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Developmental Biology

फीडर-मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों के तहत मानव Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करपोस्टाग्लियन सहानुभूति न्यूरॉन्स के कुशल भेदभाव

doi: 10.3791/60843 Published: May 24, 2020

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से postganglionic सहानुभूति न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए एक स्थिर, अत्यधिक कुशल भेदभाव रणनीति का वर्णन करते हैं । यह मॉडल कई स्वायत्त विकारों के अध्ययन के उपयोग के लिए न्यूरॉन्स उपलब्ध कराएगा।

Abstract

मानव pluripotent स्टेम सेल (hPSCs) रोग मॉडलिंग और विट्रो में मानव भ्रूण विकास के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बन गए हैं । हमने पहले स्वायत्तन्यूरोपैथी वाले रोगियों पर लागू किए गए सहानुभूति चरित्र के साथ स्वायत्त न्यूरॉन्स के व्युत्पन्न के लिए एक विभेदन प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया था। हालांकि, प्रोटोकॉल नॉक आउट सीरम रिप्लेसमेंट (KSR) और फीडर आधारित संस्कृति की स्थिति पर बनाया गया था, और उच्च भेदभाव दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, सेल छंटाई आवश्यक था। ये कारक उच्च परिवर्तनशीलता, उच्च लागत और कम प्रजनन क्षमता का कारण बनते हैं। इसके अलावा, विद्युत गतिविधि सहित परिपक्व सहानुभूति गुणों का सत्यापन नहीं किया गया है। यहां, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जहां फीडर-मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों में पीएससी संस्कृति और भेदभाव किया जाता है। ट्रंक तंत्रिका शिखर की पहचान करने वाले आनुवंशिक मार्कर की पहचान की जाती है। पोस्टगैंगलियनिक सहानुभूति न्यूरॉन्स में आगे भेदभाव सेल छंटाई की आवश्यकता के बिना 20 दिनों के बाद प्राप्त किया जाता है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग आगे कार्यात्मक न्यूरॉन पहचान को दर्शाती है। हमारे विभेदित न्यूरॉन्स से पता चला फायरिंग निकोटीन द्वारा बढ़ाया जा सकता है और एड्रेनेर रिसेप्टर विरोधी प्रोप्रानोल द्वारा दबाया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में मध्यवर्ती सहानुभूति तंत्रिका जनकों को 2 सप्ताह तक तंत्रिका स्फेरॉइड के रूप में बनाए रखा जा सकता है, जो संस्कृतियों के विस्तार की अनुमति देता है। संक्षेप में, हमारा अद्यतन सहानुभूति न्यूरॉन विभेदन प्रोटोकॉल पिछले संस्करण की तुलना में उच्च भेदभाव दक्षता, बेहतर प्रजनन क्षमता, अधिक लचीलापन और बेहतर तंत्रिका परिपक्वता दिखाता है। यह प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को स्वायत्त तंत्रिका तंत्र को प्रभावित करने वाले मानव विकारों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक कोशिकाओं के साथ प्रदान करेगा।

Introduction

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पोस्टगैंगलियनसहानुभूति न्यूरॉन्स (symNs) स्वायत्त तंत्रिका तंत्र (ANS) से संबंधित हैं और चेतना से स्वतंत्र शरीर के होमोस्टोसिस का जवाब देने और विनियमन करने में कई महत्वपूर्ण भूमिकाएं हैं। उदाहरण के लिए, तनाव symNs को उत्तेजित करता है और लड़ाई या उड़ान प्रतिक्रिया है कि दिल की दर, रक्तचाप, और पसीना में वृद्धि की ओर जाता है उदाहरण भी देते हैं । आनुवंशिकी, विषाक्तता/चोट, या अन्य रोगों के साथी के रूप में कई मानव विकारों में SymNs प्रभावित होते हैं । एक आनुवंशिक न्यूरोपैथी का एक उदाहरण बचपन विकार पारिवारिक डिस्कोसिया (एफडी) है, जहां सिम्स का एक गंभीर डिस्रेगुलेशन डिस्स्वायत्त संकट का कारण बनता है, जो पसीना, त्वचा के दाग, उल्टी हमलों, उच्च रक्तचाप और चिंता1से स्पष्ट होता है। विषाक्तता का एक उदाहरण कीमोथेरेपी उपचार है, जो स्वायत्त न्यूरॉन्स2पर विषाक्त दुष्प्रभाव होने की सूचना दी गई है । यह ज्ञात है कि स्वायत्त दरिवता और हाइपर-इनरवेशन दोनों पार्किंसंस रोग या उच्च रक्तचाप गुर्दे की बीमारी3,,4जैसी बीमारियों का कारण बन सकते हैं। इस प्रकार, अनुसंधान का संचालन करने और बीमारी के संदर्भ में साइएमएन जीव विज्ञान और दोषों के तंत्र को समझने में सक्षम होना उपन्यास और प्रभावी उपचारों की खोज के लिए फायदेमंद है।

एनाटॉमी
परिधीय तंत्रिका तंत्र शाखाओं संवेदी और स्वायत्त विभाजन में। संवेदी तंत्रिका तंत्र की संबद्ध तंत्रिकाएं दर्द और स्पर्श की अनुभूति के लिए जिम्मेदार हैं, जबकि एएसएस सभी अंगों से मस्तिष्क तक जानकारी को रिले करने के लिए जिम्मेदार है। एएनएस को आंत्र तंत्रिका तंत्र में विभाजित किया गया है, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट, पैरापेनुसी तंत्रिका तंत्र, जो विश्राम के लिए महत्वपूर्ण है, और सहानुभूति तंत्रिका तंत्र (एसएनएस), जो अंगों के सक्रियण/विनियमन के लिए महत्वपूर्ण है। एसएनएस एक दो न्यूरॉन प्रणाली5अनुकूलित करता है । रीढ़ की हड्डी में Preganglionic सहानुभूति तंत्रिका axons सहानुभूति गंगलिया, जहां postganglionic symN सेल निकायों स्थित है के लिए पहली परियोजना । इसके बाद ये न्यूरॉन्स शरीर के हर अंग के लक्षित ऊतकों को इनरवेट करने के लिए लंबे अनुमान भेजते हैं। प्रीगैग्लियोटिक न्यूरॉन्स द्वारा प्रेषित संकेत कोलिनेर्गिक होते हैं, जबकि पोस्टगैग्लियोटिक सिमेंस एड्रेनेस होते हैं और इस प्रकार उनके मुख्य न्यूरोट्रांसमीटर के रूप में नोरेपिनेफ्रीन (एनई) को व्यक्त करते हैं। पोस्टगैंगलियनिक, सहानुभूति न्यूरॉन्स के कुछ उल्लेखनीय अपवाद हैं जो कोलिनेर्गिक हैं, जिनमें रक्त वाहिकाओं को आंतरिक बनाना शामिल है। एड्रेनेर्गिक पोस्टगैग्लियोटिक न्यूरॉन्स एंजाइमों टायरोसिन हाइड्रोक्साइल (टीएच), सुगंधित एल-अमीनो एसिड डिकार्बोक्सिलास (एएएडी), डोपामाइन-हाइड्रोक्साइल (डीबीएच), और मोनोमाइन ऑक्सीडेस (माओ-ए) को व्यक्त करते हैं, जो एनई को पैदा करने और मेटाबोलाइज करने के लिए जिम्मेदार हैं। इसके अलावा, वे एनई रीसाइक्लिंग ट्रांसपोर्टरों और/या रिसेप्टर्स α-एड्रेनेर्गिक रिसेप्टर (ADRA2), एड्रेनेर रिसेप्टर (ADR2B), नोरेनिनेफ्रीन ट्रांसपोर्टर (NET1), और वेसिकुलर मोनोमाइन ट्रांसपोर्टर (VMAT1/2) को व्यक्त करते हैं ।

विकास
भ्रूण विकास के दौरान सिम्न तंत्रिका शिखर (नेकां) से प्राप्त होते हैं, जो तंत्रिका ट्यूब और ओवरलेलिंग एक्टोडर्म6के बीच उभरते हैं, और मेलानोसाइट्स, ऑस्टियोब्लास्ट, आदिपोसाइट्स, ग्लिया, एंटिक न्यूरॉन्स, संवेदी न्यूरॉन्स और स्वायत्त न्यूरॉन्स7सहित कई सेल वंशों में अंतर कर सकते हैं। तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाएं (एनसीसी) अत्यधिक प्रवासी कोशिकाएं हैं जो भ्रूण के माध्यम से कई मार्ग लेती हैं। नेकां के विकास के इस प्रारंभिक चरण में, कोशिकाएं मार्कर घोंघा 1/2, FOXD3 और SOX108,,9,,10,,11को व्यक्त करती हैं। प्रवास मार्ग उनके द्वारा अपनाए जाने वाले अक्षीय स्थान के साथ मिलकर एनसी उपप्रकार निर्धारित करता है जिसमें वे विकसित होंगे। इन नेकां उपप्रकारों को उनके विशिष्ट HOX जीन अभिव्यक्ति द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है: कपाल एनसीसी होएक्स जीन, वागल एनसीसी एक्सप्रेस HOX 1-5, ट्रंक एनसीसी एक्सप्रेस HOX 6-9, और पवित्र एनसीसी एक्सप्रेस HOX 10-1112व्यक्त नहीं करते हैं। उनमें से, ट्रंक एनसीसी को सिमिन्स के मुख्य स्रोत के रूप में पहचाना जाता है। सिम्न अग्रदूत प्रतिलेखन कारक MASH1/ASCL113को व्यक्त करते हैं, जो PHOX2B14 और INSM115की अभिव्यक्ति को बढ़ावा देता है । ट्रांसक्रिप्शन कारकों का गेटा परिवार देर से सहानुभूतिपूर्ण विकास के दौरान व्यक्त किया जाता है। GATA2 और GATA3 symNs में व्यक्त कर रहे हैं, जो बदले में DBH16सक्रिय । डीबीएच और टीएच17की अभिव्यक्ति और रखरखाव के लिए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर हैंड2 भी महत्वपूर्ण है ।

एचपीएससी (उदाहरण के लिए, भ्रूणीय और प्रेरित प्लुरीटेंट स्टेम सेल) विकासात्मक प्रतिमानों को फिर से तैयार करने और सिमेंस उत्पन्न करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण18 हैं जिन्हें विभिन्न मानव विकारों के रोग मॉडलिंग के लिए नियोजित किया जा सकता है। इस प्रकार, एचपीएससी से साइमेंस उत्पन्न करते समय, विकासात्मक दिशा-निर्देशों का पालन करना और भेदभाव प्रक्रिया के साथ उचित मार्कर की अभिव्यक्ति का आकलन करना महत्वपूर्ण है।

पिछला सिमिन प्रोटोकॉल
कुछ शोध समूहों ने पहले एचपीएससी19,20,,21से साइमेंस की पीढ़ी की सूचना दी है । इन प्रोटोकॉलों की सीधी तुलना एक-दूसरे और हमारी ओर से हाल ही में22की समीक्षा की गई थी . 201623में, हमने सिमिन चरित्र(चित्रा 1ए)के साथ स्वायत्त न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए एक विभेदन प्रोटोकॉल प्रकाशित किया। इस प्रोटोकॉल में केएसआर आधारित माध्यम का उपयोग किया गया था, जिसका उपयोग अविभेदित एचपीएससी और सेल विभेदन दोनों के रखरखाव में किया गया था। इसके अलावा, चूहे भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट (एमईएफ फीडर कोशिकाओं) पर एचसीपीसी बनाए रखा गया था। हमने इस प्रोटोकॉल और पीएससी को एफडी वाले रोगियों से23विकार को मॉडल करने के लिए नियोजित किया । 2019 में, हमने इस पुराने प्रोटोकॉल24का अधिक विस्तृत संस्करण वर्णित किया। संक्षेप में, तंत्रिका भाग्य को पहले 2 दिनों में टीजीएफ-एऔर बीएमपी सिग्नलिंग को ब्लॉक करने के लिए दोहरी SMAD अवरोध25 द्वारा प्रेरित किया गया था। CHIR99021 का उपयोग कर WNT सक्रियण तंत्रिका जनकों को पदोन्नत करने के लिए नेकां कोशिकाओं बन जाते हैं । 11 दिन, कोशिकाओं को सीडीएस 49डी+ या SOX10+ आबादी26,,23के लिए FACS द्वारा हल किया गया, जिससे लगभग 40% नेकां उत्पादन दक्षता मिली। इस प्रकार, भेदभाव के अगले चरणों के लिए दक्षता और शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए छंटाई की आवश्यकता थी। एनसीसी को एफजीएफ2 और चिर के संयुक्त उपचार के साथ स्फेरॉइड के रूप में बनाए रखा गया और परिलक्षित किया गया। 4 दिनों के बाद, रखरखाव के एनसी स्फेरॉइड को चढ़ाया गया और सीपीएन परिपक्वता को समाप्त करने के लिए बीडीएनएफ, जीडीएनएफ और एनजीएफ दिया गया। हालांकि इन symNs ऐसे ASCL1, TH, DBH, और PHOX2A के रूप में मजबूत symN मार्कर व्यक्त की, अधिक परिपक्व symNs के लिए मार्कर, निकोटीनिक acetylcholine रिसेप्टर (CHRNA3/CHRNB4) और वेसिकल ट्रांसपोर्टर (VMAT1/2) की अभिव्यक्ति सहित, भेदभाव के ७० दिनों के बाद भी कम थे । इस प्रोटोकॉल में HOX जीन औपचारिक रूप से परीक्षण नहीं किया गया था, और कोशिकाओं की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गतिविधि सहित परिपक्व तंत्रिका गुणों, सत्यापित नहीं थे ।

यहां, हम सिमेंस(चित्रा 1B)उत्पन्न करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एचपीएससी को फीडर-फ्री स्थितियों में, विट्रोनेक्टिन (वीटीएन) -लेपित व्यंजनों पर बनाए रखा जाता है, जो आवश्यक 8 (ई8) मीडिया27का उपयोग करके। विभेदन मीडिया के फार्मूले को प्रत्येक चरण में संशोधित किया गया है, जिससे नेकां की जनसंख्या28का प्रतिशत बढ़ गया है । symN परिपक्वता CD49D+/SOX10+ हल या अक्रमित थोक एनसीसी आबादी पर किया जा सकता है । दोनों 30 दिन तक साइएमएन मार्कर अभिव्यक्ति के उच्च स्तर को दिखाते हैं । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न सिमेंस इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग और सिमिन एक्टिवेटर और अवरोधक यौगिकों के साथ उपचार के लिए उत्तरदायी हैं।

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Protocol

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नोट: H9 PHOX2B: GFP रिपोर्टर लाइन ओह एट अल19द्वारा प्रदान की गई थी । इस पेपर में उपयोग किए जाने वाले कुछ क्यूपीसीआर प्राइमर ओरीजीन टेक्नोलॉजीज से प्राप्त किए गए थे, जबकि फ्रिथ एट अल20,,30से कुछ दृश्य प्राप्त किए जाते हैं।

1. डिश कोटिंग, मीडिया तैयारी और एचपीएससी रखरखाव के लिए सेट-अप

  1. डिश कोटिंग
    1. विट्रोनेक्टिन (वीटीएन) कोटिंग
      1. वीटीएन की शीशियों को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पूरी तरह गल ने तक रखें, फिर अच्छी तरह से मिलाएं।
      2. 100 मिमी पेट्री डिश के लिए, 0.5 मिलीग्राम/एमएल वीटीएन के साथ 1x फॉस्फेट बफर्ड लवलिन (पीबीएस) का 7 मिलीग्राम मिलाएं, डिश में वीटीएन समाधान जोड़ें, और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करें।
    2. बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स कोटिंग
      1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स (सामग्री की मेजदेखें) की गल शीशियों ।
      2. 6 अच्छी प्लेट के एक कुएं के लिए, 100x बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 20 माइक्रोन के साथ DMEM/F12 के 2 mL मिश्रण, पकवान के लिए तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान जोड़ें, पैराफिन फिल्म के साथ पकवान लपेटें, और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक साफ कंटेनर में स्टोर । जितनी जल्दी हो सके काम करें। लेपित व्यंजन 2 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस में संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. पॉलीऑर्निथिन (पीओ) /लैमिनिन (एलएम)/फाइब्रोनेक्टिन (एफएन) कोटिंग
      1. पहले दिन, 24 अच्छी प्लेट के एक कुएं के लिए, पीओ के 15 μg/mL को 1x पीबीएस के 1 मिलील के साथ मिलाएं, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2 रातोंरात। रात भर -20 डिग्री सेल्सियस पर एलएम और एफएन दोनों गल और पूरी तरह से गल जाने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      2. दूसरे दिन एस्पिरेट पीओ सॉल्यूशन, कुओं को 1x पीबीएस से धोएं, 1x पीबीएस के 1 mL जोड़ें जिसमें एलएम का 2 μg/mL और एफएन का 2 μg/mL और इनक्यूबेट 5% सीओ2 में रातोंरात 37 डिग्री सेल्सियस पर हो। इस बिंदु पर एलएम/एफएन समाधान के साथ पकवान महीनों के लिए इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है जब तक यह बाहर सूखी नहीं है । डिश को सूखने से रोकने के लिए और 1x पीबीएस जोड़ें।
  2. मीडिया की तैयारी
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर E8 पूरक की एक बोतल विगलन करके आवश्यक 8 मध्यम (E8) तैयार करें। यदि आवश्यक हो तो ई8 मध्यम और एंटीबायोटिक दवाओं के 500 मिलील के साथ पूरक मिलाएं।
      नोट: काम कर रहे E8 समाधान 2 सप्ताह के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।
    2. 100 मीटर की कुल मात्रा के लिए डीएमएसओ के 10 मिलील के साथ पूर्ण ई8 मीडियम के 90 मिली0 को मिलाकर एचपीएससी फ्रीजिंग मीडियम तैयार करें। फिल्टर स्टरलाइज करें।
    3. 10 माइक्रोन एसबी431542, 1 एनजी/एमएल बीएमपी4, 300 एनएम चिर99021, और 10 माइक्रोन वाई 27632 के साथ आवश्यक 6 (ई6) माध्यम के 100 मीटर मिश्रण द्वारा दिन 0 से दिन 1 भेदभाव माध्यम तैयार करें 100 मीटर की कुल मात्रा के लिए।
    4. 100 मीटर की कुल मात्रा के लिए 10 माइक्रोएम एसबी और 0.75 माइक्रोएम चिर99021 के साथ ई6 मीडियम के 100 मिलील को मिलाकर दिन 2 से 10 विभेदन माध्यम तैयार करें।
    5. बी 27 (50x) के 2 मिलील के साथ न्यूरोबेसल मीडियम को मिलाकर 10 दिन से दिन 14 स्फेरॉइड मीडियम तैयार करें, N2 (100x), 2 mM L-ग्लूटामेट, 3 μM CHIR99021, और 10 एनजी/mL FGF2 के कुल वॉल्यूम के लिए 100 मीटर ।
    6. हर फीडिंग के लिए 10 से दिन 14 स्फेरॉइड मीडियम में फ्रेश आरए के 0.5 माइक्रोन जोड़कर स्फेरॉइड लॉन्ग टर्म मेंटेनेंस के लिए दिन 14 से दिन 28 मीडियम तैयार करें।
      नोट: हमेशा -80 डिग्री सेल्सियस पर आरए रखें।
    7. बी 27 (50x), एन 2 (100x), 2 एमएम एल-ग्लूटामेट के 2 मिलील के साथ न्यूरोबेसल मीडियम मिलाकर सिमिन परिपक्वता माध्यम तैयार करें, 25 एनजी/एमएल जीडीएएनएफ, 25 एनजी/एमएल बीडीएनएफ, 25 एनजी/एमएल एनजीएफ, 200 माइक्रोएम एस्कोम्बिक एसिड और 100 मीटर की कुल मात्रा के लिए 02 एम एम डीएम एमपीपी। समाधान का उपयोग 2 सप्ताह के भीतर किया जाना चाहिए। प्रत्येक भोजन से पहले, 0.125 माइक्रोएम ताजा आरए जोड़ें। इस समाधान का उपयोग दिन 14 (विकल्प 1) या दिन 28 (विकल्प 2) से किया जाता है।
    8. 100 मिलील की कुल मात्रा के लिए जरूरत पड़ने पर 2% एफबीएस, 2 एमएम एल-ग्लूटामेट और एंटीबायोटिक्स के साथ डीएमईएम मिलाकर एफएसीएस बफर तैयार करें।
  3. एचपीएससी रखरखाव
    1. विगलन और एचपीएससी रखते हुए
      1. एक वीटीएन कोटेड 100 एमएम डिश तैयार करें।
      2. तरल नाइट्रोजन से सीधे एचपीएससी की एक शीशी गल करने के लिए, शीशी को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें, ध्यान से ट्यूब को पानी में तब तक झूलते रहें जब तक कि यह गल न जाए। गल एचपीएससी को 1x पीबीएस के 10 मिलील वाली 15 मिलीग्राम ट्यूब पर स्थानांतरित करें, और 4 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें।
      3. अधिनेता को त्यागें और ट्यूब में ई8 मध्यम का 1 mL जोड़ें। पिपेट कई बार पूरी तरह से गोली को फिर से निलंबित करने के लिए और फिर 10 मीटर कुल तक पहुंचने के लिए E8 मध्यम का एक और 9 mL जोड़ें ।
      4. 100 मिमी पकवान से वीटीएन समाधान को एस्पिरेट कर ते हैं।
      5. एचपीएससी को 100 मिमी डिश में स्थानांतरित करें, धीरे-धीरे हिलाएं (ऊपर-नीचे और बाएं-दाएं, हलकों में नहीं) यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं को डिश में समान रूप से वितरित किया जाता है
      6. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2में।
      7. अगले दिन, सभी माध्यम को एस्पिरेट करें और ई8 के 10 मीटर के साथ फ़ीड करें।
      8. अगले 3-4 दिनों तक हर दिन इस तरह से खिलाएं और फिर विभाजित करने के लिए तैयार करें।
    2. एचपीयूसी का बंटवारा
      नोट: बंटवारे के बिंदु पर HPSCs 80%-90% confluent होना चाहिए । चिकनी और चमकीले किनारों वाली बड़ी कॉलोनियों को देखा जाना चाहिए। हालांकि, प्रत्येक कॉलोनी के बीच संपर्क से बचा जाना चाहिए(चित्रा 2B,0 दिन और चित्रा 6B)।
      1. जरूरत के हिसाब से वीटीएन-लेपित 100 एमएम व्यंजन तैयार करें।
      2. E8 Aspirate और पकवान है कि 1x PBS के साथ 1x विभाजित करने की जरूरत है धोने ।
      3. 1x पीबीएस एस्पिरेट और 0.25 मीटर EDTA के 4 मिलीएल जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर 2 मिन के लिए इनक्यूबेट।
        नोट: एचपीएससी को छोटी कॉलोनियों के रूप में विभाजित/प्रत्यावर्तित किया जाना चाहिए । एकल कोशिकाओं में अलगाव को रोकने के लिए 2 मिन से अधिक ईटीए के साथ इलाज न करें। कोशिकाओं को अभी भी 2 मिन उपचार के बाद पकवान की सतह से जुड़ा होना चाहिए।
      4. EDTA Aspirate, दृढ़ता से पकवान की सतह पर E8 मध्यम के 10 mL पाइपिंग द्वारा कालोनियों अलग, और एक 15 मीटर ट्यूब में सभी मध्यम और कोशिकाओं को इकट्ठा ।
      5. 80% -90% कन्फ्लंकुलरी पर एचसीपीसी के साथ, 1:15-1:20 तक उपनिवेशों को विभाजित किया गया है। उदाहरण के लिए, एचपीएससी को 1:20 से 1:20 से एक 100 मिमी पकवान में विभाजित करने के लिए, ई8/एचपीएससी समाधान के 500 माइक्रोन लें और ताजा ई8 माध्यम के 9.5 मिलील के साथ मिलाएं।
      6. वीटीएन-लेपित 100 मिमी व्यंजनों में प्लेट एचपीएससी।
        नोट: प्रत्येक शोधकर्ता और सेल लाइन के लिए स्वतंत्र रूप से आदर्श विभाजन अनुपात स्थापित करने की सलाह दी जाती है।
    3. एचपीएससी को फ्रीज करना
      1. एचपीएससी के 100 मिमी पकवान के लिए जो विभाजित होने के लिए तैयार है, तीन क्रायोवियल ्स और 3.5 मिलीमीटर ठंड माध्यम तैयार करें।
        नोट: मीडिया और शीशियों को उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर रखा जाना चाहिए।
      2. एस्पिरेट E8 और 1x PBS के साथ डिश 2x धोने।
      3. एस्पिरेट 1x पीबीएस और 0.25 एम EDTA के 4 मिलील जोड़ें, 2 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2में।
        नोट: HPSCs समय है कि वे विभाजित किया जाएगा पर छोटी कालोनियों के रूप में जमे हुए होना चाहिए । एकल कोशिकाओं में अलगाव को रोकने के लिए 2 मिन से अधिक ईटीए के साथ कोशिकाओं का इलाज न करें। कोशिकाओं को अभी भी 2 मिन उपचार के बाद पकवान की सतह पर संलग्न किया जाना चाहिए।
      4. EDTA Aspirate, दृढ़ता से पकवान की सतह पर 1x PBS के 10 mL पाइपिंग द्वारा कालोनियों अलग, और एक ५० मीटर ट्यूब में सभी मध्यम और कोशिकाओं को इकट्ठा ।
      5. शेष EDTA को धोने के लिए 4 मिन के लिए 200 x ग्राम पर 1x पीबीएस और सेंट्रलाइज के 20 मिलील जोड़ें।
      6. अतिशयोक्ति को त्यागें और ठंड माध्यम के 3 mL में गोली को फिर से निलंबित करें।
      7. तीन क्रायोवियल्स, 1 एमएल प्रत्येक में समान रूप से एचपीएससी वितरित करें।
      8. धीमी तापमान में गिरावट सुनिश्चित करने के लिए नियंत्रित फ्रीजिंग बॉक्स या स्टायरोफोम सैंडविच में रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, और फिर दीर्घकालिक भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।

2. सीडिंग एचपीएससी भेदभाव शुरू करने के लिए (0 दिन)

नोट: एचपीएससी को स्थिर होने के बाद भेदभाव के लिए तैयार रहना चाहिए (यानी, विगलन के बाद 2-3x विभाजित किया जा रहा है)। सुनिश्चित करें कि उपनिवेश चिकनी, चमकदार किनारों, और न्यूनतम भेदभाव(चित्रा 2B)के साथ स्वस्थ हैं।

  1. जरूरत के हिसाब से 0 दिन से एक दिन पहले बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित व्यंजन (24 अच्छी तरह से या 6 अच्छी तरह से व्यंजन) तैयार करें। भेदभाव की शुरुआत में व्यंजन ों को आरटी पर लाएं।
  2. जरूरत के अनुसार दिन 0-1 भेदभाव माध्यम बनाओ।
  3. एस्पिरेट एस्पिरेट ई 8 को कन्फ्लोरेंट से, एचपीसीएसएस को विभाजित करने के लिए तैयार है, और डिश 2x को 1x पीबीएस से धोएं।
  4. 0.25 मीटर ईटीए प्रति 100 मिमी डिश के 7 मिलील, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 15 मिमी के लिए 5% सीओ2जोड़ें।
    नोट: इस बिंदु पर, EDTA उपचार एकल कोशिकाओं में तितर-बितर करने के लिए लंबे समय तक है।
  5. सभी एचपीएससी (उन्हें तैरना चाहिए) से पिलेट करें और 50 मीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें। ईटीए को पतला करने के लिए ईटीए समाधान के रूप में 1x पीबीएस की एक ही राशि या अधिक जोड़ें।
  6. 4 मिन के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
  7. अधिनेता को त्यागें, कोशिकाओं को समरूप बनाने के लिए दिन 0-1 भेदभाव माध्यम का 1 mL जोड़ें और पाइप्ट करें। अधिक माध्यम जोड़कर पालन करें और फिर कोशिकाओं को गिनने के लिए एकाग्रता आदर्श के लिए सेल समाधान को पतला करने के लिए मिलाएं।
    नोट: सेल समाधान को अधिक न करें। एक पूर्ण 100 मिमी पकवान से कोशिकाओं को शुरू करने के लिए मध्यम के 5 मिलील में पतला किया जाना चाहिए।
  8. स्वचालित सेल काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल नंबर की गणना करें।
  9. सेल समाधान को कमजोर करें क्योंकि कम अंतिम मात्रा में 125,000 कोशिकाओं/सेमी2 तक पहुंचने की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, 2 अच्छी तरह से डिश के लिए प्रति अच्छी तरह से 2 mL या 24 अच्छी तरह से पकवान के लिए प्रति अच्छी तरह से 500 माइक्रोन)।
    नोट: कम मात्रा कोशिकाओं को तेजी से संलग्न करने में मदद करती है।
  10. लेपित व्यंजनों से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स समाधान के सभी Aspirate और कुओं में सेल समाधान थाली ।
  11. 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2में।

3. तंत्रिका क्रेस्ट सेल प्रेरण (दिन 1 से 10 दिन, चित्रा 2A)

  1. दिन 1 पर दिन 0-1 भेदभाव माध्यम के साथ कोशिकाओं को खिलाने (6 अच्छी तरह से व्यंजन के लिए प्रति अच्छी तरह से 3 mL और 24 अच्छी तरह से व्यंजन के लिए 1 mL प्रति अच्छी तरह से) ।
  2. दूसरे दिन कोशिकाओं को दिन 2-दिन 10 विभेदन माध्यम (3 mL प्रति अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से व्यंजन के लिए और 1 mL प्रति अच्छी तरह से 24 अच्छी तरह से व्यंजन के लिए) के साथ फ़ीड ।
  3. अब से, कोशिकाओं को 10 दिन तक हर दूसरे दिन खिलाया जाना चाहिए (यानी, अगले खिला दिन 4 दिन होगा)।
    नोट: 6 दिन से, नेकां लकीरें का पता लगाया जाना चाहिए(चित्रा 2B)। यह जांचने के लिए कि क्या भेदभाव हो रहा है, छोटे कुओं (यानी, 24 कुओं) में समानांतर विभेदन संस्कृति ले जाने की सलाह दी जाती है, जिसे SOX10/AP2a के लिए दाग दिया जा सकता है और भेदभाव के समय के साथ मार्कर जीन अभिव्यक्ति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है(चित्रा 2B,C)।
  4. यदि कोशिकाओं को छांटते हैं, तो धारा 4 पर जाएं। अन्यथा धारा 5 पर आगे बढ़ें।

4. तंत्रिका क्रेस्ट मार्कर CD49D के लिए फ्लोरेसेंस सक्रिय सेल छंटाई (FACS) और स्फेरॉइड में नेकां कोशिकाओं को एकत्र करना

नोट: FACS छंटाई के लिए, नमूनों बर्फ पर रखा जाना चाहिए और छंटाई तक धुंधला के बाद प्रकाश के संपर्क में नहीं किया जाना चाहिए ।

  1. यदि कोशिकाओं को हल किया जाता है तो FACS बफर तैयार करें।
  2. दिन 10-14 स्फेरॉइड मीडियम तैयार करें।
  3. 10 दिन, माध्यम निकालें, और 1x PBS के साथ 1x धोने ।
  4. एक 6 अच्छी तरह से पकवान के लिए अच्छी तरह से 2 mL या एक 24 अच्छी तरह से पकवान के लिए प्रति अच्छी तरह से 1 mL पर 2 mL पर वियोजन समाधान जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें) और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 20 मिन के लिए 5% सीओ2।
  5. सभी एचपीएससी बंद पाइप और एक 50 मीटर ट्यूब के लिए स्थानांतरण।
  6. 4 मिन के लिए 200 x ग्राम पर एफएसीएस बफर और अपकेंद्री के साथ बाकी ट्यूब भरें।
    नोट: प्रत्येक 50 mL ट्यूब 20 mL या सेल समाधान के कम तक समायोजित कर सकते हैं। FACS बफर की मात्रा पर्याप्त उच्च के लिए वियोजन समाधान बेअसर होना चाहिए ।
  7. अधिनेता को त्यागें, कोशिकाओं को 6 अच्छी प्लेट के 6 अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से (~ 2 mL प्रति अच्छी तरह से) के साथ फिर से निलंबित करें, और सेल संख्या निर्धारित करने के लिए गणना करें।
  8. निम्नलिखित नमूने तैयार करें।
    1. नमूना 1 (अनदाग नियंत्रण): 1 x 106 कोशिकाओं में FACS बफर के 400 μL. कोशिकाओं को 20 माइक्रोन छलनी टोपी के माध्यम से फ़िल्टर करें और ट्यूब को बर्फ पर रखें।
    2. नमूना 2 (डीपीआई केवल नियंत्रण): एफएसीएस बफर के 400 माइक्रोन में 1 x 106 कोशिकाएं जिसमें 0.5 यूजी/एमएल डीपीआई होता है। एक छलनी टोपी के साथ एक FACS ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं को फ़िल्टर और बर्फ पर ट्यूब रखने के लिए।
    3. नमूना 3 (CD49d-लेबल): एक 15 मिलील ट्यूब में 15 मीटर ट्यूब में और 20 टिन के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट, पीई/Cy7-conjugated CD49D एंटीबॉडी (FACS बफर के 1 x 10 6 कोशिकाओं प्रति 1 x 106 कोशिकाओं के लिए 5 μL) युक्त FACS बफर के साथ शेष कोशिकाओं को निलंबित करें ।
  9. 4 मिन के लिए 200 x ग्राम पर एफएसीएस बफर और अपकेंद्री के साथ ट्यूबों को भरें।
  10. सुपरनेटेंट को त्यागें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार 0.5 यूजी/एमएल डीएपीआई वाले एफएसीएस बफर के 1 एमएल में हर 5-10 x 106 कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  11. छन्नी टोपी के साथ FACS ट्यूब के माध्यम से कोशिकाओं को छान और बर्फ पर ट्यूब रखने के लिए।
  12. FACS बफर के 2 mL युक्त संग्रह FACS ट्यूब तैयार करें।
  13. लेज़रों के साथ FACS मशीन के माध्यम से सॉर्ट करें जो CD49D+ आबादी को अलग करने के लिए DAPI और पीई-Cy7 का पता लगा सकता है।
  14. छंटाई के बाद, हल की गई कोशिकाओं को गिनें।
  15. सभी क्रमबद्ध कोशिकाओं को केंद्रित करें और दिन में फिर से निलंबित करें 10-14 स्फेरॉइड माध्यम मध्यम के प्रति 500 माइक्रोन प्रति 0.5 x 106 कोशिकाओं की अंतिम एकाग्रता के लिए।
  16. प्लेट 0.5 x 106 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव 24 अच्छी तरह से प्लेटों में।
  17. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 5% सीओ2में।

5. स्फेरॉइड में नेकां कोशिकाओं को एकत्र करना

  1. यदि एनसी कोशिकाओं को अलग करने के लिए FACS का उपयोग नहीं किया जाता है और इसके बजाय उन्हें सीधे स्फेरॉइड में एकत्र किया जाता है, तो पहले कोशिकाओं को 4.2-4.5 चरणों में वर्णित तैयार करें।
  2. 1x पीबीएस के साथ ट्यूब के बाकी भरें, और 4 मिन के लिए २०० x ग्राम पर अपकेंद्री ।
  3. अधिनेता को त्यागें, कोशिकाओं को दिन की उचित मात्रा के साथ फिर से निलंबित करें 10-14 स्फेरॉइड माध्यम (उदाहरण के लिए, 6 अच्छी प्लेट के लिए प्रति अच्छी तरह से मध्यम का ~ 2 mL), और सेल संख्या निर्धारित करने के लिए गणना करें।
  4. दिन में कोशिकाओं को पतला करें 10-14 स्फेरॉइड मीडियम से 0.5 x 106 कोशिकाएं प्रति 500 माइक्रोन मीडियम।
  5. अल्ट्रा-कम अटैचमेंट 24 अच्छी प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन की प्लेट 500 माइक्रोन।
  6. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें, 5% सीओ2में।

6. नेकां स्फेरॉइड रखरखाव और सहानुभूति जनक प्रेरण (दिन 10 से दिन 14, चित्रा 4A)

  1. विकल्प 1: न्यूनतम स्फेरॉइड संस्कृति
    1. 11 दिन पर, 10 दिन से मौजूदा माध्यम को एस्पिरेटिंग किए बिना एनसी स्फेरॉइड में 10-14 स्फेरॉइड माध्यम के 500 माइक्रोन जोड़ें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2में।
    2. 12 दिन, चाकुओं के एक तरफ नेकां स्फेरॉइड जमा करने के लिए थाली झुकाएं। ध्यान से एस्पिरेट और जितना संभव हो उतना माध्यम त्यागें, और दिन 10-14 स्फेरॉइड माध्यम के 1 mL के साथ फ़ीड।
    3. 14 दिन तक हर दिन कोशिकाओं को खिलाते रहें।
    4. वैकल्पिक: यदि स्फेरॉइड कुल और एक बड़ा झुरमुट उत्पन्न करते हैं, तो स्फेरॉइड झुरमुट को तोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। यह यह भी सुनिश्चित करता है कि व्यक्तिगत स्फेरॉइड बहुत बड़े नहीं मिलते हैं।
      नोट: आदर्श स्फेरॉइड आकार सीमा लगभग 100-500 माइक्रोन होनी चाहिए। उस सीमा के भीतर, व्यक्तिगत स्फेरॉइड का आकार महत्वपूर्ण नहीं है। हालांकि, आकृति विज्ञान, जैसे कि एक चिकनी और स्पष्ट किनारों(चित्रा 3 और चित्रा 6)आगे की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है। 14 दिन में, प्रत्येक 24 अच्छी प्लेट में आदर्श रूप से उपरोक्त आकार सीमा के भीतर विभिन्न आकारों के लगभग 50-60 स्फेरॉइड होते हैं।
  2. विकल्प 2: विस्तारित स्फेरॉइड संस्कृति
    1. 15 दिन, नेकां स्फेरॉइड रखने के लिए, 10-14 दिन के 1.5 mL के साथ फ़ीड 0.5 माइक्रोएम आरए युक्त। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट।
      नोट: आरए को हर खिलाके लिए ताजा जोड़ा जाना चाहिए और हमेशा -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए।
    2. अब से, हर दूसरे दिन 28 दिन तक खिलाएं और फिर स्फेरॉइड (धारा 7.1) की चढ़ाना जारी रखें।
      नोट: बढ़ते स्फेरॉइड उन्हें तोड़ने के लिए 1 mL पिपेट के साथ पाइपिंग करके प्रति सप्ताह लगभग 1x विभाजित होते हैं। वे 1:2-1:4 के अनुमानित अनुपात में विभाजित हैं। 2 सप्ताह के विस्तार की अवधि के भीतर, कोशिकाओं की संख्या में मोटे तौर पर चौगुनी चाहिए ।

7. साइर्न भेदभाव और परिपक्वता (विकल्प 1: 14 दिन के बाद; विकल्प 2: 28 दिन के बाद)

  1. नियमित व्यंजनों में स्फेरॉइड चढ़ाना
    1. पीओ/एलएम/एफएम कोटेड 24 वेल प्लेटतैयार करें।
    2. 0.125 माइक्रोएम आरए (ताजा हर फ़ीड जोड़ें) और 10 μM Y27632 (केवल दिन 14) युक्त symN माध्यम तैयार करें।
    3. 14 दिन, कुओं के एक तरफ नेकां स्फेरॉइड जमा करने के लिए थाली झुकाएं। ध्यान से एस्पिरेट और जितना संभव हो उतना माध्यम त्यागें, और symN माध्यम के 1 mL के साथ फ़ीड ।
    4. लेपित प्लेटों से एलएम/एफएन निकालें।
    5. विभाजन और थाली 24 अच्छी तरह से थाली से नए, लेपित 24 अच्छी तरह से थाली के 4 अलग कुओं में प्रत्येक अच्छी तरह से । प्रत्येक मूल कुएं में 1 mL होगा, जिसमें ~ 50-60 स्फेरॉइड होंगे। यह 250 माइक्रोन की पैदावार करता है, जिसमें नई प्लेट पर प्रत्येक कुएं के लिए लगभग 10-15 स्फेरॉइड होते हैं।
    6. प्रति अच्छी तरह से अतिरिक्त माध्यम के 250 μL जोड़ें।
      नोट: यह 1:4 का विभाजन है; सुनिश्चित करें कि स्फेरॉइड समाधान के भीतर ठीक से वितरित किए जाते हैं ताकि विभाजन अपेक्षाकृत भी हो। स्फेरॉइड की संख्या नहीं गिनी जाती है क्योंकि अंतिम संख्या में स्यार्न पैदा करने की सफलता को प्रभावित नहीं किया जाता है।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2पर इनक्यूबेट।
    8. 15 दिन (या विकल्प 2 के लिए 29 दिन), सभी माध्यम को बदलकर 0.125 माइक्रोन आरए वाले सभी माध्यम को 1 mL symN माध्यम से बदलकर खिलाएं। अब से, न्यूरॉन्स 20 दिन तक हर 2 दिन खिलाया जाना चाहिए (या विकल्प 2 के लिए दिन 35)।
    9. 20 दिन (या विकल्प 2 के लिए दिन 35) के बाद, न्यूरॉन्स को ध्यान से मौजूदा माध्यम (500 माइक्रोन) के केवल आधे की जगह से खिलाया जाना चाहिए। अब से, हर हफ्ते फ़ीड जब तक माध्यम जल्दी से पीला हो जाता है ।
    10. वांछित समय बिंदु तक साप्ताहिक भोजन करते रहें।
      नोट: symNs गंगलिया की तरह संरचनाओं में कुल करने के लिए करते है और संस्कृति व्यंजनों से अलग करने के लिए प्रवण हैं । इसे रोकने के लिए, आधा फीडिंग और न्यूनतम हैंडलिंग की सिफारिश की जाती है।
  2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए चढ़ाना कोशिकाएं
    1. पीओ/एलएम/एफएम कोटेड ९६ अच्छी तरह से इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्लेटें तैयार करें ।
    2. 0.125 माइक्रोएम आरए (ताजा हर फ़ीड जोड़ें) और 10 μM Y27632 (केवल दिन 14) युक्त symN माध्यम तैयार करें।
    3. 14 दिन, सभी स्फेरॉइड इकट्ठा करें, फिर उन्हें 4 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रितकरें।
    4. अधिनेता को त्यागें, विघटन समाधान के 2 mL जोड़ें, और मिश्रण को अल्ट्रा-कम अटैचमेंट प्लेट के कुओं में से एक में वापस स्थानांतरित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट, 5% सीओ2 में 20-45 मिन के लिए।
      नोट: स्फेरॉइड के आकार के आधार पर, विघटन अवधि 20 न्यूनतम से अधिक हो सकती है। 45 न्यूनतम तक हर 10 न्यूनतम कोशिका के विघटन की जांच करें वैकल्पिक रूप से, DNase के 0.1 मिलीग्राम/mL को विघटन समाधान के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि समाधान चिपचिपा बनाने वाली मृत कोशिकाओं से मुफ्त डीएनए को रोका जा सके। यह इस प्रोटोकॉल में वैकल्पिक है क्योंकि स्फेरॉइड पूरी तरह से अलग होने के बाद एकत्रित नहीं होंगे।
    5. पिपेट पूरी तरह से स्फेरॉइड को अलग करने के लिए, फिर 4 मिन के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
    6. अधिनेता को त्यागें, कोशिकाओं को उचित मात्रा में साइएमएन माध्यम के साथ फिर से निलंबित करें, और सेल नंबर गिनें।
    7. २०० μL कुल मात्रा में पीओ/एलएम/एफएन-लेपित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी कुओं में १००,०००/सेमी2 पर कोशिकाओं को प्लेट करें ।
    8. 15 दिन (या विकल्प 2 के लिए 29 दिन), धारा 7.1 में के रूप में एक ही खिला प्रक्रियाओं का पालन करें। दिन के बाद कुल मात्रा 15 (या विकल्प 2 के लिए 29 दिन) 300 μL प्रति अच्छी तरह से होना चाहिए।
    9. 20 दिन के बाद एक मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी मशीन का उपयोग कर विद्युत संकेतों को मापें (या विकल्प 2 के लिए दिन 35)।
      नोट: विकल्प 2 में, स्फेरॉइड को 14-दिन 28 के बीच कभी भी चढ़ाया जा सकता है। पहले विद्युत संकेतों माप स्फेरॉइड चढ़ाना के बाद 1 सप्ताह आयोजित किया जा सकता है।

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Representative Results

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इस प्रोटोकॉल में, हम एचपीएससी से साइमेंस उत्पन्न करने के तरीके के बारे में निर्देश देते हैं। यहां प्रदर्शित संस्कृति की स्थितियों में पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल23,24 (चित्रा 1ए)से फीडर-मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित स्थितियों(चित्रा 1बी)में सुधार किया गया था । दो विकल्प प्रदान किए जाते हैं, एक जहां 20 दिनों के भीतर सिएमन बनाए जाते हैं, और दूसरा जहां एनसीसी को अधिक कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए 2 सप्ताह के लिए विस्तारित किया जा सकता है जिसे फिर साइटर्न(चित्रा 1 B,विकल्प 1 और 2) में विभेदित किया जा सकता है।

विभेदित कोशिकाओं की सिएमएन विशेषताओं की ठीक से निगरानी करने के लिए, PHOX2B-eGFP WA09 रिपोर्टर लाइन और माता-पिता WA09 पीएससी लाइन19। सभी भेदभाव कम से तीन जैविक दोहराता में आयोजित किए गए थे, कम से एक मार्ग के बाद स्वतंत्र भेदभाव प्रयोगों के रूप में परिभाषित किया गया है और/ जब अविभेदित एचपीएससी की संवत् 80%-90% तक पहुंच गई तो भेदभाव प्रेरित हुआ। एचपीएससी उपनिवेशों का दौर था, चमकदार, चिकनी किनारों और कोई भेदभाव के लिए थोड़ा के साथ । कॉलोनाइजर्स को एक-दूसरे को नहीं छूना चाहिए(फिगर 2बी,दिन 0)। ठेठ दोहरी SMAD अवरोध25के बजाय, जो पहले न्यूरेक्टोडर्म प्रेरण के लिए इस्तेमाल किया गया था, टीजीएफ-पहले 2 दिनों में WNT और BMP4 सिग्नलिंग के साथ संयुक्त अवरोध प्रारंभिक तंत्रिका क्रेस्ट मार्कर AP2a की मजबूत अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व किया । तंत्रिका क्रेस्ट मार्कर SOX10 दिन 4 से 10 दिन(चित्रा 2B)व्यक्त किया गया था । एनसीसी 6 दिन से दिखाई घने, अंधेरे लकीरें में उभरा । इन लकीरों SOX10 व्यक्त(चित्रा 2B,तीर) । पहले यह दिखाया गया था कि एनसीसी चरण में SOX10 सेल सतह मार्कर CD49D23,,26 के साथ संबंधित है और इस प्रकार CD49D का उपयोग एनसी कोशिकाओं को सॉक्स 10 लोकस से किसी फ्लोरोफोर की रिपोर्ट नहीं करने के लिए किया जा सकता है। चित्रा 2C समय के साथ एनसीसी मार्कर जीन की अभिव्यक्ति को दर्शाता है। चित्रा 2डी इंगित करता है कि हमारी भेदभाव दक्षता 80% से ऊपर थी। शेष कोशिकाओं की पहचान निर्धारित करने के लिए, क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग सेल प्रकारों को दूषित करने के लिए परीक्षण करने के लिए किया गया था, जिसमें ब्रायट-एक्सप्रेसिंग मेसोडरम, SOX17-व्यक्त एंडोडेम, और पैक्स6-व्यक्त न्यूरोएक्टोडर्म शामिल हैं; सभी बहुत निम्न स्तर पर अनुपस्थित या व्यक्त किए गए पाए गए (आंकड़े नहीं दिखाए गए; सभी प्राइमर के लिए अनुपूरक तालिका 1 देखें)। हालांकि, कुछ SIX1/EYA1+ प्लाकोड का पता चला (डेटा नहीं दिखाया गया) जो शेष सेल प्रकारों का स्रोत हो सकता है । इसके अतिरिक्त, यह संभव है कि शेष सेल प्रकार एनसीसी डेरिवेटिव हैं जो पहले से ही आगे विभेदित हैं। एनसीसी के HOX कोड का आकलन इस स्तर पर किया गया था(चित्रा 2E)। हालांकि, इस प्रारंभिक चरण में HOX संकेत बहुत कम थे (पैमाने पर ध्यान दें), सुझाव है कि इन NCCs या तो कपाल-नेकां चरित्र के थे या किसी भी एनसीसी उपप्रकार चरित्र अभी तक नहीं अपनाया था ।

10 दिन एनसीसीएस को FACS का उपयोग करके शुद्ध किया जा सकता है, जो लगभग 80% सीडी49डी+ एनसीसी(चित्रा 2डी)का परिणाम है। एक विशिष्ट गेटिंग रणनीति का एक उदाहरण चित्र 2Dमें इंगित किया गया है। छंटाई के बाद, कोशिकाओं को एनसी स्फेरॉइड(चित्रा 3ए)के रूप में एकत्रित किया गया था। एनसीसी का विस्तार करने और ट्रंक-एनसी जैसी संपत्तियों को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं को एफजीएफ 2 और चिर के संयोजन के साथ इलाज किया गया था। हम अगर CD49D+ आबादी के लिए छंटाई का परीक्षण किया बेहतर या symNs के शुद्ध संस्कृतियों पर बाद में मिले । चित्रा 3B C49D+ हल बनाम CD49D- हल सेल आबादी बनाम बिना किसी क्रमबद्ध की तुलना करता है। बाईं ओर, यह देखा जा सकता है कि सकारात्मक हल और अक्रमित आबादी ने इसी तरह के फैशन में नेकां स्फेरॉइड बनाया, जबकि नकारात्मक हल की कोशिकाओं ने ठीक से कुल नहीं किया, गोल, चिकनी, स्वस्थ दिखने वाले स्फेरॉइड नहीं बनाए और 3-4 दिनों के भीतर मर गए। इसके अलावा, जब नेकां के लिए क्यूआरटी-पीसीआर के माध्यम से 14 दिन में नेकां और साइर्न जनक मार्कर के लिए नेकां स्फेरॉइड की तुलना की गई, तो हल और अनसॉर्ट कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण अंतर का पता नहीं लगाया जा सका । काफ़ी, इस बिंदु पर सहानुभूति जनक मार्कर की अभिव्यक्ति अभी भी कम थी और SOX10 का स्तर उच्च बना रहा, यह सुझाव देते हुए कि स्फेरॉइड अभी भी नेकां गुणों वाली कोशिकाओं से बने थे। चढ़ाना के एक दिन बाद (दिन 15), दोनों अनसॉर्ट्ड और CD49D+ स्फेरॉइड पीओ/एलएम/एफएन व्यंजनों से अच्छी तरह से जुड़े और न्यूराइट आउटग्रोथ को स्पष्ट रूप से मनाया जा सकता है(चित्रा 3B,D15 और चित्रा 3C,D29) । अक्रमित और हल की गई संस्कृतियों को समानांतर में ३५ दिन तक आगे ले जाया गया, लेकिन कोई बड़ा अंतर नहीं देखा गया (डेटा नहीं दिखाया गया) । इस प्रकार, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि सीपीएन की पीढ़ी के लिए छंटाई कदम आवश्यक नहीं था, और इसलिए यह इस प्रोटोकॉल में एक वैकल्पिक कदम है। हालांकि, कम कुशल भेदभाव के लिए जो 80% सीडी49डी+ कोशिकाओं को नहीं देते हैं, हम छंटाई प्रक्रिया की सलाह देते हैं।

इसके बाद, हमने परीक्षण किया कि क्या इन एनसी स्फेरॉइड को अपनी नेकां पहचान(चित्रा 3A,विकल्प 2) खोने के बिना बनाए रखा जा सकता है। एनसीसी को 2 सप्ताह तक के लिए स्फेरॉइड के रूप में सुसंस्कृत किया गया था(चित्रा 3C)। 29 दिन पर दिन 28 स्फेरॉइड और प्लेटेड कोशिकाओं की आकृति विज्ञान समान थी जब विकल्प 1 में दिन 14 और 15 कोशिकाओं की तुलना में। 28 दिन, SOX10 अभिव्यक्ति 14 दिन के रूप में इसी तरह के स्तर पर बनाए रखा गया था । हालांकि, जल्दी सहानुभूति जनक मार्कर (यानी, ASCL1, PHOX2B, और GATA3) की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई(चित्रा 3C,सही), सुझाव है कि FGF2, WNT, और आरए संकेत में विस्तारित संस्कृति परिपक्वता और पीछे की रण्यता के लिए नेतृत्व किया(चित्रा 4C और एफ)। इसी तरह के प्रभाव पहले किरिनो एट अल21द्वारा सूचित किए गए थे ।

नेकां विस्तार (विकल्प 1 या विकल्प 2) के बाद, स्फेरॉइड पीओ/एलएम/एफएन कोटेड व्यंजनों पर चढ़ाया गया और सिमिन्स(चित्रा 4A)को परिपक्व करने के लिए कई तंत्रिका कारकों के साथ आपूर्ति की गई । 20 और 35 दिन (विकल्प 1 और 2 में चढ़ाना के बाद क्रमशः 1 सप्ताह) पर, न्यूराइट्स संलग्न स्फेरॉइड(चित्र4A,दाएं) से विस्तारित रेडियल पैटर्न में मनाया गया। इसके अलावा, नोरेपिनेफ्रीन (NE) संश्लेषण और परिवहन (यानी, TH, AAAD, DBH) से संबंधित मार्कर व्यक्त किए गए(चित्रा 4B)। यहां फिर से दूषित कोशिका प्रकारों की उपस्थिति की जांच की गई, और चाट की अभिव्यक्ति, जो परानुभूति न्यूरॉन्स को इंगित कर सकती है, पाया गया(चित्र4B,ई)। हालांकि, ChAT कोलिनेर्गिक सिनेमें भी व्यक्त किया जाता है। वीआईपी के बहुत कम स्तर, एक और परानुभूति मार्कर, पता लगाया गया (डेटा नहीं दिखाया गया) । इसके अलावा, BRN3A, ISL1, और RUNX1 के निम्न स्तर का पता लगाया गया(चित्रा 4B,ई),जो या तो संवेदी न्यूरॉन्स या ट्राइजेमिनल न्यूरॉन्स, यानी प्लेकोड के डेरिवेटिव का संकेत दे सकता है । न्यूनतम EDNRB (अंकन आंत्र न्यूरॉन्स) और ओलिजी 2 (मोटरन्यूरॉन्स अंकन) का पता लगाया गया (डेटा नहीं दिखाया गया)। गैर-न्यूरोनल कोशिकाओं की पहचान अस्पष्ट बनी हुई है। हालांकि, हमारे पिछले सिम्न प्रोटोकॉल23के परिणामों के आधार पर, वे सबसे अधिक संभावना αSMA+ myofibroblasts थे । HOX जीन की अभिव्यक्ति की फिर से जांच की गई, और यह पाया गया कि HOX5-9 व्यक्त किए गए थे, एक ट्रंक पहचान का सुझाव । HOX10 (पवित्र-नेकां का संकेत) व्यक्त नहीं किया गया था(चित्र4C, एफ)। अंत में, निकोटीनिक एसीटाइलकोलिन रिसेप्टर (CHRNA3/4) और एड्रेनेर्जिक रिसेप्टर्स (ADRA2A/B2) NE ट्रांसपोर्टर (नेट, SCL6A2), और वेसिकल ट्रांसपोर्टर (VMAT1) सहित परिपक्व मार्कर, व्यक्त किए गए(चित्र4D,जी)। विकल्प 1(चित्रा 4ई-जी)की तुलना में विकल्प 2 के साथ प्राप्त कोशिकाओं में इन जीन की अभिव्यक्ति में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया।

हमने आगे H9-PHOX2B: GFP रिपोर्टर लाइन(चित्रा 5)पर इस प्रोटोकॉल प्रदर्शन करके हमारे परिणामों की पुष्टि की । 20 दिन तक, कोशिकाओं ने न्यूरॉन्स का एक घना लॉन बनाया और यहां तक कि उच्च घनत्व के समूहों में एकत्रित किया, जो एक बहुत ही उच्च भेदभाव दक्षता(चित्रा 5A,शीर्ष पंक्ति) का संकेत देता है। धुंधला दिखाया है कि उन समूहों में सबसे सिंन झुरमुट है, जो मूल्यांकन और समग्र भेदभाव दक्षता के मात्राकरण मुश्किल बना दिया । विशिष्ट सिमन मार्कर के धुंधला और colocalization को उजागर करने के लिए, हमने समूहों के बाहरी इलाके में कम घने क्षेत्रों पर ध्यान केंद्रित किया (चित्रा 5Aमें पीला बॉक्स देखें, सही)। यह भी था जहां सबसे दूषित कोशिकाओं स्थित थे, तो यह एक अच्छा क्षेत्र के लिए समग्र दक्षता ंयायाधीश नहीं था । बहरहाल, ठेठ सिएम्न मार्कर; परिधीय (पीआरपीएच), एएससीएल1, टीएच, PHOX2B, TUJ1 (पैन न्यूरोनल), डीबीएच और NET1 (सिमन निकायों और एक्सॉन, चित्र5A,नीचे) के साथ डॉट्स में व्यक्त) शामिल हैं; पता चला। विद्युत गतिविधि को मापने के लिए एक मल्टीइलेक्ट्रोड सरणी (विदेश पक्ष) दृष्टिकोण नियोजित किया गया था, और यह पाया गया कि दिन 20 सिमन ने अविभेदित एचपीएससी(चित्रा 5B)के नकारात्मक नियंत्रण की तुलना में प्रति सेकंड लगभग 3-5 स्पाइक्स पर गोली चलाई। यह महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को समान रूप से अच्छी तरह से अच्छी तरह से वितरित किया जाए ताकि प्रत्येक इलेक्ट्रोड (चित्रा 5Bमें काले बिंदुओं, उज्ज्वल क्षेत्र) को ठीक से रिकॉर्ड किया जा सके। दिन 20 से दिन 30 सिंन भी 1 μM निकोटीन के साथ उत्तेजित किया गया, जो वीवो में symns के preganglionic संकेत की नकल और कोशिकाओं में मतलब गोलीबारी दर में वृद्धि हुई । न्यूरॉन्स के निषेध को भी मापा गया था। सिएमएन एक्सॉन टर्मिनलों पर स्थित एड्रेनेर्गिक रिसेप्टर (एडीआरबी2) एनई स्राव29के लिए एक सकारात्मक प्रतिक्रिया लूप बनाता है। 1 μM प्रोप्रानोल (एक 2-एड्रेनेर्गिक रिसेप्टर विरोधी) के साथ सिंन का इलाज उनकी गतिविधि को बाधित(चित्रा 5C,सही)। इन परिणामों से पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल द्वारा उत्पन्न सिमेंस कार्यात्मक रूप से सक्रिय थे।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध चित्रण और सिम्न भेदभाव प्रोटोकॉल की तुलना। (A)Zeltner एट अल23द्वारा पिछले प्रोटोकॉल । (ख)अनुकूलित प्रोटोकॉल। विकल्प 1 20 दिन लंबा है और इसमें एनसी स्फेरॉइड कल्चर के केवल 4 दिन शामिल हैं। विकल्प 2 35 दिन लंबा है और इसमें 2 सप्ताह का एनसी स्फेरॉइड विस्तार चरण होता है जो अधिक एनसी कोशिकाओं के उत्पादन की अनुमति देता है। VTN = vitronectin, पीओ = पाली-एल-ornithine, एलएम = laminin, FN = fibronectin, एसबी = एसबी 431542, चिर = चिर 99021, आरए = रेटिनोइक एसिड, एए = एस्कोक एसिड, एनएफएस = एनजीएफ + BDNF + GDNF। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: नेकां प्रेरण। (A)0 दिन से 10 दिन तक नेकां इंडक्शन के लिए टाइमलाइन और उपचार । (ख)ब्राइट फील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा हर 2 दिन में एनसी लकीरों के आकृति विज्ञान और गठन की निगरानी की जाती थी । 2 दिन के बाद हर समय बिंदु पर कोशिकाओं को सह AP2A (लाल) और SOX10 (हरे रंग) के लिए दाग थे । सभी इम्यूनोफ्लोरेसेंस चित्रों को डीपीआई के साथ प्रतिदागित किया गया था। लाल तीर लकीरें की संरचनाओं का संकेत देते हैं। (ग)2-10 दिन से एनसी मार्कर की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण। (D)CD49D+ नेकां आबादी (बाएं) के लिए 10 दिन पर छंटाई FACS के प्रतिनिधि साजिश । पहले चार भूखंडों में एक विशिष्ट गेटिंग रणनीति और आइसोटाइप नियंत्रण दर्शाया गया है। 10 दिन पर CD49D+ सेल प्रतिशत का परिमाणीकरण भी किया गया था। (ई)2-10 दिन से HOX जीन की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण। नेकां = तंत्रिका शिखर। त्रुटि सलाखों n के डेटा से स्टेम 3 जैविक दोहराता है, स्वतंत्र भेदभाव पीएससी संस्कृतियों से अलग दिनों पर किया प्रयोगों के रूप में परिभाषित किया है कि कम से एक अलग अलग थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: तंत्रिका शिखर रखरखाव और विस्तार। (A)विकल्प 2 के लिए विकल्प 1 या दिन 10 से दिन 28 संस्कृति के लिए 10 दिन 14 संस्कृति के दौरान नेकां विस्तार के लिए समयरेखा और उपचार । (ख)नेकां स्फेरॉइड गठन की निगरानी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा 11 दिन (स्फेरॉइड गठन के 1 दिन बाद 14 दिन (यानी चढ़ाना के दिन) से की गई थी । अक्रमित, सीडी49डी+और सीडी49डी- आबादी की तुलना की गई। 15 दिन चढ़ाया कोशिकाओं को भी दिखाया गया है। कोशिकाएं CD49D- समूह में ठीक से स्फेरॉइड बनाने में विफल रही और चढ़ाना के बाद मृत्यु हो गई। दिन 14 कोशिकाओं की जांच क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण (दाएं) द्वारा साइएमएन जनकों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए की गई थी । अक्रमित और सीडी49डी+ आबादी की तुलना (एन ♫ 3) की तुलना की गई थी। (ग)नेकां स्फेरॉइड को 2 सप्ताह तक बनाए रखा जा सकता है। स्फेरॉइड की निगरानी 15 दिन से 28 दिन (लैंडिंग के दिन) तक ब्राइट फील्ड माइक्रोस्कोपी से की गई थी । 29 दिन चढ़ाया कोशिकाओं को भी दिखाया गया है। दिन 28 स्फेरॉइड की जांच क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण द्वारा साइटर्न प्रोजेनिटर्स (दाएं) की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के लिए की गई। अक्रमित और सीडी49डी+ आबादी को पूल किया गया (एन ♫ 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: SymN भेदभाव और परिपक्वता। (A)विकल्प 2 के लिए विकल्प 1 या 28 दिन के लिए 14 दिन चढ़ाना के बाद टाइमलाइन और उपचार । ब्राइट फ़ील्ड माइक्रोस्कोपी तस्वीरें (दाएं) क्रमशः 20 दिन और 35 दिन पर सिमेंस दिखाती हैं (दोनों विकल्पों के लिए चढ़ाना के 1 सप्ताह बाद)। (B-D) 20-30 दिनों के बीच साइएमएन गुणों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए विकल्प 1 क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण। अक्रमित और सीडी49डी+ आबादी को पूल किया गया था। (-जी) विकल्प 2 क्यूआरटी-पीसीआर विश्लेषण दिन 35 के बाद साइएमएन गुणों की अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल के लिए। अक्रमित और सीडी49डी+ आबादी को पूल किया गया (एन ♫ 3)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: सिमिन्स का कार्यात्मक लक्षण वर्णन। (ए,शीर्ष पंक्ति) 20 दिन में साइएमएन समूहों की उज्ज्वल क्षेत्र छवि और दाग छवि पीआरपीएच और टीएच डबल सकारात्मक कोशिकाओं को दिखा रहा है जो ज्यादातर समूहों में स्थित है। (ए,नीचे) 20 दिन पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला द्वारा कई सिमन मार्कर (अलग चैनल) सत्यापित किए गए थे। नोरेपिनेफ्रीन ट्रांसपोर्टर (NET1) सेल निकायों की सतह के साथ-साथ एक्सॉन और डैंडराइट्स दोनों पर स्थित था। यह इस आवर्धन पर डॉट्स के रूप में दिखाया । सभी इम्यूनोफ्लोरेसेंस चित्रों को डीपीआई के साथ प्रतिदागित किया गया था। (ख)20 दिन (शीर्ष) पर साइमेंस के लिए मल्टीइलेक्ट्रोड ऐरे (एमईए) विश्लेषण के प्रतिनिधि हीटमैप्स । उज्ज्वल क्षेत्र चित्र (नीचे) symns के घनत्व और इलेक्ट्रोड (आठ काले डॉट्स) के वितरण से पता चलता है । यहां अनसॉर्ट और सीडी49डी+ आबादी जमा की गई थी। (C)1 माइक्रोन निकोटीन के उपचार के तहत 20-30 सिंपों के लिए औसत गोलीबारी दरों का परिमाणीकरण और 5 मिन के लिए 1 μM प्रोप्रानोल, क्रमशः (दाएं) । अक्रमित और सीडी49डी-सकारात्मक आबादी के परिणाम ों को पूल किया गया (एन ♫ 3)। वेल्च के सुधार, पी-वैल्यू: *<0.05 के साथ अनपेयर, दो पूंछ वाला टी-टेस्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: उन स्थितियों के तहत कोशिकाओं का उदाहरण जो भेदभाव के साथ आगे बढ़ने के लिए अनुपयुक्त हैं। (A) बी- ई में दर्शाई गई कोशिका मॉर्फोलोज के लिए प्रत्येक चेक पॉइंट के साथ भेदभावकीटाइमलाइन । (ख)स्वस्थ उपनिवेशों और बहुत सारी विभेदित कोशिकाओं के साथ एचसीपीएससी (क) और (ख) ने 0 दिन कुछ उपनिवेशों के बीच सीमाओं का विलय और विभेदित किया । लाल तीर विलय क्षेत्रों का संकेत देते हैं। (ग)एनसीसी दिन 10 में लकीरें में बुलबुले की तरह छाले के साथ । लाल तीर शीर्ष पंक्ति में छाले का संकेत देते हैं। नीचे पंक्ति एक उच्च आवर्धन का प्रतिनिधित्व करता है। हम फफोले की कोशिका पहचान नहीं कर पाए हैं। हालांकि, अधिक छाले की उपस्थिति कम SOX10/CD49D अभिव्यक्ति के साथ सहसंबंधित लगता है । (घ)14 दिन में चिकनी किनारों और गोल आकार की कमी अनियमित दिखने वाले स्फेरॉइड। (ई)20 दिन अस्वस्थ और मरने वाले symNs । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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हमने हाल ही में दो समीक्षाएं प्रकाशित की हैं, जिनमें से एक रोग मॉडलिंग31 के लिए एचपीएससी-व्युत्पन्न सिमन के उपयोग के साथ-साथ उपलब्ध विभेदन प्रोटोकॉल22की गहराई से तुलना करने पर चर्चा कर रहा है । इस प्रकार, यहां हम वर्तमान प्रोटोकॉल की समस्या निवारण पर ध्यान केंद्रित करने में मदद करने के इच्छुक शोधकर्ता symNs बनाने में सफल । संपूर्ण विभेदन प्रक्रिया के दौरान, लगातार डेटा के साथ-साथ स्वस्थ विभेदित कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, सभी चरणों में संदूषण को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। नियमित एचपीएससी रखरखाव में, माइकोप्लाज्मा परीक्षण द्विसाप्ताहिक या मासिक किया जाना चाहिए। यदि सेल छंटाई 10 दिन पर किया जाता है, किसी भी माध्यम के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा अत्यधिक प्रोत्साहित किया जाता है । विभेदन शुरू करने से पहले और बाद में सेल आकृति विज्ञान की जांच करना भी महत्वपूर्ण है। यहां, हम कई महत्वपूर्ण चेक पॉइंट(चित्रा 6A)का सुझाव देते हैं। सबसे पहले, भेदभाव के लिए तैयार आदर्श एचपीएससी उपनिवेशों में छोटे स्पाइक्स के साथ उज्ज्वल और चिकनी किनारों होने चाहिए। गियर की तरह स्पाइक्स के साथ कालोनियों में अंतर शुरू कर दिया है और इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए । यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि सही समय बिंदु पर कोशिकाओं का तुरंत उपयोग किया जाना चाहिए, क्योंकि आकृति विज्ञान घंटों के भीतर बदल सकता है। सिर्फ एक दिन के लिए स्थगित कोशिकाओं(चित्रा 6बी, एक)या कालोनियों के बीच संपर्क करने के लिए नेतृत्व(चित्रा 6B, बी),जो hPSCs में भेदभाव को उत्तेजित करता है दुर्घटना हो सकती है । संस्कृति में हर विभेदित सेल से छुटकारा पाना चुनौतीपूर्ण है, फिर भी आबादी को नियंत्रित किया जाना चाहिए ताकि 5% से कम खराब कॉलोनियों को नियंत्रित किया जा सके । इस प्रोटोकॉल का पालन करते समय, भेदभाव के दौरान दूसरा चेक पॉइंट दिन 2 और दिन 10 के बीच होता है। इस स्तर पर, डार्क एनसी लकीरें स्पष्ट रूप से एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप(चित्रा 2C)के तहत मनाया जाना चाहिए । लकीरें की मोटाई और वितरण का उपयोग नेकां दक्षता के संकेतकों के रूप में किया जा सकता है: क्योंकि एनसीसी मुख्य रूप से कोशिकाओं से प्राप्त होती है जो लकीरें, पतली या कम व्यापक लकीरें और लकीरें में छाले कम एनसी उत्पादन का संकेत दे सकती हैं, और इसलिए असंगत परिणामों के मामले में चिह्नित या त्याग दिया जाना चाहिए(चित्रा 6 सी)। ऊपर वर्णित एनसी मार्कर की जांच करने के लिए 10 दिन आरएनए नमूना अत्यधिक अनुशंसित है। तीसरी चौकी नेकां स्फेरॉइड चरण के दौरान है, क्योंकि स्फेरॉइड एकत्र हो सकते हैं। एकत्रीकरण को तोड़ने और फिर से निलंबित करने के लिए समय-समय पर माध्यम को पाइप करना सबसे अच्छा है (कोशिकाओं को एकल कोशिकाओं में वापस नहीं बल्कि केवल छोटे स्फेरॉइड को फैलाया जाएगा)। यदि स्फेरॉइड बहुत जल्दी विस्तार करते हैं, तो कोशिकाओं को बढ़ने के लिए पर्याप्त स्थान और पोषक तत्वों को छोड़ने के लिए उन्हें 1:2 या 1:4 से विभाजित करें। यदि स्फेरॉइड में चिकनी और गोल आकार नहीं है(चित्रा 6D),तो यह इंगित कर सकता है कि 10 दिन में नेकां दक्षता पर्याप्त उच्च नहीं थी, और इस प्रकार अंतिम भेदभाव को बर्बाद कर सकती है। सिएमएन प्रोजेनिटर गुणों की जांच करने के लिए अभिव्यक्ति प्रोफाइल का परीक्षण वांछित स्फेरॉइड चढ़ाना दिन पर अनुशंसित है। चौथी चौकी स्फेरॉइड चढ़ाना के बाद है । न्यूराइट्स स्पष्ट रूप से दिखाई देने चाहिए और बंडलों को 20 दिन के बाद बनाना शुरू कर देना चाहिए। व्यापक न्यूराइट्स और बंडलों के बिना कोशिकाओं को संदूषण(चित्र 6E)माना जाना चाहिए। इस बिंदु पर, स्थिर न्यूरॉन्स द्वारा बनाए गए पौष्टिक वातावरण को बनाए रखने के लिए मौजूदा माध्यम के केवल आधे हिस्से को बदलकर न्यूरॉन्स को खिलाना महत्वपूर्ण है। कोशिकाओं को खिलाते समय सावधान रहें, क्योंकि परिपक्व स्याम कमजोर होते हैं और आसानी से अलग हो सकते हैं। यहां वर्णित प्रत्येक खराब दिखने वाली मॉर्फोलोज का कारण अभी तक पूरी तरह से समझ में नहीं आ रहा है। हालांकि, यह एचपीएससी की संवेदनशील प्रकृति और इन विट्रो भेदभाव के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। ऐसी अनियमितताओं का एक स्रोत विभिन्न विक्रेताओं के अभिकर्मकों के कारण हो सकता है। उदाहरण के लिए, BMP4 के एक अलग ब्रांड का उपयोग करते समय छाले के साथ पतली लकीरें दिखाई देते हैं।

विदेश मंत्री दल का उपयोग करके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल विश्लेषण के लिए, इलेक्ट्रोड कुओं में समान रूप से सिंन वितरित करने के लिए, स्फेरॉइड को Accutase द्वारा विसोसिएट किया जाता है। इलाज का समय शुरू करने के लिए 20 मिन होना चाहिए। हालांकि, क्योंकि स्फेरॉइड अत्यधिक कॉम्पैक्ट होते हैं, इसलिए विसोशन के समय को 45 मिन तक बढ़ाया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि स्फेरॉइड पूरी तरह से विरक्त हैं। सामान्य तौर पर, विदेश सरकार की प्लेट पर प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह को लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए कम से कम छह के गुणकों में चलाने की आवश्यकता होती है। विशेष रूप से, क्योंकि रीप्लेटिंग के लिए हमारा घनत्व निर्माता की सिफारिशों32 (लगभग 500-700,000/सेमी2)की तुलना में बहुत कम है, अच्छी तरह से दोहराता है महत्वपूर्ण हैं। हमारे परिणामों में, दोनों पर्याप्त symN मार्कर अभिव्यक्ति और स्थिर गतिविधि दिन 20 से 30 दिन तक दिखाई देते हैं । हम पसंद के चर रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए सबसे अच्छा समय बिंदु के रूप में इसकी सलाह देते हैं। प्रत्येक भेदभाव के लिए, माध्यम को ताजा किया जाना चाहिए और जितनी जल्दी हो सके उपयोग किया जाना चाहिए (अब एक महीने से अधिक नहीं)।

यहां प्रस्तुत साइएमएन विभेदन प्रोटोकॉल फीडर-फ्री, रासायनिक रूप से परिभाषित, कुशल, विस्तारयोग्य और 20 दिन तक कार्यात्मक सिजन पैदावार है। इस परिभाषित सिम्न विभेदन प्रोटोकॉल का उपयोग सहानुभूति तंत्रिका तंत्र के मानव विकारों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, दवा स्क्रीनिंग के लिए एक मंच के रूप में, न्यूरोब्लास्टोमा/फेओक्रोमोसाइटोमा जैसे ट्यूमरिजेनेसिस अध्ययनों के लिए, या होमोस्टैटिक विनियमन में बुनियादी अनुसंधान के लिए ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने और संपादन के लिए हीदी उल्रिच का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

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References

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फीडर-मुक्त और रासायनिक रूप से परिभाषित संस्कृति स्थितियों के तहत मानव Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग करपोस्टाग्लियन सहानुभूति न्यूरॉन्स के कुशल भेदभाव
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Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

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