Summary
Le but de cet article est de décrire une méthode raffinée d’intubation de la souris de laboratoire. La méthode est non invasive et, par conséquent, idéale pour les études qui nécessitent une surveillance en série de la fonction respiratoire et / ou l’instillation des traitements dans le poumon.
Abstract
La littérature décrit plusieurs méthodes pour l’intubation de souris qui exigent la visualisation des glottis par la cavité orale ou l’incision dans le cou ventral pour la confirmation directe du placement de canule dans la trachée. La difficulté relative ou le trauma tissulaire induit au sujet par de telles procédures peuvent être un obstacle à la capacité d’un investigateur d’effectuer des études longitudinales. Cet article illustre une technique dans laquelle la manipulation physique de la souris suite à l’utilisation d’un dépilatoire pour enlever les cheveux du cou ventral permet la visualisation transcutanée de la trachée pour l’intubation orotracheal indépendamment du degré de peau Pigmentation. Cette méthode est inoffensive pour le sujet et facilement atteint avec une compréhension limitée de l’anatomie murine. Cette approche raffinée facilite l’intubation répétée, qui peut être nécessaire pour surveiller la progression de la maladie ou l’instillation des traitements. L’utilisation de cette méthode peut entraîner une réduction du nombre d’animaux et des compétences techniques nécessaires pour mesurer la fonction pulmonaire dans les modèles de souris des maladies respiratoires.
Introduction
La souris de laboratoire est un modèle animal commun pour les maladies respiratoires humaines. Ainsi, il existe plusieurs méthodes publiées pour l’intubation de souris dans le but de l’instillation des traitements et la mesure de la mécanique respiratoire. La plupart des procédures décrites nécessitent une visualisation des glottes à travers la cavité buccale avec un équipement spécialisé tel qu’un laryngoscope ou une source de lumière à fibres optiques1,2,3,4,5,6,7. Cependant, cela peut être difficile lorsqu’une canule relativement grande est nécessaire, car elle peut obscurcir le point de vue du chercheur. Limjunyawong et coll.8 ont abordé cette préoccupation avec une méthode d’intubation dans laquelle une petite incision cutanée est faite le long de la ligne médiane du cou ventral permettant la visualisation de la trachée. Après la procédure, l’incision est fermée avec adhésif tissulaire.
Pour les études nécessitant de fréquentes intubations répétées, l’incising et la fermeture successifs de ce site exigent le débridement des marges de peau et le trauma de tissu au cou ventral. Le but de l’approche transcutanée de visualisation trachéale à l’intubation orale est de fournir une technique raffinée et non invasive spécifiquement appropriée pour des études répétées d’intubation aussi bien que des événements d’intubation simple chez la souris.
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Protocol
Toutes les activités animales décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université d’État de l’Ohio et ont été menées dans des installations accréditées PAR l’AAALAC.
1. Préparation de la procédure
- Construire la plate-forme d’intubation. Pour atteindre la pente appropriée de la plate-forme, utilisez un liant à 3 anneaux de trois pouces (7,6 cm). Pliez une longueur de 15 à 20 cm de soie de 3-0 ou d’autres matières filantes en deux et adhérez les extrémités du fil au sommet de la plate-forme inclinée avec du ruban adhésif pour créer une boucle de suspension(figure 1).
- Sélectionnez une canule de la taille et de la longueur appropriées.
REMARQUE: Pour une souris de 20 à 30 g, un cathéter de 1 à 1,5 pouce (2,5 à 3,8 cm) de long peut être utilisé. Pour cette étude, des souris BALB/c femelles de 18 semaines et C57BL/6 de 10 semaines (n - 3 de chaque souche) ont été utilisées. Une gaine de cathéter blanc opaque offre la meilleure visualisation transcutanée. - Couper un biseau à l’extrémité distale du cathéter et lisser la surface coupée avec du papier abrasif pour créer une pointe de biseau arrondie. Créer délicatement une légère courbure dans la canule à environ 1 cm du biseau(figure 2).
REMARQUE: Un nouveau cathéter doit être utilisé pour chaque souris. - Anesthésiez la souris avec de la kétamine (5,4 mg/g de poids corporel) et de la xylazine (16 g/g de poids corporel) administrée par voie intrapétotéritoétoïnée. Appliquer la pommade ophalimique stérile sur les yeux.
REMARQUE: Une bonne profondeur anesthésique est obtenue par manque de réponse de la souris à une pincement ferme d’un toe. - Suspendre la souris en position de supine sur la plate-forme d’intubation en accrochant les incisives supérieures autour du fil de soie en haut de la surface inclinée(figure 3). Une fois que la souris est carrément placée dans une inclinaison dorsale, saisissez doucement la base de la queue et rétractez la queue vers la table. Placez un morceau de ruban adhésif sur la base de la queue pour fixer la souris.
- Appliquer de la crème dépilatoire(tableau des matériaux)dans la région ventrale cervicale pendant 30 à 45 s, puis retirer toute la crème dépilatoire de la région cervicale à l’aide d’une gaze sèche. Répéter le processus de demande si nécessaire. Rincer soigneusement la peau avec de l’eau saline ou distillée pour enlever tout résidu puis essuyer sec.
2. Procédure d’intubation
- Utilisez des forceps droits et plats dans la main nondominante pour rétracter doucement la langue d’une manière qui ouvre suffisamment la bouche pour l’introduction de la canule.
REMARQUE: Les forceps de dent de rat ne doivent pas être employés car ceci endommagera la langue. - Avec la main dominante, avancez la canule dans la bouche de telle sorte que la fin qui est distal à la légère courbure est contre le toit de la bouche du sujet.
- Relâchez la langue et faites glisser le bord plat des forceps fermés le long du cou ventral jusqu’à ce que le manubrium soit atteint. Ce mouvement déplace latéralement les glandes salivaires et aplatit le muscle couvrant la trachée. La trachée apparaît transcutanément comme une ligne blanche(figure 3A). Si nécessaire, faites pivoter les forceps dans une direction craniodorsal tout en maintenant la tension sur la peau dans une direction caudale pour faire culminer les glandes salivaires latéralement déplacées. Cette manœuvre crée plus de contraste autour de la trachée(figure 3B).
REMARQUE: Évitez la force excessive sur le cou ventral car il peut effondrer la trachée et altérer la respiration. - Avancez la canule tout en balançant simultanément la pointe distale de la canule ventrally par supination de la main dominante avec une flexion simultanée du poignet.
- Le bon placement de la canule est indiqué par la visualisation de la canule opaque dans la trachée(figure 4B,D). Si la canule a été avancée au-delà du niveau de l’origine du muscle masseur et la visualisation de la canule dans la trachée n’a pas été confirmée, rétracter la canule et réattaciter la manœuvre.
- Confirmer le bon placement de canules en reliant une ampoule d’inflation pulmonaire à la canule et en observant l’expansion thoracique avec la dépression simultanée de l’appareil.
- Sans déplacer la canule, débranchez soigneusement les incisives de la souris de la plate-forme d’intubation. Déplacez la souris vers une plate-forme horizontale (tableau des matériaux) et insérez la canule à l’adaptateur sur le ventilateur. Après l’inflation profonde, ventiler la souris pendant 60 s puis mesurer la résistance respiratoire.
3. Récupération
- Une fois la procédure terminée, déplacez la souris vers une plate-forme réchauffée. Fournir une stimulation constante par l’intermédiaire d’orteils légers ou de pincements de la queue pour encourager la respiration spontanée.
- L’extubation peut se produire lorsque la souris commence à mâcher. Saisissez la canule au niveau du moyeu et tirez doucement le tube de façon craninelle et éloignez-vous de la souris jusqu’à ce que la canule soit complètement retirée de la bouche du sujet.
REMARQUE: Il est préférable de fournir un soutien des voies respiratoires avec la canule rigide aussi longtemps que possible pendant le processus de récupération. - Une fois extubated, transférer la souris dans une cage de récupération propre avec un support thermique. Surveillez continuellement la souris jusqu’à ce qu’elle soit entièrement ambulatoire et que la récupération soit terminée.
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Representative Results
Surveillance en série de la fonction pulmonaire de base
Les souris femelles de 18 semaines BALB/c et C57BL/6 de 10 semaines (n - 3 de chaque souche) ont été intubées à l’aide de la méthode décrite le jour 0, 3, 10 et 17. Après l’intubation de chaque jour, le sujet était relié à un ventilateur mécanique fourni avec 100% d’oxygène(Tableau des matériaux). La résistance respiratoire (Rrs) a été mesurée à l’aide de la technique d’oscillation forcée pour 60 s suivant une inflation profonde à 25 cm H2O tenue pendant 5 s. Aucune erreur logicielle associée à cette prise d’haleine soutenue ainsi que les valeurs Rrs dans la plage physiologique fournissent un soutien supplémentaire pour le placement approprié de la canule. Les données n’ont révélé aucune différence significative de Rrs mesurés observés entre les points de temps dans chaque souche (figure 5). On suppose que l’absence d’une augmentation des Rrs au fil du temps indique le manque à l’inflammation trauma-associée dans le système respiratoire sur quatre points de temps successifs.
Analyse statistique
Les statistiques descriptives (erreur moyenne et standard) ont été calculées àl’aide d’un logiciel d’analyse statistique (Tableau des matériaux). La méthode Kolmogorov-Smirnov a été utilisée pour vérifier la distribution de données gaussiennes. Des analyses statistiques des ensembles de données ont été effectuées par ANOVA non appréré, avec une comparaison multiple post hoc Tukey-Kramer post-test. Toutes les données sont présentées comme moyennes - SEM. P 'lt; 0.05 a été considérée statistiquement significative.
Figure 1 : Plate-forme d’intubation. La plate-forme d’intubation se compose d’un liant à trois anneaux avec une boucle de fil de soie adhéré au haut du classeur pour créer une boucle de suspension. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Préparation des canules. (A) Vue latérale de la canule préparée. Notez l’angle doux créé à environ 1 cm du biseau arrondi à l’extrémité distale du cathéter et l’orientation de l’angle de canule par rapport au biseau. (B) Dorsoventral vue de la canule préparée. Notez le bord arrondi et lissé du biseau. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Visualisation trachéale. (A) Des forceps sont placés sur le cou ventral et la peau est doucement rétractée caudally pour déplacer latéralement les glandes salivaires et fournir une visualisation de la trachée comme une structure blanche sur la ligne médiane ventrale (flèche noire). (B) Rotation craniodorsale des forceps sur le cou ventral crée une saillie des glandes salivaires . La trachée est visualisée comme la structure linéaire blanche sur la ligne médiane ventrale entre les glandes salivaires (flèche noire). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Placement approprié de canule. (A) C57BL/6 souris positionnée sur la plate-forme d’intubation avec la canule introduite dans la cavité buccale proximal. (B) C57BL/6 souris avec la canule correctement placée dans la trachée. Notez que la canule peut être facilement visualisée comme la structure blanche dans la trachée (flèche blanche). (C) BALB/c souris positionné sur le tableau d’intubation avec la canule introduite dans la cavité buccale proximal. (D) BALB/c souris avec la canule correctement placée dans la trachée. La canule blanche peut être facilement visualisée dans la trachée (flèche noire). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Mesure en série de la résistance. Aucune différence significative de Rrs mesurés observées entre les points de temps dans chaque souche. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L’intubation utilisant la technique transcutanée de visualisation trachéale offre une approche raffinée de la méthode standard d’incision de peau. Avec une attention particulière à plusieurs étapes clés, l’intubation peut être facilement et rapidement atteint. L’animal doit être placé carrément dans la récurrence dorsale sur la plate-forme d’intubation avec la souris fixée dans une rétraction douce. Cela étendra l’animal dans l’alignement vertical et le positionnement approprié pour l’intubation. En outre, la crème dépilatoire ne doit pas rester en contact avec la peau de l’animal pendant plus de 30-45 s et doit être soigneusement rincé pour enlever tous les résidus. Le contact prolongé de peau avec la crème dépilatoire causera la douleur inutile pour l’animal et les ulcérations peuvent obstruer la vue de la trachée9. Il est impératif d’utiliser le bon mouvement du poignet que la main dominante introduit le cathéter dans les glottes. Le poignet dominant doit fléchir pendant que la main se déplace dans un mouvement de supination. Il est également essentiel de surveiller le sujet de près que le bord plat des forceps sont pressés sur le cou ventral pour visualiser la trachée. La pression des forceps entraînera la trachée et causera l’hypoxie si elle est maintenue pendant une durée prolongée. Si le patient semble cyanotique, laissez une brève pause pour que les muqueuses reviennent à une couleur rose et que la respiration se stabilise avant de répéter des tentatives.
Une vaste expérience d’intubation de souris n’était pas nécessaire pour exécuter cette technique. Les complications les plus courantes chez les personnes inexpérimentées comprennent le traumatisme laryngique et l’inflammation supérieure des voies respiratoires dues à de multiples tentatives d’intubation. Une surveillance étroite est nécessaire pendant le rétablissement de ces patients car l’intervention médicale avec des anti-inflammatoires non stériles peut être indiquée. Les tentatives répétées infructueuses d’intubation peuvent avoir comme conséquence le trauma de tissu et l’inflammation de la cavité orale distale, qui pourrait avoir comme conséquence le bruit supérieur de respiratoire, la dyspnée, l’hypoxémie, le rétablissement prolongé, l’incapacité d’exécuter l’intubation ou la mort répétées.
Plusieurs modifications sont recommandées dans le cas où l’intubation n’est pas réussie. Tout d’abord, assurez-vous que le biseau de la canule est lisse, arrondi et coupé à la longueur appropriée pour la taille de l’animal. Le bord biseau peut être lissé à l’aide de papier abrasif pour minimiser les traumatismes tissulaires et faciliter l’intubation7. En outre, vérifiez que la canule présente une légère courbe d’environ 15 degrés à un tiers de distance du biseau et que la pointe de la canule est biseautée à un angle de 45 degrés tel que décrit dans Brown et al.6. Vérifiez toujours que le cathéter est dans l’orientation appropriée avant et pendant l’exécution de cette procédure.
Pour cette étude, les souris ont été intubées pour des essais répétés de fonction pulmonaire utilisant un système mécanique de ventilation pour enregistrer des mesures de fonction pulmonaire. Une grande canule de 18 G a été utilisée pour créer un joint serré. Pour effectuer des études répétées de fonction pulmonaire sur des souris avec un diamètre trachéal plus petit en raison de l’âge ou de la souche, il peut être difficile de placer une canule plus grande. Si une canule plus petite est élue pour une utilisation, assurez-vous qu’un sceau approprié peut encore être atteint, et que la résistance de la canule n’est pas plus élevée que la résistance des voies respiratoires du sujet d’essai10. Une perturbation de l’inflation profonde réussie est la confirmation adéquate d’un sceau approprié. Notez qu’un tel joint n’est pas nécessaire si l’on désire seulement l’installation de traitements dans le poumon.
Bien que la méthode décrite ait apporté des modifications qui empêchent des dommages externes de tissu, la limite supérieure de fréquence de l’intubation est toujours fonction du trauma cumulatif aux glottis et à la trachée dues à l’introduction excessive de la canule. La surveillance simultanée d’un groupe témoin pour des augmentations significatives de la résistance des voies respiratoires au cours d’une étude est recommandée puisque le trauma tissulaire est accompagné d’inflammation qui se traduira par une diminution du diamètre luminal de la trachée. Des augmentations significatives de la résistance des voies respiratoires au cours des procédures répétées d’intubation n’ont pas été observées dans la présente étude. Les souris sont restées cliniquement normales pour la durée de l’étude et l’autopsie brute des structures supérieures des voies respiratoires était ordinaire à la conclusion de l’étude chez tous les animaux.
En résumé, la technique décrite d’intubation offre une méthode non invasive pour placer des canlas endotrachéles avec un équipement minimal comprenant une surface inclinée, des forceps, une canule de polypropylène et des approvisionnements dépilatoires. Cette méthode raffinée permet des événements répétés d’intubation sans trauma récurrent de tissu et la douleur liée à un emplacement d’incision cutanée sur le cou ventral ou une procédure de trachéotomie. En outre, cette méthode réduit le nombre de souris requises car les souris individuelles peuvent être intubées à plusieurs reprises tout au long d’une étude. Il élimine également le besoin de dispositifs de retenue d’intubation spécialement conçus, de portées ou d’équipement de transillumination pour la visualisation des voies respiratoires. Des souches BALB/c et C57BL/6 ont été utilisées dans cette étude pour démontrer le succès technique chez les souches et les animaux pigmentés légers et foncés d’un âge relativement jeune et de petite taille (souris de 10 à 20 semaines). Cette technique raffinée convient à l’instillation intratracheal simple ou répétée des composés, au lavage bronchoalvéolaire, à l’imagerie ou aux tests de fonction pulmonaire. Cette méthode peu invasive et polyvalente peut être mise en œuvre pour pratiquement n’importe quelle procédure qui nécessite l’accès aux voies respiratoires inférieures.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph et Lindsey Ferguson pour leur assistance technique et le Laboratoire universitaire des ressources animales pour leur soutien aux soins aux animaux. Ces travaux sont financés par NIH T35OD010977 et R01-HL102469.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
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- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179 (1999).
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- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
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- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
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