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Developmental Biology

Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen

Published: May 24, 2020 doi: 10.3791/60843
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Center for Molecular Medicine, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia, 3Department of Cellular Biology, Franklin College of Arts and Sciences, University of Georgia

Summary

In diesem Protokoll beschreiben wir eine stabile, hocheffiziente Differenzierungsstrategie für die Erzeugung postganglionischer sympathischer Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen. Dieses Modell wird Neuronen für die Verwendung von Studien zu multiplen autonomen Störungen zur Verfügung stellen.

Abstract

Menschliche pluripotente Stammzellen (hPSCs) sind zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Krankheitsmodellierung und die Untersuchung der menschlichen embryonalen Entwicklung in vitro geworden. Zuvor haben wir ein Differenzierungsprotokoll zur Ableitung autonomer Neuronen mit sympathischem Charakter vorgelegt, das auf Patienten mit autonomer Neuropathie angewendet wurde. Das Protokoll wurde jedoch auf Knock Out Serum Replacement (KSR) und Feeder-basierten Kulturbedingungen aufgebaut, und um eine hohe Differenzierungseffizienz zu gewährleisten, war eine Zellsortierung erforderlich. Diese Faktoren verursachen eine hohe Variabilität, hohe Kosten und geringe Reproduzierbarkeit. Darüber hinaus wurden reife sympathische Eigenschaften, einschließlich elektrischer Aktivität, nicht überprüft. Hier präsentieren wir ein optimiertes Protokoll, in dem PSC-Kultur und Differenzierung unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen durchgeführt werden. Genetische Marker, die den neuronalen Kamm des Stammes identifizieren, werden identifiziert. Eine weitere Differenzierung in postganglionische sympathische Neuronen wird nach 20 Tagen ohne Zellsortierung erreicht. Die elektrophysiologische Aufzeichnung zeigt die funktionelle Neuronenidentität weiter. Das aus unseren differenzierten Neuronen nachgewiesene Feuer kann durch Nikotin verstärkt und durch den adrenergen Rezeptor-Antagonisten Propranolol unterdrückt werden. Zwischensympathische neuronale Vorläufer in diesem Protokoll können als neuronale Sphäroide für bis zu 2 Wochen aufrechterhalten werden, was eine Erweiterung der Kulturen ermöglicht. Zusammenfassend zeigt unser aktualisiertes sympathisches Neuronendifferenzierungsprotokoll eine hohe Differenzierungseffizienz, eine bessere Reproduzierbarkeit, mehr Flexibilität und eine bessere neuronale Reifung im Vergleich zur vorherigen Version. Dieses Protokoll wird Forschern die Zellen zur Verfügung stellen, die notwendig sind, um menschliche Störungen zu untersuchen, die das autonome Nervensystem beeinflussen.

Introduction

Postganglionische sympathische Neuronen (SymNs) gehören zum autonomen Nervensystem (ANS) und haben mehrere wichtige Rollen bei der Reaktion und Regulierung der Homöostase des Körpers unabhängig vom Bewusstsein. Zum Beispiel stimuliert Stress SymNs und ruft die Kampf-oder-Flug-Reaktion hervor, die zu einer Erhöhung der Herzfrequenz, des Blutdrucks und des Schwitzens führt. SymNs sind bei mehreren menschlichen Störungen aufgrund von Genetik, Toxizität/Verletzung oder als Begleiter zu anderen Krankheiten betroffen. Ein Beispiel für eine genetische Neuropathie ist die Kindheitsstörung Familiäre Dysautonomie (FD), bei der eine schwere Dysregulation von SymNs eine dysautonome Krise verursacht, die durch Schwitzen, Ausblasen der Haut, Erbrechen, Bluthochdruck und Angst1offensichtlich wird. Ein Beispiel für Toxizität ist die Chemotherapie, die toxische Nebenwirkungen auf autonome2Neuronen 2 haben soll. Es ist bekannt, dass autonome Denervation und Hyper-Innervation sowohl zu Krankheiten wie Parkinson oder hypertensiveNierenerkrankung,4führen können, als auch zu begleiten. Daher ist es für die Suche nach neuartigen und wirksamen Behandlungen von Vorteil, die Mechanismen der SymN-Biologie und Defekte im Zusammenhang mit Krankheiten zu erforschen und zu verstehen.

Anatomie
Das periphere Nervensystem verzweigt sich in sensorische und autonome Divisionen. Die affevollen Nerven des sensorischen Nervensystems sind für das Gefühl von Schmerz und Berührung verantwortlich, während das ANS für die Weitergabe von Informationen von allen Organen an das Gehirn verantwortlich ist. Das ANS ist in das enterische Nervensystem unterteilt, das den Magen-Darm-Trakt, das parasympathische Nervensystem, das für die Entspannung wichtig ist, und das sympathische Nervensystem (SNS), das für die Aktivierung/Regulierung von Organen wichtig ist. Das SNS passt ein Zwei-Neuron-System5an. Präganglionische sympathische neuronale Axone im Rückenmark projizieren zunächst auf die sympathischen Ganglien, wo sich postganglionische SymN-Zellkörper befinden. Diese Neuronen senden dann lange Projektionen, um das Zielgewebe jedes Organs im Körper zu innervieren. Signale, die von präganglionischen Neuronen übertragen werden, sind cholinerge, während postganglionische SymNs adrenerge sind und somit Noradrenalin (NE) als ihren wichtigsten Neurotransmitter ausdrücken. Es gibt nur wenige bemerkenswerte Ausnahmen von postganglionischen, sympathischen Neuronen, die cholinergisch sind, einschließlich derer, die die Blutgefäße innervierend bilden. Adrenergetische postganglonische Neuronen drücken die Enzyme Tyrosinhydroxylase (TH), aromatische L-Aminosäure-Decarboxylase (AAAD), Dopamin-Hydroxylase (DBH) und Monoaminoxidase (MAO-A) aus, die alle für die Erzeugung und Metabolisierung von NE verantwortlich sind. Darüber hinaus exprimieren sie die NE-Recycling-Transporter und/oder Rezeptoren a-adrenergen Rezeptor (ADRA2), den adrenergen Rezeptor (ADR2B), den Noradrenalin-Transporter (NET1) und den vesikulären Monoamin-Transporter (VMAT1/2).

Entwicklung
Während der embryonalen Entwicklung werden SymNs aus dem Neuralkamm (NC) abgeleitet, der zwischen dem Neuralrohr und dem überlagernden Ektoderm6entsteht und sich in mehrere Zelllinien differenzieren kann, einschließlich Melanozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Glia, enterischen Neuronen, sensorischen Neuronen und autonomen Neuronen7. Neurale Kammzellen (NCCs) sind hochwandernde Zellen, die mehrere Wege durch den Embryo nehmen. In diesem frühen Stadium der NC-Entwicklung exprimieren die Zellen die Marker SNAIL1'2, FOXD3 und SOX108,9,10,11. Die Migrationsroute zusammen mit der axialen Position, die sie annehmen, bestimmt den NC-Subtyp, zu dem sie sich entwickeln werden. Diese NC-Subtypen lassen sich durch ihre spezifische HOX-Genexpression unterscheiden: Cranial NCCs exprimieren keine HOX-Gene, vagal-NCCs drücken HOX 1–5 aus, Trunk-NCCs drücken HOX 6–9 aus und sakrale NCCs drücken HOX 10–1112aus. Unter ihnen werden Trunk-NCCs als Hauptquelle von SymNs anerkannt. SymN-Vorläufer drücken den Transkriptionsfaktor MASH1/ASCL113aus, der die Expression von PHOX2B14 und INSM115fördert. Die GATA-Familie von Transkriptionsfaktoren kommt während der späten sympathischen Entwicklung zum Ausdruck. GATA2 und GATA3 werden in den SymNs ausgedrückt, was wiederum DBH16aktiviert. Der Transkriptionsfaktor HAND2 ist auch wichtig für die Expression und Wartung von DBH und TH17.

HPSCs (z. B. embryonale und induzierte pluripotente Stammzellen) sind ein leistungsfähiges Werkzeug18, um Entwicklungsparadigmen zu rekapitulieren und SymNs zu erzeugen, die dann zur Krankheitsmodellierung verschiedener menschlicher Störungen eingesetzt werden können. Daher ist es bei der Generierung von SymNs aus hPSCs von entscheidender Bedeutung, Entwicklungsrichtlinien zu befolgen und die Ausprägung geeigneter Marker entlang des Differenzierungsprozesses zu bewerten.

Vorheriges symN-Protokoll
Nur wenige Forschungsgruppen haben bisher über die Generierung von SymNs aus hPSCs19,20,21berichtet. Der direkte Vergleich dieser Protokolle untereinander und unserer wurde vor kurzem22überprüft. Im Jahr 201623haben wir ein Differenzierungsprotokoll für die Erzeugung autonomer Neuronen mit SymN-Charakter veröffentlicht (Abbildung 1A). Dieses Protokoll verwendete KSR-basiertes Medium, das sowohl bei der Aufrechterhaltung undifferenzierter hPSCs als auch bei der Zelldifferenzierung verwendet wurde. Darüber hinaus wurden hPSCs auf embryonalen Fibroblasten der Maus (MEF-Feederzellen) aufrechterhalten. Wir verwendeten dieses Protokoll und PSCs von Patienten mit FD, um die Störung23zu modellieren. Im Jahr 2019 haben wir eine detailliertere Version dieses älteren Protokolls24beschrieben. Zusammenfassend wurde das neuronale Schicksal durch die doppelte SMAD-Hemmung25 induziert, um die TGF-- und BMP-Signalisierung in den ersten 2 Tagen zu blockieren. Die WNT-Aktivierung mit CHIR99021 förderte neuronale Vorläufer zu NC-Zellen. Am 11. Tag wurden die Zellen nach FACS für CD49D+ oder SOX10+ Populationen26,23sortiert, was zu einer Effizienz von etwa 40 % NC-Erzeugung führte. Daher war eine Sortierung erforderlich, um die Effizienz und Reinheit für die nächsten Differenzierungsschritte zu gewährleisten. Die NCCs wurden mit der kombinierten Behandlung von FGF2 und CHIR als Sphäroide aufrechterhalten und verstärkt. Nach 4 Tagen wurden die NC-Sphäroide der Wartung plattiert und mit BDNF, GDNF und NGF versorgt, um die SymN-Reifung zu beenden. Obwohl diese SymNs starke SymN-Marker wie ASCL1, TH, DBH und PHOX2A exprimierten, waren Marker für reifere SymNs, einschließlich der Expression des Nicotinacetylcholin-Rezeptors (CHRNA3/CHRNB4) und des Vesikeltransporters (VMAT1/2), auch nach 70 Tagen Differenzierung niedrig. HOX-Gene in diesem Protokoll wurden nicht formal getestet, und reife neuronale Eigenschaften, einschließlich der elektrophysiologischen Aktivität der Zellen, wurden nicht überprüft.

Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SymNs vor (Abbildung 1B). HPSCs werden unter feederfreien Bedingungen auf vitronectin (VTN)-beschichteten Gerichten mit Essential 8 (E8) Medien27gehalten. Die Formel der Differenzierungsmedien wurde in jeder Phase geändert, wodurch der Prozentsatz der NC-Bevölkerungum 28erhöht wurde. Die SymN-Reifung kann auf CD49D+/SOX10+ sortierten oder unsortierten Massen-NCC-Populationen durchgeführt werden. Beide zeigen eine hohe SymN-Marker-Expression am 30. Tag. Darüber hinaus reagieren die mit diesem Protokoll erzeugten SymNs auf elektrophysiologische Aufzeichnungen und Auflagen mit SymN-Aktivator- und Inhibitorverbindungen.

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Protocol

HINWEIS: Die H9 PHOX2B:GFP Reporterlinie wurde von Oh et al.19zur Verfügung gestellt. Einige qPCR Primer, die in diesem Papier verwendet werden, wurden von OriGene Technologies bezogen, während einige Sequenzen von Frith et al.20,30erhalten werden.

1. Aufbau für Schalenbeschichtung, Medienaufbereitung und hPSC-Wartung

  1. Tellerbeschichtung
    1. Vitronectin (VTN) Beschichtung
      1. Fläschchen VTN in ein 37 °C-Wasserbad geben, bis es vollständig aufgetaut ist, dann gründlich mischen.
      2. Für eine 100 mm Petrischale 7 ml 1x Phosphat gepufferte Saline (PBS) mit 0,5 mg/ml VTN mischen, VTN-Lösung in die Schale geben und bei Raumtemperatur (RT) 1 h brüten.
    2. Kellermembran-Matrixbeschichtung
      1. Durchstechflaschen der Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)über Nacht bei 4 °C auf Eis auftauen.
      2. Für einen Brunnen einer 6-Well-Platte 2 ml DMEM/F12 mit 20 l 100x Kellermembranmatrix mischen, Kellermembran-Matrixlösung in die Schale geben, die Schale mit Paraffinfolie umwickeln und über Nacht in einem sauberen Behälter bei 4 °C aufbewahren. Arbeiten Sie so schnell wie möglich. Beschichtete Gerichte können in 4 °C für bis zu 2 Wochen gelagert werden.
    3. Polyornithin (PO)/Laminin (LM)/Fibronectin (FN) Beschichtung
      1. Am ersten Tag, für einen Brunnen einer 24-Well-Platte, mischen Sie 15 g/ml PO mit 1 ml 1x PBS, inkubieren bei 37 °C, 5%CO2 über Nacht. Sowohl LM als auch FN über Nacht bei -20 °C auftauen und bei 4 °C lagern, bis sie vollständig aufgetaut sind.
      2. Am zweiten Tag, Aspirat-PO-Lösung, waschen Sie die Brunnen 2x mit 1x PBS, fügen Sie 1 ml 1x PBS mit 2 g/ml LM und 2 g/ml FN hinzu und inkubieren bei 37 °C in 5%CO2 über Nacht. An dieser Stelle kann die Schale mit der LM/FN-Lösung monatelang im Inkubator aufbewahrt werden, solange sie nicht austrocknet. Fügen Sie weitere 1x PBS hinzu, um zu verhindern, dass die Schale austrocknet.
  2. Medienvorbereitung
    1. Bereiten Sie das Essential 8 Medium (E8) vor, indem Sie eine Flasche E8-Ergänzung bei 4 °C über Nacht auftauen. Mischen Sie die Ergänzung mit 500 ml E8 Medium und Antibiotika, wenn nötig.
      HINWEIS: Die E8-Lösung sollte innerhalb von 2 Wochen aufgebraucht sein.
    2. Bereiten Sie das hPSC Gefriermedium vor, indem Sie 90 ml komplettes E8-Medium mit 10 ml DMSO für ein Gesamtvolumen von 100 ml mischen. Filter sterilisieren.
    3. Bereiten Sie den Tag 0 bis Tag 1 Differenzierungsmedium durch Mischen von 100 ml essentielles 6 (E6) Medium mit 10 m SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021 und 10 'M Y27632 bei einem Gesamtvolumen von 100 ml vor.
    4. Bereiten Sie den Tag 2 bis Tag 10 Differenzierungsmedium durch Mischen von 100 ml E6 Medium mit 10 m SB und 0,75 m CHIR99021 für ein Gesamtvolumen von 100 ml vor.
    5. Bereiten Sie den Tag 10 bis Tag 14 Sphäroid Medium durch Mischen neurobasalen Medium mit 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 3 M CHIR99021 und 10 ng/mL FGF2 für ein Gesamtvolumen von 100 ml.
    6. Bereiten Sie den Tag 14 bis Tag 28 Medium für Sphäroid langfristige Wartung durch Hinzufügen von 0,5 M frische RA auf den Tag 10 bis Tag 14 Sphäroid Medium für jede Fütterung.
      HINWEIS: RA immer bei -80 °C halten.
    7. Bereiten Sie das SymN-Reifungsmedium vor, indem Sie neurobasales Medium mit 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 25 ng/mL GDNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 mM Ascorbinsäure und 0,2 mM dbcAMP bei einem Gesamtvolumen von 100 ml mischen. Die Lösung sollte innerhalb von 2 Wochen verwendet werden. Vor jeder Fütterung 0,125 m frische RA hinzufügen. Diese Lösung wird ab Tag 14 (Option 1) oder Tag 28 (Option 2) verwendet.
    8. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, indem Sie DMEM mit 2% FBS, 2 mM L-Glutamat und Antibiotika bei Bedarf für ein Gesamtvolumen von 100 ml mischen.
  3. hPSC Wartung
    1. Auftauen und Halten von hPSCs
      1. Bereiten Sie eine VTN beschichtete 100 mm Schale vor.
      2. Um eine Durchstechflasche mit hPSCs direkt aus flüssigem Stickstoff aufzutauen, legen Sie die Durchstechflasche in ein 37 °C-Wasserbad und schwingen Sie das Rohr vorsichtig im Wasser, bis es auftaut. Übertragen Sie die aufgetauten hPSCs in ein 15 ml-Rohr mit 10 ml 1x PBS und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
      3. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie 1 ml E8 Medium in das Rohr. Pipetten Sie ein paar Mal, um das Pellet vollständig wieder aufzuhängen und dann fügen Sie weitere 9 ml E8 Medium, um 10 ml insgesamt zu erreichen.
      4. Aspirieren Sie die VTN-Lösung aus der 100 mm Schale.
      5. Übertragen Sie die hPSCs auf eine 100-mm-Schale, schütteln Sie sanft (nach oben und links rechts, nicht im Kreis), um sicherzustellen, dass die Zellen gleichmäßig in der Schale verteilt sind
      6. Inkubieren bei 37 °C, in 5%CO2.
      7. Am folgenden Tag alle Medien aspirieren und mit 10 ml E8 füttern.
      8. Füttern Sie diesen Weg jeden Tag für die nächsten 3 bis 4 Tage und bereiten Sie sich dann auf die Trennung vor.
    2. Aufteilen von hPSCs
      HINWEIS: hPSCs am Punkt der Spaltung sollten 80% –90% konfluent sein. Große Kolonien mit glatten und hellen Rändern sollten beobachtet werden. Der Kontakt zwischen den einzelnen Kolonien sollte jedoch vermieden werden(Abbildung 2B, Tag 0 und Abbildung 6B).
      1. Bereiten Sie VTN-beschichtete 100-mm-Gerichte nach Bedarf zu.
      2. Aspirieren Sie den E8 und waschen Sie die Schale, die 1x mit 1x PBS geteilt werden muss.
      3. Aspirieren Sie die 1x PBS und fügen Sie 4 ml von 0,25 M EDTA hinzu. 2 min bei 37 °C, 5%CO2inkubieren.
        HINWEIS: Die hPSCs sollten als kleine Kolonien geteilt/neu plattiert werden. Behandeln Sie mit EDTA nicht länger als 2 min, um eine Trennung in einzelne Zellen zu verhindern. Die Zellen sollten nach der 2-min-Behandlung noch an der Telleroberfläche befestigt werden.
      4. Aspirieren Sie die EDTA, lösen Sie die Kolonien, indem Sie 10 ml E8-Medium stark auf die Telleroberfläche pfeifen, und sammeln Sie alle Mittel und Zellen in einem 15 ml Rohr.
      5. Mit hPSCs bei 80%–90% Konfluenz, teilen Kolonien um 1:15-1:20. Um z. B. hPSCs um 1:20 in eine 100-mm-Schale aufzuteilen, nehmen Sie 500 L E8/hPSCs Lösung und mischen Sie mit 9,5 ml frischem E8-Medium.
      6. Platte hPSCs in VTN-beschichteten 100 mm Geschirr.
        HINWEIS: Es wird empfohlen, das ideale Split-Verhältnis für jeden Forscher und jede Zelllinie unabhängig zu bestimmen.
    3. Einfrieren von hPSCs
      1. Für eine 100-mm-Schale von hPSCs, die zum Split enden bereit ist, bereiten Sie drei Kryovials und 3,5 ml Gefriermedium vor.
        HINWEIS: Medien und Fläschchen sollten bis zur Verwendung in 4 °C oder auf Eis gehalten werden.
      2. E8 aspirieren und 2x mit 1x PBS waschen.
      3. Aspirieren 1x PBS und fügen Sie 4 ml 0,25 M EDTA, inkubieren für 2 min bei 37 °C, in 5%CO2.
        HINWEIS: hPSCs sollten als kleine Kolonien eingefroren werden, wenn sie geteilt würden. Behandeln Sie die Zellen mit EDTA nicht länger als 2 min, um eine Trennung in einzelne Zellen zu verhindern. Die Zellen sollten nach der 2-min-Behandlung noch auf der Telleroberfläche befestigt werden.
      4. Aspirieren Sie die EDTA, lösen Sie die Kolonien, indem Sie 10 ml 1x PBS stark auf die Oberfläche der Schale pfeifen, und sammeln Sie alle Mittel und Zellen in einem 50 ml Rohr.
      5. Fügen Sie 20 ml 1x PBS und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min, um die verbleibende EDTA auszuwaschen.
      6. Den Überstand entsorgen und das Pellet in 3 ml Gefriermedium wieder aufhängen.
      7. Verteilen Sie hPSCs gleichmäßig in die drei Kryovials, jeweils 1 ml.
      8. Bei -80 °C über Nacht in einer kontrollierten Gefrierbox oder einem Styropor-Sandwich aufbewahren, um einen langsamen Temperaturabfall zu gewährleisten, und dann zur Langzeitlagerung in einen Flüssigstickstofftank geben.

2. Seeding hPSCs, um die Differenzierung zu starten (Tag 0)

HINWEIS: hPSCs sollten nach der Stabilisierung (d. h. 2–3x nach dem Auftauen) zur Differenzierung bereit sein. Achten Sie darauf, dass die Kolonien gesund sind, mit glatten, glänzenden Kanten und minimaler Differenzierung (Abbildung 2B).

  1. Bereiten Sie Kellermembran Matrix-beschichtete Gerichte (24 gut oder 6 brunnen Gerichte) einen Tag vor Tag 0 nach Bedarf. Bringen Sie die Gerichte zu Beginn der Differenzierung zu RT.
  2. Machen Sie den Tag 0-1 Differenzierung Mittel wie nötig.
  3. Aspirieren Sie den E8 aus dem Konfluent, bereit, hPCSs zu teilen, und waschen Sie die Schale 2x mit 1x PBS.
  4. 7 ml 0,25 M EDTA pro 100 mm Schale hinzufügen, bei 37 °C, 5%CO2für 15 min brüten.
    HINWEIS: An diesem Punkt wird die EDTA-Behandlung verlängert, um sich in einzelne Zellen zu dispergieren.
  5. Pipetten Sie alle hPSCs (sie sollten schwebend sein) und übertragen Sie auf ein 50 ml Rohr. Fügen Sie die gleiche Menge oder mehr von 1x PBS wie EDTA-Lösung hinzu, um die EDTA zu verwässern.
  6. Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
  7. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 1 ml des Tages 0:1 Differenzierungsmedium und Pipetten hinzu, um die Zellen zu homogenisieren. Folgen Sie durch Hinzufügen von mehr Medium und dann mischen, um die Zelllösung zu einer Konzentration ideal zu verdünnen, um die Zellen zu zählen.
    HINWEIS: Verdünnen Sie die Zelllösung nicht. Zellen aus einer vollen 100 mm Schale sollten in 5 ml Medium verdünnt werden, um zu beginnen.
  8. Zählen Sie die Zellennummer mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer.
  9. Verdünnen Sie die Zelllösung nach Bedarf, um 125.000Zellen/cm2 in einem geringen Endvolumen zu erreichen (z. B. 2 ml pro Brunnen für eine 6-Well-Schale oder 500 l pro Brunnen für eine 24-Well-Schale).
    HINWEIS: Ein niedriges Volumen hilft den Zellen, sich schneller zu verbinden.
  10. Die gesamte Kellermembranmatrixlösung aus den beschichteten Schalen aspirieren und die Zelllösung in die Brunnen verdecken.
  11. Inkubieren bei 37 °C, in 5%CO2.

3. Neurale Kammzellinduktion (Tag 1 bis Tag 10, Abbildung 2A)

  1. Füttern Sie die Zellen am ersten Tag mit dem Tag 0-1 Differenzierungsmedium (3 ml pro Brunnen für 6 Brunnengerichte und 1 ml pro Brunnen für 24 Brunnengerichte).
  2. Füttern Sie die Zellen am 2. Tag mit dem Tag 2-Tag 10 Differenzierungsmedium (3 ml pro Brunnen für 6 Brunnengerichte und 1 ml pro Brunnen für 24 Brunnengerichte).
  3. Von nun an sollten die Zellen jeden zweiten Tag bis zum 10. Tag gefüttert werden (d.h. der nächste Fütterungstag ist Tag 4).
    ANMERKUNG: Ab Tag 6 sollten NC-Rippen erkannt werden (Abbildung 2B). Um zu überprüfen, ob eine Differenzierung stattfindet, wird empfohlen, eine parallele Differenzierungskultur in kleineren Brunnen (d.h. 24 Brunnen) zu tragen, die für SOX10/AP2a gebeizt und zur Markergenexpression während der Differenzierungszeit verwendet werden können (Abbildung 2B,C).
  4. Wenn Sie Zellen sortieren, fahren Sie mit Abschnitt 4 fort. Fahren Sie andernfalls mit Abschnitt 5 fort.

4. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) für neuralen Kammmarker CD49D und Aggregieren von NC-Zellen in Sphäroiden

HINWEIS: Bei der FACS-Sortierung sollten die Proben auf Eis gehalten werden und nach der Färbung bis zur Sortierung nicht dem Licht ausgesetzt werden.

  1. Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, wenn die Zellen sortiert sind.
  2. Bereiten Sie Tag 10-14 Sphäroid Medium.
  3. Am 10. Tag das Medium entfernen und 1x mit 1x PBS waschen.
  4. Fügen Sie Dissoziationslösung (siehe Materialtabelle) bei 2 ml pro Brunnen für eine 6 Brunnenschale oder 1 ml pro Brunnen für eine 24-Well-Schale hinzu und bei 37 °C, 5%CO2 für 20 min inkubieren.
  5. Pipetten Sie alle hPSCs ab und übertragen Sie sie in ein 50 ml Rohr.
  6. Füllen Sie den Rest des Rohres mit FACS-Puffer und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
    HINWEIS: Jedes 50 ml Rohr kann bis zu 20 ml oder weniger Zelllösung aufnehmen. Das Volumen des FACS-Puffers sollte hoch genug sein, um die Dissoziationslösung zu neutralisieren.
  7. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen mit der entsprechenden Menge an FACS-Puffer (ca. 2 ml pro Bohrkörper einer 6-Well-Platte) wieder aus und zählen Sie, um die Zellzahl zu bestimmen.
  8. Bereiten Sie die folgenden Beispiele vor.
    1. Probe 1 (unbefleckte Kontrolle): 1 x 106 Zellen in 400 l FACS-Puffer. Filtern Sie die Zellen durch eine 20-m-Siebkappe und halten Sie die Röhre auf Eis.
    2. Probe 2 (nur DAPI-Steuerung): 1 x 106 Zellen in 400 l FACS-Puffer mit 0,5 ug/ml DAPI. Filtern Sie die Zellen durch ein FACS-Rohr mit einer Siebkappe und halten Sie die Röhre auf Eis.
    3. Probe 3 (CD49d-markiert): Den Rest der Zellen mit FACS-Puffer, der PE/Cy7-konjugierte CD49D-Antikörper enthält (5 x 106 Zellen pro 100 l FACS-Puffer) in einem 15 ml-Rohr aussetzen und 20 min auf Eis brüten.
  9. Füllen Sie die Rohre mit FACS-Puffer und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
  10. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie alle 5–10 x 106 Zellen in 1 ml FACS-Puffer mit 0,5 ug/ml DAPI gemäß den Anweisungen des Herstellers wieder ab.
  11. Filtern Sie die Zellen mit der Siebkappe durch das FACS-Rohr und halten Sie die Röhre auf Eis.
  12. Bereiten Sie Sammlung FACS Rohre mit 2 ml FACS Puffer.
  13. Sortieren Sie die FACS-Maschine mit Lasern, die DAPI und PE-Cy7 erkennen können, um die CD49D+ Population zu isolieren.
  14. Zählen Sie nach dem Sortieren die sortierten Zellen.
  15. Zentrifugieren Sie alle sortierten Zellen und setzen Sie sich in Tag 10-14 Sphäroidmedium auf eine Endkonzentration von 0,5 x 106 Zellen pro 500 l Medium aus.
  16. Platte 0,5 x 106 Zellen pro Brunnen in ultra-niedrige Befestigung 24 Wellplatten.
  17. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, in 5%CO2.

5. Aggregieren von NC-Zellen in Sphäroiden

  1. Wenn Sie FACS nicht verwenden, um die NC-Zellen zu isolieren und sie stattdessen direkt in Sphäroide zu aggregieren, bereiten Sie zunächst Zellen vor, wie in den Schritten 4.2–4.5 beschrieben.
  2. Füllen Sie den Rest des Rohres mit 1x PBS und Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
  3. Entsorgen Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen mit einer entsprechenden Menge an Tag 10-14 Sphäroidmedium (z. B. 2 ml Medium pro Brunnen für eine 6-Well-Platte) und zählen Sie, um die Zellzahl zu bestimmen.
  4. Verdünnen Sie die Zellen in Tag 10–14 Sphäroid Medium auf 0,5 x 106 Zellen pro 500 l Medium.
  5. Platte 500 l der Zellsuspension pro Brunnen in ultraniedriger Befestigung 24 Wellplatten.
  6. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C, in 5%CO2.

6. NC-Sphäroid-Wartung und sympathische Vorläuferinduktion (Tag 10 bis Tag 14, Abbildung 4A)

  1. Option 1: Minimale Sphäroidkultur
    1. Fügen Sie am 11. Tag 500 L des Sphäroidmediums 10–14 zu den NC-Sphäroiden hinzu, ohne das vorhandene Medium ab dem 10. Tag zu ansischen. Inkubieren bei 37 °C, in 5%CO2.
    2. Neigen Sie am 12. Tag die Platte, um die NC-Sphäroide auf einer Seite der Brunnen anzusammeln. Sorgfältig aspirieren und entsorgen Sie so viel Medium wie möglich, und füttern Sie mit 1 ml Tag 10-14 Sphäroid Medium.
    3. Füttern Sie die Zellen täglich bis zum 14. Tag.
    4. Optional: Wenn die Sphäroide aggregieren und einen großen Klumpen erzeugen, verwenden Sie eine Pipette, um die Sphäroidklumpen aufzubrechen. Dadurch wird auch sichergestellt, dass einzelne Sphäroide nicht zu groß werden.
      HINWEIS: Der ideale Sphäroid-Größenbereich sollte etwa 100–500 m betragen. Innerhalb dieses Bereichs ist die Größe der einzelnen Sphäroide nicht entscheidend. Die Morphologie, z. B. glatte und klare Kanten (Abbildung 3 und Abbildung 6), ist jedoch wichtig für den weiteren Erfolg. An Tag 14 enthält jede 24-Well-Platte idealerweise etwa 50–60 Sphäroide unterschiedlicher Größe innerhalb des oben genannten Größenbereichs.
  2. Option 2: Erweiterte Sphäroidkultur
    1. Am 15. Tag, um NC-Sphäroide zu halten, füttern Sie mit 1,5 ml Tag 10–14 Sphäroid Medium mit 0,5 M RA. Inkubieren bei 37 °C, 5%CO2.
      HINWEIS: RA sollte für jede Fütterung frisch zugegeben und immer bei -80 °C gelagert werden.
    2. Von nun an jeden zweiten Tag bis zum 28. Tag füttern und dann mit der Beschichtung der Sphäroide fortfahren (Abschnitt 7.1).
      HINWEIS: Die wachsenden Sphäroide werden etwa 1x pro Woche geteilt, indem sie mit einer 1 ml Pipette pipetiert werden, um sie aufzubrechen. Sie werden mit einem ungefähren Verhältnis von 1:2-1:4 aufgeteilt. Innerhalb der zweiwöchigen Expansionsphase sollten sich die Zellen in etwa vervierfachen.

7. SymN-Differenzierung und -Reifung (Option 1: nach Tag 14; Option 2: nach Tag 28)

  1. Plating Sphäroide in regulären Gerichten
    1. Bereiten Sie PO/LM/FM-beschichtete 24 Wellplatten vor.
    2. Bereiten Sie symN-Medium mit 0,125 M RA (frisches Futter hinzufügen) und 10 M Y27632 (nur Tag 14) vor.
    3. Neigen Sie die Platte am 14. Tag, um NC-Sphäroide auf einer Seite der Brunnen anzusammeln. Sorgfältig aspirieren und entsorgen Sie so viel Medium wie möglich, und füttern Sie mit 1 ml symN Medium.
    4. Entfernen Sie LM/FN von den beschichteten Platten.
    5. Jeweils gut aus der 24 Brunnenplatte in 4 separate Brunnen der neuen, beschichteten 24-Well-Platte aufteilen und verschichten. Jeder Originalbrunnen hat 1 ml, der 50 bis 60 Sphäroide enthält. Daraus ergeben sich 250 L, die ca. 10–15 Sphäroide für jeden Brunnen auf der neuen Platte enthalten.
    6. Fügen Sie 250 l zusätzliches Medium pro Brunnen hinzu.
      HINWEIS: Dies ist eine Aufteilung von 1:4; Stellen Sie sicher, dass die Sphäroide innerhalb der Lösung richtig verteilt sind, sodass die Teilung relativ gleichmäßig ist. Die Anzahl der Sphäroide wird nicht gezählt, da die endgültige Zahl den Erfolg der Generierung von SymNs nicht beeinflusst.
    7. Inkubieren bei 37 °C, 5%CO2.
    8. Am 15. Tag (oder Tag 29 für Option 2) wird das gesamte Medium durch 1 ml SymN-Medium ersetzt, das 0,125 M RA enthält. Von nun an sollten die Neuronen alle 2 Tage bis zum Tag 20 (oder Tag 35 für Option 2) gefüttert werden.
    9. Nach Tag 20 (oder Tag 35 für Option 2) sollten die Neuronen gefüttert werden, indem nur die Hälfte des vorhandenen Mediums (500 l) sorgfältig ersetzt wird. Von nun an jede Woche füttern, es sei denn, das Medium wird schnell gelb.
    10. Füttern Sie wöchentlich bis zum gewünschten Zeitpunkt.
      HINWEIS: SymNs neigen dazu, sich in ganglia-ähnlichen Strukturen zu aggregieren und neigen dazu, sich von den Kulturgerichten zu lösen. Um dies zu verhindern, wird eine Halbfütterung und minimale Handhabung empfohlen.
  2. Beschichtungszellen für elektrophysiologische Aufzeichnung
    1. Bereiten Po/LM/FM-beschichtete 96 Brunnenelektrophysiologieplatten vor.
    2. Bereiten Sie symN-Medium mit 0,125 M RA (frisches Futter hinzufügen) und 10 M Y27632 (nur Tag 14) vor.
    3. Sammeln Sie am 14. Tag alle Sphäroide, zentrieren Sie sie dann bei 200 x g für 4 min.
    4. Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie 2 ml Dissoziationslösung hinzu und übertragen Sie das Gemisch zurück in einen der Brunnen der ultra-niedrigen Befestigungsplatte. Bei 37 °C inkubieren, in 5% CO2 für 20–45 min.
      HINWEIS: Abhängig von der Größe der Sphäroide kann die Dissoziationsdauer länger als 20 min sein. Überprüfen Sie die Trennung der Zelle alle 10 min bis zu 45 min. Optional können 0,1 mg/ml DNase mit Dissoziationslösung hinzugefügt werden, um freie DNA von abgestorbenen Zellen zu verhindern, die die Lösung klebrig machen. Dies ist in diesem Protokoll optional, da die Sphäroide nicht aggregiert werden, sobald sie vollständig getrennt sind.
    5. Pipette, um die Sphäroide vollständig zu dissoziieren, dann Zentrifuge bei 200 x g für 4 min.
    6. Entsorgen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen mit der entsprechenden Menge an symN-Medium wieder aus, und zählen Sie die Zellenzahl.
    7. Die Zellen mit 100.000/cm2 in PO/LM/FN-beschichteten Elektrophysiologiebrunnen in 200 l Gesamtvolumen pro Brunnen verschichten.
    8. Folgen Sie am 15. Tag (oder Tag 29 für Option 2) den gleichen Fütterungsprozessen wie in Abschnitt 7.1. Das Gesamtvolumen nach Tag 15 (oder Tag 29 für Option 2) sollte 300 l pro Brunnen betragen.
    9. Messen Sie die elektrischen Signale mit einer Multielektroden-Array-Maschine nach Tag 20 (oder Tag 35 für Option 2).
      HINWEIS: In Option 2 können Sphäroide jederzeit zwischen dem 14. Tag 28 plattiert werden. Die ersten elektrischen Signalmessungen können 1 Woche nach der Beschichtung der Sphäroide durchgeführt werden.

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Representative Results

In diesem Protokoll geben wir Anweisungen, wie man SymNs von hPSCs generiert. Die hier gezeigten Kulturbedingungen wurden von einem früheren veröffentlichten Protokoll23,24 (Abbildung 1A) zu feederfreien und chemisch definierten Bedingungen ( Abbildung1B) verbessert. Es werden zwei Optionen angeboten, eine, bei der SymNs innerhalb von 20 Tagen hergestellt werden, und eine andere, in der die NCCs für 2 Wochen erweitert werden können, um mehr Zellen zu generieren, die dann in SymNs unterschieden werden können(Abbildung 1B, Option 1 und 2).

Um die SymN-Eigenschaften differenzierter Zellen, der PHOX2B-eGFP WA09-Reporterlinie und der übergeordneten WA09 PSCs-Zeile19,richtig zu überwachen Alle Differenzierungen wurden in mindestens drei biologischen Wiederholungen durchgeführt, definiert als unabhängige Differenzierungsexperimente nach mindestens einem Durchgang und/oder abgeleitet von einer frisch aufgetauten Durchstechflasche von Zellen. Die Differenzierung wurde induziert, wenn die Konfluenz undifferenzierter hPSCs 80%–90% erreichte. Die hPSC Kolonien waren rund, mit glänzenden, glatten Kanten und wenig bis gar keiner Differenzierung. Die Kolonien sollten sich nicht berühren(Abbildung 2B, Tag 0). Anstelle der typischen doppelten SMAD-Hemmung25, die zuvor für die Neurectoderm-Induktion verwendet wurde, führte die TGF-A-Hemmung in Kombination mit WNT- und BMP4-Signalisierung in den ersten 2 Tagen zu einer robusten Expression des frühen neuralen Kammmarkers AP2a. Der neurale Kammmarker SOX10 wurde von Tag 4 bis Tag 10(Abbildung 2B)exprimiert. NCCs entstanden in dichten, abgedunkelten Graten, die ab Dem 6. Tag sichtbar sind. Diese Grate exprimiert SOX10 (Abbildung 2B, Pfeile). Zuvor wurde gezeigt, dass SOX10 im NCC-Stadium mit dem Zelloberflächenmarker CD49D23,26 korreliert und somit CD49D verwendet werden kann, um NC-Zellen zu sortieren, die kein Fluorophor aus dem SOX10-Lokus melden. Abbildung 2C zeigt die Expression von NCC-Markergenen im Laufe der Zeit. Abbildung 2D zeigt, dass unsere Differenzierungseffizienz über 80 % lag. Zur Bestimmung der Identität der verbleibenden Zellen wurde qRT-PCR verwendet, um auf kontaminierende Zelltypen zu testen, einschließlich BryT-exezierendes Mesoderm, SOX17-extierendes Endoderm und PAX6-exezierendes Neuroektoderm; es wurde festgestellt, dass alle wertefern oder auf sehr niedrigen Werten ausgedrückt wurden (Daten nicht dargestellt; siehe Ergänzende Tabelle 1 für alle Primer). Es wurde jedoch ein TEIL des SIX1/EYA1+ Placodes (Daten nicht angezeigt), die die Quelle der verbleibenden Zelltypen sein können. Darüber hinaus ist es möglich, dass die verbleibenden Zelltypen NCC-Derivate sind, die bereits weiter differenziert sind. Der HOX-Code der NKP wurde in dieser Phase bewertet (Abbildung 2E). In diesem frühen Stadium waren die HOX-Signale jedoch sehr niedrig (beachten Sie die Skala), was darauf hindeutet, dass diese NCCs entweder einen Kranial-NC-Charakter hatten oder noch keinen NCC-Subtyp-Charakter angenommen hatten.

Am 10. Tag konnten die NCCs mit FACS gereinigt werden, was zu rund 80 % CD49D+ NCCs führte (Abbildung 2D). Ein Beispiel für eine typische Gating-Strategie ist in Abbildung 2Dangegeben. Nach der Sortierung wurden die Zellen als NC-Sphäroide aggregiert (Abbildung 3A). Um die NCCs zu erweitern und trunk-NC-ähnliche Eigenschaften zu induzieren, wurden Zellen mit einer Kombination aus FGF2 und CHIR behandelt. Wir haben getestet, ob die Sortierung für die CD49D+ Population später bessere oder reinere SymNs-Kulturen ergeben hat. Abbildung 3B vergleicht unsortiert mit CD49D+ sortiert im Vergleich zu CD49D- sortierte Zellpopulationen. Auf der linken Seite kann man sehen, dass die positiv sortierten und die unsortierten Populationen NC-Sphäroide in ähnlicher Weise hergestellt haben, während die negativ sortierten Zellen sich nicht richtig aggregierten, keine runden, glatten, gesund aussehenden Sphäroide machten und innerhalb von 3–4 Tagen starben. Darüber hinaus konnten beim Vergleich der NC-Sphäroide am 14. Tag über qRT-PCR für NC- und SymN-Vorläufermarker keine signifikanten Unterschiede zwischen sortierten und unsortierten Zellen festgestellt werden. Bemerkenswerterweise war zu diesem Zeitpunkt die Expression von sympathischen Vorläufermarkern noch niedrig und die SOX10-Spiegel blieben hoch, was darauf hindeutet, dass die Sphäroide noch aus Zellen mit NC-Eigenschaften bestehen. Einen Tag nach der Beschichtung (Tag 15) konnten sowohl unsortierte als auch CD49D+ Sphäroide, die gut an PO/LM/FN-Gerichten befestigt sind, und das Neuritenwachstum deutlich beobachtet werden(Abbildung 3B, D15 und Abbildung 3C, D29). Die unsortierten und sortierten Kulturen wurden parallel zu Tag 35 weitergeführt, aber es wurden keine größeren Unterschiede beobachtet (Daten wurden nicht angezeigt). Daraus lässt sich schließen, dass der Sortierschritt für die Generierung von SymNs nicht wesentlich war und daher ein optionaler Schritt in diesem Protokoll ist. Für weniger effiziente Differenzierungen, die nicht 80% CD49D+ Zellen ergeben, empfehlen wir jedoch das Sortierverfahren.

Als nächstes haben wir getestet, ob diese NC-Sphäroide beibehalten werden können, ohne ihre NC-Identität zu verlieren (Abbildung 3A, Option 2). Die NCCs wurden bis zu 2 Wochen lang als Sphäroide kultiviert (Abbildung 3C). Die Morphologie von Tag 28 Sphäroiden und plattierten Zellen an Tag 29 war ähnlich im Vergleich zu Tag 14 und 15 Zellen in Option 1. Am 28. Tag wurde der SOX10-Ausdruck auf einem ähnlichen Niveau wie Tag 14 beibehalten. Die Expression früher sympathischer Vorläufermarker (d. h. ASCL1, PHOX2B und GATA3) nahm jedoch zu (Abbildung 3C, rechts), was darauf hindeutet, dass die erweiterte Kultur in FGF2, WNT und RA-Signalisierung zu Reifung und Nachbildung führte (Abbildung 4C und F). Ähnliche Effekte wurden zuvor von Kirino et al21berichtet.

Nach NC-Erweiterung (Option 1 oder Option 2) wurden Sphäride auf PO/LM/FN-beschichteten Schalen plattiert und mit mehreren neuronalen Faktoren geliefert, um die SymNs zu reifen (Abbildung 4A). An Tag 20 und 35 (1 Woche nach der Beschichtung in Option 1 bzw. 2) wurden Neuriten in einem radialen Muster beobachtet, das sich von den angebrachten Sphäroiden aus erstreckt(Abbildung 4A, rechts). Darüber hinaus wurden Marker im Zusammenhang mit der Noradrenalinsynthese (NE) und dem Transport (d. h. TH, AAAD, DBH) ausgedrückt (Abbildung 4B). Das Vorhandensein kontaminierender Zelltypen wurde hier erneut untersucht, und es wurde eine Expression von ChAT gefunden, die auf parasympathische Neuronen hinweisen kann (Abbildung 4B,E). ChAT kommt jedoch auch in cholinergen SymNs zum Ausdruck. Es wurden sehr niedrige VIP-Werte, ein weiterer parasympathischer Marker, entdeckt (Daten werden nicht angezeigt). Darüber hinaus wurden niedrige Konzentrationen von BRN3A, ISL1 und RUNX1 (Abbildung 4B,E), die entweder sensorische Neuronen oder trigeminale Neuronen, d. h. Derivate von Placode, anzeigen könnten. Es wurden minimale EDNRB(Marking enteric neurons) und OLIG2 (marking motorneurons) detektiert (Daten nicht dargestellt). Die Identität der nicht-neuronalen Zellen bleibt unklar. Jedoch, basierend auf den Ergebnissen aus unserem vorherigen symN-Protokoll23, waren sie höchstwahrscheinlich SMA+ Myofibroblasten. Die Expression von HOX-Genen wurde erneut untersucht, und es wurde festgestellt, dass HOX5–9 exprimiert wurde, was auf eine Stammidentität hindeutet. HOX10 (Indikator für Sakrale-NC) wurde nicht ausgedrückt (Abbildung 4C, F). Schließlich wurden reife Marker, einschließlich Nikotin-Acetylcholin-Rezeptor (CHRNA3/4) und NE-bezogene Rezeptoren, einschließlich adrenergen Rezeptoren (ADRA2A/B2), NE-Transporter (NET, SCL6A2) und Vesikeltransporter (VMAT1) ausgedrückt (Abbildung 4D,G). Bei der Expression dieser Gene in Zellen, die mit Option 2 abgeleitet wurden, wurde kein signifikanter Unterschied im Vergleich zu Option 1 (Abbildung 4E-G) festgestellt.

Wir haben unsere Ergebnisse durch die Durchführung dieses Protokolls auf der H9-PHOX2B:GFP Reporterzeile (Abbildung 5) weiter bestätigt. Am 20. Tag bildeten die Zellen einen dichten Rasen aus Neuronen und aggregierten in Clustern mit noch höherer Dichte, was auf eine sehr hohe Differenzierungseffizienz hindeutet(Abbildung 5A, obere Reihe). Die Färbung zeigte, dass die meisten SymNs in diesen Clustern verklumpen, was die Bewertung und Quantifizierung der Gesamtdifferenzierungseffizienz erschwerte. Um die Färbung und Kolokalisierung bestimmter SymN-Marker hervorzuheben, konzentrierten wir uns auf die weniger dichten Gebiete am Rande der Cluster (siehe gelbe Box in Abbildung 5A, rechts). Dies war auch, wo die meisten kontaminierenden Zellen lokalisiert wurden, so war es kein guter Bereich, um die Gesamteffizienz zu beurteilen. Nichtsdestotrotz, typische SymN-Marker; einschließlich Peripherin (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronal), DBH und NET1 (ausgedrückt in Punkten entlang symN-Körpern und Axonen, Abbildung 5A,unten); erkannt wurden. Ein Multielektroden-Array-Ansatz (MEA) wurde verwendet, um die elektrische Aktivität zu messen, und es wurde festgestellt, dass Tag 20 SymNs mit etwa 3–5 Spitzen pro Sekunde im Vergleich zur negativen Kontrolle von undifferenzierten hPSCs abgefeuert wurden (Abbildung 5B). Es ist wichtig, dass die Zellen gleichmäßig im Brunnen verteilt werden, damit jede Elektrode (schwarze Punkte in Abbildung 5B,helles Feld) richtig aufzeichnet. Tag 20 bis Tag 30 SymNs wurden auch mit 1 'M Nikotin stimuliert, das die präganglionische Signalisierung von SymNs in vivo imitiert und die mittlere Abschussrate in den Zellen erhöht. Die Hemmung der Neuronen wurde ebenfalls gemessen. Der adrenerge Rezeptor (ADRB2), der sich auf symN-Axon-Terminals befindet, erzeugt eine positive Rückkopplungsschleife für NE-Sekretion29. Die Behandlung der SymNs mit 1 M Propranolol (ein adrenergen Rezeptor-Antagonist) hemmte ihre Aktivität(Abbildung 5C, rechts). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch dieses Protokoll generierten SymNs funktional aktiv waren.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung und Vergleich von SymN-Differenzierungsprotokollen. (A) Vorheriges Protokoll von Zeltner et al.23. (B) Optimiertes Protokoll. Option 1 ist 20 Tage lang und enthält nur 4 Tage NC-Sphäroidkultur. Option 2 ist 35 Tage lang und enthält eine 2-wöchige NC-Sphäroid-Erweiterungsstufe, die die Produktion von mehr NC-Zellen ermöglicht. VTN = vitronectin, PO = Poly-L-Ornithin, LM = Laminin, FN = Fibronectin, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = Retinsäure, AA = Ascorbinsäure, NFs = NGF+BDNF+GDNF. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: NC-Induktion. (A) Zeitleiste und Behandlungen für NC-Induktion vom Tag 0 bis zum 10. Tag. (B) Die Morphologie und Bildung von NC-Rippen wurden alle 2 Tage durch Hellfeldmikroskopie überwacht. Zellen wurden zu jedem Zeitpunkt nach Tag 2 für AP2A (rot) und SOX10 (grün) mitgefärbt. Alle Immunfluoreszenzbilder wurden mit DAPI konterkariert. Rote Pfeile zeigen die Strukturen von Graten an. (C) qRT-PCR-Analyse für das Expressionsprofil von NC-Markern vom 2. bis 10. Tag. (D) Repräsentatives Diagramm der FACS-Sortierung am 10. Tag für CD49D+ NC-Populationen (links). Eine typische Gating-Strategie und Isotypkontrolle ist in den ersten vier Diagrammen angegeben. Quantifizierung des CD49D+ Zellprozentsatzes am 10. Tag wurde ebenfalls durchgeführt. (E) qRT-PCR-Analyse für das Expressionsprofil von HOX-Genen vom 2. bis 10. Tag. NC = neuraler Kamm. Fehlerbalken stammen aus Daten von n bis 3 biologischen Wiederholungen, definiert als unabhängige Differenzierungsexperimente, die an getrennten Tagen von PSC-Kulturen durchgeführt werden, die mindestens eins voneinander getrennt waren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Wartung und Erweiterung des Neuralkamms. (A) Zeitleiste und Behandlungen für nc-Erweiterung während Tag 10 bis Tag 14 Kultur für Option 1 oder Tag 10 bis Tag 28 Kultur für Option 2. (B) Die NC-Sphäroidbildung wurde von Tag 11 (1 Tag nach sphäroider Bildung) bis zum Tag 14 (d. h. dem Tag der Beschichtung) durch Hellfeldmikroskopie überwacht. Unsortiert, CD49D+und CD49D- Populationen wurden verglichen. Die plattierten Zellen an Tag 15 werden ebenfalls angezeigt. Zellen konnten in der CD49D-Gruppe- keine Sphäroide richtig bilden und starben nach der Beschichtung. Tag 14-Zellen wurden durch qRT-PCR-Analyse (rechts) auf das Expressionsprofil von SymN-Vorläufern untersucht. Unsortiert und CD49D+ Populationen wurden verglichen (n 3). (C) NC-Sphäroide können bis zu 2 Wochen lang gewartet werden. Sphäroide wurden von Tag 15 bis Tag 28 (dem Tag der Landung) durch Hellfeldmikroskopie überwacht. Die plattierten Zellen an Tag 29 werden ebenfalls angezeigt. Tag 28 Sphäroide wurden durch qRT-PCR-Analyse auf das Expressionsprofil von SymN-Vorläufern (rechts) untersucht. Unsortiert und CD49D+ Populationen wurden gepoolt (n 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: SymN-Differenzierung und -Reifung. (A) Zeitleiste und Behandlungen nach der Beschichtung am 14. Tag für Option 1 oder Tag 28 für Option 2. Helle Feldmikroskopie-Fotos (rechts) zeigen SymNs am Tag 20 bzw. Tag 35 (1 Woche nach der Beschichtung für beide Optionen). (B–D) Option 1 qRT-PCR-Analyse für das Ausdrucksprofil von SymN-Eigenschaften zwischen den Tagen 20 bis 30. Unsortiert und CD49D+ Populationen wurden gepoolt. (E–G) Option 2 qRT-PCR-Analyse für das Ausdrucksprofil von symN-Eigenschaften nach Tag 35. Unsortiert und CD49D+ Populationen wurden gepoolt (n 3). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Funktionale Charakterisierung von SymNs. (A, obere Reihe) Helles Feldbild von SymN-Clustern an Tag 20 und gebeiztes Bild, das PRPH- und TH-Doppel-Positivzellen zeigt, die sich meist in den Clustern befinden. (A, unten) Mehrere SymN-Marker (getrennte Kanäle) wurden durch Immunfluoreszenzfärbung am 20. Tag überprüft. Der Noradrenalintransporter (NET1) befand sich sowohl auf der Oberfläche der Zellkörper als auch entlang der Axone und Dendriten. Es zeigte sich als Punkte bei dieser Vergrößerung. Alle Immunfluoreszenzbilder wurden mit DAPI konterkariert. (B) Repräsentative Heatmaps der Multielektroden-Array-Analyse (MEA) für SymNs am 20. Tag (oben). Das helle Feldbild (unten) zeigt die Dichte der SymNs und die Verteilung von Elektroden (acht schwarze Punkte). Unsortiert und CD49D+ Populationen wurden hier gepoolt. (C) Quantifizierung der mittleren Feuerraten für Tag 20-30 SymNs bei Behandlungen von 1 m Nikotin bzw. 1 M Propranolol für 5 min (rechts). Die Ergebnisse unsortierter und CD49d-positiver Populationen wurden gebündelt (n 3). Ungepaarter, zweiarmigen t-Test mit Welch-Korrektur, p-Wert:*<0.05. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Beispiel für Zellen unter Bedingungen, die für die Differenzierung ungeeignet sind. (A) Zeitleiste der Differenzierung mit jedem Prüfpunkt für Zellmorphologien, die wie in B–Eangegeben sind. (B) hPSCs (a) mit gesunden Kolonien und vielen differenzierten Zellen und (b) zusammengeführten und differenzierten Grenzen zwischen einigen Kolonien an Tag 0. Rote Pfeile zeigen die zusammengeführten Bereiche an. (C) NCCs an Tag 10 mit blasenartigen Blasen in den Graten. Rote Pfeile zeigen die Blasen in der obersten Reihe an. Die untere Zeile stellt eine höhere Vergrößerung dar. Wir konnten die Zellidentität der Blasen nicht identifizieren. Das Vorhandensein von mehr Blasen scheint jedoch mit der niedrigeren SOX10/CD49D-Expression zu korrelieren. (D) Unregelmäßig aussehende Sphäroide ohne glatte Kanten und runde Form am 14. Tag. (E) Ungesunde und sterbende SymNs am 20. Tag. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Wir haben vor kurzem zwei Rezensionen veröffentlicht, eine, die die Verwendung von hPSC-abgeleiteten SymNs für die Krankheitsmodellierung31 sowie einen eingehenden Vergleich der verfügbaren Differenzierungsprotokolle22diskutiert. Daher konzentrieren wir uns hier auf die Fehlerbehebung des aktuellen Protokolls, um dem interessierten Forscher zu helfen, SymNs zu erstellen. Während des gesamten Differenzierungsprozesses sollte die Kontamination in allen Stadien sorgfältig kontrolliert werden, um konsistente Daten sowie gesunde differenzierte Zellen zu erhalten. Bei der routinemäßigen hPSC-Wartung sollten Mykoplasmentests zweiwöchentlich oder monatlich durchgeführt werden. Wenn die Zellsortierung am 10. Tag durchgeführt wird, wird die Zugabe von Antibiotika zu jedem Medium stark gefördert. Es ist auch wichtig, die Zellmorphologie vor und nach Beginn der Differenzierung zu überprüfen. Hier schlagen wir mehrere kritische Kontrollpunkte vor (Abbildung 6A). Erstens sollten ideale hPSC-Kolonien, die zur Differenzierung bereit sind, helle und glatte Kanten mit winzigen Spitzen haben. Kolonien mit zahnradähnlichen Spitzen haben begonnen zu differenzieren und sollten nicht verwendet werden. Es wird dringend empfohlen, zellen am perfekten Zeitpunkt sofort zu verwenden, da sich die Morphologie innerhalb von Stunden ändern kann. Das Aufschieben um nur einen Tag kann die Zellen abstürzen lassen (Abbildung 6B, a) oder zu einem Kontakt zwischen Kolonien führen ( Abbildung6B, b), was die Differenzierung in hPSCs stimuliert. Es ist eine Herausforderung, jede differenzierte Zelle in einer Kultur loszuwerden, aber die Bevölkerung sollte kontrolliert werden, um weniger als 5% der schlechten Kolonien zu enthalten. Wenn Sie diesem Protokoll folgen, ist der zweite Kontrollpunkt während der Differenzierung zwischen Tag 2 und Tag 10. In diesem Stadium sollten dunkle NC-Grate unter einem hellfeldmikroskopen(Abbildung 2C) deutlich beobachtet werden. Die Dicke und Verteilung der Grate kann als Indikatoren für die NC-Effizienz verwendet werden: Da NCCs hauptsächlich aus Zellen abgeleitet werden, die die Grate bilden, können dünne oder weniger verbreitete Grate und Blasen in den Graten auf eine niedrige NC-Produktion hinweisen und sollten daher bei inkonsistenten Ergebnissen markiert oder verworfen werden (Abbildung 6C). Eine RNA-Probenahme wird am 10. Tag dringend empfohlen, um die oben beschriebenen NC-Marker zu überprüfen. Der dritte Prüfpunkt befindet sich während der NC-Sphäroidphase, da Sphäroide aggregiert werden können. Es ist am besten, das Medium regelmäßig zu pipet, um die Aggregation aufzubrechen und wieder auszusetzen (Zellen werden nicht zu einzelnen Zellen, sondern nur zu kleinen Sphäroiden dispergiert). Wenn sich die Sphäroide zu schnell ausdehnen, teilen Sie sie durch 1:2 oder 1:4 auf, um genügend Platz und Nährstoffe für das Wachstum der Zellen zu lassen. Wenn Sphäroide keine glatten und runden Formen aufweisen(Abbildung 6D), kann dies darauf hindeuten, dass die NC-Effizienz an Tag 10 nicht hoch genug war, und somit die endgültige Differenzierung ruinieren. Das Testen von Expressionsprofilen zur Überprüfung der SymN-Vorläufereigenschaften wird am gewünschten Sphäroid-Beschichtungstag empfohlen. Der vierte Prüfpunkt ist nach dem Beschichten der Sphäroide. Neurite sollten deutlich sichtbar sein und Bündel sollten sich nach dem 20. Tag bilden. Zellen ohne weit verbreitete Neuriten und Bündel sollten als Kontamination betrachtet werden (Abbildung 6E). An diesem Punkt ist es wichtig, die Neuronen zu füttern, indem nur die Hälfte des vorhandenen Mediums ersetzt wird, um die nahrhafte Umgebung zu erhalten, die durch stabile Neuronen geschaffen wird. Seien Sie vorsichtig bei der Fütterung von Zellen, denn reifende SymNs sind anfällig und können sich leicht lösen. Der Grund für jede der schlecht aussehenden Morphologien, die hier beschrieben werden, ist noch nicht vollständig geklärt. Sie gibt jedoch Einen Einblick in die Sensibilität von hPSCs und in vitro Differenzierung. Eine Ursache für solche Unregelmäßigkeiten könnte reagenzien verschiedener Anbieter sein. Zum Beispiel zeigen sich die dünnen Grate mit Blasen, wenn sie eine andere Marke von BMP4 verwenden.

Für die elektrophysiologische Analyse mit MEA werden Sphäroide durch Accutase dissoziiert, um SymNs in den Elektrodenbrunnen gleichmäßig zu verteilen. Die Behandlungszeit sollte 20 min sein. Da Sphäroide jedoch stark verdichtet sind, kann die Zeit der Dissoziation auf 45 min erhöht werden, um sicherzustellen, dass die Sphäroide vollständig dissoziiert sind. Im Allgemeinen muss jede Versuchsgruppe auf einer MEA-Platte in Vielfachen von mindestens sechs betrieben werden, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Da unsere Dichte für das Replating deutlich niedriger ist als die Empfehlungen des Herstellers32 (ca. 500–700.000/cm2), sind die Brunnenwiederholungen entscheidend. In unseren Ergebnissen zeigen sich sowohl ein substanzieller SymN-Marker-Ausdruck als auch eine stabile Aktivität vom 20. bis zum 30. Tag. Wir empfehlen dies als den besten Zeitpunkt, um mit der Aufzeichnung der Variablen der Wahl zu beginnen. Für jede Differenzierung sollte das Medium frisch gemacht und so schnell wie möglich (nicht länger als einen Monat) verwendet werden.

Das hier vorgestellte symN-Differenzierungsprotokoll ist feederfrei, chemisch definiert, effizient, erweiterbar und liefert funktionelle SymNs bis zum 20. Tag. Dieses definierte SymN-Differenzierungsprotokoll könnte verwendet werden, um menschliche Störungen des sympathischen Nervensystems zu untersuchen, als Plattform für das Arzneimittelscreening, für Tumorgenese-Studien wie Neuroblastom/Pheochromozytom oder für die Grundlagenforschung in der panostatischen Regulation.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir danken Heidi Ulrichs für die kritische Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 159 menschliche pluripotente Stammzellen Neuralkamm sympathische Neuronen autonomes Nervensystem sympathisches Nervensystem feederfreie chemisch definierte Stammzellkultur
Effiziente Differenzierung postganglionischer Sympathika-Neuronen mit humanen pluripotenten Stammzellen unter feederfreien und chemisch definierten Kulturbedingungen
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Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

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