Summary
Целью данной статьи является описание утонченного метода интубации лабораторной мыши. Метод является неинвазивным и, следовательно, идеально подходит для исследований, которые требуют последовательного мониторинга дыхательной функции и / или зависания лечения в легких.
Abstract
Литература описывает несколько методов интубации мыши, которые либо требуют визуализации glottis через полость рта или разрез в брюшной шее для прямого подтверждения размещения канюли в трахее. Относительная трудность или травма тканей, вызванная предметом такими процедурами, может быть препятствием для способности следователя проводить продольные исследования. Эта статья иллюстрирует технику, в которой физические манипуляции с мышью после использования депиляции для удаления волос из брюшной шеи позволяет транскожную визуализацию трахеи для оротрахальной интубации, независимо от степени кожи Пигментации. Этот метод безобиден для предмета и легко достигается с ограниченным пониманием анатомии мурин. Этот изысканный подход облегчает повторную интубацию, которая может быть необходима для мониторинга прогрессирования заболевания или зависания лечения. Использование этого метода может привести к сокращению количества животных и технических навыков, необходимых для измерения функции легких в мышиных моделях респираторных заболеваний.
Introduction
Лабораторная мышь является общей моделью животных для респираторных заболеваний человека. Таким образом, существует несколько опубликованных методов интубации мыши с целью как зависания процедур, так и измерения дыхательной механики. Большинство описанных процедур требуют визуализации glottis через полость рта со специализированным оборудованием, таким как ларингоскоп или волоконно-оптический источник света1,2,3,,4,,55,6,7. Однако, это может быть трудно, когда требуется относительно большая канюля, так как она может скрыть мнение исследователя. Limjunyawong et al.8 обратились к этой проблеме с помощью метода интубации, при котором небольшой кожный разрез делается вдоль средней линии брюшной шеи, позволяющей визуализировать трахею. После процедуры разрез закрывается клеем ткани.
Для исследований, требующих частых повторных интубации, последовательное обрезка и закрытие этого участка требует дебридирования кожи края и травмы тканей брюшной шеи. Цель юрисподхода к визуализации транскожной трахеи к устной интубации заключается в предоставлении усовершенствованной, неинвазивной техники, специально подходящей для повторных исследований интубации, а также одиночных интубации у мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все виды деятельности животных, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Университета штата Огайо и проводились в аккредитованных AAALAC учреждениях.
1. Процедура подготовки
- Постройте интубную платформу. Для достижения соответствующего наклона платформы используйте трехдюймовый (7,6 см) 3-кольцевый связующий. Сложите длину 15–20 см в длину 3-0 шелка или другого материала нити пополам и привяжите концы нити к верхней части наклонной платформы лентой, чтобы создать петлю подвески(рисунок 1).
- Выберите канюли соответствующего размера и длины.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мыши длиной 20–30 г можно использовать катетер длиной от 20 до 30 г. Для этого исследования были использованы 18 недельные самки BALB/c и 10-недельные мыши C57BL/6 (n no 3 каждого штамма). Непрозрачный белый катетер оболочки обеспечивает лучшую транскожную визуализацию. - Вырежьте скобы на дистальном кончике катетера и разгладьте поверхность разреза абразивной бумагой, чтобы создать округлый кончик скотоводства. Аккуратно создайте небольшой изгиб в канюле примерно на 1 см от скобелевк(рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши следует использовать новый катетер. - Анестезируйте мышь кетамин (5,4 мг/г массы тела) и ксилазин (16 мкг/г массы тела) вводят интраперитонеально. Нанесите стерильную офтальмологическую мазь на глаза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная глубина анестезии достигается за счет отсутствия реакции мыши на твердую щепотку ног. - Приостановить мышь в положении на спине на интубации платформы, зацепив верхние резцы вокруг шелковой нити в верхней части угловой поверхности (Рисунок 3). После того, как мышь прямо расположен в подошве лежачих, аккуратно схватить основание хвоста и втянуть хвост к столу. Поместите кусок ленты над основанием хвоста, чтобы обеспечить мышь.
- Нанесите крем для депилатория(Таблица материалов)в брюшной шейки матки в течение 30-45 с, затем удалить все крем для депиляции из шейки матки с помощью сухой марли. Повторите процесс подачи заявки, если это необходимо. Тщательно промыть кожу сольник или дистиллированной воды, чтобы удалить любые остатки затем протрите сухой.
2. Процедура интубации
- Используйте прямые, плоские щипцы в недоминирующей стороны, чтобы осторожно втянуть язык таким образом, что достаточно открывает рот для введения канюли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крысиные зубные щипчи не должны использоваться, так как это повредит язык. - С доминирующей рукой, заранее канюли в рот так, что конец, который является дистальным к небольшому изгибу против крыши рта субъекта.
- Отпустите язык и сдвиньте плоский край закрытых щипц вдоль брюшной шеи до тех пор, пока манубриум не будет достигнут. Это движение боково вытесняет слюнные железы и выравнивает мышцы, покрывающие трахею. Трахея появляется транскожно, как белая линия(рисунок 3A). При необходимости поверните щипцы в направлении черепадора, сохраняя при этом напряжение на коже в каудальном направлении, чтобы вызвать боковое смещенные слюнные железы к пику. Этот маневр создает больше контраста вокруг трахеи(рисунок 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте чрезмерной силы на брюшной шее, так как она может разрушить трахею и ухудшить дыхание. - Предварительный канюли в то время как одновременно рыбалка дистальный кончик канюли ventrally путем supination доминирующей стороны с одновременным сгибанием запястья.
- Надлежащее размещение канюли указывается на визуализацию непрозрачной канюли в трахее(рисунок 4B,D). Если канюля была выдвинута мимо уровня происхождения массыции мышц и визуализации канюли в трахееи не было подтверждено, отказаться от канюли и повторного маневра.
- Подтвердите правильное размещение канюли, подключив лампу инфляции легких к канюле и наблюдая грудное расширение с одновременной депрессией устройства.
- Не вытесняя канюлу, тщательно отцепляйте резцы мыши с интубирующей платформы. Переместите мышь на горизонтальную платформу(Таблица материалов)и вставьте канюлю в адаптер на вентиляторе. После глубокой инфляции, проветрить мышь в течение 60 с затем измерить сопротивление дыхания.
3. Восстановление
- Как только процедура будет завершена, переместите мышь на разогретую платформу. Обеспечить постоянную стимуляцию через легкий нос или хвост щепотки для поощрения спонтанного дыхания.
- Экстубация может произойти, когда мышь только начинает жевать. Возьмите канюль на уровне концентратора и осторожно потяните трубку кранистом и от мыши, пока канюля не будет полностью удалена из рта субъекта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтительно обеспечить поддержку дыхательных путей жесткой канюлей как можно дольше во время процесса восстановления. - После экстубации перенесите мышь в чистую клетку восстановления с тепловой поддержкой. Непрерывно следите за мышью до тех пор, пока она не будет полностью амбулаторной, и восстановление завершено.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Серийный мониторинг исходной легочной функции
Восемнадцатинедельная самка BALB/c и 10-недельная мышь C57BL/6 (n no 3 каждого штамма) были интубированы с помощью описанного метода в день 0, 3, 10 и 17. После интубации на каждый день, предмет был подключен к механической вентилятора поставляется со 100% кислорода(Таблица материалов). Дыхательная устойчивость (Rrs) была измерена с использованием метода принудительного колебания в течение 60 с после глубокой инфляции до 25 см H2O, удерживаемой в течение 5 с. Никакие программные ошибки, связанные с этим устойчивым затмевом дыхания вместе с значениями Rrs в пределах физиологического диапазона, не обеспечивают дополнительную поддержку для правильного размещения канюли. Данные не выявили существенных различий измеренных Rrs наблюдается между точками времени в рамках каждого штамма (Рисунок 5). Предполагается, что отсутствие увеличения Rrs с течением времени указывает на отсутствие травмосвязанных воспаление в дыхательной системе в течение четырех последовательных точек времени.
Статистический анализ
Описательная статистика (средняя и стандартная погрешность) была рассчитана с помощью программного обеспечения статистического анализа(Таблица материалов). Для проверки распределения гаусских данных использовался метод Колмогорова-Смирнова. Статистический анализ наборов данных был сделан непарной ANOVA, с пост-специального Tukey-Kramer несколько сравнения после теста. Все данные представлены в виде среднего значения - SEM. P qlt; 0,05 был признан статистически значимым.
Рисунок 1: Интубная платформа. Интубная платформа состоит из трехкольцевого связующего с петлей шелковой нити, прилипшой к верхней части связующего для создания петли подвески. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Подготовка Каннулы. (A)Боковой вид на подготовленную канюлу. Обратите внимание на нежный угол, созданный примерно в 1 см от закругленный скобы на дистальном конце катетера и ориентации угла канюли по отношению к скову. (B) Дорсовентральный вид на подготовленную канюльу. Обратите внимание на закругленный и сглаженный край скобы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Визуализация трахеи. (A) Forceps помещены на брюшной шее и кожа нежно втягивается caudally, чтобы боково вытеснить слюнных желез и обеспечить визуализацию трахеи, как белая структура на брюшной средней линии (черная стрелка). (B) Краниодорсаль вращения щипцы на брюшной шее создает выступ слюнных желез (к). Трахея визуализируется как белая линейная структура на брюшной средней линии между слюнными железами (черная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Правильное размещение канюли. (A) Мышь C57BL/6 расположена на интубации платформы с канюлей, введенной в проксимальной полости рта. (B) C57BL/6 мышь с канюлей правильно помещены в трахею. Обратите внимание, канюля может быть легко визуализирована как белая структура внутри трахеи (белая стрелка). (C) BALB/c мышь расположена на интубационной доске с канюлей, введенной в проксимальной полости рта. (D) BALB/c мышь с канюлей правильно помещены в трахею. Белая канюля может быть легко визуализирована в трахееее (черная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Серийное измерение сопротивления. Нет значительных различий измеряется Rrs наблюдается между точками времени в каждом штамме. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Интубация с использованием транскожной методики визуализации трахеи предлагает изысканный подход к стандартному методу разреза кожи. При особом внимании к нескольким ключевым шагам интубация может быть легко и быстро достигнута. Зверь должен быть помещен прямо в подошве лежачих на интубации платформы с мышью обеспеченных в нежном опровержения. Это расширит животное в вертикальное выравнивание и правильное позиционирование для интубации. Кроме того, крем для депилационного крема не должен оставаться в контакте с кожей животного дольше 30–45 с и должен быть тщательно промыт, чтобы удалить все остатки. Расширенный контакт кожи с кремом для депилатория вызовет ненужную боль для животного и язвы могут препятствовать виду трахеи9. Крайне важно использовать надлежащее движение запястья, как доминирующая рука вводит катетер в glottis. Доминирующее запястье должно сгибаться в то время как рука движется в движении супинации. Также важно внимательно следить за объектом, так как плоский край щипцев нажат на брюшную шею, чтобы визуализировать трахею. Давление от щипц будет окклюзии трахеи и вызвать гипоксию, если поддерживается в течение длительного времени. Если у пациента появляется цианотический, позвольте краткой паузе для слизистых оболочек, чтобы вернуться к розовому цвету и для дыхания, чтобы стабилизироваться перед повторением попыток.
Обширный опыт интубации мыши не было необходимо для выполнения этой техники. Наиболее распространенные осложнения у неопытных людей включают травмы гортани и воспаление верхних дыхательных путей из-за нескольких попыток интубации. При выздоровлении этих пациентов необходим тщательный мониторинг, так как может быть указано медицинское вмешательство с нестероидными противовоспалительными средствами. Повторные неудачные попытки интубации могут привести к травме тканей и воспалению дистальной полости рта, что может привести к шуму верхних дыхательных путей, одышке, гипоксемии, длительному выздоровлению, неспособности выполнять повторяющиеся интубации или смерть.
Несколько изменений рекомендуется в случае, если интубация не является успешной. Во-первых, обеспечить сколожку канюли гладкой, округлые и сократить до соответствующей длины для размера животного. Ограненный край может быть сглажен с помощью абразивной бумаги, чтобы свести к минимуму травмы тканей и облегчить интубацию7. Кроме того, убедитесь, что канюля экспонатов небольшая кривая примерно 15 "на одной трети расстояния от скобы и кончик канюли скошенный под углом 45 ", как описано в Браун и др.6. Всегда проверяйте, что катетер находится в надлежащей ориентации до и при выполнении этой процедуры.
Для этого изучения, мыши были intubated для повторных испытаний функции легкя используя механическую систему вентиляции для того чтобы записать измерения функции легкя. Для создания плотной уплотнения была использована большая, 18 г канюла. Для выполнения повторных исследований функции легких на мышах с меньшим диаметром трахеи из-за возраста или деформации, это может быть сложной задачей, чтобы поместить большую канюлю. Если меньше канюли избирается для использования, убедитесь, что надлежащее уплотнение все еще может быть достигнуто, и что сопротивление канюли не выше, чем сопротивление дыхательных путей испытуемых10. Успешное глубокое возмущение инфляции является адекватным подтверждением соответствующего уплотнения. Обратите внимание, что такая печать не нужна, если только установка лечения в легких желательно.
Хотя описанный метод внес изменения, которые предотвращают повреждение внешней ткани, верхний предел частоты интубации по-прежнему является функцией кумулятивной травмы глоттиса и трахеи из-за чрезмерного введения канюли. Одновременное наблюдение контрольной группы для значительного увеличения устойчивости к дыхательным пути во время исследования рекомендуется, так как травма тканей сопровождается воспалением, которое приведет к снижению светящегося диаметра трахеи. Значительного повышения устойчивости дыхательных путей в ходе повторных процедур интубации в текущем исследовании не наблюдалось. Мыши оставались клинически нормальными для продолжительности исследования и валовой некропсии верхних структур дыхательных путей был ничем не примечательным при заключении исследования у всех животных.
Таким образом, описанная технология интубации предлагает неинвазивный метод размещения эндотрахельных канюлей с минимальным оборудованием, включая наклонную поверхность, щипцы, полипропиленовые канюли и депиляционные запасы. Этот усовершенствованный метод позволяет повторять события интубации без рецидивирующей травмы ткани и боли, связанной с кожным участком разреза на брюшной шее или процедурой трахеотомии. Кроме того, этот метод уменьшает количество мышей, необходимых в качестве отдельных мышей могут быть неоднократно интубированы в течение всего исследования. Это также устраняет необходимость в специально разработанных интубационных удерживающих устройствах, прицелов или трансиллиосвещения оборудования для визуализации дыхательных путей. Штаммы BALB/c и C57BL/6 были использованы в этом исследовании, чтобы продемонстрировать успех техники как у светлых, так и у темных пигментированных штаммов и животных относительно молодого возраста и небольшого размера (10–20 недельных мышей). Этот усовершенствованный метод подходит для однократного или повторного внутрипеченочного зависания соединений, бронхоальвеолярной проважа, визуализации или тестирования функций легких. Этот минимально инвазивный, универсальный метод может быть реализован практически для любой процедуры, которая требует доступа к нижним дыхательным путям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят Люсию Розас, Лорен Дулиттл, Лизу Джозеф и Линдси Фергюсон за техническую помощь и университетскую лабораторию животных ресурсов за поддержку по уходу за животными. Эта работа финансируется NIH T35OD010977 и R01-HL102469.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179 (1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107 (2013).
