Summary
Het doel van dit artikel is het beschrijven van een verfijnde methode van intubatie van de laboratoriummuis. De methode is niet-invasief en daarom ideaal voor studies die seriële controle van de ademhalingsfunctie en/of instillatie van behandelingen in de long vereisen.
Abstract
De literatuur beschrijft verschillende methoden voor muisintubatie die ofwel visualisatie van de glottis door de mondholte of incisie in de ventrale nek vereisen voor directe bevestiging van canuleplaatsing in de luchtpijp. De relatieve moeilijkheid of het weefseltrauma dat door dergelijke procedures aan het onderwerp wordt veroorzaakt, kan een belemmering vormen voor het vermogen van een onderzoeker om longitudinale studies uit te voeren. Dit artikel illustreert een techniek waarbij fysieke manipulatie van de muis na het gebruik van een ontharingsom om haar te verwijderen uit de ventrale nek maakt transcutane visualisatie van de luchtpijp voor orotracheale intubatie ongeacht de mate van de huid Pigmentatie. Deze methode is onschadelijk voor het onderwerp en gemakkelijk bereikt met een beperkt begrip van murine anatomie. Deze verfijnde aanpak vergemakkelijkt herhaalde intubatie, wat nodig kan zijn voor het monitoren van de progressie van de ziekte of de instillatie van behandelingen. Het gebruik van deze methode kan leiden tot een vermindering van het aantal dieren en technische vaardigheden die nodig zijn om de longfunctie te meten in muismodellen van ademhalingsziekten.
Introduction
De laboratoriummuis is een gemeenschappelijk diermodel voor menselijke ademhalingsziekte. Zo zijn er verschillende gepubliceerde methoden voor muisintubatie met het oog op zowel instillatie van behandelingen als meting van ademhalingsmechanica. De meeste van de beschreven procedures vereisen visualisatie van de glottis door de mondholte met gespecialiseerde apparatuur zoals een laryngoscoop of glasvezel lichtbron1,2,3,4,5,6,7. Dit kan echter moeilijk zijn wanneer een relatief grote canule nodig is, omdat het de mening van de onderzoeker kan verduisteren. Limjunyawong et al.8 hebben deze bezorgdheid aangepakt met een methode van intubatie waarbij een kleine cutane incisie wordt gemaakt langs de middellijn van de ventrale nek waardoor de luchtpijp kan worden gevisualiseerd. Na de procedure wordt de incisie afgesloten met weefsellijm.
Voor studies die frequente herhaalde intubaties vereisen, vereist opeenvolgende inbedding en sluiting van deze site debridement van de huidmarges en weefseltrauma aan de ventrale nek. Het doel van de transcutane tracheale visualisatie benadering van orale intubatie is om een verfijnde, niet-invasieve techniek te bieden die specifiek geschikt is voor herhaalde intubatiestudies en enkele intubatiegebeurtenissen bij muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier beschreven dierlijke activiteiten zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Ohio State University en werden uitgevoerd in AAALAC-geaccrediteerde faciliteiten.
1. Procedurevoorbereiding
- Bouw het intubatieplatform. Gebruik een 3-ringbindmiddel van 7,6 cm om de juiste helling van het platform te bereiken. Vouw een 15−20 cm lengte van 3-0 zijde of andere draad materiaal in de helft en hecht de uiteinden van de draad aan de bovenkant van het hellende platform met tape om een ophanging lus te creëren (Figuur 1).
- Selecteer een canule van de juiste grootte en lengte.
LET OP: Voor een 20−30 g muis kan een 1−1,5 inch (2,5−3,8 cm) lange katheter tot 18 G worden gebruikt. Voor deze studie werden 18 weken oude vrouwelijke BALB/c en 10 weken oude C57BL/6 muizen (n = 3 van elke stam) gebruikt. Een ondoorzichtige witte katheterschede zorgt voor de beste transcutane visualisatie. - Snijd een schuine kant op de distale punt van de katheter en maak het snijoppervlak glad met schuurpapier om een afgeronde schuine punt te creëren. Maak voorzichtig een lichte bocht in de canule ongeveer 1 cm van de schuine kant (Figuur 2).
LET OP: Voor elke muis moet een nieuwe katheter worden gebruikt. - Verdoof de muis met ketamine (5,4 mg/g lichaamsgewicht) en xylazine (16 μg/g lichaamsgewicht) intraperitoneally toegediend. Breng steriele oogheelkundige zalf aan op de ogen.
LET OP: Juiste verdovingsdiepte wordt bereikt door gebrek aan reactie van de muis op een stevige teensnuif. - Hang de muis in een supine positie op het intubatieplatform door het aansluiten van de bovenste incisors rond de zijden draad aan de bovenkant van het schuine oppervlak (Figuur 3). Zodra de muis vierkant is gepositioneerd in dorsale recumbency, voorzichtig grijpen de basis van de staart en trek de staart naar de tafel. Plaats een stuk tape over de basis van de staart om de muis te beveiligen.
- Breng ontharingscrème (Table of Materials) aan op het ventrale cervicale gebied voor 30−45 s verwijder vervolgens alle ontharingscrème uit het cervicale gebied met behulp van een droog gaas. Herhaal indien nodig een aanvraagprocedure. Spoel de huid grondig af met zout of gedestilleerd water om eventuele resten te verwijderen en veeg vervolgens droog.
2. Intubatieprocedure
- Gebruik rechte, platte tangen in de niet-dominante hand om de tong voorzichtig in te trekken op een manier die de mond voldoende opent voor de introductie van de canule.
LET OP: Rattentandtangen mogen niet worden gebruikt omdat dit de tong zal beschadigen. - Met de dominante hand, vooraf de canule in de mond zodanig dat het uiteinde dat distaal is aan de lichte bocht is tegen het dak van de mond van het onderwerp.
- Laat de tong los en schuif de vlakke rand van de gesloten tangen caudally langs de ventrale hals totdat het manubrium is bereikt. Deze beweging verdringt lateraal de speekselklieren en vlakt de spier die de luchtpijp bedekt af. De luchtpijp verschijnt transcutaneously als witte lijn (Figuur 3A). Indien nodig, draai de tangen in een craniodorsal richting met behoud van spanning op de huid in een caudal richting om de lateraal verplaatste speekselklieren te laten pieken. Deze manoeuvre zorgt voor meer contrast rond de luchtpijp (Figuur 3B).
LET OP: Vermijd overmatige kracht op de ventrale nek als het kan instorten van de luchtpijp en afbreuk doen aan de ademhaling. - Ga verder met de canule terwijl u tegelijkertijd de distale punt van de canule ventrally hengelt door supinatie van de dominante hand met gelijktijdige flexie van de pols.
- De juiste plaatsing van de canule wordt aangegeven door visualisatie van de ondoorzichtige canule in de luchtpijp (Figuur 4B,D). Als de canule is gevorderd voorbij het niveau van de oorsprong van de masseter spier en visualisatie van de canule in de luchtpijp is niet bevestigd, trek de canule en probeer de manoeuvre.
- Bevestig de juiste canule plaatsing door het aansluiten van een longinflatie lamp aan de canule en het observeren van thoracale expansie met gelijktijdige depressie van het apparaat.
- Zonder de canule te verplaatsen, sluit u de incisors van de muis voorzichtig los van het intubatieplatform. Beweeg de muis naar een horizontaal platform(Tabel van materialen)en plaats de canule op de adapter op de ventilator. Na de diepe inflatie, ventileer de muis voor 60 s en meet vervolgens de ademhalingsweerstand.
3. Herstel
- Zodra de procedure is voltooid, verplaatst u de muis naar een opgewarmd platform. Zorg voor constante stimulatie via lichte teen of staartpjes om spontane ademhaling aan te moedigen.
- Extubatie kan optreden wanneer de muis net begint te kauwen. Pak de canule op het niveau van de naaf en trek de buis voorzichtig craniaal en uit de buurt van de muis totdat de canule volledig uit de mond van het onderwerp is verwijderd.
LET OP: Het verdient de voorkeur om de starre canule zo lang mogelijk tijdens het herstelproces te ondersteunen bij de luchtweg. - Eenmaal geëstubeerd, breng de muis naar een schone herstelkooi met warmtesteun. Controleer de muis continu totdat deze volledig ambulant is en het herstel is voltooid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Seriële bewaking van de uitgangslongfunctie
Achttien weken oude vrouwelijke BALB/c en 10 weken oude C57BL/6 muizen (n = 3 van elke stam) werden geïntubeerd met behulp van de beschreven methode op dag 0, 3, 10 en 17. Na intubatie op elke dag, werd het onderwerp aangesloten op een mechanische ventilator geleverd met 100% zuurstof (Tabel van materialen). Ademhalingsweerstand (Rrs) werd gemeten met behulp van de geforceerde oscillatietechniek voor 60 s na een diepe inflatie tot 25 cm H2O gehouden voor 5 s. Geen software fouten in verband met deze aanhoudende adem te houden samen met Rrs waarden binnen fysiologischbereik bieden extra ondersteuning voor een goede plaatsing van de canule. Uit gegevens bleek dat er geen significante verschillen waren tussen gemeten Rrs tussen de tijdspunten binnen elke stam (figuur 5). Aangenomen wordt dat de afwezigheid van een toename van Rrs na verloop van tijd duidt op gebrek aan trauma-geassocieerde ontsteking in het ademhalingssysteem gedurende vier opeenvolgende tijdspunten.
Statistische analyse
Beschrijvende statistieken (gemiddelde en standaardfout) werden berekend met behulp van statistische analysesoftware(Tabel van materialen). De Kolmogorov-Smirnov methode werd gebruikt om de Gaussian data distributie te verifiëren. Statistische analyses van datasets werden gemaakt door ongepaarde ANOVA, met een post hoc Tukey-Kramer meervoudige vergelijking post-test. Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.
Figuur 1: Intubatieplatform. Het intubatieplatform bestaat uit een bindmiddel met drie ringen met een lus van zijdedraad die aan de bovenkant van het bindmiddel is gehecht om een ophangingslus te creëren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Canule voorbereiding. (A) Zijdelingse weergave van de voorbereide canule. Let op de zachte hoek gemaakt ongeveer 1 cm van de afgeronde schuine kant aan het distale uiteinde van de katheter en de oriëntatie van de canule hoek ten opzichte van de schuine kant. bB) Dorsoventral mening van de voorbereide canule. Let op de afgeronde en gladgestreken rand van de schuine kant. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Tracheale visualisatie. (A) Tangen worden geplaatst op de ventrale nek en de huid wordt voorzichtig ingetrokken caudally om lateraal verdringen de speekselklieren en bieden visualisatie van de luchtpijp als een witte structuur op de ventrale middellijn (zwarte pijl). (B) Craniodorsal rotatie van de tang op de ventrale nek creëert een uitsteeksel van de speekselklieren (*). De luchtpijp wordt gevisualiseerd als de witte lineaire structuur op de ventrale middellijn tussen de speekselklieren (zwarte pijl). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Juiste canule plaatsing. (A) C57BL/6 muis geplaatst op het intubatieplatform met de canule in de proximale mondholte. (B) C57BL/6 muis met de canule goed geplaatst in de luchtpijp. Let op de canule kan gemakkelijk worden gevisualiseerd als de witte structuur in de luchtpijp (witte pijl). (C) BALB/c muis geplaatst op de intubatie plaat met de canule geïntroduceerd in de proximale mondholte. dD) BALB/c muis met de canule goed geplaatst in de luchtpijp. De witte canule kan gemakkelijk worden gevisualiseerd in de luchtpijp (zwarte pijl). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Seriële meting van de weerstand. Geen significante verschillen van gemeten Rrs waargenomen tussen de tijdspunten binnen elke stam. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intubatie met behulp van de transcutane tracheale visualisatie techniek biedt een verfijnde benadering van de standaard huid incisie methode. Met speciale aandacht voor verschillende belangrijke stappen kan intubatie gemakkelijk en snel worden bereikt. Het dier moet vierkant in dorsale recumbency op het intubatieplatform worden geplaatst met de muis die in zachte intrekking wordt vastgezet. Dit zal het dier in verticale uitlijning en de juiste positionering voor intubatie uit te breiden. Bovendien mag de ontharingscrème niet langer dan 30−45 s in contact blijven met de huid van het dier en grondig worden gespoeld om alle residu te verwijderen. Langdurig huidcontact met de ontharingscrème zal onnodige pijn veroorzaken voor het dier en zweren kunnen het zicht op de luchtpijp9belemmeren. Het is noodzakelijk om de juiste polsbeweging te gebruiken als de dominante hand introduceert de katheter in de glottis. De dominante pols moet buigen terwijl de hand beweegt in een supinatie beweging. Het is ook van cruciaal belang om het onderwerp nauwlettend te volgen als de platte rand van de tangen worden gedrukt op de ventrale nek om de luchtpijp te visualiseren. Druk van de tangen zal de luchtpijp occlude en hypoxie veroorzaken indien gehandhaafd voor een langere duur. Als de patiënt cyanotisch verschijnt, laat een korte pauze voor slijmvliezen om terug te keren naar een roze kleur en voor de ademhaling te stabiliseren voordat herhalen pogingen.
Uitgebreide muisintubatie ervaring was niet nodig om deze techniek uit te voeren. De meest voorkomende complicaties bij onervaren personen zijn laryngeal trauma en bovenste luchtwegontsteking als gevolg van meerdere intubatiepogingen. Nauwlettend toezicht is noodzakelijk tijdens het herstel van deze patiënten als medische interventie met niet-steroïde ontstekingsremmers kan worden aangegeven. Herhaalde mislukte intubatiepogingen kunnen leiden tot weefseltrauma en ontsteking van de distale mondholte, wat kan leiden tot bovenste ademhalingslawaai, dyspneu, hypoxemie, langdurig herstel, onvermogen om herhaalde intubatie of de dood uit te voeren.
Verschillende wijzigingen worden aanbevolen in het geval dat intubatie niet succesvol is. Zorg er eerst voor dat de schuine kant van de canule glad, afgerond en op de juiste lengte wordt gesneden voor de grootte van het dier. De schuine rand kan worden gladgestreken met behulp van schuurpapier om weefseltrauma te minimaliseren en intubatie te vergemakkelijken7. Controleer bovendien of de canule een lichte curve van ongeveer 15° vertoont op een derde afstand van de schuine kant en de punt van de canule wordt afgeschuind onder een hoek van 45°, zoals beschreven in Brown et al.6. Controleer altijd of de katheter voor en tijdens het uitvoeren van deze procedure in de juiste richting staat.
Voor deze studie werden muizen geïntubeerd voor herhaalde longfunctietests met behulp van een mechanisch ventilatiesysteem om longfunctiemetingen vast te leggen. Een grote canule van 18 G werd gebruikt om een strakke afdichting te creëren. Om herhaalde longfunctiestudies uit te voeren op muizen met een kleinere tracheale diameter als gevolg van leeftijd of stam, kan het een uitdaging zijn om een grotere canule te plaatsen. Als een kleinere canule wordt gekozen voor gebruik, zorg ervoor dat een goede afdichting nog steeds kan worden bereikt, en dat de weerstand van de canule niet hoger is dan de weerstand van de luchtwegen van de proefpersoon10. Een succesvolle diepe inflatieverstoring is een adequate bevestiging van een geschikt zegel. Houd er rekening mee dat een dergelijke afdichting niet nodig is als alleen de installatie van behandelingen in de long gewenst is.
Hoewel de beschreven methode wijzigingen heeft aangebracht die externe weefselschade voorkomen, is de bovengrens van de frequentie van intubatie nog steeds een functie van cumulatief trauma aan de glottis en luchtpijp als gevolg van overmatige introductie van de canule. Gelijktijdige monitoring van een controlegroep voor significante toename van de luchtwegweerstand tijdens een studie wordt aanbevolen omdat weefseltrauma gepaard gaat met ontstekingen die zullen resulteren in een verminderde armatuurdiameter van de luchtpijp. In de huidige studie werden in de huidige studie geen significante toenamevan de luchtwegweerstand waargenomen in de loop van herhaalde intubatieprocedures. Muizen bleven klinisch normaal voor de studieduur en de bruto obductie van de bovenste luchtwegen structuren was onopvallend bij studie conclusie in alle dieren.
Samengevat biedt de beschreven intubatietechniek een niet-invasieve methode voor het plaatsen van endotracheale canule's met minimale apparatuur, waaronder een hellend oppervlak, tangen, een polypropyleencanulea en ontharingsmiddelen. Deze verfijnde methode maakt herhaalde intubatie gebeurtenissen zonder terugkerende weefsel trauma en pijn in verband met een cutane incisie plaats op de ventrale nek of een tracheotomie procedure. Bovendien vermindert deze methode het aantal muizen dat nodig is, omdat individuele muizen herhaaldelijk kunnen worden geïntubeerd in de loop van een studie. Het elimineert ook de noodzaak van speciaal ontworpen intubatiebevestigingsapparaten, scopes of transilluminaterapparatuur voor luchtwegvisualisatie. BALB/c en C57BL/6 stammen werden in deze studie gebruikt om technieksucces aan te tonen bij zowel lichte als donker gepigmenteerde stammen en dieren van een relatief jonge leeftijd en kleine omvang (10-20 weken oude muizen). Deze verfijnde techniek is geschikt voor enkele of herhaalde intratracheale instillatie van verbindingen, bronchoalveolar lavage, beeldvorming of longfunctie testen. Deze minimaal invasieve, veelzijdige methode kan worden geïmplementeerd voor vrijwel elke procedure die toegang tot de onderste luchtwegen vereist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs bedanken Lucia Rosas, Lauren Doolittle, Lisa Joseph en Lindsey Ferguson voor hun technische bijstand en het University Laboratory Animal Resources voor hun ondersteuning bij de verzorging van dieren. Dit werk wordt gefinancierd door NIH T35OD010977 en R01-HL102469.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179 (1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107 (2013).
