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Developmental Biology

Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente

doi: 10.3791/60843 Published: May 24, 2020

Summary

En este protocolo, describimos una estrategia de diferenciación estable y altamente eficiente para la generación de neuronas simpáticas postgangliónicas a partir de células madre pluripotentes humanas. Este modelo hará que las neuronas estén disponibles para el uso de estudios de múltiples trastornos autonómicos.

Abstract

Las células madre pluripotentes humanas (hPSC) se han convertido en una poderosa herramienta para el modelado de enfermedades y el estudio del desarrollo embrionario humano in vitro. Anteriormente presentamos un protocolo de diferenciación para la derivación de neuronas autonómicas con carácter simpático que se ha aplicado a pacientes con neuropatía autonómica. Sin embargo, el protocolo se construyó sobre el reemplazo de suero Knock Out (KSR) y las condiciones de cultivo basadas en el alimentador, y para garantizar una alta eficiencia de diferenciación, la clasificación celular era necesaria. Estos factores causan alta variabilidad, alto costo y baja reproducibilidad. Además, no se han verificado las propiedades simpáticas maduras, incluida la actividad eléctrica. Aquí, presentamos un protocolo optimizado donde el cultivo y la diferenciación de PSC se realizan en condiciones de cultivo libres de alimentación y definidas químicamente. Se identifican marcadores genéticos que identifican la cresta neural del tronco. Una mayor diferenciación en las neuronas simpáticas postgangliónicas se logra después de 20 días sin la necesidad de clasificación celular. El registro electrofisiológico muestra aún más la identidad funcional de la neurona. El disparo detectado por nuestras neuronas diferenciadas puede ser mejorado por la nicotina y suprimido por el antagonista del receptor adrenérgico propranolol. Los progenitores neuronales simpáticos intermedios en este protocolo se pueden mantener como esferoides neuronales durante un máximo de 2 semanas, lo que permite la expansión de los cultivos. En resumen, nuestro protocolo actualizado de diferenciación de neuronas simpáticas muestra una alta eficiencia de diferenciación, mejor reproducibilidad, más flexibilidad y mejor maduración neuronal en comparación con la versión anterior. Este protocolo proporcionará a los investigadores las células necesarias para estudiar los trastornos humanos que afectan al sistema nervioso autónomo.

Introduction

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Las neuronas simpáticas postgangliónicas (simron) pertenecen al sistema nervioso autónomo (ANS) y tienen múltiples papeles importantes en la respuesta y regulación de la homeostasis del cuerpo independiente de la conciencia. Por ejemplo, el estrés estimula las sin, y evoca la respuesta de lucha o vuelo que conduce a un aumento de la frecuencia cardíaca, la presión arterial y la sudoración. Los SymN se ven afectados en múltiples trastornos humanos debido a la genética, toxicidad/lesión, o como compañeros de otras enfermedades. Un ejemplo de neuropatía genética es el trastorno infantil Disautonomia Familiar (FD), donde una severa desregulación de las simadoras causa crisis disautonómica, evidente por sudoración, manchadeo de la piel, ataques de vómitos, hipertensión y ansiedad1. Un ejemplo de toxicidad es el tratamiento de quimioterapia, que se ha divulgado para tener efectos secundarios tóxicos en las neuronas autonómicas2. Se sabe que la denervación autonómica y la hiperinnervación pueden conducir o acompañar a enfermedades como la enfermedad de Parkinson o la enfermedad renal hipertensiva3,4. Por lo tanto, ser capaz de llevar a cabo investigaciones y comprender los mecanismos de la biología sinmN y defectos en el contexto de la enfermedad es beneficioso para la búsqueda de tratamientos novedosos y eficaces.

Anatomía
El sistema nervioso periférico se ramifica en divisiones sensoriales y autonómicas. Los nervios aferentes del sistema nervioso sensorial son responsables de la sensación de dolor y tacto, mientras que el ANS es responsable de transmitir información de todos los órganos al cerebro. El ANS se divide en el sistema nervioso entérico, inervando el tracto gastrointestinal, el sistema nervioso parasimpático, que es importante para la relajación, y el sistema nervioso simpático (SNS), que es importante para la activación / regulación de los órganos. El SNS adapta un sistema de dos neuronas5. Los axones neurales simpáticos pregangliónicos en la médula espinal primero se proyectan a los ganglios simpáticos, donde se encuentran los cuerpos celulares simios posganglónicos. Estas neuronas entonces envían proyecciones largas para inervate los tejidos diana de cada órgano en el cuerpo. Las señales transmitidas por las neuronas pregangliónicas son colinérgicas, mientras que los símN postgangliónicos son adrenérgicos y por lo tanto expresan norepinefrina (NE) como su principal neurotransmisor. Hay pocas excepciones notables de las neuronas simpáticas postgangliónicas que son colinérgicas, incluyendo las que inervan los vasos sanguíneos. Las neuronas postgangliónicas adrenérenérgicas expresan las enzimas tirosina hidroxilasa (TH), la aromática L-aminoácido decarboxilasa (AAAD), la dopamina-hidroxilasa (DBH) y la monoaminooxidasa (MAO-A), todas responsables de generar y metabolizar NE. Además, expresan los transportadores de reciclaje NE y/o los receptores de receptores adrenérgicos (ADRA2), el receptor adrenérgico (ADR2B), el transportador de noradrenalina (NET1) y el transportador de monoamina vesicular (VMAT1/2).

Desarrollo
Durante el desarrollo embrionario, los sinmos se derivan de la cresta neural (NC), que emerge entre el tubo neural y la superposición de ectodermos6,y pueden diferenciarse en múltiples linajes celulares, incluyendo melanocitos, osteoblastos, adipocitos, glia, neuronas entéricas, neuronas sensoriales y neuronas autonómicas7. Las células de la cresta neural (NCC) son células altamente migratorias que toman varias rutas a través del embrión. En esta etapa temprana del desarrollo de NC, las células expresan los marcadores SNAIL1/2, FOXD3 y SOX108,,9,10,11. La ruta de migración junto con la ubicación axial que adoptan determina el subtipo NC en el que se desarrollarán. Estos subtipos NC se pueden distinguir por su expresión génica HOX específica: los NCC craneales no expresan genes HOX, los NCC vagales expresan HOX 1–5, los NCC troncales expresan HOX 6–9 y los NCC sacros expresan HOX 10–1112. Entre ellos, los NCC troncales se reconocen como la fuente principal de symNs. Los precursores de SymN expresan el factor de transcripción MASH1/ASCL113, que promueve la expresión de PHOX2B14 e INSM115. La familia GATA de factores de transcripción se expresa durante el desarrollo simpático tardío. GATA2 y GATA3 se expresan en los sinmN, que a su vez activa DBH16. El factor de transcripción HAND2 también es importante para la expresión y el mantenimiento de DBH y TH17.

Los HpSC (por ejemplo, células madre embrionarias e pluripotentes inducidas) son una poderosa herramienta18 para recapitular paradigmas de desarrollo y generar sinmN que luego se pueden emplear para el modelado de enfermedades de diversos trastornos humanos. Por lo tanto, al generar sinmos a partir de hPSCs, es crucial seguir las pautas de desarrollo y evaluar la expresión de marcadores apropiados a lo largo del proceso de diferenciación.

Protocolo SymN anterior
Pocos grupos de investigación han informado previamente de la generación de sinmN sde hPSCs19,20,21. La comparación directa de estos protocolos entre sí y el nuestro fue revisada recientemente22. En 201623,publicamos un protocolo de diferenciación para la generación de neuronas autonómicas con carácter symN(Figura 1A). Este protocolo utilizaba un medio basado en KSR, que se utilizaba tanto en el mantenimiento de hPSC indiferenciados como en la diferenciación celular. Además, se mantuvieron los hPSC en fibroblastos embrionarios de ratón (células alimentadoras de MEF). Empleamos este protocolo y PSCs de pacientes con FD para modelar el trastorno23. En 2019, describimos una versión más detallada de este protocolo anterior24. En resumen, el destino neural fue inducido por la inhibición SMAD dual25 para bloquear la señalización de TGF y BMP en los primeros 2 días. La activación de WNT mediante CHIR99021 promovió progenitores neuronales para convertirse en células NC. En el día 11, las células fueron ordenadas por FACS para CD49D+ o SOX10+ poblaciones26,23, que produjo aproximadamente 40% de eficiencia de generación NC. Por lo tanto, la clasificación era necesaria para garantizar la eficiencia y pureza para los próximos pasos de diferenciación. Los NCC se mantuvieron y se amplificaron como esferoides con el tratamiento combinado de FGF2 y CHIR. Después de 4 días, los esferoides NC de mantenimiento fueron chapados y recibieron BDNF, GDNF y NGF para terminar la maduración de la simN. Aunque estos sinmN expresaron marcadores sinmN fuertes como ASCL1, TH, DBH y PHOX2A, los marcadores para sinmNs más maduros, incluida la expresión del receptor de acetilcolina nicotínico (CHRNA3/CHRNB4) y el transportador de vesículas (VMAT1-2), eran bajos incluso después de 70 días de diferenciación. Los genes HOX en este protocolo no fueron probados formalmente, y las propiedades neuronales maduras, incluyendo la actividad electrofisiológica de las células, no fueron verificadas.

Aquí, presentamos un protocolo optimizado para generar symNs(Figura 1B). Los HPSC se mantienen en condiciones libres de alimentación, en platos recubiertos con vitronectina (VTN), utilizando los medios Essential 8 (E8)27. La fórmula de los medios de diferenciación se ha modificado en cada etapa, aumentando así el porcentaje de la población NC28. La maduración de la sinmN se puede hacer en CD49D+/SOX10+ poblaciones de NCC a granel ordenadas o no ordenadas. Ambos muestran altos niveles de expresión de marcador symN para el día 30. Además, los sinmN generados con este protocolo responden a la grabación electrofisiológica y a los tratamientos con activador de SIMn y compuestos inhibidores.

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Protocol

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NOTA: La línea de reporteroh9 PHOX2B:GFP fue proporcionada por Oh et al.19. Algunas imprimaciones qPCR utilizadas en este artículo se obtuvieron de OriGene Technologies, mientras que algunas secuencias se obtienen de Frith et al.20,30.

1. Configuración para recubrimiento de platos, preparación de medios y mantenimiento de hPSC

  1. Recubrimiento de platos
    1. Recubrimiento vitronectina (VTN)
      1. Colocar los viales de VTN en un baño de agua a 37 oC hasta que esté completamente descongelado y, a continuación, mezcle bien.
      2. Para una placa Petri de 100 mm, mezcle 7 ml de solución salina tamponada de fosfato 1x (PBS) con 0,5 mg/ml de VTN, agregue la solución VTN al plato e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1 h.
    2. Recubrimiento de matriz de membrana de sótano
      1. Descongelar los viales de matriz de membrana del sótano (ver Tabla de Materiales)sobre hielo a 4oC durante la noche.
      2. Para un pozo de una placa de 6 pocillos, mezcle 2 ml de DMEM/F12 con una matriz de membrana de sótano de 200x, agregue la solución de matriz de membrana del sótano al plato, envuelva el plato con película de parafina y guárdelo en un recipiente limpio a 4 oC durante la noche. Trabaje lo más rápido posible. Los platos recubiertos se pueden guardar en 4 oC durante un máximo de 2 semanas.
    3. Recubrimiento de poliornitina (PO)/laminina (LM)/fibronectina (FN)
      1. El primer día, para un pozo de una placa de 24 pocillos, mezcle 15 g/ml de PO con 1 ml de PBS 1x, incubar a 37oC, 5%CO2 durante la noche. Descongelar tanto LM como FN a -20 oC durante la noche y almacenar a 4oC hasta que esté completamente descondén.
      2. En el segundo día, aspirar la solución de PO, lavar los pozos 2x con 1x PBS, añadir 1 mL de 1x PBS que contenga 2 g/ml de LM y 2 g/ml de FN e incubar a 37 oC en 5% de CO2 durante la noche. En este punto, el plato con la solución LM/FN se puede mantener en la incubadora durante meses, siempre y cuando no se seque. Agregue más 1x PBS para evitar que el plato se seque.
  2. Preparación de los medios
    1. Preparar el medio Essential 8 (E8) descongelando una botella de suplemento E8 a 4 oC durante la noche. Mezclar el suplemento con 500 mL de medio E8 y antibióticos si es necesario.
      NOTA: La solución E8 en funcionamiento debe utilizarse en un plazo de 2 semanas.
    2. Preparar el medio de congelación hPSC mezclando 90 ml de medio E8 completo con 10 ml de DMSO para un volumen total de 100 ml. Esterilizar por filtro.
    3. Preparar el medio de diferenciación del día 0 al día 1 mezclando 100 ml de medio esencial 6 (E6) con 10 M SB431542, 1 ng/mL BMP4, 300 nM CHIR99021, y 10 m Y27632 para un volumen total de 100 ml.
    4. Preparar el medio de diferenciación del día 2 a 10 mezclando 100 ml de medio E6 con 10 M SB y 0,75 oM CHIR99021 para un volumen total de 100 ml.
    5. Preparar el medio esferoide del día 10 a día 14 mezclando el medio neurobasal con 2 ml de B27 (50x), 1 mL de N2 (100x), 2 mM de L-glutamato, 3 m de CHIR99021 y 10 ng/mL FGF2 para un volumen total de 100 ml.
    6. Preparar el día 14 a día 28 medio para el mantenimiento esferoide a largo plazo mediante la adición de 0,5 m de RA fresca al día 10 a día 14 medio esferoide para cada alimentación.
      NOTA: Mantenga siempre el RA a -80 oC.
    7. Preparar el medio de maduración SymN mezclando el medio neurobasal con 2 ml de B27 (50x), 1 ml de N2 (100x), 2 mM de L-glutamato, 25 ng/mL bdNF, 25 ng/mL BDNF, 25 ng/mL NGF, 200 mM de ácido ascórbico y 0,2 mM dbcAMP para un volumen total de 10 mL. La solución debe utilizarse en un plazo de 2 semanas. Antes de cada alimentación, agregue un RA fresco de 0,125 m. Esta solución se utiliza desde el día 14 (opción 1) o el día 28 (opción 2).
    8. Prepare el tampón FACS mezclando DMEM con 2% DE FBS, 2 mM de L-glutamato y antibióticos si es necesario para un volumen total de 100 ml.
  3. mantenimiento hPSC
    1. Descongelar y mantener los hPSCs
      1. Preparar un plato de 100 mm recubierto de VTN.
      2. Para descongelar un vial de hPSCs directamente a partir de nitrógeno líquido, coloque el vial en un baño de agua de 37 oC, balanceando cuidadosamente el tubo en el agua hasta que se descongele. Transfiera los hPSC descongelarse a un tubo de 15 ml que contenga 10 ml de 1pbS y centrífuga a 200 x g durante 4 min.
      3. Deseche el sobrenadante y agregue 1 ml de e8 medio al tubo. Pipetear unas cuantas veces para resuspender completamente el pellet y luego añadir otros 9 ml de medio E8 para alcanzar 10 ml en total.
      4. Aspirar la solución VTN de la placa de 100 mm.
      5. Transfiera los hPSC a un plato de 100 mm, agítese suavemente (arriba-abajo y izquierda-derecha, no en círculos) para asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente en el plato
      6. Incubar a 37oC, en 5% CO2.
      7. Al día siguiente, aspirar todo el medio y alimentar con 10 mL de E8.
      8. Alimente de esta manera todos los días durante los próximos 3-4 días y luego prepárese para separarse.
    2. Dividir los hPSC
      NOTA: los hPSC en el punto de división deben ser entre 80% y 90% de confluente. Se deben observar grandes colonias con bordes lisos y brillantes. Sin embargo, se debe evitar el contacto entre cada colonia(Figura 2B,día 0 y Figura 6B).
      1. Prepare platos de 100 mm recubiertos con VTN según sea necesario.
      2. Aspirar el E8 y lavar el plato que necesita ser dividido 1x con 1x PBS.
      3. Aspira el 1x PBS y agrega 4 mL de 0.25 M EDTA. Incubar durante 2 min a 37oC, 5%CO2.
        NOTA: Los hPSC deben dividirse/replacarse como pequeñas colonias. No tratar con EDTA de más de 2 min para evitar la separación en células individuales. Las células deben estar todavía unidas a la superficie del plato después del tratamiento de 2 minutos.
      4. Aspirar el EDTA, separar las colonias mediante el pipeteo fuertemente 10 mL de medio E8 en la superficie del plato, y recoger todos los medios y células en un tubo de 15 ml.
      5. Con hPSCs en 80%–90% de confluencia, divida las colonias por 1:15-1:20. Por ejemplo, para dividir los hPSC s por 1:20 en un plato de 100 mm, tome 500 ml de solución E8/hPSCs y mezcle con 9,5 ml de medio E8 fresco.
      6. PlacahPS en platos de 100 mm recubiertos con VTN.
        NOTA: Se recomienda establecer la relación de división ideal para cada investigador y línea celular de forma independiente.
    3. Congelación de hPSCs
      1. Para un plato de 100 mm de hPSCs que esté listo para ser partido, prepare tres crioviales y 3,5 ml de medio de congelación.
        NOTA: Los medios y viales deben conservarse en 4 oC o en hielo hasta su uso.
      2. Aspirar E8 y lavar el plato 2x con 1x PBS.
      3. Aspirar 1x PBS y añadir 4 mL de 0,25 M EDTA, incubar durante 2 min a 37oC, en 5% CO2.
        NOTA: los hPSC deben congelarse como pequeñas colonias en el momento en que se dividirían. No trate las células con EDTA durante más de 2 minutos para evitar la separación en células individuales. Las células deben estar todavía unidas en la superficie del plato después del tratamiento de 2 minutos.
      4. Aspirar el EDTA, separar las colonias mediante el pipeteo fuertemente 10 mL de 1x PBS en la superficie del plato, y recoger todos los medios y células en un tubo de 50 ml.
      5. Añadir 20 ml de 1x PBS y centrifugar a 200 x g durante 4 min para lavar el EDTA restante.
      6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 3 ml de medio de congelación.
      7. Distribuya los hPSC uniformemente en los tres crioviales, 1 ml cada uno.
      8. Almacenar a -80 oC durante la noche en una caja de congelación controlada o en un sándwich de espuma de poliestireno para garantizar un descenso lento de la temperatura, y luego transferir a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

2. Sembrar hPSCs para iniciar la diferenciación (día 0)

NOTA: los hPSC deben estar listos para la diferenciación después de ser estabilizados (es decir, dividirse de 2 a 3 veces después de descongelarse). Asegúrese de que las colonias son saludables, con bordes lisos y brillantes, y diferenciación mínima(Figura 2B).

  1. Preparar platos recubiertos con matriz de membrana del sótano (24 pozos o 6 platos de pozos) un día antes del día 0 según sea necesario. Lleve los platos a RT al comienzo de la diferenciación.
  2. Haga que el día 0-1 de diferenciación sea medio según sea necesario.
  3. Aspirar el E8 del confluente, listo para dividir los hPCS, y lavar el plato 2x con 1x PBS.
  4. Añadir 7 mL de 0,25 M EDTA por plato de 100 mm, incubar a 37oC, 5% CO2,durante 15 min.
    NOTA: En este punto, el tratamiento con EDTA se dispersa en células individuales.
  5. Pipet a todos los hPSCs (deben estar flotando) y transferir a un tubo de 50 ml. Agregue la misma cantidad o más de 1x PBS como solución EDTA para diluir el EDTA.
  6. Centrífuga a 200 x g durante 4 min.
  7. Deseche el sobrenadante, agregue 1 ml del medio de diferenciación del día 0-1 y pipetee para homogeneizar las células. Siga agregando más medio y luego mezcle para diluir la solución celular a una concentración ideal para contar las células.
    NOTA: No sobrediluir la solución celular. Las células de un plato completo de 100 mm deben diluirse en 5 ml de medio para comenzar.
  8. Cuente el número de celda usando un contador de células automatizado o un hemocitómetro.
  9. Diluir la solución celular según sea necesario para alcanzar 125.000 células/cm2 en un volumen final bajo (por ejemplo, 2 ml por pozo para un plato de 6 pozos o 500 ol por pozo para un plato de 24 pozos).
    NOTA: Un volumen bajo ayuda a que las celdas se conecten más rápido.
  10. Aspirar toda la solución de matriz de membrana del sótano de los platos recubiertos y placar la solución celular en los pozos.
  11. Incubar a 37oC, en 5% CO2.

3. Inducción celular de la cresta neural (día 1 al día 10, Figura 2A)

  1. En el día 1 alimentar las células con el día 0-1 medio de diferenciación (3 mL por pozo para 6 platos de pozo y 1 mL por pozo para 24 platos de pozo).
  2. El día 2 alimentar las celdas con día 2-día 10 medio de diferenciación (3 mL por pozo para 6 platos de pozo y 1 mL por pozo para 24 platos de pozo).
  3. A partir de ahora, las células deben ser alimentadas cada dos días hasta el día 10 (es decir, el siguiente día de alimentación será el día 4).
    NOTA: A partir del día 6, se deben detectar crestas NC(Figura 2B). Para comprobar si se está produciendo una diferenciación, se recomienda llevar un cultivo de diferenciación paralela en pozos más pequeños (es decir, 24 pozos), que se puede teñir para SOX10/AP2a y utilizarse para la expresión génica de marcadores a lo largo del tiempo de diferenciación(Figura 2B,C).
  4. Si está ordenando celdas, proceda a la sección 4. De lo contrario, proceda a la sección 5.

4. Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para el marcador de cresta neural CD49D y la agregación de células NC en esferoides

NOTA: Para la clasificación facS, las muestras deben mantenerse en hielo y no exponerse a la luz después de la tinción hasta la clasificación.

  1. Prepare el búfer FACS si las celdas están ordenadas.
  2. Preparar el medio esferoide del día 10–14.
  3. El día 10, retire el medio y lave 1x con 1pbS.
  4. Añadir solución de disociación (ver Tabla de Materiales)a 2 ml por pozo para un plato de 6 pozos o 1 ml por pozo para un plato de 24 pozos, e incubar a 37 oC, 5% CO2 durante 20 min.
  5. Pipet a todos los hPSCs y transfiera a un tubo de 50 ml.
  6. Llene el resto del tubo con tampón FACS y centrífuga a 200 x g durante 4 min.
    NOTA: Cada tubo de 50 ml puede acomodar hasta 20 ml o menos de solución celular. El volumen del búfer FACS debe ser lo suficientemente alto como para neutralizar la solución de disociación.
  7. Deseche el sobrenadante, resuspenda las celdas con la cantidad apropiada de búfer FACS (2 ml por pozo de una placa de 6 pocillos) y cuente para determinar el número de celda.
  8. Prepare los siguientes ejemplos.
    1. Muestra 1 (control sin mancha): 1 x 106 celdas en 400 l de tampón FACS. Filtrar las células a través de una tapa de colador de 20 m y mantener el tubo en hielo.
    2. Muestra 2 (control de solo DAPI): 1 x 106 celdas en 400 l de búfer FACS que contiene 0,5 ug/ml de DAPI. Filtrar las células a través de un tubo FACS con una tapa de colador y mantener el tubo en el hielo.
    3. Muestra 3 (con etiqueta CD49d): Suspenda el resto de las celdas con tampón FACS que contenga anticuerpos CD49D conjugados con PE/Cy7 (5 l para 1 x 106 celdas por 100 ml de tampón FACS) en un tubo de 15 ml e incubar en hielo durante 20 minutos.
  9. Llene los tubos con tampón FACS y centrífuga a 200 x g durante 4 min.
  10. Deseche el sobrenadante y resuspenda cada 5-10 x 106 celdas en 1 ml de tampón FACS que contenga 0,5 ug/ml de DAPI de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  11. Filtrar las células a través del tubo FACS con la tapa del colador y mantener el tubo en hielo.
  12. Prepare tubos FACS de recolección que contengan 2 ml de tampón FACS.
  13. Ordenar a través de la máquina FACS con láseres que pueden detectar DAPI y PE-Cy7 para aislar la población CD49D+.
  14. Después de ordenar, cuente las celdas ordenadas.
  15. Centrifugar todas las células ordenadas y resuspender en el día 10–14 medio esferoide a una concentración final de 0,5 x 106 células por 500 ol de medio.
  16. Placa 0.5 x 106 células por pozo en un accesorio ultrabajo 24 placas de pozo.
  17. Incubar las células a 37oC, en 5%CO2.

5. Agregación de células NC en esferoides

  1. Si no utiliza FACS para aislar las células NC y, en su lugar, agregándolas directamente en esferoides, primero prepare las celdas como se describe en los pasos 4.2–4.5.
  2. Llene el resto del tubo con 1pbS y centrífuga a 200 x g durante 4 min.
  3. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células con una cantidad apropiada de medio esferoide del día 10–14 (por ejemplo, 2 ml de medio por pozo para una placa de 6 pocillos) y cuente para determinar el número de celda.
  4. Diluir las células en el día 10–14 medio esferoide a 0.5 x 106 células por 500 s de medio.
  5. Placa de 500 l de la suspensión celular por pozo en un accesorio ultrabajo de 24 placas de pozo.
  6. Incubar las células a 37oC, en 5%CO2.

6. Mantenimiento de esferoides NC e inducción de progenitors simpáticos (día 10 a día 14, Figura 4A)

  1. Opción 1: Cultura esferoide mínima
    1. El día 11, agregue 500 ol del medio esferoide del día 10-14 a los esferoides NC sin aspirar el medio existente desde el día 10. Incubar a 37oC, en 5% CO2.
    2. En el día 12, incline la placa para acumular los esferoides NC en un lado de los pozos. Aspirar cuidadosamente y desechar tanto medio como sea posible, y alimentar con 1 ml del medio esferoide del día 10-14.
    3. Siga alimentando las células todos los días hasta el día 14.
    4. Opcional: Si los esferoides agregan y generan un grupo grande, utilice una pipeta para romper los grumos esferoides. Esto también garantiza que los esferoides individuales no se vuelvan demasiado grandes.
      NOTA: El rango de tamaño de esferoide ideal debe ser de alrededor de 100–500 m. Dentro de ese rango, el tamaño de los esferoides individuales no es crítico. Sin embargo, la morfología, como los bordes lisos y claros(Figura 3 y Figura 6)es importante para un mayor éxito. En el día 14, cada placa de 24 pozos contiene idealmente entre 50 y 60 esferoides de diferentes tamaños dentro del rango de tamaños antes mencionado.
  2. Opción 2: Cultura esferoide ampliada
    1. En el día 15, para mantener los esferoides NC, alimentar con 1,5 ml del medio esferoide del día 10-14 que contiene 0,5 m de RA. Incubar a 37oC, 5% CO2.
      NOTA: La AR debe añadirse fresca para cada alimentación y almacenarse siempre a -80 oC.
    2. A partir de ahora, alimentar cada dos días hasta el día 28 y luego continuar con el enchapado de los esferoides (sección 7.1).
      NOTA: Los esferoides en crecimiento se dividen aproximadamente 1 veces por semana clasificarlos con una pipeta de 1 ml para romperlos. Se dividen en una proporción aproximada de 1:2–1:4. Dentro del período de expansión de 2 semanas, las células deben cuadruplicar se cuadruplicar en número.

7. Diferenciación y maduración de la empresa (Opción 1: después del día 14; Opción 2: después del día 28)

  1. Esferoides de chapado en platos regulares
    1. Prepare 24 placas de pozo recubiertas con PO/LM/FM.
    2. Preparar el medio symN que contenga 0,125 m de RA (añadir fresco cada alimento) y 10 m Y27632 (solo el día 14).
    3. El día 14, incline la placa para acumular esferoides NC en un lado de los pozos. Aspirar cuidadosamente y desechar tanto medio como sea posible, y alimentar con 1 ml de medio symN.
    4. Retire el LM/FN de las placas recubiertas.
    5. Dividir y placa cada pozo de la placa de 24 pozos en 4 pozos separados de la nueva placa de 24 pozos recubiertos. Cada pozo original tendrá 1 ml, que contiene 50-60 esferoides. Esto produce 250 l, que contiene aproximadamente 10-15 esferoides para cada pocedés en la placa nueva.
    6. Añadir 250 s l de medio adicional por pozo.
      NOTA: Esta es una división de 1:4; asegúrese de que los esferoides se distribuyen correctamente dentro de la solución para que la división sea relativamente uniforme. El número de esferoides no se cuenta porque el número final no afecta al éxito de generar symNs.
    7. Incubar a 37oC, 5% CO2.
    8. El día 15 (o el día 29 para la opción 2), se alimenta reemplazando todo medio por 1 ml de medio symN que contenga 0,125 m de RA. A partir de ahora, las neuronas deben ser alimentadas cada 2 días hasta el día 20 (o el día 35 para la opción 2).
    9. Después del día 20 (o el día 35 para la opción 2), las neuronas deben ser alimentadas reemplazando cuidadosamente sólo la mitad del medio existente (500 l). A partir de ahora, alimente cada semana a menos que el medio se vuelva rápidamente amarillo.
    10. Siga la alimentación semanal hasta el punto de tiempo deseado.
      NOTA: los sinmos tienden a acumularse en estructuras similares a los ganglios y son propensos a separarse de los platos de cultivo. Para evitar esto, se recomienda la mitad de la alimentación y un manejo mínimo.
  2. Células de chapado para el registro electrofisiológico
    1. Preparar placas de electrofisiología recubiertas de PO/LM/FM 96 pozos.
    2. Preparar el medio symN que contenga 0,125 m de RA (añadir fresco cada alimento) y 10 m Y27632 (solo el día 14).
    3. En el día 14, recoger todos los esferoides, luego centrifugarlos a 200 x g durante 4 min.
    4. Deseche el sobrenadante, agregue 2 ml de solución de disociación y transfiera la mezcla a uno de los pocillos de la placa de fijación ultrabaja. Incubar a 37oC, en 5%CO2 durante 20-45 min.
      NOTA: Dependiendo del tamaño de los esferoides, el período de disociación puede ser superior a 20 min. Compruebe la disociación de la célula cada 10 minutos hasta 45 min. Opcionalmente, se pueden añadir 0,1 mg/ml de DNase con solución de disociación para evitar que el ADN libre de las células muertas haga que la solución sea pegajosa. Esto es opcional en este protocolo porque los esferoides no se agregarán una vez que se disocien por completo.
    5. Pipet para disociar completamente los esferoides, luego centrifugar a 200 x g durante 4 min.
    6. Deseche el sobrenadante, resuspenda las células con la cantidad adecuada de medio symN y cuente el número de celda.
    7. Placa relinfe las células a 100.000/cm2 en pozos de electrofisiología recubiertos con PO/LM/FN en un volumen total de 200 l por poc.
    8. El día 15 (o el día 29 para la opción 2), siga los mismos procesos de alimentación que en la sección 7.1. El volumen total después del día 15 (o el día 29 para la opción 2) debe ser de 300 ml por pozo.
    9. Mida las señales eléctricas utilizando una máquina de matriz multielectrodo después del día 20 (o el día 35 para la opción 2).
      NOTA: En la opción 2, los esferoides se pueden chapar en cualquier momento entre el día 14 y el día 28. Las primeras mediciones de señales eléctricas se pueden realizar 1 semana después de enchapar los esferoides.

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Representative Results

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En este protocolo, damos instrucciones sobre cómo generar symNs a partir de hPSCs. Las condiciones de cultivo que se han demostrado aquí se mejoraron de un protocolo publicado anteriormente23,24 (Figura 1A) a condiciones libres de alimentación y definidas químicamente(Figura 1B). Se proporcionan dos opciones, una en la que se realizan symN en un plazo de 20 días y otra en la que los CNC se pueden ampliar durante 2 semanas para generar más celdas que luego se pueden diferenciar en symNs(Figura 1B,Opción 1 y 2).

Para supervisar correctamente las características symN de las células diferenciadas, la línea de reportero sIMP/o 209 DE PHOX2B-eGFP WA09 y la línea19de los PSC WA09 principales. Todas las diferenciaciones se llevaron a cabo en al menos tres repeticiones biológicas, definidas como experimentos de diferenciación independientes después de al menos un pasaje y/o derivados de un vial de células recién descongelado. La diferenciación se indujo cuando la confluencia de hPSC indiferenciados alcanzó 80%-90%. Las colonias hPSC eran redondas, con bordes brillantes y lisos y poca o ninguna diferenciación. Las colonias no deben tocarse entre sí(Figura 2B,día 0). En lugar de la inhibición sMAD dual típica25,que se utilizó anteriormente para la inducción de neurectoderm, la inhibición de TGF-o combinada con la señalización WNT y BMP4 en los primeros 2 días condujo a la expresión robusta del marcador de cresta neural temprana AP2a. El marcador de cresta neural SOX10 se expresó desde el día 4 hasta el día 10(Figura 2B). Los NCC surgieron en crestas densas y oscurecidas visibles desde el día 6 en adelante. Estas crestas expresaban SOX10(Figura 2B,flechas). Anteriormente se demostró que SOX10 en la etapa NCC se correlaciona con el marcador de superficie celular CD49D23,26 y por lo tanto CD49D se puede utilizar para ordenar las células NC que no informan de ningún fluoróforo del locus SOX10. La Figura 2C muestra la expresión de los genes marcadores NCC a lo largo del tiempo. La Figura 2D indica que nuestra eficiencia de diferenciación fue superior al 80%. Para determinar la identidad de las células restantes, qRT-PCR se utilizó para probar los tipos de células contaminantes, incluyendo mesoderm expreso de BryT, endoderm de expresión SOX17 y neuroectoderm de expresión de PAX6; todos se constató que estaban ausentes o expresados en niveles muy bajos (datos no mostrados; véase el Cuadro Suplementario 1 para todos los primeros). Sin embargo, se detectó algunos SIX1/EYA1+ placode (datos no mostrados) que pueden ser el origen de los tipos de celda restantes. Además, es posible que los tipos de celda restantes sean derivados NCC que ya están más diferenciados. El código HOX de los NCC se evaluó en esta etapa(Figura 2E). Sin embargo, en esta etapa temprana las señales HOX eran muy bajas (tenga en cuenta la escala), lo que sugiere que estos CNC eran de carácter craneal-NC o aún no habían adoptado ningún carácter de subtipo NCC.

El día 10 los NCC pudieron ser purificados usando FACS, que produjo alrededor del 80% CD49D+ NCCs(Figura 2D). En la Figura 2Dse indica un ejemplo de una estrategia de gating típica. Después de la clasificación, las celdas se agregaron como esferoides NC(Figura 3A). Para expandir los CNC e inducir las propiedades similares al tronco-NC, las células se trataron con una combinación de FGF2 y CHIR. Probamos si la clasificación para el CD49D+ población produjo mejores o más puros cultivos de symNs más adelante. La Figura 3B compara las poblaciones de células ordenadas no ordenadas frente a CD49D+ ordenadas frente a CD49D.- A la izquierda, se puede ver que las poblaciones positivas ordenadas y no ordenadas hicieron esferoides NC de una manera similar, mientras que las células ordenadas negativas no se agregaron correctamente, no hicieron esferoides redondos, lisos y de aspecto saludable y murieron dentro de 3-4 días. Además, cuando los esferoides NC se compararon en el día 14 a través de qRT-PCR para NC y marcadores de progenitor esmimos, no se pudieron detectar diferencias significativas entre las células ordenadas y no ordenadas. Notablemente, en este punto la expresión de marcadores de progenitors simpáticos era todavía baja y los niveles de SOX10 se mantuvieron altos, lo que sugiere que los esferoides todavía estaban compuestos de células con propiedades NC. Un día después del enchapado (día 15), tanto no clasificados como CD49D+ esferoides unidos bien a los platos PO/LM/FN y el crecimiento de neurita podría observarse claramente(Figura 3B,D15 y Figura 3C,D29). Las culturas no ordenadas y ordenadas se llevaron más allá del día 35 en paralelo, pero no se vieron diferencias importantes (datos no mostrados). Por lo tanto, se puede concluir que el paso de clasificación no era esencial para la generación de symNs, y por lo tanto es un paso opcional en este protocolo. Sin embargo, para diferenciaciones menos eficientes que no producen 80% CD49D+ celdas, recomendamos el procedimiento de clasificación.

A continuación, probamos si estos esferoides NC podrían mantenerse sin perder su identidad NC(Figura 3A,opción 2). Los NCC se cultivaron como esferoides durante un máximo de 2 semanas(Figura 3C). La morfología de los esferoides y células chapadas del día 28 fue similar en comparación con las células del día 14 y 15 en la opción 1. El día 28, la expresión SOX10 se mantuvo en niveles similares al día 14. Sin embargo, la expresión de los primeros marcadores de progenitors simpáticos (es decir, ASCL1, PHOX2B y GATA3) aumentó(Figura 3C, derecha), lo que sugiere que el cultivo extendido en la señalización FGF2, WNT y RA condujo a la maduración y posteriorización(Figura 4C y F). Efectos similares fueron reportados previamente por Kirino et al21.

Después de la expansión de NC (opción 1 o opción 2), los esferoides se enchaparon en platos recubiertos con PO/LM/FN y se suministraron con múltiples factores neuronales para madurar los sinmos(Figura 4A). En los días 20 y 35 (1 semana después del chapado en las opciones 1 y 2, respectivamente), se observaron neurites en un patrón radial que se extendía desde los esferoides adjuntos(Figura 4A,derecha). Además, se expresaron marcadores relacionados con la síntesis y el transporte de norepinefrina (NE) (es decir, TH, AAAD, DBH)(Figura 4B). La presencia de tipos de células contaminantes se examinó aquí de nuevo, y se encontró la expresión de ChAT, que puede indicar neuronas parasimpáticas (Figura 4B,E). Sin embargo, ChAT también se expresa en sinmNs colinérgicos. Se detectaron niveles muy bajos de VIP, otro marcador parasimpático (datos no mostrados). Además, se detectaron niveles bajos de BRN3A, ISL1 y RUNX1(Figura 4B,E),que podrían indicar neuronas sensoriales o neuronas trigémino, es decir, derivados del placode. Se detectaron EDNRB mínimo (marcando neuronas entéricas) y OLIG2 (marcando neuronas motoras) (datos no mostrados). La identidad de las células no neuronales sigue sin estar clara. Sin embargo, en base a los resultados de nuestro protocolo symN anterior23, lo más probable es que fueran sMA+ miofibroblastos. La expresión de genes HOX fue reexaminada, y se encontró que HOX5-9 fueron expresados, lo que sugiere una identidad troncal. HOX10 (indicativo de sacral-NC) no se expresó(Figura 4C, F). Por último, se expresaron marcadores maduros, incluidos receptores de acetilcolina nicotínicos (CHRNA3/4) y receptores relacionados con NE, incluidos receptores adrenérgicos (ADRA2A/B2) transportador NE (NET, SCL6A2) y transportador de vesículas (VMAT1)(Figura 4D,G). No se encontró ninguna diferencia significativa en la expresión de estos genes en las células que se derivaron con la opción 2 en comparación con la opción 1(Figura 4E–G).

Además, confirmamos nuestros resultados realizando este protocolo en la línea de reporteros H9-PHOX2B:GFP (Figura 5). Para el día 20, las células formaban un denso césped de neuronas y se agregaban en grupos de densidad aún mayor, lo que indica una eficiencia de diferenciación muy alta(Figura 5A,fila superior). La tinción mostró que la mayoría de los sínmN se agrupan en esos grupos, lo que dificultó la evaluación y cuantificación de la eficiencia de diferenciación general. Para resaltar la tinción y la colocación de marcadores symN específicos, nos centramos en las áreas menos densas en las afueras de los clústeres (ver caja amarilla en la Figura 5A,derecha). Aquí también se encontraba la mayoría de las células contaminantes, por lo que no era un buen área para juzgar la eficiencia general. Sin embargo, marcadores SymN típicos; incluyendo periferia (PRPH), ASCL1, TH, PHOX2B, TUJ1 (pan neuronal), DBH y NET1 (expresado en puntos a lo largo de cuerpos y axones sinérmicos, Figura 5A,inferior); fueron detectados. Se empleó un enfoque de matriz de multielectrodos (MEA) para medir la actividad eléctrica, y se encontró que el día 20 symNs se dispararon en unos 3-5 picos por segundo en comparación con el control negativo de los hPSC indiferenciados(Figura 5B). Es importante que las células se distribuyan uniformemente en el pozo para que cada electrodo (puntos negros en la Figura 5B,campo brillante) se registre correctamente. El día 20 al día 30 symNs también fueron estimulados con 1 M de nicotina, que imita la señalización pregangliónica de los sinmN in vivo y aumentó la tasa media de disparo en las células. También se midió la inhibición de las neuronas. El receptor adrenérgico 2 (ADRB2), situado en terminales de axón symN, crea un bucle de retroalimentación positiva para la secreción NE29. El tratamiento de los simrones con 1 propranolol de M (un antagonista del receptor adrenérgico de 2) inhibió su actividad(Figura 5C,derecha). Estos resultados sugieren que los symN generados por este protocolo estaban funcionalmente activos.

Figure 1
Figura 1: Ilustración esquemática y comparación de protocolos de diferenciación symN. (A) Protocolo anterior de Zeltner et al.23. (B) Protocolo optimizado. La opción 1 tiene una duración de 20 días y contiene solo 4 días de cultivo esferoide NC. La opción 2 tiene una duración de 35 días y contiene una etapa de expansión esferoide NC de 2 semanas que permite la producción de más células NC. VTN - vitronectina, PO - poli-L-ornitina, LM - laminina, FN - fibronectina, SB - SB 431542, CHIR - CHIR 99021, RA - ácido retinoico, AA á ácido ascórbico, NFs - NGF+BDNF+GDNF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Inducción NC. (A) Cronología y tratamientos para la inducción de NC desde el día 0 hasta el día 10. (B) La morfología y la formación de crestas NC fueron monitoreadas cada 2 días mediante microscopía de campo brillante. Las células en cada punto de tiempo después del día 2 fueron co-teñidas para AP2A (rojo) y SOX10 (verde). Todas las imágenes de inmunofluorescencia fueron contrarretidas con DAPI. Las flechas rojas indican las estructuras de las crestas. (C) análisis qRT-PCR para el perfil de expresión de marcadores NC del día 2-10. (D) Gráfica representativa de la clasificación FACS el día 10 para poblaciones CD49D+ NC (izquierda). En las cuatro primeras gráficas se indica una estrategia de gating típica y un control de isotipo. También se realizó la cuantificación de CD49D+ porcentaje de células el día 10. (E) análisis qRT-PCR para el perfil de expresión de genes HOX del día 2-10. NC - cresta neural. Las barras de error se derivan de los datos de n 3 repeticiones biológicas, definidas como experimentos de diferenciación independientes realizados en días separados de los cultivos de PSC que fueron al menos una separación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Mantenimiento y expansión de la cresta neuronal. (A) Cronología y tratamientos para la expansión NC durante el día 10 a día 14 cultura para la opción 1 o día 10 a día 28 cultura para la opción 2. (B) La formación de esferoides NC fue monitoreada por microscopía de campo brillante desde el día 11 (1 día después de la formación de esferoides) hasta el día 14 (es decir, el día del revestimiento). No ordenados, CD49D+, y CD49D - poblacionesse compararon. También se muestran las células chapadas en el día 15. Las células no pudieron formar esferoides correctamente en el GRUPO CD49Dy murieron después del enchapado. Las células del día 14 fueron examinadas por el análisis qRT-PCR (derecha) para el perfil de expresión de los progenitores symN. Se compararon las poblaciones no ordenadas y CD49D+ (n.o 3). (C) Los esferoides NC podrían mantenerse durante un máximo de 2 semanas. Los esferoides fueron monitoreados por microscopía de campo brillante desde el día 15 hasta el día 28 (el día del aterrizaje). También se muestran las células chapadas en el día 29. Los esferoides del día 28 fueron examinados por el análisis qRT-PCR para el perfil de expresión de los progenitores symN (derecha). No clasificados y CD49D+ poblaciones se agruparon (n.o 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Diferenciación y maduración de SymN. (A) Cronología y tratamientos después del chapado el día 14 para la opción 1 o día 28 para la opción 2. Las fotos de microscopía de campo brillante (derecha) muestran sinmN según el día 20 y el día 35, respectivamente (1 semana después del chapado para ambas opciones). (BD) Opción 1 qRT-PCR para el perfil de expresión de propiedades symN entre los días 20–30. No ordenado y CD49D+ poblaciones se agruparon. (EG) Opción 2 qRT-PCR para el perfil de expresión de propiedades symN después del día 35. No clasificados y CD49D+ poblaciones se agruparon (n.o 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Caracterización funcional de symNs. (A, fila superior) Imagen de campo brillante de clústeres symN en el día 20 y una imagen teñida que muestra las celdas positivas dobles PRPH y TH ubicadas principalmente en los clústeres. (A, inferior) Múltiples marcadores sinmN (canales separados) fueron verificados por la tinción de inmunofluorescencia el día 20. El transportador de noradrenalina (NET1) se encontraba tanto en la superficie de los cuerpos celulares como a lo largo de los axones y dendritas. Se presentó como puntos en este aumento. Todas las imágenes de inmunofluorescencia fueron contrarretidas con DAPI. (B) Mapas de calor representativos del análisis de matriz de multielectrodos (MEA) para symNs el día 20 (arriba). La imagen de campo brillante (abajo) muestra la densidad de los sinmos y la distribución de electrodos (ocho puntos negros). Las poblaciones no ordenadas y CD49D+ se agruparon aquí. (C) Cuantificación de las tasas medias de cocción para el día 20–30 symN sin tratamientos de 1 M de nicotina y 1 M de propranolol durante 5 min, respectivamente (derecha). Los resultados de las poblaciones no ordenadas y CD49d positivas se agruparon (n.o 3). Prueba t de dos colas sin emparejar con corrección de Welch, valor p:*<0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Ejemplo de células en condiciones que son inapropiadas para proceder con la diferenciación. (A) Cronología de la diferenciación con cada punto de control de morfologías celulares indicadas como en BE. (B) hPSCs (a) con colonias sanas y muchas células diferenciadas, y b) fronteras fusionadas y diferenciadas entre algunas colonias el día 0. Las flechas rojas indican las áreas combinadas. (C) CNC en el día 10 con ampollas similares a burbujas en las crestas. Las flechas rojas indican las ampollas en la fila superior. La fila inferior representa una ampliación más alta. No hemos podido identificar la identidad celular de las ampollas. Sin embargo, la presencia de más ampollas parece correlacionarse con una expresión SOX10/CD49D más baja. (D) Esferoides de aspecto irregular que carecen de bordes lisos y forma redonda en el día 14. (E) Sinsersus a y morir sin sistema el día 20. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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Recientemente publicamos dos reseñas, una discutiendo el uso de sínmNs derivados de hPSC para el modelado de enfermedades31, así como una comparación en profundidad de los protocolos de diferenciación disponibles22. Por lo tanto, aquí nos centramos en la solución de problemas del protocolo actual para ayudar al investigador interesado a tener éxito en la fabricación de symNs. Durante todo el proceso de diferenciación, con el fin de obtener datos consistentes, así como células diferenciadas saludables, la contaminación en todas las etapas debe controlarse cuidadosamente. En el mantenimiento rutinario de hPSC, las pruebas de micoplasma se deben realizar quincenalmente o mensualmente. Si la clasificación celular se realiza el día 10, se recomienda encarecidamente la adición de antibióticos a cualquier medio. También es importante comprobar la morfología celular antes y después de comenzar la diferenciación. Aquí, sugerimos varios puntos de control críticos(Figura 6A). En primer lugar, las colonias hPSC ideales listas para la diferenciación deben tener bordes brillantes y lisos con picos diminutos. Las colonias con picos similares a engranajes han comenzado a diferenciarse y no deben utilizarse. Se recomienda encarecidamente que las células en el momento perfecto se utilicen inmediatamente, ya que la morfología puede cambiar en cuestión de horas. Posponer por sólo un día puede estrellar las células(Figura 6B,a ) o conducir al contacto entre colonias(Figura 6B, b), lo que estimula la diferenciación en los hPSC. Es difícil deshacerse de cada célula diferenciada en un cultivo, sin embargo, la población debe ser controlada para contener menos del 5% de las colonias malas. Al seguir este protocolo, el segundo punto de comprobación durante la diferenciación es entre el día 2 y el día 10. En esta etapa, las crestas NC oscuras deben observarse claramente bajo un microscopio de campo brillante(Figura 2C). El espesor y la distribución de las crestas se pueden utilizar como indicadores de eficiencia NC: Debido a que los NCC se derivan principalmente de células que forman las crestas, crestas delgadas o menos extendidas y ampollas en las crestas podrían indicar baja producción de NC, y por lo tanto deben ser marcadas o desechadas en el caso de resultados inconsistentes(Figura 6C). El muestreo de ARN es muy recomendable el día 10 para comprobar los marcadores NC descritos anteriormente. El tercer punto de control es durante la etapa esferoide NC, porque los esferoides pueden agregarse. Lo mejor es canalizar periódicamente el medio para romper y resuspender la agregación (las células no se dispersarán de nuevo a células individuales, sino solo a esferoides pequeños). Si los esferoides se expanden demasiado rápido, divídalos por 1:2 o 1:4 para dejar suficiente espacio y nutrientes para que las células crezcan. Si los esferoides no tienen formas lisas y redondas(Figura 6D),puede indicar que la eficiencia nc en el día 10 no era lo suficientemente alta, y por lo tanto puede arruinar la diferenciación final. Se recomienda probar perfiles de expresión para comprobar las propiedades del progenitor symN en el día de chapado de esferoide deseado. El cuarto punto de control es después de chapar los esferoides. Las neuróitas deben ser claramente visibles y los haces deben comenzar a formarse después del día 20. Las células sin neulitos y paquetes generalizados deben considerarse contaminación(Figura 6E). En este punto, es importante alimentar las neuronas reemplazando sólo la mitad del medio existente para mantener el entorno nutritivo creado por las neuronas estables. Tenga cuidado al alimentar las células, porque los sinmos madurantes son vulnerables y pueden desprenderse fácilmente. La razón de cada una de las morfologías de mal aspecto descritas aquí aún no se entiende completamente. Sin embargo, proporciona información sobre la naturaleza sensible de los hPSC y la diferenciación in vitro. Una fuente de tales irregularidades podría deberse a reactivos de diferentes proveedores. Por ejemplo, las crestas delgadas con ampollas aparecen cuando se utiliza una marca diferente de BMP4.

Para el análisis electrofisiológico utilizando MEA, con el fin de distribuir uniformemente syns en los pozos de electrodos, los esferoides son disociados por Accutase. El tiempo de tratamiento debe ser de 20 minutos para empezar. Sin embargo, debido a que los esferoides están muy compactados, el tiempo de disociación se puede aumentar a 45 minutos para garantizar que los esferoides estén completamente disociados. En general, cada grupo experimental en una placa MEA necesita ser ejecutado en múltiplos de al menos seis para obtener resultados consistentes. En particular, debido a que nuestra densidad para el replating es mucho menor que las recomendaciones del fabricante32 (alrededor de 500-700,000/cm2), las repeticiones de pozos son cruciales. En nuestros resultados, tanto la expresión sustancial del marcador symN como la actividad estable aparecen desde el día 20 hasta el día 30. Recomendamos esto como el mejor punto de tiempo para empezar a grabar las variables de elección. Para cada diferenciación, el medio debe hacerse fresco y utilizarse lo más rápido posible (no más de un mes).

El protocolo de diferenciación symN presentado aquí es libre de alimentador, químicamente definido, eficiente, expandible y produce sinmNfuncionales para el día 20. Este protocolo de diferenciación symN definido podría utilizarse para estudiar los trastornos humanos del sistema nervioso simpático, como una plataforma para la detección de fármacos, para estudios de tumorigenesis como neuroblastoma/feocromocitoma, o para la investigación básica en la regulación homeostática.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría dar las gracias a Heidi Ulrichs por la lectura crítica y la edición del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100 mm cell culture dishes Falcon 353003
15 mL conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-664
24-well tissue culture plates Falcon 353047
24-well ultra-low-attachment plates Corning 07 200 601 and 07 200 602
5% CO2/20% O2 tissue culture incubator Thermo Fisher/Life Technologies Heracell VIOS 160i
50 ml conical tissue culture tubes VWR/Corning 89039-656
6-well tissue culture plates Costar 3516
Accutase Innovation Cell Technologies AT104500 Cell dissociation solution
Anti-AP2a antibody Abcam ab108311 Host: Rabbit; 1:400 dilution
Anti-Ascl1 antibody BD Pharmingen 556604 Host: Mouse IgG1; 1:200 dilution
Anti-CD49D antibody BioLegend 304313 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
Anti-CD49D antibody (isotype) BioLegend 400125 Host: Mouse IgG1; 5 μl/million cells in 100 μl volume
DAPI dye Sigma D9542 1:1000 dilution
Anti-DBH antibody Immunostar 22806 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Anti-GFP antibody Abcam ab13970 Host: Chicken; 1:1000 dilution
Anti-HOXC9 antibody Abcam ab50839 Host: Mouse; 1:100 dilution
Anti-NET1 antibody Mab NET17-1 Host: Mouse; 1:1000 dilution
Anti-PRPH antibody Santa Cruz Biotechnology SC-377093/H0112 Host: Mouse IgG2a; 1:200 dilution
Anti-SOX10 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-365692 Host: Mouse IgG1; 1:100 dilution
Anti-TH antibody Pel-Freez P40101- 150 Host: Rabbit; 1:500 dilution
Ascorbic acid Sigma A8960-5G Stock concentration: 100 mM
B27 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 12587-010 Stock concentration: 50x
BDNF R&D Systems 248-BD Stock concentration: 10 μg/mL
BMP4 R&D Systems 314-BP Stock concentration: 6 mM
Cell counter Thermo Fisher/Life Technologies Countess II
Cell counting chamber slides Invitrogen C10312
Centrifuge Eppendorf 57021&5424R
CHIR99021 R&D Systems 4423 Stock concentration: 6 mM
Cryo-vial Thermo Fisher/Life Technologies 375353
dbcAMP Sigma D0627 Stock concentration: 100 mM
DMEM Thermo Fisher/Life Technologies 10829-018 Stock concentration: 1x
DMEM/F12 Thermo Fisher/Life Technologies 11330-057 Stock concentration: 1x
DMSO Thermo Fisher/Life Technologies BP231-100
E6 medium gibco A15165-01
E8 medium gibco A15169-01 Stock concentration: 1x
E8 supplement gibco A15171-01 Stock concentration: 50x
EDTA Sigma ED2SS Stock concentration: 0.5 M
Electrophysiology plates (AXION cytoview MEA96) Axion BioSystems M768-tMEA-96W
FACS machine Beckman Coulter CytoFLEX (for FACS)
FACS machine Beckman Coulter MoFlo Astrios EQ (for sorting)
FACS tubes (blue filter cap) Falcon 352235
FACS tubes (white cap) Falcon 352063
Fetal bovine serum (FBS) Atlanta Biologicals S11150
GDNF PeproTech 450 Stock concentration: 10 μg/mL
Geltrex Invitrogen A1413202 Basement membrane matrix; Stock concentration: 100x
hPSCs Thomson et al., (1998) WA09
hPSCs Oh et al. (2016) H9-PHOX2B::eGFP
Human fibronectin (FN) VWR/Corning 47743-654 Stock concentration: 1 mg/mL
L-glutamine Thermo Fisher/Gibco 25030-081 Stock concentration: 200 mM
LN tank Custom Biogenic Systems V-1500AB
MEA reader Axion BioSystems Maestro Pro
Mouse laminin I (LM) R&D Systems 3400-010-01 Stock concentration: 1 mg/mL
N2 supplement Thermo Fisher/Life Technologies 17502-048 Stock concentration: 100x
Neurobasal medium gibco 21103-049 Stock concentration: 1x
NGF PeproTech 450-01 Stock concentration: 25 μg/mL
Phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 14190-136 Stock concentration: 1x
Poly-L-ornithine hydrobromide (PO) Sigma P3655 Stock concentration: 15 mg/mL
Primocin (antibiotics) InvivoGen ANTPM1 Stock concentration: 50 mg/mL
qPCR machine Bio-Rad Laboratories C1000 Touch
qPCR plates Bio-Rad Laboratories HSP9601
recombinant FGF2 R&D Systems 233-FB/CF Stock concentration: 10 μg/mL
Retinoic acid Sigma R2625 Stock concentration: 1 mM
SB431542 Tocris/R&D Systems 1614 Stock concentration: 10 mM
Trypan blue Corning MT-25-900-CI
Vitronectin (VTN) Thermo Fisher/Life Technologies A14700 Stock concentration: 0.5 mg/mL
Water bath VWR/Corning 706308
Y27632 R&D Systems 1254 Stock concentration: 10 mM

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References

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Diferenciación eficiente de las neuronas simpáticas postgangliónicas utilizando células madre pluripotentes humanas bajo condiciones de cultivo sin alimentador y definidas químicamente
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Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).More

Wu, H. F., Zeltner, N. Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions. J. Vis. Exp. (159), e60843, doi:10.3791/60843 (2020).

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