.
        NOT: Ortam ve şişeler kullanıma kadar 4 °C'de veya buz üzerinde tutulmalıdır.
      2. E8'i aspire edin ve 1x PBS ile 2x yıkayın.
      3. Aspire 1x PBS ve 0,25 M EDTA 4 mL ekleyin, 37 °C'de 2 dakika kuluçka, %5 CO2.
        NOT: hPSC'ler bölünecekleri anda küçük koloniler halinde dondurulmalıdır. Tek hücrelere ayrılmasını önlemek için hücreleri 2 dk'dan uzun süre EDTA ile tedavi etmeyin. Hücreler 2 dk tedaviden sonra hala çanak yüzeyine takılmalıdır.
      4. EDTA'yı aspire edin, 10 mL'lik 1x PBS'yi çanak yüzeyinde güçlü bir şekilde borulandırarak kolonileri ayırın ve 50 mL'lik bir tüpte tüm ortam ve hücreleri toplayın.
      5. Kalan EDTA'yı yıkamak için 200 x g'de 20 mL 1x PBS ve santrifüj ekleyin.
      6. Supernatant atın ve donma orta 3 mL pelet resuspend.
      7. HPSC'leri üç cryovial'a eşit olarak dağıtın, her biri 1 mL.
      8. -80 °C'de bir gecede kontrollü bir dondurucu kutuda veya strafor sandviçte saklayın ve daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojen tankına aktarın.

2. Fide hPSC'ler farklılaşma (gün 0) başlatmak için

NOT: hPSC'ler stabilize edildikten sonra farklılaşmaya hazır olmalıdır (yani, çözülmeden sonra 2-3x bölünerek). Kolonilerin sağlıklı, pürüzsüz, parlak kenarlara ve minimal farklılaşmaya sahip olduğundan emin olun (Şekil 2B).

  1. Gerektiğinde 0. günden bir gün önce bodrum membran matris kaplı yemekleri (24 kuyu veya 6 kuyu yemeği) hazırlayın. Farklılaşmanın başlangıcında yemekleri RT'ye getirin.
  2. Gerektiğinde günü 0-1 farklılaştırma ortamı haline getirin.
  3. E8'i kabartmadan aspire edin, hPCS'leri bölmeye hazır olun ve yemeği 2x 1x PBS ile yıkayın.
  4. 100 mm çanak başına 0,25 M EDTA 7 mL ekleyin, 37 °C,% 5 CO2,15 dakika kuluçka.
    NOT: Bu noktada EDTA tedavisi tek hücrelere dağılmak üzere uzar.
  5. Tüm hPSC'leri (yüzer olmalılar) kapatın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın. EDTA'yı seyreltmek için EDTA çözeltisi ile aynı miktarda veya daha fazla 1x PBS ekleyin.
  6. Santrifüj 200 x g 4 dk.
  7. Supernatant atın, gün 0-1 diferansiyasyon orta ve hücreleri homojenize pipet 1 mL ekleyin. Daha fazla orta ekleyerek izleyin ve daha sonra hücreleri saymak için ideal bir konsantrasyon için hücre çözeltisi seyreltmek için karıştırın.
    NOT: Hücre çözeltisini aşırı seyreltme. Bir tam 100 mm çanak hücreleri başlamak için orta 5 mL seyreltilmiş olmalıdır.
  8. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın.
  9. Hücre çözeltisini düşük son hacimde 125.000 hücre/cm2'ye ulaşmak için gerektiği gibi seyreltin (örneğin, 6 kuyuluk için kuyu başına 2 mL veya 24 kuyu luk bir yemek için kuyu başına 500 l).
    NOT: Düşük hacimli hücreler daha hızlı takılmaya yardımcı olur.
  10. Kaplanmış tabaklardan tüm bodrum membran matris çözeltisinin aspire edilmesi ve hücre çözeltisinin kuyulara sataşması.
  11. 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.

3. Nöral krest hücre indüksiyonu (gün 1-gün 10, Şekil 2A)

  1. 1. günde hücreleri 0-1 farklılaştırma ortamıyla besleyin (6 kuyu için kuyu başına 3 mL ve 24 kuyu yemeği için iyi başına 1 mL).
  2. 2. günde hücreleri 2 günlük 10 farklılaştırma ortamıyla besleyin (6 kuyu için kuyu başına 3 mL ve 24 kuyu yemeği için iyi başına 1 mL).
  3. Şu andan itibaren hücreler 10.
    NOT: 6. günden itibaren NC sırtları tespit edilmelidir (Şekil 2B). Farklılaşma nın gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol etmek için, SOX10/AP2a için lekelenebilecek ve ayırt etme zamanı boyunca marker gen ekspresyonu için kullanılan küçük kuyularda (yani 24 kuyu) paralel bir farklılaşma kültürü taşıması tavsiye edilir(Şekil 2B,C).
  4. Hücreleri sıralıyorsanız, bölüm 4'e devam edin. Aksi takdirde, bölüm 5'e devam edin.

4. Nöral krest marker CD49D için floresan aktif hücre sıralaması (FACS) ve küresel lerde NC hücrelerinin toplanması

NOT: FACS sıralama için numuneler buz üzerinde tutulmalı ve sıralamaya kadar boyandan sonra ışığa maruz kalmalıdır.

  1. Hücreler sıralanmışsa FACS arabelleği hazırlayın.
  2. Gün 10-14 küresel orta hazırlayın.
  3. 10. günde, ortayı çıkarın ve 1x PBS ile 1x yıkayın.
  4. Ayrıştırma çözeltisi (Bkz. Malzeme Tablosu)6 kuyu luk bir yemek için her kuyuda 2 mL veya 24 iyi bir yemek için kuyu başına 1 mL ve 37 °C'de %5 CO2, 20 dk için %5 CO 2'de kuluçkaya yatırın.
  5. Tüm hPSC'leri kapatın ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
  6. 4 dakika için 200 x g FACS tampon ve santrifüj ile tüp geri kalanını doldurun.
    NOT: Her 50 mL tüp 20 mL veya daha az hücre çözeltisi barındırabilir. FACS arabelleği hacmi, dissosiasyon çözümünün nötralize edilebilecek kadar yüksek olmalıdır.
  7. Supernatant atın, FACS arabellek uygun miktarda hücreleri yeniden askıya (~ 2 mL bir kuyu başına 6 iyi plaka) ve hücre numarasını belirlemek için saymak.
  8. Aşağıdaki örnekleri hazırlayın.
    1. Örnek 1 (lekesiz kontrol): 400 μL FACS arabelleğinde 1 x 106 hücre. Hücreleri 20 μm'lik bir süzgeç başlığından filtreleyin ve tüpü buzda tutun.
    2. Örnek 2 (DAPI sadece kontrol): 0.5 ug/mL DAPI içeren 400 μL FACS arabelleğinde 1 x 106 hücre. Hücreleri bir süzgeç kapağı olan bir FACS tüpünden süzün ve tüpü buzda tutun.
    3. Örnek 3 (CD49d etiketli): 15 mL'lik bir tüpte PE/Cy7 konjuge CD49D antikor içeren FACS arabelleği (100°L FACS tamponunda 1x 106 hücre için 5 l) içeren FACS arabelleği olan hücrelerin geri kalanını 15 mL'lik bir tüpte askıya alın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
  9. 4 dk için 200 x g FACS tampon ve santrifüj ile tüpler doldurun.
  10. Üreticinin talimatlarına göre 0,5 ug/mL DAPI içeren FACS tamponunun 1 mL'lik 5-10 x 106 hücresini atın ve yeniden askıya alın.
  11. Hücreleri süzgeç kapağıyla FACS tüpünden süzün ve tüpü buzda tutun.
  12. 2 mL FACS tamponu içeren toplama FACS tüpleri hazırlayın.
  13. CD49D+ popülasyonu izole etmek için DAPI ve PE-Cy7'yi algılayabilen lazerlerle FACS makinesini sıralayın.
  14. Sıralamadan sonra, sıralanan hücreleri sayın.
  15. Tüm sıralanmış hücreleri santrifüj edin ve 10-14 gün küresel orta 500 μL orta başına 0,5 x 106 hücre son konsantrasyonuna resuspend.
  16. Plaka 0.5 x 106 hücreleri ultra-düşük eki 24 iyi plakalar içine iyi başına.
  17. Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.

5. Küresel lerde NC hücrelerinin toplanması

  1. NC hücrelerini izole etmek için FACS kullanmıyorsanız ve bunun yerine doğrudan küresel olarak biraraya getirmiyorsanız, öncelikle 4.2-4.5 adımlarında açıklandığı gibi hücreleri hazırlayın.
  2. Tüpün geri kalanını 1x PBS ile doldurun ve 4 dk için 200 x g'de santrifüj.
  3. Supernatant atın, gün 10-14 küresel orta uygun bir miktar hücreleri yeniden askıya (örneğin, 6 kuyu plaka için iyi başına orta ~ 2 mL) ve hücre numarasını belirlemek için saymak.
  4. 10-14 küresel orta gün içinde hücreleri seyreltin 0.5 x 106 hücre 500 μL orta başına.
  5. Ultra düşük eki 24 kuyu plakasında kuyu başına hücre süspansiyonunun 500 μL plakası.
  6. Hücreleri 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.

6. NC küresel bakım ve sempatik progenitor indüksiyon (gün 10 gün 14, Şekil 4A)

  1. Seçenek 1: Minimal küresel kültür
    1. 11. günde, NC küresel spheroidlerine 10.günden itibaren mevcut ortamı sindirmeden 500 μL gün 10-14 küresel orta ekleyin. 37 °C'de % 5 CO2'dekuluçkaya yatırın.
    2. 12. günde, kuyuların bir tarafında NC küreselleri biriktirmek için plakayı yatırın. Dikkatle aspire ve mümkün olduğunca çok orta atın ve gün 10-14 küresel orta 1 mL ile yem.
    3. 14. güne kadar hücreleri her gün beslemeye devam edin.
    4. İsteğe bağlı: Eğer küresel ler toplanır ve büyük bir küme oluştururlarsa, küresel kümeleri kırmak için bir pipet kullanın. Bu aynı zamanda bireysel küresellerin çok büyük alamadım sağlar.
      NOT: İdeal küresel boyut aralığı 100-500 μm civarında olmalıdır. Bu aralıkta, bireysel küresellerin boyutu kritik değildir. Ancak, morfoloji, pürüzsüz ve net kenarları gibi(Şekil 3 ve Şekil 6)daha fazla başarı için önemlidir. Gün 14, her 24 iyi plaka ideal yukarıda belirtilen boyut aralığı içinde farklı boyutlarda yaklaşık 50-60 sferoidler içerir.
  2. Seçenek 2: Genişletilmiş küresel kültür
    1. 15. günde, NC küreseloidleri tutmak için, 0,5 μM RA içeren 10-14 küresel ortam 1.5 mL ile beslenir. 37 °C,% 5 CO2inkübat.
      NOT: RA her besleme için taze eklenmeli ve her zaman -80 °C'de saklanmalıdır.
    2. Şu andan itibaren, 28.
      NOT: Büyüyen küreseloidler, 1 mL'lik pipetle boruile parçalayarak haftada yaklaşık 1 x bölünürler. Yaklaşık 1:2-1:4 oranında bölünürler. 2 haftalık genişleme süresi içinde, hücrelerin kabaca sayı olarak dört katına çıkmalıdır.

7. SymN farklılaşma ve olgunlaşma (Seçenek 1: gün 14 sonra; Seçenek 2: 28. günden sonra)

  1. Düzenli yemeklerde spheroidlerin kaplaması
    1. PO/LM/FM kaplamalı 24 kuyu plakası hazırlayın.
    2. 0,125 μM RA (her beslemeyi taze ekleyin) ve 10 μM Y27632 (sadece 14. gün) içeren symN ortamı hazırlayın.
    3. 14. günde, kuyuların bir tarafında NC küreselleri birikmesi için plakayı yatırın. Dikkatle aspire ve mümkün olduğunca çok orta atın ve symN orta 1 mL ile yem.
    4. LM/FN'yi kaplamalı plakalardan çıkarın.
    5. 24 kuyu plakasından her kuyuyu yeni, kaplamalı 24 kuyunun 4 ayrı kuyuya ayırın ve plakalayın. Her orijinal kuyu ~ 50-60 spheroids içeren 1 mL olacaktır. Bu verim 250 μL, yeni plaka her kuyu için yaklaşık 10-15 küresel içeren.
    6. Kuyu başına 250 μL ek ortam ekleyin.
      NOT: Bu 1:4 bir bölünme; bölme nispeten eşit olacak şekilde küresellerin çözelti içinde düzgün bir şekilde dağıtıldıklarından emin olun. Son sayı symNoluşturma başarısını etkilemediği için küresel lerin sayısı sayılmaz.
    7. 37 °C,% 5 CO2inkübat.
    8. 15. günde (veya seçenek 2 için 29. gün) tüm ortamları 0,125 μM RA içeren 1 mL symN ortamı ile değiştirerek besleyin. Şu andan itibaren, nöronlar gün 20 (veya seçenek 2 için gün 35) kadar her 2 günde bir beslenmelidir.
    9. 20. günden sonra (veya seçenek 2 için 35. günden sonra), nöronlar mevcut ortamın sadece yarısı (500 μL) dikkatle değiştirilerek beslenmelidir. Şu andan itibaren, ortam hızla sarıya dönüşmedikçe her hafta beslenin.
    10. İstenilen zaman noktasına kadar haftalık beslemeye devam edin.
      NOT: symNs ganglia benzeri yapılarda toplam eğilimindedir ve kültür yemekleri ayırmak için eğilimli. Bunu önlemek için, yarı beslemeve minimum işleme önerilir.
  2. Elektrofizyolojik kayıt için kaplama hücreleri
    1. PO/LM/FM kaplamalı 96 kuyu elektrofizyoloji plakası hazırlayın.
    2. 0,125 μM RA (her beslemeyi taze ekleyin) ve 10 μM Y27632 (sadece 14. gün) içeren symN ortamı hazırlayın.
    3. 14. günde, tüm küresel leri toplayın, sonra 4 dk için 200 x g'de santrifüj edin.
    4. Supernatant atın, dissosilasyon çözeltisi 2 mL ekleyin ve ultra düşük eki plaka kuyularından birine geri karışımı aktarın. 37 °C'de, %5 CO2'de 20-45 dakika kuluçkaya yatırın.
      NOT: Küresellerin boyutuna bağlı olarak, ayrışma süresi 20 dk'dan uzun olabilir. Hücrenin ayrışma süresini kontrol edin her 10 dakikada bir 45 dk. İsteğe bağlı olarak, 0,1 mg/mL DNase ayrıştırma solüsyonu ile eklenebilir ve çözeltiyi yapış hale getiren ölü hücrelerden serbest DNA'yı önleyin. Bu protokolde isteğe bağlıdır, çünkü küreseller tamamen ayrıştırıklarında bir araya gelmezler.
    5. Pipet tamamen spheroids ayrıştırmak için, sonra 4 dakika için 200 x g santrifüj.
    6. Supernatant atın, symN orta uygun miktarda hücreleri yeniden askıya ve hücre numarasını saymak.
    7. Hücreleri 100.000/cm2'de PO/LM/FN kaplı elektrofizyoloji kuyularında kuyu başına 200°L toplam hacimde kaplayın.
    8. 15. günde (veya seçenek 2 için 29. gün) bölüm 7.1'deki yle aynı besleme işlemlerini takip edin. 15. günden sonraki toplam hacim (veya seçenek 2 için 29. gün) kuyu başına 300 μL olmalıdır.
    9. Elektrik sinyallerini 20.
      NOT: Seçenek 2'de, spheroidler 14 gün 28 gün arasında her zaman kaplanabilir. İlk elektrik sinyalleri ölçümleri küresel lerin kaplamadan 1 hafta sonra yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokolde, hPSC'lerden symN'lerin nasıl üretilenlere ilişkin talimatlar veriyoruz. Burada gösterilen kültür koşulları daha önce yayınlanmış bir protokol23,24 (Şekil 1A)ile besleyicisiz ve kimyasal olarak tanımlanmış koşullara(Şekil 1B)iyileştirilmiştir. İki seçenek sağlanır, biri 20 gün içinde symN'lerin yapıldığı, diğeri ise Daha sonra symN'lere ayrıştırılabilen daha fazla hücre oluşturmak için 2 hafta boyunca genişletilebilen(Şekil 1B, Seçenek 1 ve 2).

Düzgün farklılaşmış hücrelerin symN özelliklerini izlemek için, PHOX2B-eGFP WA09 muhabir hattı ve üst WA09 PSCs hattı19. Tüm farklılaşmalar en az üç biyolojik tekrarda gerçekleştirildi, en az bir pasajdan sonra bağımsız diferansiyasyon deneyleri olarak tanımlandı ve/veya yeni çözülmüş bir hücre şişesinden türetilmiştir. Farklılaşmamış hPSC'lerin birleşmesi %80-90'a ulaştığında farklılaşmaya neden oldu. HPSC kolonileri yuvarlak, parlak, pürüzsüz kenarları ve hiçbir farklılaşma çok az idi. Koloniler birbirine dokunmamalıdır(Şekil 2B, gün 0). Daha önce nötrektiderm indüksiyoniçin kullanılan tipik çift SMAD inhibisyonu25yerine, ilk 2 gün içinde WNT ve BMP4 sinyalizasyonu ile birlikte TGF-β inhibisyonu erken nöral krest marker AP2a'nın sağlam ekspresyonuna yol açtı. Nöral krest belirteç SOX10 gün 4 gün 10(Şekil 2B)ifade edildi. NNC'ler 6. Bu sırtlar SOX10(Şekil 2B, oklar) ifade etti. Daha önce NCC aşamasında SOX10 hücre yüzey marker CD49D23,26 ve böylece CD49D SOX10 locus herhangi bir florofor raporlama olmayan NC hücreleri sıralamak için kullanılabilir ilişkili olduğu gösterilmiştir. Şekil 2C, Zaman içinde NCC marker genlerinin ekspresyonunu gösterir. Şekil 2D, farklılaşma verimimizin %80'in üzerinde olduğunu göstermektedir. Kalan hücrelerin kimliğini belirlemek için, qRT-PCR BryT ifade mezoderm, SOX17-ifade endoderm ve PAX6-ifade nöroektoderm dahil hücre tipleri, kontamine için test etmek için kullanılmıştır; tüm eksik veya çok düşük seviyelerde ifade edildi (veriler gösterilmedi; tüm astarlar için Ek Tablo 1'e bakınız). Ancak, kalan hücre türlerinin kaynağı olabilecek bazı SIX1/EYA1+ placode algılandı (veriler gösterilmedi). Ayrıca, kalan hücre türlerinin zaten daha da farklılaşmış Olan NCC türevleri olması mümkündür. NcCs HOX kodu bu aşamada değerlendirildi(Şekil 2E). Ancak, bu erken aşamada HOX sinyalleri çok düşüktü (ölçeği not edin), bu NC'lerin kranial-NC karakterli olduğunu veya henüz herhangi bir NCC alt tipi karakteri benimsemediğini düşündürmektedir.

10. günde NCC'ler FACS kullanılarak saflaştırılabilir, bu da %80 cd49D+ NCC(Şekil 2D)elde eder. Tipik bir gating stratejisiörneği Şekil 2D'degösterilir. Sıralamadan sonra hücreler NC spheroidolarak toplandı (Şekil 3A). NcCs genişletmek ve gövde-NC benzeri özellikleri neden, hücreler FGF2 ve CHIR bir kombinasyonu ile tedavi edildi. CD49D+ nüfus için sıralama daha sonra symNs daha iyi veya saf kültürleri verim olup olmadığını test etti. Şekil 3B, sıralanmamış VE CD49D+ sıralanmış ve CD49D ile karşılaştırılır- sıralanmış hücre popülasyonları. Solda, pozitif sıralanmış ve sıralanmamış popülasyonların NC küreselleri benzer bir şekilde yaptığı, negatif sıralanmış hücrelerin düzgün bir şekilde toplanmadığı, yuvarlak, pürüzsüz, sağlıklı görünen küresel leri yapmadığı ve 3-4 gün içinde öldüğü görülmektedir. Ayrıca NC spheroidleri NC ve symN progenitor belirteçleri için qRT-PCR ile 14. Bu noktada sempatik ata belirteçlerinin ekspresyonu hala düşüktü ve SOX10 düzeyleri yüksek kaldı, bu da küresel lerin hala NC özelliğine sahip hücrelerden oluştuğunu düşündürüyordu. Kaplamadan bir gün sonra (15. gün), hem sıralanmamış hem de CD49D+ küresel oidler PO/LM/FN yemeklerine iyi bağlanmış ve neurite çıkıntısı açıkça gözlemlenebilir(Şekil 3B, D15 ve Şekil 3C, D29). Sıralanmamış ve sıralanmış kültürler 35. Bu nedenle, sıralama adımının symN'lerin oluşumu için gerekli olmadığı ve bu nedenle bu protokolde isteğe bağlı bir adım olduğu sonucuna varılabilir. Ancak, %80 CD49D+ hücre verimi olmayan daha az verimli farklılaştırmalar için sıralama işlemini öneririz.

Daha sonra, bu NC spheroidlerinin NC kimliklerini kaybetmeden muhafaza edilip edilemeyeceğini test ettik(Şekil 3A, seçenek 2). NcC'ler 2 haftaya kadar küresel olarak kültürlenmiştir(Şekil 3C). 29. günde 28 spheroid ve kaplama hücrelerinin morfolojisi 14. 28. günde, SOX10 ifadesi 14. Ancak, erken sempatik progenitor belirteçleri (yani, ASCL1, PHOX2B ve GATA3) ekspresyonu arttı(Şekil 3C, sağ), FGF2 genişletilmiş kültür düşündüren, WNT, ve RA sinyalizasyon olgunlaşma ve posteriorizasyon yol açtı(Şekil 4C ve F). Benzer etkiler daha önce Kirino ve ark21tarafından bildirilmiştir.

NC genişlemesinden sonra (seçenek 1 veya seçenek 2), küreseloidler PO/LM/FN kaplı tabaklara kaplandı ve symN'leri olgunlaştıracak birden fazla sinirsel faktörle birlikte verildi(Şekil 4A). 20 ve 35. günde (sırasıyla seçenek 1 ve 2'de kaplamadan 1 hafta sonra) bağlı küresel lerden yayılan radyal desende nöritler gözlendi(Şekil 4A, sağda). Ayrıca norepinefrin (NE) sentezi ve taşınması ile ilgili belirteçler (yani TH, AAAD, DBH) ifade edilmiştir(Şekil 4B). Kontamine hücre tiplerinin varlığı burada tekrar incelenmiş ve parasempatik nöronları gösterebilen ChAT ekspresyonu bulunmuştur (Şekil 4B,E). Ancak, ChAT da kolinerjik symNs ifade edilir. Çok düşük VIP düzeyleri, başka bir parasempatik belirteç, tespit edildi (veriler gösterilmedi). Ayrıca, brn3A, ISL1 ve RUNX1 düzeylerinin düşük olduğu saptandı (Şekil 4B,E), bu da duyusal nöronları veya trigeminal nöronları, yani placode türevlerini gösterebilir. Minimal EDNRB (enterik nöronların işaretlenmesi) ve OLIG2 (motornöronişaretleme) saptanır (veriler gösterilmedi). Nöronal olmayan hücrelerin kimliği belirsizliğini koruyor. Ancak, önceki symN protokol23sonuçları dayanarak , onlar büyük olasılıkla αSMA+ miyofibroblastlar edildi. HOX genlerinin ekspresyonu yeniden incelendi ve HOX5-9'un ifade edildiği ve gövde kimliğinin ortaya çıkarıldığı saptandı. HOX10 (sakral-NC göstergesi) ifade edilmedi (Şekil 4C, F). Son olarak, nikotinik asetilkolin reseptörü (CHRNA3/4) ve NE ile ilişkili reseptörler, adrenerjik reseptörler (ADRA2A/B2) NE taşıyıcı (NET, SCL6A2) ve vezikül taşıyıcısı (VMAT1) dahil olgun belirteçler ifade edilmiştir(Şekil 4D,G). Seçenek 1'e göre seçenek 2 ile türetilen hücrelerde bu genlerin ekspresyonunda anlamlı bir fark saptanmamaz(Şekil 4E-G).

Ayrıca bu protokolü H9-PHOX2B:GFP muhabir hattında gerçekleştirerek sonuçlarımızı doğruladık (Şekil 5). 20. gün, hücreler nöronların yoğun bir çim oluşturdu ve daha yüksek yoğunlukta kümeler halinde toplanan, çok yüksek bir farklılaşma verimliliği gösteren(Şekil 5A, üst satır). Boyama, bu kümelerde çoğu symN'in kümelenmesinin genel farklılaşma verimliliğinin değerlendirilmesi ve ölçülmesinin zor olduğunu gösterdi. Belirli symN belirteçlerinin boyanmasını ve birlikte lokalizasyonunu vurgulamak için, kümelerin eteklerindeki daha az yoğun alanlara odaklandık (Şekil 5A'dakisarı kutuya bakınız, sağda). Burası aynı zamanda en kirletici hücrelerin bulunduğu yerdi, bu yüzden genel verimliliği değerlendirmek için iyi bir alan değildi. Yine de, tipik symN işaretleri; peripherin dahil (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan nöronal), DBH, ve NET1 (symN organları ve aksonları boyunca nokta ifade, Şekil 5A, alt); tespit edildi. Elektriksel aktiviteyi ölçmek için çok elektrotlu bir dizi (MEA) yaklaşımı kullanılmıştır ve o gün 20 symN'in farklılaşmamış hPSC'lerin negatif kontrolüne kıyasla saniyede yaklaşık 3-5 ani ateş ettiği bulunmuştur(Şekil 5B). Her elektrotun (Şekil 5B'dekisiyah nokta , parlak alan) düzgün bir şekilde kaydedilebilmesi için hücrelerin kuyuda eşit olarak dağıtılması önemlidir. Gün 20 gün 30 symNs da 1 μM nikotin ile uyarılmış, hangi vivo symNs preganglionic sinyal taklit ve hücrelerde ortalama ateş oranı arttı. Nöronların inhibisyonu da ölçüldü. β2-adrenerjik reseptör (ADRB2), symN akson terminalleri bulunan, NE salgısı için olumlu bir geri bildirim döngüsü oluşturur29. SymNs'in 1 μM propranolol (β2-adrenerjik reseptör antagonisti) ile tedavi edilmesi aktivitelerini inhibe etti(Şekil 5C, sağ). Bu sonuçlar, bu protokol tarafından oluşturulan symNs işlevsel olarak etkin olduğunu göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Şematik illüstrasyon ve symN farklılaşma protokollerinin karşılaştırılması. (A) Zeltner ve ark.23tarafından önceki protokol . (B) Optimize edilmiş protokol. Seçenek 1 20 gün uzunluğunda ve NC küresel kültür sadece 4 gün içerir. Seçenek 2 35 gün uzunluğunda ve daha fazla NC hücrelerinin üretimine olanak sağlayan bir 2 hafta NC küresel genişleme aşaması içerir. VTN = vitronektin, PO = poli-L-ornitin, LM = laminin, FN = fibronektin, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = retinoik asit, AA = askorbik asit, NFs = NGF+BDNF+GDNF. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: NC indüksiyon. (A) Zaman çizelgesi ve NC indüksiyonu için 0 günden 10 güne tedaviler. (B) NC sırtlarının morfolojisi ve oluşumu parlak alan mikroskobu ile her 2 günde bir izlendi. 2. günden sonra her zaman noktasındaki hücreler AP2A (kırmızı) ve SOX10 (yeşil) için birlikte boyandı. Tüm immünofloresan resimleri DAPI ile karşılekelendi. Kırmızı oklar sırtların yapılarını gösterir. (C) 2-10 gün nc belirteçlerinin ifade profili için qRT-PCR analizi. (D) CD49D+ NC popülasyonları (solda) için 10. Tipik bir gating stratejisi ve isotip kontrolü ilk dört parselde gösterilir. 10. günde CD49D+ hücre yüzdesinin sayısallaştırılması da gerçekleştirildi. (E) 2-10 gün HOX genlerinin ekspresyon profili için qRT-PCR analizi. NC = nöral tepe. Hata çubukları, PSC kültürlerinden ayrı günlerde yapılan ve en az bir birbirinden ayrılan bağımsız farklılaşma deneyleri olarak tanımlanan n ≥ 3 biyolojik tekrarın verilerinden kaynaklanmaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Nöral krest bakımı ve genişlemesi. (A) Zaman çizelgesi ve nc genişleme için tedaviler gün 10 gün 14 kültür için seçenek 1 veya gün 10 gün 28 kültür için seçenek 2. (B) NC küresel formasyonu parlak alan mikroskobu ile 11.günden (küresel oluşumundan 1 gün sonra) 14.güne (yani kaplama günü) kadar izlendi. Sıralanmamış, CD49D+ve CD49D- popülasyonları karşılaştırıldı. 15. günde kaplanmış hücreler de gösterilir. Hücreler CD49D düzgün spheroids oluşturmak için başarısızoldu - grup ve kaplama sonra öldü. Gün 14 hücreleri qRT-PCR analizi (sağ) symN atalarının ifade profili için incelendi. Sıralanmamış ve CD49D+ popülasyonlar karşılaştırıldı (n ≥ 3). (C) NC küresel leri 2 haftaya kadar muhafaza edilebilir. Spheroidler 15.günden 28.güne (iniş günü) kadar parlak alan mikroskobu ile izlendi. 29. günde kaplanmış hücreler de gösterilir. Gün 28 spheroids symN progenitors (sağda) ifade profili için qRT-PCR analizi ile incelendi. Sıralanmamış ve CD49D+ popülasyonlar bir araya getirildi (n ≥ 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: SymN farklılaşma ve olgunlaşma. (A) Seçenek 1 veya seçenek 28 için gün 14 kaplama sonra zaman çizelgesi ve tedaviler 2 seçenek için. Parlak alan mikroskobu fotoğrafları (sağda) sırasıyla 20. (B–D) 20-30 gün arasında symN özelliklerinin ifade profili için Seçenek 1 qRT-PCR analizi. Sıralanmamış ve CD49D+ popülasyonları biraraya getirildi. (E–G) 35. günden sonra symN özelliklerinin ifade profili için seçenek 2 qRT-PCR analizi. Sıralanmamış ve CD49D+ popülasyonlar bir araya getirildi (n ≥ 3). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: SymNs fonksiyonel karakterizasyonu. (A, üst satır) SymN kümelerinin 20. (A, alt) 20. günde immünoresans boyama ile birden fazla symN belirteçleri (ayrılmış kanallar) doğrulandı. Norepinefrin taşıyıcı (NET1) hem hücre gövdelerinin yüzeyinde hem de akson ve dendritler boyunca yer aldı. Bu büyütmede nokta olarak ortaya çıktı. Tüm immünofloresan resimleri DAPI ile karşılekelendi. (B) 20. Parlak alan resmi (altta) symNs yoğunluğu nu ve elektrotların dağılımını (sekiz siyah nokta) gösterir. Sıralanmamış ve CD49D+ popülasyonları burada toplandı. (C) 1 μM nikotin ve 5 dakika için 1 μM propranolol tedavileri altında gün 20-30 symNs için ortalama ateşleme oranlarının sayısallaştırılması, sırasıyla (sağda). Sıralanmamış ve CD49d pozitif popülasyonların sonuçları bir araya getirildi (n ≥ 3). Welch düzeltme, p-değeri:*<0.05 ile eşleşmemiş, iki kuyruklu t-testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Farklılaşmaya devam etmek için uygun olmayan koşullar altında hücrelerin örneği. (A) B–E'de belirtildiği hücre morfolojileri için her kontrol noktası ile farklılaşma zaman çizelgesi . (B) sağlıklı kolonileri ve farklılaşmış hücrelerin bir sürü ile hPSCs (a) ve (b) gün 0 bazı koloniler arasında birleştirilmiş ve farklılaştırılmış sınırları. Kırmızı oklar birleştirilmiş alanları gösterir. (C) NcCs gün 10 sırtlarda kabarcık gibi kabarcıklar ile. Kırmızı oklar üst sıradaki kabarcıkları gösterir. Alt satır daha yüksek bir büyütme temsil eder. Kabarcıkların hücre kimliğini belirleyemedik. Ancak, daha fazla kabarcık varlığı düşük SOX10/CD49D ifade ile ilişkili gibi görünüyor. (D) Düzensiz görünümlü küresel ler 14. (E) Sağlıksız ve ölmekte olan 20. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Geçenlerde iki değerlendirme yayınladı, bir hastalık modelleme için hPSC kaynaklı symNs kullanımını tartışırken31 yanı sıra mevcut farklılaşma protokolleri derinlemesine bir karşılaştırma22. Bu nedenle, burada ilgili araştırmacı symNs yapmada başarılı yardımcı olmak için mevcut protokol sorun giderme üzerinde duruluyor. Tüm farklılaşma sürecinde, sağlıklı farklılaşmış hücrelerin yanı sıra tutarlı veri elde etmek için, her aşamada kontaminasyon dikkatle kontrol edilmelidir. Rutin hPSC bakımında mikoplazma testi iki haftada bir veya ayda bir yapılmalıdır. Hücre ayrılma 10 gün yapılırsa, herhangi bir ortama antibiyotik eklenmesi son derece teşvik edilir. Diferansiyasyona başlamadan önce ve sonra hücre morfolojisini kontrol etmek de önemlidir. Burada birkaç kritik kontrol noktası öneriyoruz (Şekil 6A). İlk olarak, farklılaşmaya hazır ideal hPSC kolonileri küçük sivri uçları ile parlak ve pürüzsüz kenarları olmalıdır. Dişli benzeri sivri koloniler ayırt etmeye başladı ve kullanılmamalıdır. Morfolojisi saatler içinde değişebildiği için, mükemmel zaman noktasındaki hücrelerin hemen kullanılması önerilir. Sadece bir gün erteleme hücreleri çökmesine olabilir(Şekil 6B, a) veya koloniler arasında temas yol açabilir(Şekil 6B, b), hangi hPSCs farklılaşmauyarır. Bir kültürdeki her farklılaşmış hücreden kurtulmak zordur, ancak popülasyon kötü kolonilerin %5'inden daha azını içerecek şekilde kontrol edilmelidir. Bu protokolü takip ederken, farklılaşma sırasında ki ikinci kontrol noktası 2 gün ile 10. Bu aşamada, koyu NC sırtlar açıkça parlak bir alan mikroskobu altında gözlenmelidir(Şekil 2C). Sırtların kalınlığı ve dağılımı NC verimliliğinin göstergesi olarak kullanılabilir: NcC'ler esas olarak sırtları oluşturan hücrelerden türetildiği için, sırtlarda ince veya daha az yaygın sırtlar ve kabarcıklar düşük NC üretimine işaret edebilir ve bu nedenle tutarsız sonuçlar durumunda işaretlenmeli veya atılmalıdır(Şekil 6C). RNA örneklemesi, yukarıda açıklanan NC işaretlerini kontrol etmek için 10. Üçüncü kontrol noktası NC küresel evresindedir, çünkü küreseller biraraya gelebilir. Bu periyodik olarak kırmak ve agregasyon (hücreler tek hücrelere geri değil, sadece küçük küreseller için dağıtılır olmayacaktır) yeniden askıya orta boru en iyisidir. Spheroids çok hızlı bir şekilde genişletmek, 1:2 veya 1:4 hücreleri büyümek için yeterli alan ve besin bırakmak için onları bölün. Eğer küresel şekilleri düzgün ve yuvarlak değilse(Şekil 6D),10. SymN progenitor özelliklerini kontrol etmek için ifade profillerinin test edilmesi istenilen küresel kaplama gününde önerilir. Dördüncü kontrol noktası, küresel leri kaplamaktan sonra. Nöritler açıkça görülebilmeli ve 20. Yaygın nöritve demetleri olmayan hücreler kontaminasyon olarak kabul edilmelidir(Şekil 6E). Bu noktada, istikrarlı nöronlar tarafından oluşturulan besleyici ortamı korumak için mevcut ortamın sadece yarısını değiştirerek nöronları beslemek önemlidir. Hücreleri beslerken dikkatli olun, çünkü olgunlaşma symN'leri savunmasızdır ve kolayca kopabilir. Burada açıklanan kötü görünümlü morfolojilerin her birinin nedeni henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak, hPSCs ve in vitro farklılaşma hassas doğası hakkında fikir sağlar. Bu tür usulsüzlüklerin bir kaynağı farklı satıcılardan gelen reaktiflerden kaynaklanıyor olabilir. Örneğin, bmp4 farklı bir marka kullanırken kabarcıklar ile ince sırtlar gösterir.

MEA kullanılarak yapılan elektrofizyolojik analizler için, elektrot kuyularında symN'leri eşit olarak dağıtmak için, küresel oidler Accutase tarafından ayrıştırılır. Tedavi süresi ile başlamak için 20 dk olmalıdır. Ancak, küreseller son derece sıkıştırılmış olduğundan, spheroids tamamen ayrıştırılmış olduğundan emin olmak için ayrışma süresi 45 dk'ya çıkarılabilir. Genel olarak, bir MEA plaka üzerinde her deney grubu tutarlı sonuçlar elde etmek için en az altı katları çalıştırılması gerekir. Özellikle, rekaplama için yoğunluğu üreticinin önerileri32 (yaklaşık 500-700.000/cm2)çok daha düşük olduğundan, iyi tekrarlar çok önemlidir. Sonuçlarımızda, hem önemli symN işaretleyici ifadesi hem de kararlı etkinlik 20.günden 30.güne kadar gösteriş gösterir. Bunu, tercih edilen değişkenleri kaydetmeye başlamak için en iyi zaman noktası olarak öneririz. Her farklılaşma için ortam taze yapılmalı ve mümkün olduğunca çabuk kullanılmalıdır (bir aydan fazla değil).

Burada sunulan symN farklılaştırma protokolü besleyicisiz, kimyasal olarak tanımlanmış, verimli, genişletilebilir ve 20. Bu tanımlanmış symN farklılaşma protokolü sempatik sinir sisteminin insan bozukluklarını incelemek için, ilaç taraması için bir platform olarak, nöroblastom/pheokromositoma gibi tümörigenez çalışmaları için veya homeostatik regülasyonda temel araştırmalar için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Heidi Ulrichs'e makalenin eleştirel okuması ve düzenlenmesi için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13 (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30 (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6 (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. , Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23 (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76 (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18 (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244 (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139 (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57 (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75 (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399 (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135 (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. , Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277 (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19 (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8 (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50 (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22 (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21 (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89 (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49 (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).

Tags

Gelişimbiyolojisi Sayı 159 insan pluripotent kök hücreleri nöral ibik sempatik nöronlar otonom sinir sistemi sempatik sinir sistemi besleyicisiz kimyasal olarak tanımlanmış kök hücre kültürü
Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanan Postgangliyonik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient… More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter