Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Effektiv differensiering av postganglioniske sympatiske nevroner ved hjelp av humane pluripotente stamceller under materfrie og kjemisk definerte kulturforhold

doi: 10.3791/60843 Published: May 24, 2020

Summary

I denne protokollen beskriver vi en stabil, svært effektiv differensieringsstrategi for generering av postganglioniske sympatiske nevroner fra humane pluripotente stamceller. Denne modellen vil gjøre nevroner tilgjengelig ei bruk av studier av flere autonome lidelser.

Abstract

Humane pluripotente stamceller (hPSCer) har blitt et kraftig verktøy for sykdomsmodellering og studiet av menneskelig embryonisk utvikling in vitro. Vi har tidligere presentert en differensieringsprotokoll for avledning av autonome nevroner med sympatisk karakter som har blitt brukt på pasienter med autonom nevropati. Protokollen ble imidlertid bygget på Knock Out Serum Replacement (KSR) og materbaserte kulturforhold, og for å sikre høy differensieringseffektivitet var cellesortering nødvendig. Disse faktorene forårsaker høy variasjon, høye kostnader og lav reproduserbarhet. Videre har modne sympatiske egenskaper, inkludert elektrisk aktivitet, ikke blitt verifisert. Her presenterer vi en optimalisert protokoll der PSC-kultur og differensiering utføres i materfrie og kjemisk definerte kulturforhold. Genetiske markører som identifiserer trunk neural crest er identifisert. Ytterligere differensiering til postganglioniske sympatiske nevroner oppnås etter 20 dager uten behov for cellesortering. Elektrofysiologisk opptak viser videre funksjonell nevron identitet. Avfyring oppdaget fra våre differensierte nevroner kan forbedres av nikotin og undertrykkes av adrenerge reseptorantagonist propranolol. Mellomliggende sympatiske nevrale stamfarer i denne protokollen kan opprettholdes som nevrale spheroider i opptil 2 uker, noe som gjør det mulig å utvide kulturene. I sum viser vår oppdaterte sympatiske nevrondifferensieringsprotokoll høy differensieringseffektivitet, bedre reproduserbarhet, mer fleksibilitet og bedre neural modning sammenlignet med den forrige versjonen. Denne protokollen vil gi forskere cellene som er nødvendige for å studere menneskelige lidelser som påvirker det autonome nervesystemet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Postganglionic sympatiske nevroner (symNer) tilhører det autonome nervesystemet (ANS) og har flere viktige roller i å svare og regulere homeostase av kroppen uavhengig av bevissthet. For eksempel stimulerer stress symNer og fremkaller kamp-eller-fly respons som fører til en økning i hjertefrekvens, blodtrykk og svette. SymNer påvirkes i flere menneskelige lidelser på grunn av genetikk, toksisitet/skade, eller som følgesvenner til andre sykdommer. Et eksempel på en genetisk nevropati er barndomsforstyrrelsen Familiær dysautonomi (FD), hvor en alvorlig dysregulering av symNer forårsaker dysautonom krise, tydelig ved svette, flekking av huden, oppkast angrep, hypertensjon og angst1. Et eksempel på toksisitet er kjemoterapi behandling, som er rapportert å ha toksiske bivirkninger på autonome nevroner2. Det er kjent at autonom denervation og hyper-inervation kan både føre til, eller følge, sykdommer som Parkinsons sykdom eller hypertensiv nyresykdom3,4. Dermed er det gunstig å kunne drive forskning og forstå mekanismene til symNbiologi og defekter i sammenheng med sykdom for søken etter nye og effektive behandlinger.

Anatomi
Det perifere nervesystemet grener inn sensoriske og autonome divisjoner. De afferent nervene i sensorisk nervesystemet er ansvarlige for følelse av smerte og berøring, mens ANS er ansvarlig for å videresende informasjon fra alle organer til hjernen. ANS er delt inn i det enteriske nervesystemet, innervating mage-tarmkanalen, det parasympatiske nervesystemet, som er viktig for avslapning, og det sympatiske nervesystemet (SNS), som er viktig for aktivering / regulering av organer. SNS tilpasser et to-neuron system5. Preganglionic sympatiske nevrale aksoner i ryggmargen første prosjektet til sympatiske ganglia, hvor postganglionic symN celleorganer er plassert. Disse nevronene sender deretter lange projeksjoner for å innervate målet vev av hvert organ i kroppen. Signaler som overføres av preganglionic nevroner er kolinerge, mens postganglionic symNer er adrenerge og dermed uttrykke noradrenalin (NE) som deres viktigste nevrotransmitter. Det er få bemerkelsesverdige unntak av postganglionic, sympatiske nevroner som er kolinerge, inkludert de som innerver blodkar. Adrenerge postganglionic nevroner uttrykke enzymer tyrosin hydroksylase (TH), aromatisk L-aminosyre decarboxylase (AAAD), dopamin β-hydroksylase (DBH), og monoamin oksidase (MAO-A), alle ansvarlig for å generere og metabolisere NE. Videre uttrykker de NE resirkulering transportører og / eller reseptorer α-adrenerge reseptor (ADRA2), β-adrenerge reseptor (ADR2B), noradrenalin transportør (NET1), og vesikulær monoamin transportør (VMAT1/2).

Utvikling
Under embryonalutvikling symNer er avledet fra neural crest (NC), som oppstår mellom nevrale røret og overlegge ectoderm6, og kan differensiere i flere cellelinjer, inkludert melanocytter, osteoblaster, adipocytter, glia, enteriske nevroner, sensoriske nevroner, og autonome nevroner7. Neural crest celler (NCCer) er svært trekkfugler celler som tar flere ruter gjennom embryoet. På dette tidlige stadiet av NC utvikling, cellene uttrykke markørene SNAIL1/2, FOXD3, og SOX108,9,10,11. Migrasjonsruten sammen med aksialplasseringen de vedtar bestemmer NC-undertypen de vil utvikle. Disse NC-undertypene kan skilles ut av deres spesifikke HOX-genuttrykk: Kraniale NCCer uttrykker ikke HOX-gener, vagal NCCer uttrykker HOX 1–5, trunk NCCer uttrykker HOX 6–9, og sakrale NCCer uttrykker HOX 10–1112. Blant dem er trunk NCCer anerkjent som den viktigste kilden til symNer. SymN-forløpere uttrykker transkripsjonsfaktoren MASH1/ASCL113, som fremmer uttrykk for PHOX2B14 og INSM115. GATA-familien av transkripsjonsfaktorer uttrykkes under sen sympatisk utvikling. GATA2 og GATA3 uttrykkes i symNene, som igjen aktiverer DBH16. Transkripsjonsfaktoren HAND2 er også viktig for uttrykk og vedlikehold av DBH og TH17.

HPSCer (f.eks. embryonale og induserte pluripotente stamceller) er et kraftig verktøy18 for å rekapitulere utviklingsparadigmer og generere symNer som deretter kan brukes til sykdomsmodellering av ulike menneskelige lidelser. Dermed, mens du genererer symNer fra hPSCer, er det avgjørende å følge utviklingsretningslinjer og vurdere uttrykk for passende markører langs differensieringsprosessen.

Tidligere symN-protokoll
Få forskningsgrupper har tidligere rapportert generering av symNer fra hPSCs19,20,21. Den direkte sammenligningen av disse protokollene til hverandre og vår ble gjennomgått nylig22. I 201623publiserte vi en differensieringsprotokoll for generering av autonome nevroner med symN-karakter (figur 1A). Denne protokollen brukte KSR-basert medium, som ble brukt i både vedlikehold av udifferensierte hPSCer og celledifferensiering. Videre ble hPSCer opprettholdt på mus embryonale fibroblaster (MEF materceller). Vi brukte denne protokollen og PsCer fra pasienter med FD for å modellere lidelsen23. I 2019 beskrev vi en mer detaljert versjon av denne eldre protokollen24. Oppsummert, nevrale skjebnen ble indusert av dual SMAD hemming25 å blokkere TGF-β og BMP signalisering i de første 2 dagene. WNT-aktivering ved hjelp av CHIR99021 fremmet nevrale forfedre til å bli NC-celler. På dag 11 ble cellene sortert etter FACS for CD49D+ eller SOX10+ populasjoner26,23, som ga ca 40% NC generasjon effektivitet. Dermed var sortering nødvendig for å sikre effektivitet og renhet for de neste trinnene i differensiering. NcCs ble opprettholdt og forsterket som spheroids med kombinert behandling av FGF2 og CHIR. Etter 4 dager ble NC-spheroidene for vedlikehold belagt og gitt BDNF, GDNF og NGF for å fullføre symN-modningen. Selv om disse symN-merkene uttrykte sterke symN-markører som ASCL1, TH, DBH og PHOX2A, var markører for mer modne symNer, inkludert uttrykk for nikotinacetylkolinreseptoren (CHRNA3/CHRNB4) og vesikeltransportør (VMAT1/2), lav selv etter 70 dager med differensiering. HOX-gener i denne protokollen ble ikke formelt testet, og modne nevrale egenskaper, inkludert elektrofysiologisk aktivitet av cellene, ble ikke verifisert.

Her presenterer vi en optimalisert protokoll for å generere symNer (figur 1B). HPSCer vedlikeholdes i materfrie forhold, på vitronectin (VTN)-belagte retter, ved hjelp av Essential 8 (E8) media27. Formelen for differensieringsmediet er endret på hvert trinn, og dermed øke prosentandelen av NC-populasjonen28. SymN modning kan gjøres på CD49D+/SOX10+ sortert eller usortert bulk NCC populasjoner. Begge viser høye nivåer av symN markør uttrykk av dag 30. Videre er symNene som genereres med denne protokollen, responsiv til elektrofysiologisk opptak og behandlinger med symN-aktivator og inhibitorforbindelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: H9 PHOX2B: GFP reporterlinjen ble levert av Oh et al.19. Noen qPCR primere som brukes i dette papiret ble hentet fra OriGene Technologies, mens noen sekvenser er hentet fra Frith et al.20,30.

1. Oppsett for oppvaskbelegg, medieforberedelse og hPSC-vedlikehold

  1. Oppvaskbelegg
    1. Vitronectin (VTN) belegg
      1. Plasser hetteglassene med VTN i et 37 °C vannbad til de er helt tint, og bland deretter godt.
      2. For en 100 mm petriskål, bland 7 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS) med 0,5 mg/ml VTN, tilsett VTN-løsning på fatet og inkuber ved romtemperatur (RT) i 1 h.
    2. Kjeller membran matrise belegg
      1. Tin hetteglass med kjellermembranmatrise (se Materialbord) på is ved 4 °C over natten.
      2. For en brønn på en 6 brønnplate, bland 2 ml DMEM/F12 med 20 μL av 100x kjellermembranmatrise, tilsett matriseløsning for kjellermembran til parabolen, pakk fatet med parafinfilm og oppbevar i en ren beholder ved 4 °C over natten. Arbeid så raskt som mulig. Belagte retter kan lagres i 4 °C i opptil 2 uker.
    3. Polyornithin (PO)/laminin (LM)/fibronectin (FN) belegg
      1. På den første dagen, for en brønn av en 24 brønnplate, bland 15 μg / ml PO med 1 ml 1x PBS, inkuber ved 37 ° C, 5% CO2 over natten. Tin både LM og FN ved -20 °C over natten og oppbevar ved 4 °C til den er helt tint.
      2. På den andre dagen, aspirePO løsning, vask brønnene 2x med 1x PBS, tilsett 1 ml 1x PBS som inneholder 2 μg / ml LM og 2 μg / ml FN og inkuber ved 37 ° C i 5% CO2 over natten. På dette punktet kan parabolen med LM / FN-løsningen holdes i inkubatoren i flere måneder så lenge den ikke tørker ut. Tilsett mer 1x PBS for å hindre at parabolen tørker ut.
  2. Forberedelse av medier
    1. Forbered Essential 8 medium (E8) ved å tine en flaske E8-tilskudd ved 4 °C over natten. Bland tillegget med 500 ml E8 medium og antibiotika om nødvendig.
      MERK: Fungerende E8-løsning skal brukes opp innen 2 uker.
    2. Forbered hPSC frysemedium ved å blande 90 ml komplett E8 medium med 10 ml DMSO for et totalt volum på 100 ml. Filter sterilisere.
    3. Forbered dagen 0 til dag 1 differensieringsmedium ved å blande 100 ml essensiell 6 (E6) medium med 10 μM SB431542, 1 ng/ml BMP4, 300 nM CHIR99021 og 10 μM Y27632 for et samlet volum på 100 ml.
    4. Forbered dag 2 til dag 10 differensieringsmedium ved å blande 100 ml E6 medium med 10 μM SB og 0,75 μM CHIR99021 for et totalt volum på 100 ml.
    5. Forbered dagen 10 til dag 14 spheroid medium ved å blande neurobasal medium med 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 3 μM CHIR99021, og 10 ng / ml FGF2 for et totalt volum på 100 ml.
    6. Forbered dagen 14 til dag 28 medium for spheroid langsiktig vedlikehold ved å legge 0,5 μM frisk RA til dag 10 til dag 14 spheroid medium for hver fôring.
      MERK: Oppbevar alltid RA ved -80 °C.
    7. Forbered SymN modningsmediet ved å blande nevrobasalmedium med 2 ml B27 (50x), 1 ml N2 (100x), 2 mM L-glutamat, 25 ng/ml GDNF, 25 ng/ml BDNF, 25 ng/ml NGF, 200 μM askorbinsyre og 0,2 mM dbcAMP for totalt volum på 100 ml. Oppløsningen skal brukes innen 2 uker. Før hver fôring, tilsett 0,125 μM fersk RA. Denne løsningen brukes fra dag 14 (alternativ 1) eller dag 28 (alternativ 2).
    8. Forbered FACS-bufferen ved å blande DMEM med 2% FBS, 2 mM L-glutamat og antibiotika om nødvendig for et totalt volum på 100 ml.
  3. hPSC vedlikehold
    1. Tining og oppbevaring av hPSCer
      1. Forbered en VTN belagt 100 mm tallerken.
      2. For å tine et hetteglass med hPSCer direkte fra flytende nitrogen, legg hetteglasset i et 37 °C vannbad, og sving forsiktig røret i vannet til det tiner. Overfør tinte hPSCer til et 15 ml rør som inneholder 10 ml 1x PBS, og sentrifuge ved 200 x g i 4 min.
      3. Kast supernatanten og tilsett 1 ml E8-medium til røret. Pipette et par ganger for å fullstendig resuspendere pellet og deretter legge til en annen 9 ml E8 medium for å nå 10 ml totalt.
      4. Aspirer VTN-oppløsningen fra 100 mm parabolen.
      5. Overfør hPSCene til en 100 mm tallerken, rist forsiktig (opp ned og venstre-høyre, ikke i sirkler) for å sikre at cellene fordeles jevnt i parabolen
      6. Inkuber ved 37 °C, i 5 % CO2.
      7. Dagen etter, aspirere alle medium og mate med 10 ml E8.
      8. Mat på denne måten hver dag de neste 3–4 dagene, og gjør deg klar til å dele seg.
    2. Dele hPSCer
      MERK: HPSCer på splittingspunktet bør være 80%–90% konfluent. Store kolonier med glatte og lyse kanter bør observeres. Kontakt mellom hver koloni bør imidlertid unngås (Figur 2B, dag 0 og figur 6B).
      1. Forbered VTN-belagte 100 mm retter etter behov.
      2. Aspirer E8 og vask parabolen som må deles 1x med 1x PBS.
      3. Aspirer 1x PBS og tilsett 4 ml 0,25 M EDTA. Inkuber i 2 min ved 37 °C, 5 % CO2.
        MERK: HPSCene skal deles/omgis som små kolonier. Ikke behandle med EDTA lenger enn 2 min for å forhindre separasjon i enkeltceller. Cellene skal fortsatt festes til parabolflaten etter 2 min behandling.
      4. Aspirer EDTA, løsne koloniene ved sterkt piping 10 ml E8 medium på parabolen overflaten, og samle alle medium og celler i en 15 ml rør.
      5. Med hPSCer på 80% –90% samløpet, delte kolonier med 1:15-1:20. For eksempel, for å dele hPSCs med 1:20 i en 100 mm tallerken, ta 500 μL av E8 / hPSCs løsning og bland med 9,5 ml fersk E8 medium.
      6. Plate hPSCs i VTN-belagte 100 mm retter.
        MERK: Det anbefales å etablere det ideelle delingsforholdet for hver forsker og cellelinje uavhengig av hverandre.
    3. Frysing av hPSCer
      1. For en 100 mm tallerken med hPSCer som er klare til å deles, forberede tre kryovialer og 3,5 ml frysemedium.
        MERK: Medier og hetteglass bør oppbevares i 4 °C eller på is til bruk.
      2. Aspirer E8 og vask parabolen 2x med 1x PBS.
      3. Aspirer 1x PBS og tilsett 4 ml 0,25 M EDTA, inkuber i 2 min ved 37 °C, i 5 % CO2.
        MERK: hPSCer bør fryses som små kolonier på den tiden at de ville bli delt. Ikke behandle cellene med EDTA lenger enn 2 min for å forhindre separasjon i enkeltceller. Celler skal fortsatt festes på parabolens overflate etter 2 min behandling.
      4. Aspirer EDTA, løsne koloniene ved sterkt piping 10 ml 1x PBS på parabolens overflate, og samle alle medium og celler i et 50 ml rør.
      5. Tilsett 20 ml 1x PBS og sentrifuge ved 200 x g i 4 min for å vaske ut de resterende EDTA.
      6. Kast supernatanten og resuspend pelleten i 3 ml frysemedium.
      7. Fordel hPSCer jevnt inn i de tre kryovialene, 1 ml hver.
      8. Oppbevares ved -80 °C over natten i en kontrollert fryseboks eller en styrofoamsandwich for å sikre et sakte temperaturfall, og overfør deretter til en flytende nitrogentank for langtidslagring.

2. Seeding hPSCs å starte differensiering (dag 0)

MERK: HPSCer bør være klare for differensiering etter å ha blitt stabilisert (dvs. delt 2–3x etter tining). Pass på at koloniene er sunne, med glatte, skinnende kanter og minimal differensiering (Figur 2B).

  1. Forbered kjellermembranmatrisebelagte retter (24 brønn eller 6 brønnretter) en dag før dag 0 etter behov. Ta oppvasken til RT ved starten av differensiering.
  2. Gjør dagen 0–1 differensieringmedium etter behov.
  3. Aspirer E8 fra konfluent, klar til å dele hPCSs, og vaske parabolen 2x med 1x PBS.
  4. Tilsett 7 ml 0,25 M EDTA per 100 mm fat, inkuber ved 37 °C, 5 % CO2,i 15 min.
    MERK: På dette punktet er EDTA-behandling forlenget for å spre seg til enkeltceller.
  5. Rør av alle hPSCene (de skal flyte) og overføre til et 50 ml rør. Legg til samme mengde eller mer av 1x PBS som EDTA-løsning for å fortynne EDTA.
  6. Sentrifuge ved 200 x g i 4 min.
  7. Kast supernatanten, tilsett 1 ml dag 0–1 differensieringsmedium og pipforå homogenisere cellene. Følg med å legge til mer medium og bland deretter for å fortynne celleløsningen til et konsentrasjonsideal for å telle cellene.
    MERK: Ikke fortynn celleoppløsningen for mye. Celler fra en full 100 mm tallerken skal fortynnes i 5 ml medium for å starte.
  8. Tell cellenummeret ved hjelp av en automatisert celleteller eller hemocytometer.
  9. Fortynn celleoppløsningen etter behov for å nå 125 000 celler/cm2 i et lavt sluttvolum (f.eks. 2 ml per brønn for en 6 brønnrett eller 500 μL per brønn for en 24 brønnrett).
    MERK: Et lavt volum hjelper cellene med å feste seg raskere.
  10. Aspirer all kjellermembranmatriseløsningen fra de belagte rettene og plate celleløsningen inn i brønnene.
  11. Inkuber ved 37 °C, i 5 % CO2.

3. Neural crest celle induksjon (dag 1 til dag 10, figur 2A)

  1. På dag 1 mate cellene med dag 0-1 differensiering medium (3 ml per brønn for 6 brønnretter og 1 ml per brønn for 24 brønnretter).
  2. På dag 2 mate cellene med dag 2-dag 10 differensiering medium (3 ml per brønn for 6 brønnretter og 1 ml per brønn for 24 brønnretter).
  3. Fra nå av bør cellene mates annenhver dag til dag 10 (dvs. neste fôringsdag vil være dag 4).
    MERK: Fra dag 6 skal det påvises NC-rygger (Figur 2B). For å sjekke om differensiering finner sted, anbefales det å bære en parallell differensieringskultur i mindre brønner (dvs. 24 brønner), som kan være farget for SOX10/AP2a og brukes til markørgenuttrykk langs differensieringstidspunktet (figur 2B,C).
  4. Hvis sortering av celler, går du videre til avsnitt 4. Ellers går du videre til avsnitt 5.

4. Fluorescens aktivert cellesortering (FACS) for neural crest markør CD49D og aggregere NC-celler i spheroider

MERK: For FACS-sortering bør prøvene holdes på is og ikke utsettes for lys etter farging før sortering.

  1. Klargjør FACS-bufferen hvis cellene sorteres.
  2. Forbered dag 10–14 spheroid medium.
  3. På dag 10, fjern mediet, og vask 1x med 1x PBS.
  4. Tilsett dissosiasjonsløsning (se Materialtabellen) ved 2 ml per brønn for en 6 brønnrett eller 1 ml per brønn for en 24 brønnrett, og inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 20 min.
  5. Rør av alle hPSCer og overføre til en 50 ml rør.
  6. Fyll opp resten av røret med FACS buffer og sentrifuge ved 200 x g i 4 min.
    MERK: Hvert 50 ml rør har plass til opptil 20 ml eller mindre celleoppløsning. Volumet av FACS-bufferen skal være høyt nok til å nøytralisere dissosiasjonsløsningen.
  7. Kast supernatanten, resuspendcellene med riktig mengde FACS-buffer (~ 2 ml per brønn på en 6 brønnplate), og tell for å bestemme cellenummeret.
  8. Klargjør følgende eksempler.
    1. Eksempel 1 (ufarget kontroll): 1 x 106 celler i 400 μL FACS-buffer. Filtrer cellene gjennom en 20 μm silhette og hold røret på is.
    2. Eksempel 2 (KUN DAPI kontroll): 1 x 106 celler i 400 μL FACS-buffer som inneholder 0,5 ug/ml DAPI. Filtrer cellene gjennom et FACS-rør med en silhette og hold røret på is.
    3. Eksempel 3 (CD49d-merket): Heng resten av cellene med FACS-buffer som inneholder PE/Cy7-konjugert CD49D-antistoff (5 μL i 1 x 106 celler per 100 μL FACS-buffer) i et 15 ml rør og inkuberpå is i 20 min.
  9. Fyll opp rørene med FACS buffer og sentrifuge ved 200 x g i 4 min.
  10. Kast supernatanten og resuspend hver 5–10 x 106 celler i 1 ml FACS-buffer som inneholder 0,5 ug/ml DAPI i henhold til produsentens instruksjoner.
  11. Filtrer cellene gjennom FACS-røret med silhetten og hold røret på is.
  12. Forbered oppsamling stobakrør som inneholder 2 ml FACS-buffer.
  13. Sorter gjennom FACS-maskinen med lasere som kan oppdage DAPI og PE-Cy7 for å isolere CD49D+ populasjonen.
  14. Etter sortering teller du de sorterte cellene.
  15. Sentrifuge alle sorterte celler og resuspend i dag 10-14 spheroid medium til en endelig konsentrasjon på 0,5 x 106 celler per 500 μL medium.
  16. Plate 0,5 x 106 celler per brønn i ultra-lav vedlegg 24 brønnplater.
  17. Inkuber cellene ved 37 °C, i 5% CO2.

5. Aggregere NC-celler i spheroider

  1. Hvis du ikke bruker FACS til å isolere NC-cellene og i stedet aggregere dem til spheroider direkte, må du først forberede celler som beskrevet i trinn 4.2–4.5.
  2. Fyll opp resten av røret med 1x PBS, og sentrifuge på 200 x g i 4 min.
  3. Kast supernatanten, resuspendcellene med en passende mengde dag 10–14 spheroid medium (f.eks. ~ 2 ml medium per brønn for en 6 brønnplate), og tell for å bestemme cellenummeret.
  4. Fortynn cellene i dag 10–14 spheroid medium til 0,5 x 106 celler per 500 μL medium.
  5. Plate 500 μL av cellesuspensjonen per brønn i ultra-lav vedlegg 24 brønnplater.
  6. Inkuber cellene ved 37 °C, i 5% CO2.

6. NC spheroid vedlikehold og sympatisk stamcelle induksjon (dag 10 til dag 14, figur 4A)

  1. Alternativ 1: Minimal spheroid kultur
    1. På dag 11, tilsett 500 μL av dag 10–14 spheroid medium til NC spheroids uten aspirating eksisterende medium fra dag 10. Inkuber ved 37 °C, i 5 % CO2.
    2. På dag 12, vippe platen for å samle NC spheroids på den ene siden av brønnene. Forsiktig aspirere og kaste så mye medium som mulig, og mate med 1 ml dag 10-14 spheroid medium.
    3. Fortsett å mate cellene hver dag til dag 14.
    4. Valgfritt: Hvis spheroidene aggregerer og genererer en stor klump, bruk en pipette til å bryte spheroidklumpene opp. Dette sikrer også at individuelle spheroider ikke blir for store.
      MERK: Den ideelle spheroid størrelsesområdet skal være rundt 100–500 μm. Innenfor dette området er størrelsen på individuelle spheroider ikke kritisk. Morfologien, som for eksempel en jevn og klar kanter (Figur 3 og figur 6)er imidlertid viktig for videre suksess. På dag 14 inneholder hver 24 brønnplate ideelt ca 50-60 spheroider av forskjellige størrelser innenfor det ovennevnte størrelsesområdet.
  2. Alternativ 2: Utvidet spheroid kultur
    1. På dag 15, for å holde NC spheroids, mate med 1,5 ml dag 10–14 spheroid medium som inneholder 0,5 μM RA. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
      MERK: RA skal tilsettes frisk tåring og oppbevares alltid ved -80 °C.
    2. Fra nå av, mate annenhver dag opp til dag 28 og deretter fortsette med plating av spheroids (seksjon 7.1).
      MERK: De voksende spheroidene er delt ca 1x per uke ved å pipedem med en 1 ml pipette for å bryte dem opp. De er delt med et omtrentlig forhold på 1:2-1:4. Innen 2 ukers ekspansjonsperiode bør cellene omtrent firedobles i antall.

7. SymN differensiering og modning (Alternativ 1: etter dag 14; Alternativ 2: etter dag 28)

  1. Plating spheroids i vanlige retter
    1. Forbered PO/LM/FM-belagte 24 brønnplater.
    2. Forbered symN-mediet som inneholder 0,125 μM RA (tilsett fersk hver mating) og 10 μM Y27632 (kun dag 14).
    3. På dag 14, vippe platen for å samle NC spheroids på den ene siden av brønnene. Krøspire og kast så mye medium som mulig, og fôr med 1 ml symN-medium.
    4. Fjern LM/FN fra de belagte platene.
    5. Del og plate hver brønn fra 24 brønnplate i 4 separate brønner av den nye, belagt 24 brønnplate. Hver originalbrønn vil ha 1 ml, som inneholder ~50–60 spheroider. Dette gir 250 μL, som inneholder ca 10-15 spheroider for hver brønn på den nye platen.
    6. Tilsett 250 μL ekstra medium per brønn.
      MERK: Dette er en splitt av 1:4; kontroller at spheroidene fordeles riktig i løsningen, slik at splitten er relativt jevn. Antall spheroider telles ikke fordi det endelige tallet ikke påvirker suksessen med å generere symNer.
    7. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2.
    8. På dag 15 (eller dag 29 for alternativ 2) mates du ved å erstatte alt medium med 1 ml symN-medium som inneholder 0,125 μM RA. Fra nå av bør nevronene mates hver 2 dager til dag 20 (eller dag 35 for alternativ 2).
    9. Etter dag 20 (eller dag 35 for alternativ 2), bør nevronene mates ved å nøye erstatte bare halvparten av det eksisterende mediet (500 μL). Fra nå av, mate hver uke med mindre mediet raskt blir gul.
    10. Fortsett å mate ukentlig til ønsket tidspunkt.
      MERK: symNer har en tendens til å aggregere i ganglia-lignende strukturer og er utsatt for å løsne fra kulturrettene. For å unngå dette anbefales halvfôring og minimal håndtering.
  2. Plating celler for elektrofysiologisk opptak
    1. Forbered PO/LM/FM-belagte 96 brønnelektrofysiologiplater.
    2. Forbered symN-mediet som inneholder 0,125 μM RA (tilsett fersk hver mating) og 10 μM Y27632 (kun dag 14).
    3. På dag 14, samle alle spheroids, deretter sentrifuge dem på 200 x g i 4 min.
    4. Kast supernatanten, tilsett 2 ml dissosiasjonsløsning, og overfør blandingen tilbake til en av brønnene i den ultralave festeplaten. Inkuber ved 37 °C, i 5 % CO2 i 20–45 min.
      MERK: Avhengig av størrelsen på spheroidene kan dissosiasjonsperioden være lengre enn 20 min. Kontroller cellens dissosiasjon hver 10. min opp til 45 min. Eventuelt kan 0,1 mg/ml DNase legges til med dissosiasjonsløsning for å forhindre fritt DNA fra døde celler som gjør løsningen klebrig. Dette er valgfritt i denne protokollen fordi spheroids ikke vil aggregere når de er fullt dissosiert.
    5. Rør for å fullstendig dissosiere spheroider, deretter sentrifuge ved 200 x g i 4 min.
    6. Kast supernatanten, resuspendcellene med riktig mengde symN-medium, og tell cellenummeret.
    7. Plate cellene på 100.000/cm2 i PO/LM/FN-belagte elektrofysiologibrønner i 200 μL totalt volum per brønn.
    8. På dag 15 (eller dag 29 for alternativ 2), følg de samme fôringsprosessene som i pkt. 7.1. Det totale volumet etter dag 15 (eller dag 29 for alternativ 2) skal være 300 μL per brønn.
    9. Mål de elektriske signalene ved hjelp av en multielektrodearraymaskin etter dag 20 (eller dag 35 for alternativ 2).
      MERK: I alternativ 2 kan spheroider bli belagt når som helst mellom dag 14-dag 28. De første elektriske signalmålingene kan gjennomføres 1 uke etter plating av spheroider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne protokollen gir vi instruksjoner om hvordan du genererer symNer fra hPSCer. Kulturforholdene som ble demonstrert her ble forbedret fra en tidligere publisert protokoll23,24 (Figur 1A) til materfrie og kjemisk definerte forhold ( Figur1B). To alternativer er gitt, en der symNer er laget innen 20 dager, og en annen hvor NCCer kan utvides i 2 uker for å generere flere celler som deretter kan differensieres til symNer (Figur 1B, Alternativ 1 og 2).

For å overvåke symN-egenskapene til differensierte celler, phox2B-eGFP WA09 reporter linje og den overordnede WA09 PSC linje19. Alle differensieringer ble utført i minst tre biologiske repetisjoner, definert som uavhengige differensieringseksperimenter etter minst ett avsnitt og/eller avledet fra et nytint hetteglass med celler. Differensiering ble indusert da samløpet av udifferensierte hPSCer nådde 80%–90%. HPSC-koloniene var runde, med skinnende, glatte kanter og liten eller ingen differensiering. Koloniene bør ikke berøre hverandre (Figur 2B, dag 0). I stedet for typisk dobbel SMAD hemming25, som tidligere ble brukt for neurectoderm induksjon, TGF-β hemming kombinert med WNT og BMP4 signalering i de første 2 dagene førte til robust uttrykk for tidlig neural crest markør AP2a. Den nevrale crest markør SOX10 ble uttrykt fra dag 4 til dag 10 (Figur 2B). NcCs dukket opp i tette, mørke rygger synlig fra dag 6 på. Disse ryggene uttrykte SOX10 (Figur 2B, piler). Det ble tidligere vist at SOX10 på NCC-stadiet korrelerer med celleoverflatemarkøren CD49D23,26 og dermed KAN CD49D brukes til å sortere NC-celler som ikke rapporterer fluorforfra SOX10 locus. Figur 2C viser uttrykket for NCC-markørgener over tid. Figur 2D indikerer at differensieringseffektiviteten var over 80 %. For å fastslå identiteten til de gjenværende cellene, ble qRT-PCR brukt til å teste for forurensende celletyper, inkludert BryT-uttrykkende mesutm, SOX17-uttrykkende endoderm og PAX6-uttrykkende neuroectoderm; alle ble funnet å være fraværende eller uttrykt på svært lave nivåer (data ikke vist; se Supplerende tabell 1 for alle primere). Noen SIX1/EYA1+ placode ble imidlertid oppdaget (data vises ikke) som kan være kilden til de gjenværende celletypene. I tillegg er det mulig at de resterende celletypene er NCC-derivater som allerede er ytterligere differensiert. HOX-koden til NcCene ble vurdert på dette stadiet (figur 2E). Men på dette tidlige stadiet hox signalene var svært lav (merk skalaen), noe som tyder på at disse NCCs var enten av kranial-NC karakter eller ikke hadde vedtatt noen NCC subtype karakter ennå.

På dag 10 nccs kunne renses ved hjelp av FACS, som ga rundt 80% CD49D+ NCCer(Figur 2D). Et eksempel på en typisk gating strategi er angitt i figur 2D. Etter sortering ble cellene aggregert som NC spheroider (figur 3A). For å utvide NCCer og indusere trunk-NC-lignende egenskaper, celler ble behandlet med en kombinasjon av FGF2 og CHIR. Vi testet om sortering for CD49D+ befolkningen ga bedre eller renere kulturer av symNer senere. Figur 3B sammenligner usortert versus CD49D+ sortert versus CD49D- sorterte cellepopulasjoner. Til venstre kan det ses at den positive sorterte og de usorterte populasjonene gjorde NC spheroids på en lignende måte, mens de negative sorterte cellene ikke aggregerte riktig, gjorde ikke runde, glatte, sunne ser spheroider og døde innen 3-4 dager. Videre, når NC spheroids ble sammenlignet på dag 14 via qRT-PCR for NC og symN stamcellemarkører, betydelige forskjeller mellom sorterte og usorterte celler kunne ikke oppdages. Merkbart, på dette punktet uttrykket av sympatiske stamcellemarkører var fortsatt lav og SOX10 nivåer forble høy, noe som tyder på at spheroids var fortsatt sammensatt av celler med NC egenskaper. En dag etter plating (dag 15), både usortertog CD49D+ spheroids festet godt til PO / LM / FN retter og neurite utvekst kan være tydelig observert (Figur 3B, D15 og figur 3C, D29). De usorterte og sorterte kulturene ble fraktet videre til dag 35 parallelt, men ingen store forskjeller ble sett (data ikke vist). Dermed kan det konkluderes med at sorteringstrinnet ikke var avgjørende for generering av symNer, og derfor er det et valgfritt skritt i denne protokollen. Men for mindre effektive differensieringer som ikke gir 80% CD49D+ celler, anbefaler vi sorteringsprosedyren.

Deretter testet vi om disse NC-spheroidene kunne opprettholdes uten å miste sin NC-identitet (Figur 3A, alternativ 2). NcCs ble dyrket som spheroids i opptil 2 uker (Figur 3C). Morfologien av dag 28 spheroider og belagte celler på dag 29 var lik sammenlignet med dag 14 og 15 celler i alternativ 1. På dag 28 ble SOX10-uttrykket opprettholdt på samme nivå som dag 14. Uttrykket for tidlige sympatiske stamcellemarkører (dvs. ASCL1, PHOX2B og GATA3) økte imidlertid (figur 3C, høyre), noe som tyder på at den utvidede kulturen i FGF2, WNT og RA-signalering førte til modning og etterføring (figur 4C og F). Lignende effekter ble tidligere rapportert av Kirino et al21.

Etter NC-utvidelse (alternativ 1 eller alternativ 2) ble spheroider belagt på PO/LM/FN belagte retter og leveres med flere nevrale faktorer for å modne symNene (Figur 4A). På dag 20 og 35 (1 uke etter plating i alternativ 1 og 2, henholdsvis), ble neutritter observert i et radialt mønster som strekker seg fra de vedlagte spheroidene (figur 4A, høyre). Videre ble markører relatert til noradrenalin (NE) syntese og transport (dvs. TH, AAAD, DBH) uttrykt (Figur 4B). Tilstedeværelsen av forurensende celletyper ble undersøkt her igjen, og uttrykk for ChAT, som kan indikere parasympatiske nevroner, ble funnet (Figur 4B,E). ChAT er imidlertid også uttrykt i kolinerge symNer. Svært lave nivåer av VIP, en annen parasympatisk markør, ble oppdaget (data ikke vist). Videre ble lave nivåer av BRN3A, ISL1 og RUNX1 oppdaget (Figur 4B,E), som kan indikere enten sensoriske nevroner eller trigeminusnevroner, det vil si derivater av placode. Minimal EDNRB (merking enteriske nevroner) og OLIG2 (merking motorneurons) ble oppdaget (data ikke vist). Identiteten til de ikke-nevronale cellene er fortsatt uklar. Men basert på resultater fra vår tidligere symN-protokoll23, var de mest sannsynlig αSMA+ myofibroblaster. Uttrykk for HOX gener ble undersøkt på nytt, og det ble funnet at HOX5-9 ble uttrykt, noe som tyder på en stamme identitet. HOX10 (indikerer sakral-NC) ble ikke uttrykt (Figur 4C, F). Til slutt ble modne markører, inkludert nikotinacetylkolinreseptor (CHRNA3/4) og NE-relaterte reseptorer, inkludert adrenerge reseptorer (ADRA2A/B2) NE-transportør (NET, SCL6A2) og vesicle transportør (VMAT1) uttrykt (Figur 4D,G). Det ble ikke funnet noen signifikant forskjell i uttrykket av disse genene i celler som ble avledet med alternativ 2 sammenlignet med alternativ 1 (Figur 4E–G).

Vi bekreftet videre våre resultater ved å utføre denne protokollen på H9-PHOX2B: GFP reporter linje (Figur 5). Ved dag 20 dannet cellene en tett plen av nevroner og aggregert i klynger med enda høyere tetthet, noe som indikerer en svært høy differensieringseffektivitet (figur 5A, øverste rad). Farging viste at de fleste symNer klumper seg i disse klyngene, noe som gjorde vurderingen og kvantifiseringen av den generelle differensieringseffektiviteten vanskelig. For å markere farging og kolokalisering av spesifikke symN markører, fokuserte vi på de mindre tette områdene i utkanten av klyngene (se gul boks i figur 5A, høyre). Det var også her de fleste forurensende celler var plassert, så det var ikke et godt område å bedømme generell effektivitet. Likevel typiske symN markører; inkludert periferin (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronal), DBH og NET1 (uttrykt i prikker langs symN-legemer og aksoner, figur 5A, bunn); ble oppdaget. En multielektrodearray (MEA) tilnærming ble brukt til å måle elektrisk aktivitet, og det ble funnet at dag 20 symNer avfyrt på ca 3-5 pigger per sekund sammenlignet med negativ kontroll av udifferensierte hPSCer (Figur 5B). Det er viktig at cellene fordeles jevnt i brønnen for hver elektrode (svarte prikker i figur 5B, lyse felt) for å registrere riktig. Dag 20 til dag 30 symNer ble også stimulert med 1 μM nikotin, som imiterer preganglionic signalisering av symNer in vivo og økt gjennomsnittlig avfyring sating rate i cellene. Hemming av nevronene ble også målt. β2-adrenerge reseptor (ADRB2), som ligger på symN aksonterminaler, skaper en positiv tilbakemeldingssløyfe for NE sekresjon29. Behandling av symNer med 1 μM propranolol (en β2-adrenerge reseptorantagonist) hemmet deres aktivitet (Figur 5C, høyre). Disse resultatene tyder på at symNene som genereres av denne protokollen var funksjonelt aktive.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk illustrasjon og sammenligning av symN differensieringsprotokoller. (A) Tidligere protokoll av Zeltner et al.23. (B) Optimalisert protokoll. Alternativ 1 er 20 dager lang og inneholder bare 4 dager med NC spheroid kultur. Alternativ 2 er 35 dager lang og inneholder en 2 ukers NC spheroid ekspansjon supoiert ekspansjon stadium som tillater produksjon av flere NC celler. VTN = vitronectin, PO = poly-L-ornithine, LM = laminin, FN = fibronectin, SB = SB 431542, CHIR = CHIR 99021, RA = retinosyre, AA = askorbinsyre, NFs = NGF+BDNF+GDNF. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: NC induksjon. (A) Tidslinje og behandlinger for NC induksjon fra dag 0 til dag 10. (B) Morfologien og dannelsen av NC rygger ble overvåket annenhver dag av lyse feltmikroskopi. Celler på hvert tidspunkt etter dag 2 ble co-farget for AP2A (rød) og SOX10 (grønn). Alle immunfluorescensbilder ble motfarget med DAPI. Røde piler indikerer strukturer av rygger. (C) qRT-PCR analyse for uttrykksprofilen til NC markører fra dag 2-10. (D) Representativ tomt for FACS sortering på dag 10 for CD49D+ NC populasjoner (venstre). En typisk gating strategi og isotype kontroll er angitt i de fire første tomtene. Kvantifisering av CD49D+ celleprosent på dag 10 ble også utført. (E) qRT-PCR analyse for uttrykksprofilen til HOX gener fra dag 2-10. NC = neural crest. Feilfelt stammer fra data fra n ≥ 3 biologiske repetisjoner, definert som uavhengige differensieringseksperimenter gjort på separate dager fra PSC-kulturer som var minst ett delt fra hverandre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Neural crest vedlikehold og ekspansjon. (A) Tidslinje og behandlinger for NC-utvidelse i dag 10 til dag 14 kultur for alternativ 1 eller dag 10 til dag 28 kultur for alternativ 2. (B) NC spheroid formasjonen ble overvåket av lyse feltmikroskopi fra dag 11 (1 dag etter spheroid formasjon) til dag 14 (dvs. dagen for plating). Usorterte, CD49D+og CD49D- populasjoner ble sammenlignet. De belagte cellene på dag 15 er også vist. Celler klarte ikke å danne spheroider riktig i CD49D- gruppen og døde etter plating. Dag 14 celler ble undersøkt av qRT-PCR analyse (høyre) for uttrykksprofilen til symN stamceller. Usorterte og CD49D+ populasjoner ble sammenlignet (n ≥ 3). (C) NC spheroids kan opprettholdes i opptil 2 uker. Spheroider ble overvåket av lyse feltmikroskopi fra dag 15 til dag 28 (landingsdagen). De belagte cellene på dag 29 er også vist. Dag 28 spheroids ble undersøkt av qRT-PCR analyse for uttrykksprofilen til symN stamceller (høyre). Usorterte og CD49D+ populasjoner ble samlet (n ≥ 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: SymN differensiering og modning. (A) Tidslinje og behandlinger etter plating på dag 14 for alternativ 1 eller dag 28 for alternativ 2. Lyse feltmikroskopibilder (høyre) viser symNer på henholdsvis dag 20 og dag 35 (1 uke etter plating for begge alternativene). (B-D) Alternativ 1 qRT-PCR-analyse for uttrykksprofilen til symN-egenskaper mellom dag 20–30. Usorterte og CD49D+ populasjoner ble samlet. - Jeg harikkenoeå si. Alternativ 2 qRT-PCR-analyse for uttrykksprofilen til symN-egenskaper etter dag 35. Usorterte og CD49D+ populasjoner ble samlet (n ≥ 3). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Funksjonell karakterisering av symNer. (A,øverste rad) Bright feltbilde av symN-klynger på dag 20 og farget bilde som viser PRPH og TH doble positive celler for det meste plassert i klyngene. (A, bunn) Flere symN markører (separerte kanaler) ble verifisert av immunofluorescens farging på dag 20. Noradrenalintransportøren (NET1) ble plassert både på overflaten av cellelegemene, så vel som langs aksonene og dendrittene. Det dukket opp som prikker på denne forstørrelsen. Alle immunfluorescensbilder ble motfarget med DAPI. (B) Representativt varmekart over multielektrodearrayanalyse (MEA) for symNer på dag 20 (øverst). Det lyse feltbildet (nederst) viser tettheten av symNer og fordelingen av elektroder (åtte svarte prikker). Usorterte og CD49D+ populasjoner ble samlet her. (C) Kvantifisering av gjennomsnittlig avfyring for dag 20–30 symNer under behandlinger på 1 μM nikotin og 1 μM propranolol i henholdsvis 5 min (høyre). Resultater fra usorterte og CD49d-positive populasjoner ble samlet (n ≥ 3). Ikke parkoblet, to-tailed t-test med Welchs korreksjon, p-verdi:*<0.05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Eksempel på celler under forhold som er upassende for å fortsette med differensieringen. (A) Tidslinje for differensiering med hvert kontrollpunkt for celle morfologier angitt som i B-E. (B) hPSCer (a) med sunne kolonier og mange differensierte celler, og (b) fusjonerte og differensierte grenser mellom noen kolonier på dag 0. Røde piler angir de sammenslåtte områdene. (C) NCCer på dag 10 med boblelignende blemmer i ryggene. Røde piler indikerer blemmer i den øverste raden. Den nederste raden representerer en høyere forstørrelse. Vi har ikke vært i stand til å identifisere celleidentiteten til blærene. Imidlertid synes tilstedeværelsen av flere blemmer å korrelere med lavere SOX10 / CD49D uttrykk. (D) Uregelmessige ser spheroider mangler glatte kanter og rund form på dag 14. (E) Usunn og døende symNs på dag 20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi har nylig publisert to vurderinger, en som diskuterer bruken av hPSC-avledede symNer for sykdomsmodellering31, samt en grundig sammenligning av tilgjengelige differensieringsprotokoller22. Dermed fokuserer vi her på å feilsøke den nåværende protokollen for å hjelpe den interesserte forskeren med å lykkes i å lage symNer. Under hele differensieringsprosessen, for å få konsistente data samt friske differensierte celler, bør kontaminering i alle stadier kontrolleres nøye. Ved rutinemessig hPSC-vedlikehold bør mycoplasma-testing utføres annenhver uke eller månedlig. Hvis cellesortering utføres på dag 10, blir tilsetning av antibiotika til et hvilket som helst medium sterkt oppmuntret. Det er også viktig å sjekke cellemorfologien før og etter at differensieringen er startet. Her foreslår vi flere kritiske kontrollpunkter (figur 6A). For det første bør ideelle hPSC-kolonier klare for differensiering ha lyse og glatte kanter med små pigger. Kolonier med girlignende pigger har begynt å differensiere og bør ikke brukes. Det anbefales sterkt at celler på det perfekte tidspunktet skal brukes umiddelbart, fordi morfologien kan endres i løpet av timer. Utsettelse for bare en dag kan krasje cellene (Figur 6B, a) eller føre til kontakt mellom kolonier ( Figur6B, b), som stimulerer differensiering i hPSCer. Det er utfordrende å kvitte seg med hver differensiert celle i en kultur, men befolkningen bør kontrolleres for å inneholde færre enn 5% av dårlige kolonier. Når du følger denne protokollen, er det andre kontrollpunktet under differensiering mellom dag 2 og dag 10. På dette stadiet bør mørke NC rygger tydelig observeres under et lyst feltmikroskop (Figur 2C). Tykkelsen og fordelingen av rygger kan brukes som indikatorer på NC effektivitet: Fordi NCCs er hovedsakelig avledet fra celler som danner rygger, tynne eller mindre utbredt rygger og blemmer i ryggenkan indikere lav NC produksjon, og derfor bør merkes eller kasseres i tilfelle av inkonsekvente resultater (Figur 6C). RNA-prøvetaking anbefales på dag 10 på dag 10 for å kontrollere NC-markørene som er beskrevet ovenfor. Det tredje kontrollpunktet er under NC spheroid stadium, fordi spheroids kan aggregere. Det er best å periodisk pipet mediet for å bryte opp og resuspendere aggregeringen (celler vil ikke bli dispergert tilbake til enkeltceller, men bare små spheroider). Hvis spheroids utvide for fort, dele dem med 1:2 eller 1:4 å forlate nok plass og næringsstoffer for cellene å vokse. Hvis spheroider ikke har glatte og runde former (Figur 6D),kan det tyde på at NC-effektiviteten på dag 10 ikke var høy nok, og dermed kan ødelegge den endelige differensieringen. Testing uttrykk profiler for å sjekke symN stamcelle egenskaper anbefales på ønsket spheroid plating dag. Det fjerde kontrollpunktet er etter plating av spheroider. Neurites skal være tydelig synlig og bunter bør begynne å danne etter dag 20. Celler uten utbredte nøyvir er og bunter bør betraktes som kontaminering (Figur 6E). På dette punktet er det viktig å mate nevronene ved å erstatte bare halvparten av det eksisterende mediet for å opprettholde det næringsrike miljøet skapt av stabile nevroner. Vær forsiktig når du mater celler, fordi modning symNer er sårbare og lett kan løsne. Årsaken til hver av de dårlige morfologiene som er beskrevet her, er ikke helt forstått ennå. Det gir imidlertid innsikt i hPSCs følsomme natur og in vitro differensiering. En kilde til slike uregelmessigheter kan skyldes reagenser fra forskjellige leverandører. For eksempel vises de tynne ryggene med blemmer når du bruker et annet merke av BMP4.

For elektrofysiologisk analyse ved hjelp av MEA, for å jevnt distribuere symNer i elektrodebrønnene, dissosieres spheroider av Accutase. Behandlingstiden bør være 20 min til å begynne med. Men fordi spheroider er svært komprimert, kan tidspunktet for dissosiasjon økes til 45 min for å sikre at spheroids er fullt dissosiert. Generelt må hver eksperimentell gruppe på en MEA-plate kjøres i multipler på minst seks for å få konsistente resultater. Spesielt fordi vår tetthet for replating er mye lavere enn produsentens anbefalinger32 (ca 500-700,000/cm2),er brønnrepetisjonene avgjørende. I våre resultater vises både betydelig symN-markøruttrykk og stabil aktivitet fra dag 20 til dag 30. Vi anbefaler dette som det beste tidspunktet for å begynne å registrere de valgvariablene. For hver differensiering bør mediet gjøres friskt og brukes så raskt som mulig (ikke lenger enn en måned).

SymN differensieringsprotokollen som presenteres her er materfri, kjemisk definert, effektiv, utvidbar og gir funksjonelle symNer innen dag 20. Denne definerte symN differensieringprotokollen kan brukes til å studere menneskelige lidelser i det sympatiske nervesystemet, som en plattform for legemiddelscreening, for tumorigenesisstudier som neuroblastom/feokromocytom, eller for grunnleggende forskning i homeostatisk regulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Heidi Ulrichs for kritisk lesing og redigering av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Norcliffe-Kaufmann, L., Slaugenhaupt, S. A., Kaufmann, H. Familial dysautonomia: History, genotype, phenotype and translational research. Progress in Neurobiology. 152, 131-148 (2017).
  2. Stone, J. B., DeAngelis, L. M. Cancer-treatment-induced neurotoxicity--focus on newer treatments. Nature Reviews Clinical Oncology. 13, (2), 92-105 (2016).
  3. Goldstein, D. S., Holmes, C., Lopez, G. J., Wu, T., Sharabi, Y. Cardiac sympathetic denervation predicts PD in at-risk individuals. Parkinsonism Related Disorders. 52, 90-93 (2018).
  4. Froeschl, M., Hadziomerovic, A., Ruzicka, M. Percutaneous renal sympathetic denervation: 2013 and beyond. Canadian Journal of Cardiology. 30, (1), 64-74 (2014).
  5. Wehrwein, E. A., Orer, H. S., Barman, S. M. Overview of the Anatomy, Physiology, and Pharmacology of the Autonomic Nervous System. Comprehensive Physiology. 6, (3), 1239-1278 (2016).
  6. Le Douarin, N. M., Kalcheim, C. The Neural Crest. Cambridge University Press. (1999).
  7. Simões-Costa, M., Bronner, M. E. Insights into neural crest development and evolution from genomic analysis. Genome Research. 23, (7), 1069-1080 (2013).
  8. Labosky, P. A., Kaestner, K. H. The winged helix transcription factor Hfh2 is expressed in neural crest and spinal cord during mouse development. Mechanisms of Development. 76, (1-2), 185-190 (1998).
  9. Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nature Genetics. 18, (1), 60-64 (1998).
  10. Aruga, J., Tohmonda, T., Homma, S., Mikoshiba, K. Zic1 Promotes the Expansion of Dorsal Neural Progenitors in Spinal Cord by Inhibiting Neuronal Differentiation. Developmental Biology. 244, (2), 329-341 (2002).
  11. Garnett, A. T., Square, T. A., Medeiros, D. M. BMP, Wnt and FGF signals are integrated through evolutionarily conserved enhancers to achieve robust expression of Pax3 and Zic genes at the zebrafish neural plate border. Development. 139, (22), Cambridge, England. 4220-4231 (2012).
  12. Kam, M. K., Lui, V. C. Roles of Hoxb5 in the development of vagal and trunk neural crest cells. Development Growth, Differentiation. 57, (2), 158-168 (2015).
  13. Guillemot, F., et al. Mammalian achaete-scute homolog 1 is required for the early development of olfactory and autonomic neurons. Cell. 75, (3), 463-476 (1993).
  14. Pattyn, A., Morin, X., Cremer, H., Goridis, C., Brunet, J. F. The homeobox gene Phox2b is essential for the development of autonomic neural crest derivatives. Nature. 399, (6734), 366-370 (1999).
  15. Wildner, H., Gierl, M. S., Strehle, M., Pla, P., Birchmeier, C. Insm1 (IA-1) is a crucial component of the transcriptional network that controls differentiation of the sympatho-adrenal lineage. Development. 135, (3), Cambridge, England. 473-481 (2008).
  16. Trainor, P. Neural Crest Cells: Evolution, Development and Disease. Academic Press. (2013).
  17. Howard, M. J. Mechanisms and perspectives on differentiation of autonomic neurons. Developmental Biology. 277, (2), 271-286 (2005).
  18. Zeltner, N., Studer, L. Pluripotent stem cell-based disease modeling: current hurdles and future promise. Current Opinion in Cell Biology. 37, 102-110 (2015).
  19. Oh, Y., et al. Functional Coupling with Cardiac Muscle Promotes Maturation of hPSC-Derived Sympathetic Neurons. Cell Stem Cell. 19, (1), 95-106 (2016).
  20. Frith, T. J., et al. Human axial progenitors generate trunk neural crest cells in vitro. Elife. 7, (2018).
  21. Kirino, K., Nakahata, T., Taguchi, T., Saito, M. K. Efficient derivation of sympathetic neurons from human pluripotent stem cells with a defined condition. Scientific Reports. 8, (1), 12865 (2018).
  22. Wu, H. F., Zeltner, N. Overview of Methods to Differentiate Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 50, (1), 92 (2019).
  23. Zeltner, N., et al. Capturing the biology of disease severity in a PSC-based model of familial dysautonomia. Nature Medicine. 22, (12), 1421-1427 (2016).
  24. Saito-Diaz, K., Wu, H. F., Zeltner, N. Autonomic Neurons with Sympathetic Character Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Current Protocols Stem Cell Biology. 49, (1), 78 (2019).
  25. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27, (3), 275-280 (2009).
  26. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531, (7592), 105-109 (2016).
  27. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, (5), 424-429 (2011).
  28. Tchieu, J., et al. A Modular Platform for Differentiation of Human PSCs into All Major Ectodermal Lineages. Cell Stem Cell. 21, (3), 399-410 (2017).
  29. Kvetnansky, R., Sabban, E. L., Palkovits, M. Catecholaminergic systems in stress: structural and molecular genetic approaches. Physiology Review. 89, (2), 535-606 (2009).
  30. Frith, T. J. R., Tsakiridis, A. Efficient Generation of Trunk Neural Crest and Sympathetic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells Via a Neuromesodermal Axial Progenitor Intermediate. Current Protocols Stem Cell Biology. 49, (1), 81 (2019).
  31. Saito-Diaz, K., Zeltner, N. Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review. Clinical Autonomic Research. 29, (4), 367-384 (2019).
  32. Clements, I. P., et al. Optogenetic stimulation of multiwell MEA plates for neural and cardiac applications. Clinical and Translational Neurophotonics; Neural Imaging and Sensing; and Optogenetics and Optical Manipulation. 9690, (2016).
Effektiv differensiering av postganglioniske sympatiske nevroner ved hjelp av humane pluripotente stamceller under materfrie og kjemisk definerte kulturforhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter