Summary
המטרה של מאמר זה היא לתאר שיטה מעודנת של צנרור העכבר המעבדה. השיטה אינה פולשנית, ולכן אידיאלית למחקרים הדורשים ניטור סדרתי של תפקודי הנשימה ו/או הערכת טיפולים בריאה.
Abstract
הספרות מתארת מספר שיטות לצנרור העכבר המחייב הדמיה של הגלוטיס דרך חלל הפה או החתך בצוואר הגחוני לאישור ישיר של צינורית המיקום בקנה הנשימה. הקושי היחסי או טראומת הרקמה הנגרמת לנושא על ידי הליכים כאלה יכול להיות מכשול ליכולת של חוקר לבצע לימודי אורך. מאמר זה ממחיש טכניקה שבה מניפולציה פיזית של העכבר בעקבות השימוש דפילציה כדי להסיר שיער מפני הצוואר הגחוני היתרי ויזואליזציה של קנה הנשימה עבור צנרור הקנה מידה ללא קשר למידת העור פיגמנטציה. שיטה זו אינה מזיק לנושא ומושגת בקלות בהבנה מוגבלת של אנטומיה מורבית. גישה מעודנת זו מקלה על צנרור חוזר, אשר עשוי להיות נחוץ לניטור ההתקדמות של המחלה או החוסר הטיפול בטיפולים. שימוש בשיטה זו עלול לגרום לירידה של מספר בעלי החיים והמיומנות הטכנית נדרש למדוד את תפקוד הריאות בדגמי העכבר של מחלת הנשימה.
Introduction
עכבר המעבדה הוא מודל נפוץ בעלי חיים למחלת הנשימה האנושית. לפיכך, ישנן מספר שיטות שפורסמו עבור צנרור העכבר לצורך הן החוסר של טיפולים ומדידה של מכניקת הנשימה. רוב ההליכים המתוארים דורשים ויזואליזציה של glottis דרך חלל הפה עם ציוד מיוחד כגון לרינגוסקופ או מקור האור סיבים אופטיים1,2,3,4,5,6,7. עם זאת, זה יכול להיות קשה כאשר צינורית גדולה יחסית נדרש, כפי שהוא יכול לטשטש את ההשקפה של החוקר. לימוזין ואח '8 התייחסו דאגה זו עם שיטה של צנרור שבו חתך עורית קטן מורכב לאורך קו האמצע של הצוואר הגחוני המאפשר ויזואליזציה של קנה הנשימה. בעקבות ההליך, החתך סגור עם דבק רקמה.
למחקרים הדורשים הזנה חוזרת ונשנית של האתר, מחייב ביתור וסגירה רצופים של שולי העור ופגיעת רקמות בצוואר הגחון. מטרת הגישה ויזואליזציה של קנה הנשימה הטרנסעורית לצנרור אוראלי היא לספק טכניקה מעודנת, לא פולשנית המתאימה במיוחד למחקרי צנרור חוזרות ולאירועי צנרור בודדים בעכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפעילויות בעלי חיים המתוארים כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת אוהיו ונערכו במתקנים מוסמכים AAALAC.
1. הכנה לפרוצדורה
- . בנו את פלטפורמת הצנרור כדי להשיג את מדרון הפלטפורמה המתאים, השתמש באוגדן בגודל 3 אינץ ' (7.6 ס מ). מקפלים 15 כדי 20 ס מ באורך של 3-0 משי או חומר חוט אחר במחצית ולדבוק את קצות החוט לחלק העליון של פלטפורמת נוטה עם קלטת ליצור לולאה ההשעיה (איור 1).
- בחרו צינורית בגודל ובאורך המתאימים.
הערה: עבור a 20-30 גרם עכבר, a 1-1.5 אינץ ' (2.5-3.8 ס מ) ארוך קטטר עד 18 G ניתן להשתמש. עבור מחקר זה, 18 שבוע נקבה BALB/c ו 10-שבוע-בן C57BL/6 עכברים (n = 3 של כל זן) שימשו. מעטפת קטטר לבן אטום מספק את ההדמיה הטוב ביותר טרנסעורית. - חותכים שיקוע בקצה המרוחק של הצנתר ולהחליק את המשטח לחתוך עם נייר מחוספס כדי ליצור קצה משופע מעוגל. בעדינות ליצור עיקול קל בצינורית בערך 1 ס מ שיקוע (איור 2).
הערה: קטטר חדש צריך לשמש עבור כל עכבר. - להפחית את העכבר עם קטמין (5.4 mg/g משקל הגוף) ו xylazine (16 μg/g הגוף משקל) מנוהל intraperitoneally. החלת משחה סטרילית בעיניים.
הערה: עומק הרדמה נכונה מושגת על ידי חוסר תגובה של העכבר לצבוט הבוהן המשרד. - להשעות את העכבר במיקום פרקדן על פלטפורמת צנרור ידי חיבור חותכות העליון סביב חוט המשי בחלק העליון של משטח זוויתי (איור 3). ברגע שהעכבר ממוקם במיקום הנכון, בעדינות לתפוס את הבסיס של הזנב ולמשוך את הזנב לכיוון השולחן. מניחים פיסת קלטת מעל בסיס הזנב כדי לאבטח את העכבר.
- החלת קרם להסרת (טבלת חומרים) לאזור צוואר הרחם הגחוני עבור 30-45 לאחר מכן להסיר את כל קרם דפילציה מאזור צוואר הרחם באמצעות גזה יבש. חזור על תהליך היישום במידת הצורך. לשטוף ביסודיות את העור עם מים מלוחים או מזוקקים כדי להסיר כל שאריות ואז לנגב יבש.
2. נוהל צנרור
- השתמש ישר, מלקחיים שטוח ביד לא דומיננטי כדי למשוך בעדינות את הלשון באופן מספיק פותח את הפה למבוא של צינורית.
הערה: מלקחיים שן עכברוש לא צריך לשמש כמו זה יגרום נזק ללשון. - עם היד הדומיננטית, הקדם את הצינורית לתוך הפה כך שהקצה המרוחק לעיקול הקטן הוא כנגד הגג של פיו של הנבדק.
- שחררו את הלשון והחליקו את הקצה השטוח של מלקחיים סגורים לאורך הצוואר הגחוני עד לנובריום. ומשטחת את השריר. המכסה את קנה הנשימה קנה הנשימה מופיע כtranscutaneously קו לבן (איור 3A). במקרה הצורך, לסובב את המלקחיים בכיוון הגולגולת תוך שמירה על המתח על העור בכיוון caudal כדי לגרום בלוטות הרוק החוצה למעלה לשיא. תמרון זה יוצר ניגוד רב יותר סביב קנה הנשימה (איור 3B).
הערה: הימנע כוח מופרז על הצוואר הגחוני כפי שהוא יכול לכווץ את קנה הנשימה ולפגוע בנשימה. - מראש את הצינורית תוך כדי לדוג את הקצה המרוחק של הצינורית באמצעות גמישות של היד הדומיננטית באופן סימולטני על פרק כף היד.
- המיקום הנכון של הצינורית מצוין על ידי ויזואליזציה של הצינורית האטומה בקנה הנשימה (איור 4ב, ד). אם הצינורית מתקדמת מעבר לרמה של מקור שריר הלעיסה וההדמיה של הצינורית בקנה הנשימה לא אושרה, משכי את הצינורית והתנסה שוב את התמרון.
- אשר מיקום הצינורית הנכונה על ידי חיבור הנורה האינפלציה הריאה לצינורית והתבוננות התרחבות בית החזה עם דיכאון בו של המכשיר.
- מבלי לחלק את הצינורית, שחרר בזהירות את החותכות של העכבר מפלטפורמת הצנרור. הזז את העכבר לפלטפורמה אופקית (טבלת חומרים) והכנס את הצינורית למתאם על המאוורר. בעקבות האינפלציה העמוקה, לאוורר את העכבר על 60 s ולאחר מכן למדוד עמידות לנשימה.
3. שחזור
- לאחר ההליך הושלם, להזיז את העכבר לפלטפורמה מחומם. לספק גירוי קבוע באמצעות הבוהן או הזנב צובט לעודד נשימה ספונטנית.
- האקסון יכול להתרחש כאשר העכבר רק מתחיל ללעוס. אחוז בצינורית ברמת הרכזת ומשוך בעדינות את גולגולת הצינור והרחק מהעכבר עד שהצינורית תוסר לחלוטין מפיו של הנבדק.
הערה: עדיף לספק תמיכה בדרכי הנשימה עם צינורית נוקשה למשך זמן רב ככל האפשר במהלך תהליך ההחלמה. - ברגע שהוא הועבר, להעביר את העכבר לכלוב שחזור נקי עם תמיכה בחום. ברציפות לפקח על העכבר עד שהוא אמבולטורי באופן מלא, והתאוששות הושלמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניטור טורי של פונקציית הריאות הבסיסית
שמונה עשר שבועות נקבה BALB/c ו 10-שבוע בן C57BL/6 עכברים (n = 3 של כל זן) השתמשו בשיטה המתוארת ביום 0, 3, 10, ו -17. בעקבות צנרור בכל יום, הנושא היה מחובר מאוורר מכני שסופקו עם 100% חמצן (טבלת חומרים). עמידות בדרכי הנשימה (Rrs) נמדדה באמצעות טכניקת התנודה הנכפית עבור 60 s בעקבות אינפלציה עמוקה ל -25 ס"מ בגודל2O שנערך עבור 5 s. אין שגיאות תוכנה המשויכות לנשימה מתמשכת זו יחד עם ערכי Rrs בטווח הפיסיולוגי מספקים תמיכה נוספת למיקום תקין של הצינורית. נתונים לא חשפו הבדלים משמעותיים של הנמדד Rrs בין נקודות הזמן בתוך כל זן (איור 5). מניחים כי העדר עלייה ב Rrs לאורך זמן מצביע על חוסר טראומה הקשורים דלקת במערכת הנשימה מעל ארבע נקודות זמן רצופות.
אנליזה סטטיסטית
סטטיסטיקות תיאוריות (ממוצע ושגיאות סטנדרטיות) חושבו באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטי (טבלת חומרים). שיטת Kolmogorov-סמירנוף שימש לאימות התפלגות הנתונים של גאוס. ניתוחים סטטיסטיים של ערכות נתונים נעשו על ידי ANOVA לא מזווג, עם הודעה פוסט הוק Tukey-קרמר השוואה מרובה פוסט-מבחן. כל הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. P < 0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית.
איור 1: פלטפורמת צנרור. פלטפורמת הצנרור מורכב מקלסר בעל שלושה שזירה עם לולאה של חוט משי דבקה לחלק העליון של האוגדן כדי ליצור לולאה ההשעיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הכנה לצינורית. (א) מבט לרוחב של הצינורית המוכנה. הערה זווית עדינה שנוצר כ 1 ס מ משופע מעוגל בקצה המרוחק של הצנתר ואת כיוון הצינורית הזווית ביחס שיקוע. (ב) השקפת הצינורית המוכנה. שים לב לקצה המעוגל וההוחלק של השיקוע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הדמיית קנה. (א) מלקחיים מונחים על הצוואר הגחוני והעור הוא בעדינות והוא מניח לאחר לתפוס את בלוטות הרוק ולספק ויזואליזציה של קנה הנשימה כמבנה לבן על קו האמצע הגחוני (שחור חץ). (ב) מחזור גולגולת של הלקחיים על הצוואר הגחוני יוצר בליטה של בלוטות הרוק (*). קנה הנשימה הוא דמיינו כמבנה ליניארי לבן על קו האמצע הגייתי בין בלוטות הרוק (חץ שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיקום הצינורית הנכון. (A) C57BL/6 העכבר ממוקם על פלטפורמת הצנרור עם הצינורית הציג לחלל הפה האבובית. (ב) C57BL/6 עכבר עם הצינורית ממוקם כראוי בקנה הנשימה. שים לב הצינורית ניתן לדמיין בקלות כמו המבנה הלבן בתוך קנה הנשימה (חץ לבן). (ג) balb/C העכבר ממוקם על לוח הצנרור עם הצינורית הציג לחלל הפה האבובי. (ד) balb/c עכבר עם הצינורית ממוקם כראוי בקנה הנשימה. ניתן לדמיין בקלות את הצינורית הלבנה בתוך קנה הנשימה (חץ שחור). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: מדידה טורית של התנגדות. אין הבדלים משמעותיים של הנמדד Rrs בין נקודות זמן בתוך כל זן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צנרור באמצעות טכניקת ההדמיה הטרנסעורית מציעה גישה מעודנת לשיטת חתך העור הסטנדרטית. בתשומת לב מיוחדת למספר שלבים מרכזיים, ניתן להשיג צנרור בקלות ובמהירות. החיה חייבת להיות ממוקם הגון בתוך שכיבה על פלטפורמת הצנרור עם העכבר מאובטח בנסיגה עדינה. זה יהיה להאריך את בעל החיים ליישור אנכי מיקום נכון עבור צנרור. בנוסף, הקרם לא צריך להישאר במגע עם העור של בעל החיים במשך יותר מ 30-45 ש ח ויש לשטוף ביסודיות כדי להסיר את כל שאריות. מגע העור המורחבת עם קרם להסרת שיער יגרום לכאב מיותרים עבור בעלי החיים והכאובים יכול לחסום את ההשקפה של קנה הנשימה9. זה הכרחי להשתמש בתנועה הנכונה כף היד כמו היד הדומיננטית מציג את הקטטר לתוך glottis. פרק כף היד הדומיננטי צריך לכופף בעוד היד נעה בתנועה גבון. זה גם קריטי לפקח על הנושא מקרוב כמו קצה שטוח של מלקחיים הם לוחצים על הצוואר הגחוני כדי להמחיש את קנה הנשימה. לחץ מ מלקחיים יהיה לסגר את קנה הנשימה ולגרום היפוקסיה אם נשמר משך ממושך. אם החולה מופיע ציאנוטיק, אפשר הפסקה קצרה לקרום הריר כדי לחזור לצבע ורוד ולנשימה לייצוב לפני ניסיונות חוזרים.
לא היה צורך לבצע את הטכניקה באמצעות התנסות מקיפה בעכבר. הסיבוכים השכיחים ביותר באנשים לא מנוסים כוללים טראומה בגרון ודלקת דרכי הנשימה העליונה עקב נסיונות צנרור מרובים. ניטור סגור הוא הכרחי במהלך ההתאוששות של חולים אלה כמו התערבות רפואית עם אנטי דלקתיות נגד דלקות עשוי להיות מצוין. נסיונות צנרור חוזרים ונשנים עלולים לגרום לטראומה ודלקת של חלל הפה המרוחק, שיכול לגרום לרעש הנשימה העליון, קוצר נשימה, היפוקסמיה, התאוששות ממושכת, חוסר יכולת לבצע צנרור חוזר או מוות.
מספר שינויים מומלצים במקרה שצנרור אינו מוצלח. ראשית, יש לוודא ששיקוע הצינורית הוא חלק, מעוגל וחתוך לאורך המתאים לגודל החיה. הקצה משופע עשוי להיות החליק באמצעות נייר מחוספסים כדי למזער את הטראומה הרקמה ולהקל צנרור7. בנוסף, בדקו שהצינורית מציגה עיקול קל של כ-15 ° במרחק של שליש מהשיקוע וקצה הצינורית משופע בזווית 45 מעלות כמתואר בחום ואח '6. תמיד לבדוק כי הקטטר הוא בכיוון הנכון לפני ובזמן ביצוע הליך זה.
עבור מחקר זה, עכברים היו מצינורות בדיקות חוזרות בתפקוד הריאה באמצעות מערכת אוורור מכני להקליט מדידות תפקודי ריאה. צינורית גדולה בת 18 גר' שימשו ליצירת חותם הדוק. כדי לבצע חזרה לימודי תפקוד הריאה על עכברים עם קוטר הקנה קטן יותר בשל גיל או מאמץ, זה יכול להיות מאתגר למקום צינורית גדולה יותר. אם הצינורית קטנה יותר נבחרה לשימוש, ודא שניתן להשיג חותם ראוי, וכי ההתנגדות של הצינורית אינה גבוהה יותר מאשר התנגדות של נתיב הנשימה של הנבדק10. הפריה מוצלחת באינפלציה עמוקה. היא אישור מתאים לחותם המתאים שימו לב כי כגון החותם אינו מיותר, אם רק התקנת טיפולים לריאות רצוי.
למרות השיטה המתוארת עשה שינויים המונעים נזק לרקמות חיצוניות, הגבול העליון של התדר של צנרור הוא עדיין פונקציה של טראומה מצטברת לגלוטטיס וקנה הנשימה עקב הקדמה מוגזמת של הצינורית. ניטור בו של קבוצת שליטה לעלייה משמעותית בעמידות דרכי הנשימה במהלך מחקר מומלץ מאז טראומה ברקמות מלווה בדלקת שתגרום לירידה בקוטר הלומיאל של קנה הנשימה. עליות משמעותיות בעמידות דרכי הנשימה במהלך הליכי צנרור חוזרות ונשנות לא נצפו במחקר הנוכחי. עכברים נשארו במצב תקין קלינית למשך הלימודים, ונקרופסי הגולמי של מבני דרכי הנשימה העליונים לא היו ראויים לסיום הלימודים בכל בעלי החיים.
לסיכום, טכניקת הצנרור המתואר מציעה שיטה לא פולשנית להצבת צינורית אנפילקנה עם ציוד מינימלי, כולל משטח משופע, מלקחיים, צינורית פוליפרופילן וציוד להסרת שיער. זו שיטה מעודנת מאפשרת אירועי צנרור חוזרות ללא טראומה רקמות חוזרות וכאב הקשורים לאתר חתך עורית על הצוואר הגחוני או הליך החיתוך הקנה. בנוסף, שיטה זו מקטינה את מספר העכברים הנדרשים כעכברים בודדים ניתן לכווץ שוב ושוב במהלך המחקר. זה גם מבטל את הצורך עבור התקנים מעוצבים במיוחד צנרור, טווחים או ציוד התמרה לצורך הדמיה של דרכי הנשימה. BALB/c ו C57BL/6 זנים שימשו במחקר זה כדי להפגין הצלחה בטכניקה בשני זנים פיגמנט אור כהה ובעלי חיים של גיל צעיר יחסית בגודל קטן (10 על 20 שבועות עכברים הישן). טכניקה מעודנת זו מתאימה לאי יחיד או חוזר ונשנה של תרכובות, ששטיפה ברונכשיים, הדמיה או בדיקות תפקודי ריאות. זו שיטה מינימלית פולשנית, תכליתי ניתן ליישם עבור כמעט כל הליך המחייב גישה למערכת הנשימה התחתונה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים מודים לוצ Rosas, לורן דוליטל, ליסה ג'וזף ולינדזי פרגוסון על הסיוע הטכני שלהם ועל משאבי בעלי חיים מעבדה באוניברסיטה עבור תמיכה בבעלי חיים שלהם. עבודה זו ממומנת על ידי NIH T35OD010977 ו-R01-HL102469.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41 (1), 128-135 (2007).
- Rivera, B., Miller, S. R., Brown, E. M., Price, R. E. A Novel Method for Endotracheal Intubation of Mice and Rats Used in Imaging Studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science. 44 (2), 52-55 (2005).
- Sparrowe, J., Jimenez, M., Rullas, J., Martinez, A. E., Ferrer, S. Refined Intratracheal Intubation Technique in the Mouse, Complete Protocol Description for Lower Airway Models. Global Journal of Animal Scientific Research. 3 (2), 363-369 (2015).
- Deyo, D. J., Wei, J. A Novel Method of Intubation and Ventilation in Mice. Anesthesia & Analgesia. 88 (2), 179 (1999).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8 (3), 103-106 (2004).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. S., Mitzner, W. A Simple Method of Mouse Lung Intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964 (2015).
- Qin, W., Baran, U., Wang, W. Lymphatic response to depilation-induced inflammation assessed with label-free optical lymphangiography. Lasers in Surgery and Medicine. 47 (8), 669-676 (2015).
- McGovern, T. K., Robichaud, A., Fereydoonzad, L., Schuessler, T. F., Martin, J. G. Evaluation of Respiratory System Mechanics in Mice using the Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments. (75), e50107 (2013).
