Summary
この記事の目的は、実験室のマウスの挿管の洗練された方法を説明することです。この方法は非侵襲的であり、したがって、呼吸機能の連続モニタリングおよび/または肺への治療の注入を必要とする研究に理想的である。
Abstract
文献は、口腔を通して、または腹管のカニューレ配置を直接確認するために腹側頸部の切開を通して、神経節の視覚化を必要とするマウス挿管のためのいくつかの方法を記述する。このような処置によって被験者に誘発される相対的な困難または組織外傷は、長手方向の研究を行う研究者の能力を妨げる可能性がある。この記事では、脱毛剤を使用して腹側頸部から毛髪を取り除くマウスの物理的操作により、皮膚の程度に関係なく口腔内挿管のための気管の経皮的な視覚化が可能になる技術を示します。色素 沈着。この方法は、被験者に無害であり、マウスの解剖学の限定的な理解と容易に達成される。この洗練されたアプローチは、繰り返し挿管を容易にし、疾患の進行または治療の点込を監視するために必要な場合があります。この方法を用い、呼吸器疾患のマウスモデルにおける肺機能の測定に必要な動物数および技術スキルの減少をもたらす可能性がある。
Introduction
実験室用マウスは、ヒト呼吸器疾患の一般的な動物モデルです。したがって、治療の吸入と呼吸力学の測定の両方を目的としたマウス挿管のためのいくつかの公表された方法があります。記載された手順のほとんどは、喉頭鏡または光,ファイバー光源,,1、2、3、4、5、6、72などの特殊な装置を用いて口腔1を通してグロティスの視覚化6を必要とする7。,345しかし、研究者の見解をあいまいにすることができるので、比較的大きなカニューレが必要な場合、これは困難な場合があります。Limjunyawongら8は、小さな切開が腹管の首の正中線に沿って行われる挿管の方法でこの懸念に対処し、気管の視覚化を可能にした。手順に従って、切開部は、組織接着剤で閉じる。
頻繁に繰り返される挿管を必要とする研究のために、このサイトの連続的な切開および閉鎖は、腹側頸部に皮膚マージンおよび組織外傷の脱ブリードを必要とする。口腔挿管への経皮的気管可視化アプローチの目的は、マウスにおける単一の挿管イベントと同様に、繰り返し挿管試験に特に適した洗練された非侵襲的な手法を提供することにある。
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Protocol
ここに記載されているすべての動物活動は、オハイオ州立大学の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認され、AAALAC認定施設で行われました。
1. 手続き準備
- 挿管プラットフォームを構築します。適切なプラットフォームの傾斜を達成するには、3インチ(7.6 cm)の3リングバインダーを使用してください。長さ 15~20 cm の 3~0 シルクまたはその他の糸材質を半分に折り、ねじの端をテープで傾斜したプラットフォームの上部に貼り付けて、サスペンションループを作成します(図1)。
- 適切なサイズと長さのカニューレを選択します。
注:20-30 g マウスの場合、18 G までの長いカテーテルを 1~1.5 インチ(2.5-3.8 cm)で使用できます。本研究では、18週齢の雌BALB/cおよび10週齢のC57BL/6マウス(n=各株の3)を使用した。不透明な白いカテーテルのシースは最もよい経皮視覚化を提供する。 - カテーテルの遠位先端でベベルをカットし、研磨紙でカット面を滑らかにし、丸みを帯びたベベル先端を作成します。ベベルから約1cmのカニューレに緩やかに曲げます(図2)。
注:新しいカテーテルは、各マウスに使用する必要があります。 - ケタミン(5.4mg/g体重)とキシラジン(16 μg/g体重)でマウスを麻酔し、腹腔内投与します。 無菌眼軟膏を目に塗布する。
注:適切な麻酔深さは、しっかりとしたつま先ピンチに対するマウスの応答の欠如によって達成される。 - 傾斜面の上部にあるシルク糸の周りに上部切歯を引っ掛けて、挿管プラットフォーム上の上の位置にマウスを吊り下げます(図3)。マウスが底面の不順に配置されたら、尾の底をそっと握り、尾をテーブルに向かって引き込みます。テープを尾部の底に置き、マウスを固定します。
- 30-45sの腹側頸部領域に脱毛クリーム(材料表)を塗布し、乾燥ガーゼを使用して子宮頸部領域からすべての脱毛クリームを取り除きます。必要に応じて、申請プロセスを繰り返します。生理食い物または蒸留水で皮膚を十分に洗い流し、残留物を取り除き、乾燥させて拭きます。
2. 挿管手順
- 非支配的な手にまっすぐで平らな鉗子を使用して、カニューレの導入のために口を十分に開く方法で舌を穏やかに引き込みます。
注:ラット歯の鉗子は舌を傷つけるため使用すべきではない。 - 支配的な手で、カンヌラを口の中に進め、わずかな曲がりに遠位する端が被験者の口の屋根に向かうようします。
- 舌を離し、閉じた鉗子の平らな端を腹側首に沿って突き止めて、マニュブリウムに達するまでスライドさせます。この動きは唾液腺を横に置き換え、気管を覆う筋肉を平らにする。気管は白い線として経皮的に現れる(図3A)。必要に応じて、皮膚の緊張を尾方向に保ちながら、皮膚の緊張感を維持しながら、角蓋腺をピークにして、クスプを回転させます。この操作は、気管の周囲にコントラストを作り出します(図3B)。
注:気管を崩壊させ、呼吸を損なう可能性がありますので、腹側の首に過度の力を避けます. - カニューレを進めながら、手首の同時屈曲で支配的な手の回覧によってカニューレの先端を腹腹に同時に引きずります。
- カニューレの適切な配置は、気管内の不透明なカニューレの視覚化によって示される(図4B,D)。カニューレがマッセター筋の起源のレベルを超えて進められており、気管内のカニューレの視覚化が確認されていない場合は、カニューレを引き込んで操縦を再試行する。
- 肺インフレーション電球をカニューレに接続し、装置の同時うつ病で胸部膨張を観察することによって、適切なカニューレ配置を確認します。
- カニューレを置き換えることなく、挿管プラットフォームからマウスの切歯を慎重に外します。マウスを水平プラットフォーム(材料表)に移動し、カニューレを人工呼吸器のアダプターに挿入します。深い膨張に続いて、60 sのためにマウスを換気し、呼吸抵抗を測定する。
3. 回復
- 手順が完了したら、マウスを温めのプラットフォームに移動します。自発的な呼吸を促すために、軽いつま先または尾のピンチを介して一定の刺激を提供します。
- 外挿は、マウスが噛み始めたときに発生する可能性があります。ハブのレベルでカニューレをつかみ、カニューレが被験者の口から完全に取り除かれるまで、チューブをマウスからそっと引き離します。
注:回復過程の間にできるだけ長く堅いカニューレと気道の支持を提供することが好ましい。 - 取り出しが完了したら、マウスを熱サポートでクリーンな回復ケージに移します。マウスが完全に歩行し、回復が完了するまで、マウスを継続的に監視します。
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Representative Results
ベースライン肺機能の逐次モニタリング
18週齢の雌BALB/cおよび10週齢のC57BL/6マウス(n=各株の3)は、0日目、3日、10日、および17日目に記載された方法を用いて挿管した。毎日挿管に続いて、被験者は100%酸素を供給する機械式人工呼吸器に接続した(材料表)。呼吸抵抗(Rrs)は、5sのために保持された25cmH2Oに深いインフレーションに続く60sのための強制発振技術を使用して測定した。生理学的範囲内のRrs値と一緒にこの持続的な呼吸保持に関連するソフトウェアエラーは、カニューレの適切な配置のための追加のサポートを提供しません。データは、各株内の時点間で観測された測定されたRrsの有意な差を明らかにしなかった(図5)。時間の経過に伴うRrsの増加の欠如は、4つの連続した時点にわたって呼吸器系における外傷関連炎症の欠如を示していると仮定される。
統計分析
記述統計量(平均値と標準誤差)は、統計解析ソフトウェア(表)を用いて計算した。コルモゴロフスミルノフ法は、ガウスデータ分布を検証するために使用されました。データセットの統計的分析は、非対のANOVAによって行われ、ポストホックのTukey-Kramerの複数比較後のテストが行われました。全てのデータは、平均値±SEM.P<0.05として提示され、統計的に有意であると考えられた。 P
図1:挿管プラットフォーム挿管プラットフォームは、3リングバインダーで構成され、シルク糸のループがバインダーの上部に付着してサスペンションループを作成します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:カニューレの調製。(A)準備されたカニューレの側面図。カテーテルの遠位端の丸いベベルから約1cm、ベベルに対するカニューレ角の向きが約1cm作成されることに注意してください。(B)準備されたカニューレのドーソベントラルビュー。ベベルの丸みを帯びた滑らかなエッジに注意してください。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 気管の視覚化。(A)鉗子は腹側の首に置かれ、皮膚は静かに静かに引き込まれ、唾液腺を横方向に置き換え、腹側正中線(黒矢印)上の白い構造として気管の視覚化を提供する。(B) 腹側頸部の鉗子のクラニオドール回転は唾液腺(*)の突起を作り出す。気管は唾液腺(黒矢印)の間の腹側中線の白色の線形構造として視覚化される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:カニューレの配置を適切に行う。(A)C57BL/6マウスは、カニューレを近位口腔に導入した挿管プラットフォーム上に配置した。(B)C57BL/6マウスでカニューレを気管に正しく配置した。カニューレは気管内の白い構造(白い矢印)として簡単に視覚化できることに注意してください。(C) カニューレを近位口腔に導入した挿管板上に配置されたBALB/cマウス。(D)カニューレを気管に適切に配置したBALB/cマウス。白いカニューレは気管(黒い矢印)の中で容易に視覚化することができる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:抵抗のシリアル測定。各株内の時間差の測定されたRrsの有意な差は認められない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
経皮的気管可視化技術を用いた挿管は、標準的な皮膚切開法に対する洗練されたアプローチを提供する。いくつかの重要なステップに特別な注意を払って、挿管は容易かつ迅速に達成することができる。動物は穏やかな引き込みで固定されたマウスと挿管プラットフォームの後尻の不用に真正面に置かれなければなりません。これは、垂直整列に動物を拡張し、挿管のための適切な位置.さらに、脱毛クリームは、30-45s以上の動物の皮膚と接触したままで、すべての残留物を除去するために徹底的にすすぐるむべるべきです。脱毛クリームとの皮膚接触の延長は、動物のための不必要な痛みを引き起こし、潰瘍は気管9の視界を妨げる可能性があります。支配的な手が毛細血管にカテーテルを導入するように適切な手首の動きを使用することが不可欠です。手がスピネーションモーションで動いている間、支配的な手首は曲がるべきです。また、気管を視覚化するために、鉗子の平らな端が腹側頸部に押し付けられるので、被検体を注意深く監視することも重要です。鉗子からの圧力は気管を閉塞させ、長期間維持されれば低酸素症を引き起こす。患者がチアノスティックに見える場合は、粘液膜がピンク色に戻り、呼吸が試みを繰り返す前に安定するまでの短い休止を可能にする。
この手法を実行するために、マウスの挿管操作が必要とされませんでした。経験の浅い個人の最も一般的な合併症には、喉頭外傷および複数の挿管の試みによる上気道炎症が含まれる。非ステロイド性抗炎症薬との医学的介入が示され得るとして、これらの患者の回復中に綿密なモニタリングが必要である。挿管の試みが失敗すると、組織外傷や遠位口腔の炎症が起こり、上気道雑音、呼吸困難、低酸素血症、長期の回復、繰り返し挿管または死亡を行うことができない可能性があります。
挿管が成功しなかった場合は、いくつかの変更を行うことをお勧めします。まず、カニューレのベベルが滑らかで丸みを帯び、動物のサイズに適した長さにカットされていることを確認します。ベベルエッジは、研磨紙を使用して組織の外傷を最小限に抑え、挿管を容易にする7を使用して平滑化され得る。また、カニューレがベベルから3分の1の距離で約15°のわずかな曲線を呈し、カニューレの先端がブラウンらに記載されているように45°の角度で斜めされていることを確認する。この手順を実行する前と実行中に、カテーテルが適切な向きであることを必ず確認してください。
この研究のために、マウスは、肺機能測定を記録するために機械的換気システムを使用して繰り返し肺機能検査のために挿管された。大型の18Gカニューレを使用して密閉を行いました。年齢や緊張による気管径が小さいマウスに対して繰り返し肺機能の研究を行うためには、より大きなカニューレを配置することは困難である可能性があります。より小さなカニューレが使用のために選ばれた場合、適切なシールが達成され、かつカニューレの抵抗が試験対象の気道10の抵抗よりも高くないことを確認する。成功した深いインフレの摂動は、適切なシールの十分な確認です。肺への治療の設置のみが望まれる場合は、そのようなシールは不要であることに注意してください。
記載された方法は、外部組織の損傷を防ぐ改変を行ったが、挿管の頻度の上限は、カニューレの過剰導入による腺および気管への累積外傷の関数である。組織外傷は気管の小さな光径をもたらす炎症を伴うため、研究中の気道抵抗の有意な増加のための対照群の同時監視が推奨される。挿管手順の繰り返しの過程で気道抵抗の有意な増加は、現在の研究では観察されなかった。マウスは研究期間において臨床的に正常であり、上部気道構造の総壊死は、すべての動物における研究結論において顕著ではなかった。
要約すると、記載された挿管技術は、傾斜面、鉗子、ポリプロピレンカニューレおよび脱毛剤を含む最小限の装置で気管内カニューレを配置するための非侵襲的な方法を提供する。この洗練された方法は、腹側頸部または気管切開手順上の切開部位に関連する再発組織外傷および疼痛を伴わない繰り返しの挿管事象を可能にする。さらに、この方法は、個々のマウスとして必要なマウスの数を減らし、研究の過程を通じて繰り返し挿管することができる。また、航空路の視覚化のために特別に設計された挿管抑制装置、スコープまたはトランスイルミネーション装置の必要性を排除する。この研究では、光色と暗い色素株および比較的若い年齢と小さいサイズの動物(10〜20週齢のマウス)の両方で技術の成功を実証するために、BALB/cおよびC57BL/ 6株が使用されました。この精製された技術は、化合物の単一または繰り返し気管内植在、気管支肺胞洗浄、イメージングまたは肺機能試験に適しています。この低侵襲、汎用性の高い方法は、下気道へのアクセスを必要とする事実上すべての手順のために実装することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者らは、ルチア・ローザス、ローレン・ドゥーリトル、リサ・ジョセフ、リンジー・ファーガソンの技術支援と、大学実験動物資源に対する動物ケア支援に感謝している。この作品はNIH T35OD010977およびR01-HL102469によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G x 1 1/4" intravenous catheter, Safelet | Fisher Scientific | #14-841-14 | Cannula for intubation |
| 70% ethanol, 10 L | Fisher Scientific | 25467025 | Cleaning cannula |
| Abrasive paper (sandpaper) | Porter-Cable | 74001201 | Cannula preparation |
| AnaSed (xylazine sterile solution) injection (100 mg/mL) | Akorn Animal Health | NDC# 59399-111-50 | Anesthesia |
| Blue labeling tape (0.5 in x 14 yds) | Fisher Scientific | 15966 | Restraint on intubation platform |
| Braided silk suture without needle, nonsterile, (3-0) | Henry Schein | Item #1007842 | Intubation platform |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific | 39DP | Mouse thermoregulation and recovery |
| Deltaphase Operating Board | Braintree Scientific | 39OP | Mouse recovery (prior to extubation) |
| Distilled water | ThermoFisher | 15230253 | Cleaning mouse following depilation |
| Eye Scissors, angled, sharp/sharp | Harvard Apparatus | 72-8437 | Cannula preparation |
| FlexiVent (FX Module 2) | Scireq | N/A | Record lung function data (not required to perform procedure, used in this study to validate procedure) |
| Gauze sponges | Fisher scientific | 13-761-52 | Hair removal |
| Heavy-Duty 3" 3-Ring View Binders | Staples | 24690CT | Intubation platform |
| Instat Software | Graphpad | N/A | Statistical analysis software |
| Insulin syringe (0.5 cc, U100) | Fisher Scientific | 329461 | Anesthesia administration |
| Ketamine HCl Injection, USP (100 mg/mL) | Llyod Laoratories | List No. 4871 | Anesthesia |
| Lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | Confirm cannula placement |
| Micro Forceps, Curved, Smooth | Harvard Apparatus | 72-0445 | Retract tongue and create tension on neck for cannula visualization |
| Nair (hair removal lotion), 9 oz bottle | Church & Dwight | 42010440 | Hair removal |
| Sterile saline (0.9%), 10 mL | Fisher Scientific | NC9054335 | Anesthesia, cleaning skin following hair removal |
References
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