Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

العلامة حذف الجينات من قبل Floxed كاسيت أليليتش تبادل Mutagenesis في الكلاميديا trachomatis

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60848
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

وصف هنا هو وسيلة لاستهداف, حذف الجينات markerless في الكلاميديا trachomatis باستخدام الكاسيت floxed الطفرات تبادل أليليس, FLAEM.

Abstract

الكلاميديا التراخورات هو مسببات الأمراض الملزمة داخل الخلايا التي كان من الصعب تاريخيا للتلاعب وراثيا. وقد تم الحد من التقدم النهائي في توضيح الآليات التي تستخدم C. trachomatis لإنشاء والحفاظ على مكانة متميزة داخل الخلايا بسبب نقص الأدوات الوراثية. لحسن الحظ، كانت هناك مؤخرا العديد من التطورات الجديدة في تقنيات التلاعب الجيني. ومن بين هذه هو تطوير الفلورسينسي ذكرت الطفرات تبادل أليليتش (FRAEM). تسمح هذه الطريقة بحذف الجينات المستهدفة إلى جانب إدخال شريط اختيار ترميز مقاومة المضادات الحيوية والبروتين الفلوري الأخضر (GFP). الاعتماد على هذه الاستراتيجية يمكن أن يكون معقدا عند استهداف الجينات داخل operons polycistronic بسبب احتمال الآثار القطبية على الجينات المصب. تم تطوير الطفرات الكاسيت الكاسيت تبادل الطفرات (FLAEM)، البروتوكول الذي يرد وصفه هنا، للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت. FLAEM يستخدم تحرير الجينوم كري-loxP لإزالة كاسيت الاختيار بعد الحذف المستهدف من قبل تبادل أليليتش. تحتوي السلالات الناتجة على حذف جين بدون علامات لتسلسل ترميز واحد أو أكثر. تسهل هذه التقنية التقييم المباشر لوظيفة الجينات وتوسع ذخيرة أدوات التلاعب الجيني في C. trachomatis.

Introduction

الكلاميديا التراخورات هي السبب الرئيسي للأمراض المنقولة جنسيا البكتيرية ويمثل عبئا كبيرا على صحة الإنسان. يصاب أكثر من 100 مليون شخص كل عام بـ C. trachomatis1. ما يقرب من 70٪ من الإصابات في النساء هي أعراض على الرغم من الآثار الضارة الصحة الإنجابية، مثل مرض التهاب الحوض، والحمل خارج الرحم، و / أو العقم. تتمة المرض ترتبط مباشرة بعلم المناعة الذي بدأته عدوى التراخوات C. 2. ولا يزال يتعين استحداث لقاح فعال؛ لذلك ، فإن فهم وظيفة عوامل الفوعة البكتيرية وغيرها من المنتجات الجينية البكتيرية هو سؤال بحثي مهم وعاجل.

كما البكتيريا داخل الخلايا، وغزو الخلايا المضيفة، وتكرار داخل الخلايا، والإفراج عن ذرية، والتهرب من الاستجابات المناعية المضيف هي العمليات الحاسمة. C. التراخوفات يشكل غشاء طفيلي ملزمة vacuole, يطلق عليه إدراج, للتنمية داخل الخلايا. يتم تحقيق إنشاء إدراج والعديد من العمليات الحرجة الأخرى عن طريق إفراز البروتينات effector عبر نظام إفراز النوع الثالث (T3SS)3. كان توضيح وظائف هذه المؤثرات المعسرة محدودًا لسنوات عديدة بسبب الاستعصاء الجيني لـ C. trachomatis. على عكس الإشريكية القولونية، فإن العديد من تقنيات الاستنساخ الكلاسيكية لا تنطبق على الكلاميديا. وهناك عدد قليل من القيود الرئيسية التي تنطوي على كفاءة التحول، وعدم وجود مراسلين للاختيار المضاد مثل sacB، وصيانة البلازميد. في حين يمكن الحفاظ على البلازميدات E. coli بشكل عام إلى أجل غير مسمى مع أصل النسخ المتماثل والضغط الانتقائي المناسب ، يتطلب C. trachomatis plasmids ثمانية إطارات قراءة مفتوحة إضافية(pgp1-8) للصيانة التي تم العثور عليها على البلازميد pL2 الأصلي داخل L2 serovar4.

في السنوات الأخيرة كانت هناك العديد من الأدوات الوراثية التي تم إنشاؤها التي تستوعب علم الأحياء الكلاميديا فريدة من نوعها، ومع ذلك لا تزال هناك قيود5،6،7. يمكن أن يؤدي الطفرات الكيميائية عن طريق علاج الميثانسولفونات (EMS) إيثيل التحولات الخاطئة ، أو (أقل تواترا) إلى التحولات النيوكليوتيدإدخال codon وقف سابق لأوانه لتسفر عن طفرة هراء8. الإدراج Transposon هو فعال لتعطيل الجينات، ولكن التكنولوجيا الحالية في أبحاث الكلاميديا شاقة وتستغرق وقتا طويلا9. كل من العلاج EMS وتقنيات الطفرات المتحولة تولد تولد الطفرات العشوائية وتتطلب أساليب فحص صارمة لعزل سلالات متحولة. طريقة لتعطيل الجينات عن طريق إدخال الإنترونات المجموعة الثانية (على سبيل المثال، TargeTron) يسمح لmutagenesis موجهة; ومع ذلك، يتم تقييد هذه الطريقة بالكفاءة، ولا يتم التنبؤ دائمًا بموقع الإدراج بشكل صحيح10.

الفلورسينس ذكرت الطفرات تبادل أليليسيك (FRAEM) هي استراتيجية تستخدم لحذف الجينات المستهدفة إلى جانب إدخال كاسيت الاختيار توفير مقاومة المضادات الحيوية ومراسل الفلورسينس11. ومع ذلك ، فإن FRAEM معقد بسبب احتمال الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت على الجينات المصب ، خاصة عند استهداف الجينات داخل operons المتعددة الأقطاب. Floxed كاسيت allelic تبادل الطفرات (FLAEM) هو نهج وراثي جديد وضعت للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت لوحظ سابقا مع كاسيت اختيار FRAEM12. FLAEM يستخدم تحرير الجينوم كري-loxP لإزالة كاسيت الاختيار واستعادة التعبير عن الجينات المصب. يتم إعادة تصميم كاسيت الاختيار الذي يحتوي على مقاومة المضادات الحيوية والبروتين الفلوري الأخضر (GFP) مع مواقع لوكسب المحيطة. يمكن لهذه المواقع loxP إعادة الجمع في وجود الكري recombinase ويؤدي إلى استئصال كاسيت من الجينوم13. وقد ثبت أن هذه الاستراتيجية للتخفيف من الآثار القطبية الناجمة عن كاسيت عند استهداف tmeA للحذف12،14.

تستخدم كل من أساليب FRAEM و FLAEM نفس ناقل الانتحار ، pSUmC 4.0 ، والذي يمكن الحفاظ عليه بشكل مشروط من خلال التعبير غير القابل للاختزال لـ pgp6. وقد سبق التعبير عن pgp6 ثبت أن تكون ضرورية للاحتفاظ بلازميد، وبالتالي يتم الاستفادة للسيطرة على صيانة البلازميد11،15. عندما يتم زراعة C. trachomatis في وسائل الإعلام تستكمل مع التتراسيكلين اللامائية (aTc) للحث على التعبير pgp6، يتم الحفاظ على ناقلات. في حالة عدم وجود aTc، يتم فقدان المتجه. يتم تحقيق حذف الجينات المستهدفة من خلال التبادل الآلي للجين لكاسيت الاختيار. 3 كيلوبايت المناطق مباشرة المنبع والمصب من الجين المستهدف بمثابة الأسلحة homology لإعادة التركيب. يتم استنساخ هذه الأسلحة في pSUmC 4.0 ناقلات تحيط كاسيت الاختيار. ويلاحظ نجاح C. التحول القصبة الهوائية والأحداث إعادة التركيب من خلال الإبلاغ عن الفلورسينس. التعبير عن mCherry على العمود الفقري للمتجه وgfp داخل كاسيت الاختيار تسفر عن إدراجات الفلورسنت الحمراء والخضراء. بمجرد إزالة aTc من وسائط الثقافة ، تشير التضمينات الخضراء فقط إلى أحداث إعادة التركيب الناجحة مع فقدان ناقل الانتحار ودمج كاسيت الاختيار في الجينوم البكتيري.

FLAEM يمثل امتدادا لFRAEM عن طريق التحول اللاحق لناقلات الكري المؤافر ة ، pSU - Cre ، في سلالة متحولة تم إنشاؤها حديثا. Cre recombinase يسهل إعادة التركيب بين مواقع loxP واستئصال كاسيت الاختيار. تتم الإشارة إلى أحداث إعادة التركيب من خلال الإبلاغ عن الفلورسينس. ناقلات PSU-Cre ترميز mCherry; وبالتالي ، يشار إلى التحول الناجح من خلال إضافة الفلورية الحمراء إلى gfp- التعبير عن التضمينات. الزراعة في غياب ضغط انتقائي للكاسيت النتائج في Rere بوساطة إعادة التركيب في مواقع loxP، ويشار إلى فقدان الكاسيت من خلال إدراجات حمراء فقط. كما هو الحال مع pSUmC-4.0، يتم استخدام التعبير غير القابل للاختزال من pgp6 للحفاظ على PSU-Cre بشكل مشروط. مرة واحدة تتم إزالة aTc واختيار المضادات الحيوية، يتم علاج البلازميد، وسلالة الحذف علامة الناتجة غير الفلورسنت. وتتناول هذه الطريقة مسألة الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم وتجميع pSUmC-4.0 مع الأسلحة Homology محددة لجين الفائدة

  1. تحديد ~ 3 كيلوبايت المناطق مباشرة المنبع والمصب من الجين المستهدفة للحذف لتكون بمثابة 5 'و 3' 'الأسلحة homology لإعادة تركيب متجانسة(الشكل 1).
  2. تصميم التمهيديPCR إلى 1) تضخيم ذراع 3 كيلوبايت 5 'homology من الحمض النووي الجينومي chlamydial و 2) تحتوي على 15-30 BP فوق محددة لpSUmC-4.0 عندما هضمها في موقع انزيم تقييد سال. تأكد من أن المناطق التمهيدية المتداخلة مع pSUmC-4.0 لديها درجات حرارة ذوبان 55 درجة مئوية وأن درجات حرارة ذوبان دبوس الشعر للالتمهيدي بأكمله هي < 35 درجة مئوية.
  3. تصميم التمهيديPCR إلى 1) تضخيم ذراع 3 كيلوبايت 'homology من الحمض النووي الجينومي chlamydial و 2) تحتوي على 15-30 BP العبء محددة لpSUmC-4.0 عندما هضمها في موقع انزيم تقييد SbfI. تأكد من أن المناطق التمهيدية المتداخلة مع pSUmC-4.0 لديها درجات حرارة ذوبان 55 درجة مئوية وأن درجات حرارة ذوبان دبوس الشعر للالتمهيدي بأكمله هي < 35 درجة مئوية.
  4. تصميم التمهيديات فحص PCR من شأنها تضخيم إدراج كل ذراع homology في ناقلات pSUmC-4.0 بعد تفاعل تجميع الحمض النووي16. تصميم هذه التمهيديات إلى الصلب ~ 500 bp خارج مواقع تقييد للسماح بالتصور السهل للمنتج PCR حتى لو كان الإدراج غير ناجحة(الشكل 1).
  5. تضخيم 3 كيلوبايت 5 'و 3' 'الأسلحة homology من الحمض النووي الجينومي الكلاميديا المستخرجة حديثا من قبل PCR في واحد إلى اثنين من ردود الفعل لتسفر عن ما يكفي من جزء لتجميع الحمض النووي في وقت لاحق. اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للحمض النووي البوليميراز لإعداد رد فعل معين وظروف ركوب الدراجات.
  6. تحقق من أن كلا من منتجات PCR هي الحجم الصحيح وأن ردود الفعل لا تحتوي على أي نطاقات ملوثة. تشغيل 5 ميكرولتر من كل تفاعل PCR على 1٪ هلام أكروس الحمض النووي.
  7. تنقية وتركيز شظايا PCR عن طريق استخراج الفينول / الكلوروفورم وهطول الإيثانول.
    1. تجمع جميع ردود فعل PCR 3 'معا في أنبوب 1.5 مل وتقديمهم إلى حجم نهائي من 200 ميكرولتر مع H2O. nuclease خالية من تكرار هذه العملية لردود فعل PCR 5'.
    2. أضف 200 ميكرولتر من الفينول إلى كل أنبوب ودوامة لمدة 30-60 s. قم بتدوير كل أنبوب في جهاز طرد مركزي صغير عند أكثر من 21,000 × ز لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. نقل الطبقة العليا المرحلة المائية من كل أنبوب في أنبوب جديد 1.5 مل، إضافة عشر حجم خلات الصوديوم M 3 إلى كل أنبوب، ثم نفض الغبار لخلط.
    4. إضافة 3 مجلدات من الإيثانول 100٪ إلى كل أنبوب ونفض الغبار لخلط. احتضان كلا الأنابيب في -80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
    5. بيليه الحمض النووي عن طريق الغزل كل أنبوب في > 21,000 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. تجاهل supernatant.
    6. غسل بيليه الحمض النووي مع 100 ميكرولتر من الإيثانول 70٪. تدور كل أنبوب في > 21,000 × ز لمدة 5 دقيقة في RT. تجاهل supernatant.
    7. غسل بيليه الحمض النووي مرة أخرى مع 100 ميكرولتر من الإيثانول 100٪. تدور كل أنبوب في أكثر من 21،000 لمدة 5 دقيقة في RT. تجاهل supernatant.
    8. اسمحوا بيليه تماما الهواء الجاف، ثم إعادة تعليق بلطف الحمض النووي في 12 ميكرولتر من H2O خالية من nuclease عن طريق الخفقان لخلط.
  8. هضم 500 نانوغرام من ناقلات pSUmC-4.0 في رد فعل 20 ميكرولتر مع وحدة واحدة من سال و1 وحدة من SbfI وفقا لبروتوكول التصنيع. احتضان رد الفعل لمدة 3 ساعات تقريبًا أو بين عشية وضحاها لضمان الهضم الكامل للمتجه.
  9. تنقية وتركيز العمود الفقري المهضوم عن طريق استخراج الفينول/ الكلوروفورم وترسيب الإيثانول كما هو موضح في وقت سابق (الخطوة 1.7.1-1.7.9).
  10. الجمع بين pSUmC هضم-4.0 ناقلات وكلا 5 'و 3' 'هومولوجيا ذراع PCR المنتجات معا بنسبة 0.01 pmol pSUmC-4.0 إلى 0.09 pmol كل ذراع homology. تجميع شظايا في رد فعل تجميع الحمض النووي وفقا لبروتوكول التصنيع.
  11. تحويل 50 ميكرولتر من الإشريكية القولونية مع 1 ميكرولتر من تفاعل تجميع الحمض النووي. لوحة تحويل E. القولونية على لوحات LB أغار التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل spectinomycin عن طريق نشر 150 ميكرولتر لكل لوحة. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
  12. في اليوم التالي، شاشة المستعمرات للفلورية الخضراء والحمراء باستخدام المجهر المقلوب المقلوب. ومن المتوقع ما مجموعه 5-30 مستعمرات لكل لوحة أغار.
  13. اختيار 5-10 مستعمرات لتلقيح 4 مل من مرق LB تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل spectinomycin. الثقافات احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة.
  14. باستخدام الثقافات بين عشية وضحاها E. القولونية، وإجراء تنقية الحمض النووي على نطاق صغير. Elute الحمض النووي مع 50 ميكرولتر من nuclease خالية H2O.
  15. تأكد من إدخال كل ذراع من ذراع الهومسولوجيا في متجه pSUmC-4.0 باستخدام أجهزة فحص PCR التمهيدية (المصممة في الخطوة 1.4) لتضخيم كل إدراج. إذا كان تجميع الحمض النووي ناجحا، ينبغي ملاحظة منتج PCR ~ 4 كيلوبايت في هلام أغاروز الحمض النووي 1٪ لكل من 5 'و 3' مناطق الذراع. يشير منتج PCR 1 كيلوبايت ~ إلى عدم وجود إدراج.
    ملاحظة: إذا كان الإدراج من الأسلحة homology غير ناجحة في تفاعل التجمع جزء مزدوج، أداء اثنين من ردود الفعل الجمعية لإدراج الذراع 5 'ثم 3' الذراع، بشكل فردي. هضم ناقلات مع سال فقط قبل تجميع مع ذراع 5 '، ثم هضم ناقلات مع SbfI لتجميع الذراع 3'.
  16. تحويل السد-/ dcm- المختصة E. القولونية مع 200 نانوغرام من pSUmc-4.0 تجميعها مع كل من الأسلحة homology. لوحة البكتيريا المحولة على لوحات LB أغار التي تحتوي على 100 ميكروغرام / مل spectinomycin عن طريق نشر 25 ميكرولتر لكل لوحة. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ومن المتوقع أن يصل إجمالي المستعمرات إلى 200 مستعمرة.
  17. فحص لوحات لمستعمرات الفلورسنت الحمراء والخضراء كما هو موضح في الخطوة 1.13.
  18. إعداد ثقافة لتنقية الحمض النووي على نطاق واسع عن طريق تلقيح 100 مل من مرق LB يحتوي على 100 ميكروغرام / مل spectinomycin مع المستعمرات الحمراء والخضراء. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع اهتزاز في 250 دورة في الدقيقة.
  19. حصاد الثقافة وتنقية الحمض النووي باستخدام تنقية الحمض النووي على نطاق واسع.
    1. إعادة تعليق الحمض النووي البلازميد المنقى في 100 ميكرولتر من NF-H2O. العائد الكلي للحمض النووي من 2 μg/μL على الأقل مثالية للتحول C. trachomatis.
    2. تسلسل 5 'و 3' مناطق الذراع homology لضمان التجميع الصحيح في pSUmC-4.0 قبل تحويل C. trachomatis.

2. تحويل C. trachomatis مع pSUmC 4.0 + الأسلحة الهومنتي لحذف الجينات من قبل بورصة أليليتش

  1. البذور ماكوي الخلايا، الخلايا الليفية الماوس تستخدم على مستوى لزراعة الكلاميديا،في اثنين من لوحات بئر 6 (1 × 106 خلايا/ جيد) مع #1 وسائل الإعلام النمو. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 حتى أحادية هو confluent (حوالي 24 ساعة).
  2. في أنبوب 1.5 مل، إضافة حجم C. trachomatis WT serovar L2 الهيئات الابتدائية (EBs) التي تكفي لإصابة 12 بئرا من لوحة بئر 6 في وزارة الداخلية من 2. بيليه EBs في أكثر من 20،000 × ز لمدة 30 دقيقة ، ثم تجاهل supernatant.
  3. بدء تحويل الكلاميديا عن طريق إعادة تعليق EBs بلطف في 600 ميكرولتر من CaCl2 المخزن المؤقت، ومن ثم إضافة 24 ميكروغرام من pSUmC-4.0 + الأسلحة homology إلى الأنبوب. مزيج بلطف الحل عن طريق الخفقان. احتضان أنبوب في RTfor 30 دقيقة ونفض الغبار لخلط كل 10 دقيقة.
  4. أضف حل التحويل إلى 24 مل من محلول الملح المتوازن لهانكس (HBSS) واخلطه عن طريق الأنابيب بلطف. نقل 2 مل من inoculum إلى كل بئر من خلايا مكوي confluent في لوحات الآبار 6 وتصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز ل1 ساعة في 20 درجة مئوية.
  5. إزالة التلقيح واستبدال مع 2 مل / حسنا وسائل الإعلام نمو RPMI #2. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
  6. بعد ما لا يقل عن 7 ح، ولكن لا يزيد عن 12 ساعة، واستبدال وسائل الإعلام مع 2 مل / جيدا من وسائل الإعلام الاختيار #1. مواصلة الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة من وقت العدوى.
  7. حصاد وتمرير البكتيريا على طبقة أحادية جديدة من خلايا مكوي.
    1. باستخدام مكشطة الخلايا، كشط بلطف أحادية McCoy لرفع الخلايا في وسائل الإعلام. نقل المواد من كل بئر إلى أنبوب 2 مل. بيليه المواد الخلية في أكثر من 20،000 × ز في جهاز طرد مركزي صغير لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية.
    2. إزالة وتجاهل supernatant. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1 مل من HBSS عن طريق الأنابيب بلطف.
    3. بيليه حطام الخلية في 200 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. نقل supernatant على بئر جديدة من خلايا مكوي مكوي confluent. إضافة 1 مل إضافية من HBSS إلى كل بئر لحجم إجمالي قدره 2 مل / جيد.
    4. تصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز ل1 ساعة في 20 درجة مئوية. استبدال التلقيح مع وسائل الإعلام الاختيار #1 مباشرة بعد العدوى.
  8. مواصلة تمرير البكتيريا على طبقة أحادية جديدة من خلايا مكوي (القسم 2.7) كل 48 ساعة لمدة ثلاثة أو أكثر من الممرات حتى يتم الكشف عن التضمينات الحمراء والخضراء باستخدام المجهر المقلوب 24 ساعة بعد العدوى (24 حصان).
  9. بمجرد الكشف عن التضمينات الحمراء والخضراء، استمر في تمرير الطبقة الأحادية (القسم 2.7) باستخدام وسائط التحديد #2.
  10. مواصلة تمرير طبقة أحادية حتى يتم الكشف عن الماشتمات الخضراء فقط 24 حصان يُذكر (#3 مرور أو أحدث)، مما يشير إلى فقدان ناقل pSUmC-4.0 ودمج كاسيت اختيار loxP في الجينوم.
  11. اختر بئرًا واحدًا من التضمينات الخضراء فقط للإثراء عن طريق التشيخ. حصاد وتجميد أي آبار أخرى تحتوي أيضًا على تضمينات خضراء فقط في المخزن المؤقت للسكروز والفوسفات والغلوتامات (SPG).
    1. لإثراء إدراج ات خضراء فقط، وتمرير أحادية من بئر واحد من لوحة 6 جيدا كما فعلت في الخطوة 2.7، ولكن بعد الكريات حطام الخلية (الخطوة 2.7.3)، نقل supernatant إلى مخروطية مع 12 مل من HBSS. استخدام هذا التلقيح لتصيب اثنين من 6 لوحات جيدا عن طريق إضافة 2 مل لكل بئر، ثم تدور لوحات في 900 × ز لمدة 60 دقيقة في 20 درجة مئوية.
    2. لتجميد آبار إضافية، حصاد طبقة أحادية كما هو الحال في الخطوة 2.7.1، ولكن إعادة تعليق الكريات في 1 مل من SPG بدلا من HBSS. بيليه حطام الخلية (الخطوة 2.7.3) ونقل supernatant إلى أنبوب التبريد 1.5 مل. تجميد المواد في -80 درجة مئوية.
  12. بعد إثراء التضمينات الخضراء فقط إلى وزارة الداخلية من 0.5-1.0 (واحد إلى اثنين من الممرات بعد الكشف)، حصاد الطبقات الأحادية في SPG كما هو موضح في الخطوة 2.11.2. الحصول على aliquots من 50 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل وتجميد في -80 درجة مئوية.
  13. تتر البكتيريا الخضراء فقط لتحديد إدراج، وتشكيل وحدات / μL، وفقا لبروتوكول المعايرة القياسية17.

3. Clonal عزل الأخضر فقط C. trachomatis حذف متحولة تحتوي على شريط الاختيار مع لفس ب من خلال الحد من تخفيف

  1. البذور لوحة 384 نسيج الأنسجة مع 50 ميكرولتر من خلايا مكوي في ~ 2000 خلية / بشكل جيد في #1 وسائل الإعلام النمو. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 ل ~ 24 ساعة أو حتى confluent.
  2. تمييع a aliquot من البكتيريا الخضراء فقط في HBSS لتحقيق ~ 50 EBs لكل 20 مل. نقل التلقيح المخفف إلى صينية خزان.
    1. إزالة وسائل الإعلام من لوحة بئر 384 عن طريق نفض الغبار بحزم لوحة كاملة رأسا على عقب في حاوية النفايات. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 50 ميكرولتر من C. الميكوكولم القصبة الهوائية إلى كل بئر. تصيب عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز ل1 ساعة في 20 درجة مئوية.
      ملاحظة: ضع في اعتبارك عدم النقر بقوة بحيث ينفصل أحادي الطبقة. إذا كانت الخلايا أكثر من متشنج، فإنها سوف تنفصل بسهولة أكبر.
  3. إزالة التلقيح عن طريق الخفقان واستبدالها مع 50 ميكرولتر / جيد وسائل الإعلام النمو #2. لوحات احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يكون دمج كاسيت الاختيار في الجينوم مستقرًا ، لذلك لم يعد هناك حاجة إلى اختيار المضادات الحيوية مع spectinomycin.
  4. بعد احتضان اللوحة لمدة 5-12 يومًا ، حدد الآبار الفردية مع إدراجات فلورية خضراء باستخدام مجهر مقلوب أو منصة فحص عالية المحتوى.
  5. حصاد الآبار مع إدراج الأخضر فقط عن طريق كشط أحاديالطبقة مع تلميح ف 10 ونقل محتويات كاملة من البئر إلى أنبوب يحتوي على 2 مل من HBSS. مزيج بلطف وتطبيق 2 مل من الانينوكولوم إلى أحادية مكوي مكوي جديدة في لوحة 6 جيدا للعدوى.
    ملاحظة: عند تحديد الآبار الفردية مع التضمينات، ستكون التضمينات في مجموعة بسبب التوسع من التضمين الأولي. إذا كان البئر يحتوي على مجموعات متعددة ، فمن المحتمل أن أكثر من EB واحد أصاب في البداية ذلك بشكل جيد. ولا ينبغي حصاد هذه الآبار، وفي بعض الحالات، قد يكون من الضروري إجراء جولات متعددة من العزلة الكلونية عن طريق التخفيف المتسلسل.
  6. تصيب لوحة بئر 6 عن طريق الطرد المركزي في 900 × ز ل1 ساعة في 20 درجة مئوية. استبدال التلقيح مع 2 مل / جيدا #2 وسائل الإعلام النمو. احتضان في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2 لمدة 48 ساعة.
  7. كرر الخطوات 2.11-2.13 لإثراء وتجميد وtiter clonal السكان.
  8. تأكيد حذف الجينات المستهدفة من clonally معزولة C. trachomatis باستخدام qPCR كما سبق وصفه12.

4. تحويل C. trachomatis FRAEM متحولة مع PSU-Cre لبدء إزالة شريط الاختيار المعتمس

  1. كرر عملية التحويل في لوحة بئر 6 كما هو موضح سابقًا (الخطوات 2.1-2.8) باستخدام C. trachomatis FRAEM المتحولة ، متجه PSU-Cre ، ووسائط التحديد #3.
    ملاحظة: تتم الإشارة إلى تحويل ناجح بواسطة التضمينات التي هي الفلورسنت الأحمر والأخضر.
    1. تمرير طبقة أحادية حتى يتم الكشف عن إدراجات الأحمر فقط باستخدام المجهر المقلوب المقلوب، مما يشير إلى فقدان كاسيت الاختيار (مقطعين إلى ثلاثة مقاطع). مواصلة تمرير طبقة أحادية حتى يتم إثراء التضمينات الحمراء فقط إلى وزارة الداخلية من ~ 0.5.
  2. Clonally عزل إدراجات الأحمر فقط عن طريق الحد من التخفيف في لوحة 384 جيدا كما هو موضح سابقا (الخطوات 3.1-3.8)؛ ومع ذلك، استخدم وسائط التحديد #3 لكافة الخطوات.
  3. إثراء السكان clonal عن طريق تمرير حتى وزارة الداخلية من 0.1. وبمجرد إثرائها، استبدل وسائط القسم بوسائط النمو #2 لبدء فقدان متجه PSU-Cre (حوالي ثلاثة إلى أربعة مقاطع).
  4. Clonally عزل البكتيريا غير الفلورية (الخطوات 3.1-3.8); ومع ذلك، يدويا مسح لوحة مع المجهر brightfield للكشف عن التضمينات. إثراء وتجميد البكتيريا (الخطوة 2.11-2.12).
  5. شاشة لسلالة متحولة باستخدام كمية في الوقت الحقيقي PCR، النشاف الغربي، وتسلسل الحمض النووي الجينوم كله كما وصفت سابقا12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تعتمد طريقة حذف الجينات بدون علامات في C. trachomatis باستخدام FLAEM على تقنيات الاستنساخ والتحول المتأنية. إعادة تركيب أليليتش ناجحة هي خطوة أولى أساسية ويتطلب تحديد وإدراج الأسلحة homology في ناقلات الاستنساخ pSUmC-4.0(الشكل 1). الخطوة الثانية الأساسية لحذف الجينات markerless هو إزالة مراسل الفلورسينس وكاسيت اختيار المضادات الحيوية من قبل تحرير الجينوم كري لوكس، ممثلة في الشكل 2. يتم مشروح المتجهات المستخدمة لإنجاز كل من هذه الخطوات في الشكل 3. ويبين الشكل 4 تمثيل تخطيطي لاستراتيجية التحول لتوليد متحولة حذف بلا علامات عند البدء من النوع البري C. trachomatis.

تظهر البيانات التمثيلية في الشكل 5 والشكل 6، حيث يتم استهداف tmeA لحذف الجينات. يتم إنشاء سلالة حذف C. trachomatis tmeA باستخدام FRAEM ، ويتم إنشاء سلالة C. trachomatis tmeA-lx باستخدام FLAEM. كلا سلالات متحولة تحتوي على حذف locus tmeA; ومع ذلك، tmeA-lx لا يحتوي على كاسيت الاختيار، كما هو مبين من عدم وجود الحمض النووي gfp هو مبين في الشكل 5. وقد انخفض سلالة متحولة tmeA التعبير عن tmeB، هو مبين في الشكل 6 من قبل مرنا ومستويات البروتين. عندما يتم استخدام FLAEM لتوليد سلالة tmeA-lx متحولة، ويبين الشكل 6 أن يتم استعادة التعبير عن tmeB.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتحديد 5'و 3' 'الأذرع homology من الحمض النووي الجينومي وPCR الفحص لإدراجها في pSUmC-4.0. (أ)يتم تمثيل الجين المستهدف للحذف من جينوم C. trachomatis بواسطة السهم الأزرق. المناطق 3 كيلوبايت المحددة على أنها 5 'و 3' 'الأسلحة homology لإعادة تركيب أليليتش هي بين قوسين باللونين الأرجواني والأحمر، على التوالي. (B, C) يتم تحديد إدخال الأسلحة 5 'و 3' homology في pSUmC-4.0 عن طريق فحص PCR. تظهر مواقع إنزيم تقييد Sall و Sbfl محاطة بـ aadA (السهم الأسود) وشريط اختيار gfp (السهم الأخضر) الذي تحيط به مواقع loxP (المربعات الصفراء) على متجه pSUmC-4.0. (B)لا يتم تحديد أي إدراج من قبل منتج PCR 1 كيلوبايت عندما يتم استخدام التمهيديات فحص 5 '(رؤساء الأسهم الأرجواني) لتضخيم PCR عبر موقع سال، أو يتم استخدام التمهيديات 3 'فحص (رؤساء الأسهم الحمراء) لتضخيم عبر موقع SbfI. (C)يتم تحديد الإدراج الناجح من قبل منتجات PCR 3 كيلوبايت تحت نفس الظروف. 5 'و 3' يتم تمثيل الأسلحة homology من قبل الأقواس الأرجواني والأحمر، على التوالي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التمثيل التخطيطي لـ Cre-lox بوساطة إعادة التركيب لإزالة كاسيت اختيار gfp-aadA. في وجود Rere recombinase ، والمواقع loxP (الأصفر) إعادة الجمع ، مما أدى إلى استئصال gfp--aadA كاسيت الاختيار (المربعات الخضراء والسوداء). يظهر الموضع الناتج يحتوي على تسلسل ندبة لوكسP المتبقية. تظهر مناطق المنبع (الولايات المتحدة) والمصب (DS) باللون الرمادي. وقد تم تعديل هذا الرقم من Keb et al.12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التنظيم الوراثي للpSUmC-4.0 و PSU-CRE. للحفاظ على التحكم في ناقلات في C. trachomatis، يتم تصميم pgp6 المصب من المروج التتراسيكلين-inducible. الجينات pgp المتبقية هي المصب من المروجين الكلاميديا الأصلية، ويتم التعبير عن mCherry بشكل تأسيسي على كل من ناقلات. (A)pSUmC-4.0 يحتوي على ترميز كاسيت بشكل تأسيسي aadA والجينات gfp للمضادات الحيوية وقدرة اختيار الفلورسينس، على التوالي. مواقع LoxP لإعادة تركيب الكري بوساطة وكذلك مواقع الإنزيم التقييد لإدخال الجين محددة homology الأسلحة الجناح كاسيت الاختيار. (ب)يحتوي pSU-CRE على عمود فقري مماثل لـ pSUmC-4.0؛ ومع ذلك ، بدلا من إعادة تركيب كاسيت ، يتم التعبير عن blaM وcre بشكل تأسيسي لانتقائية المضادات الحيوية وتوليد Recombinase CRE ، على التوالي. وقد تم تعديل هذه الأرقام من Keb et al.12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: التمثيل التخطيطي لاستراتيجية تحويل FLAEM المستخدمة لإنشاء متحولة حذف بدون علامة. يتم تمثيل طريقة FLAEM العامة هنا حيث يتم تحويل الرّاية من النوع المتّبر من النوع D. trachomatis بشكل تسلسلي ومرورها بشكل تسلسلي لتوليد حذف متحول بدون علامة. يتم تمثيل خطوات التحول من خلال إضافة الأسهم الصغيرة ، ويتم تمثيل فقدان العناصر الوراثية من خلال طرح الأسهم الصغيرة. C. يتم تمثيل وسيطات التراخووما (دوائر) مع الحساسيات المضادة للمضادات الحيوية (مقاومة البنسلين أو البنسلين حساسة = PenGr أو PenGق; spectinomycin مقاومة أو spectinomycin الحساسة = المواصفاتr أوالمواصفات ق)والصفات الفلورسينس الإبلاغ (الأخضر = gfp + ، الأحمر = mCherry +، الرمادي = لا فلورسينس). وترد أدناه التمثيلات التخطيطية للموضع الجيني في كل خطوة. وقد تم تعديل هذا الرقم من Keb et al.12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: تستخدم FRAEM وFLAEM لتوليد حذف الجينات tmeA. (أ)تم استخدام FRAEM لتوليد tmeA، وتم استخدام FLAEM لتوليد tmeA-lx. أرقام نسخ الحمض النووي النسبي من tmeA وtmeB المصب؛ gfp الواردة على كاسيت الاختيار pSUmC-4.0؛ وترد كل cre الواردة على متجه PSU-CRE. تم حصاد خلايا مكوي المصابة مع دمج وحدات تشكيل من WT، L2 tmeA،أو L2RiftmeA-lx C. trachomatis في 24 حصان، وتم استخراج الحمض النووي لqPCR. تم تقييم أرقام النسخ النسبية عن طريق تطبيع الإشارة إلى chlamydial 16sRNA. ND = لم يتم الكشف عن أي منها. (B)يظهر موضع tmeAB المتسلسل من L2RiftmeA-lx مع تسلسل ندبة لوكسب واحد متبقي (مسطر). تظهر المناطق المحيطة بالحمض النووي باللون الأزرق، وتظهر الكودونات البداية باللون الأخضر، ويظهر Codon stop TmeA باللون الأحمر. كما يصور codon بداية غير الكنسي لTmeB. وقد تم تعديل هذه الأرقام من Keb et al.12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: استئصال كاسيت الاختيار باستخدام FLAEM يستعيد التعبير عن tmeB عند استهداف tmeA ولا يعطل الجينات المصب. (أ)مستوى مرنا النسبي من C. trachomatis tmeA وtmeB سلالات متحولة. تم تحديد وجود النصوص المصب من tmeA من قبل النسخ العكسية (RT) PCR الكمية. المنطقة على الفور المصب من tmeA / B operon ترميز ct696. تم عزل مجموع الجيش الملكي النيبالي في 24 حصان من خلايا ماكوي المصابة في وزارة الداخلية من 1 مع WT، L2 tmeA،L2 tmeB،أو L2ريفtmeA-lx. تم الكشف عن نصوص tmeA، tmeB، وct696 بواسطة qRT - PCR. يتم تقديم إشارات بعد التطبيع إلى rpoD. ND = لم يتم الكشف عن أي منها. (ب)لطخة الغربية لوجود TmeA وTmeB في سلالات C. trachomatis متحولة. كميات متساوية من المواد الثقافة الكاملة من 24 الثقافات hpi المصابة مع دمج وحدات تشكيل على قدم المساواة من WT، L2 tmeA،L2RiftmeA-lx، أو L2RiftmeA-lx ptmeA تم التحقيق في المناعة لTmeA وTmeB. تم استخدام Hsp60 كتحكم في التحميل ، وتم تصور البروتينات بواسطة الكيمياء. تم تعديل الشكل من Keb وآخرون12. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول الموصوف هنا لتوليد حذف الجينات بدون علامات في C. trachomatis من قبل FLAEM يسمح الحذف المستهدف للجينات غير الأساسية ويزيل الآثار القطبية الناجمة عن الكاسيت. يعتمد البروتوكول على التصميم الدقيق لأذرع الهومنولوجيا 5 'و 3' التي تم إدخالها في ناقل الانتحار pSUmC 4.0 ، والتحول الفعال لـ C. trachomatis ، والفحص الدقيق للسلالات المتحولة المعزولة. الهندسة الجينوم الناجحة عن طريق هذه الطريقة النتائج في البكتيريا التي هي غير الفلورسنت وتحتوي على تسلسل ندبة loxP واحد في موقع حذف الجينات المستهدفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الطريقة لديها القدرة على التكيف مع الاستهداف التتابعي للجينات داخل نفس سلالة C. trachomatis.

التصميم الدقيق للأذرع 5 'و 3' homology والإدراج في ناقلات الانتحار هو الخطوة الأولى والأكثر أهمية في عملية الاستنساخ. وقد وجد أن 3 كيلوبايت الأسلحة homology توفير إعادة تركيب أليلايك الأكثر كفاءة. في حين أن إدخال هذه الأسلحة يولد ناقلًا كبيرًا ويصعب العمل معه في بعض الأحيان ، فقد كان هناك نجاح أقل بأذرع أقصر ، مع ~ 2 كيلوبايت يمثل الحد الأدنى للنجاح. يوفر استخدام مواقع تقييد Sall و Sbfl رد فعل بناء مريح من خطوة واحدة عند إجراء تجميع الحمض النووي.

كما كانت أساليب الاستنساخ الأخرى، مثل إدراج PCR، فعالة في إدخال أذرع الهومسولوجيا، ولكنها تقدم إمكانية أكبر للأخطاء المستندة إلى PCR. ومن المثير للاهتمام، وقد لوحظ أن استنساخ الذراع 5 'هو أكثر كفاءة نسبيا من الذراع 3'. إذا نشأت مشكلة، فمن المستحسن لتقسيم تجميع الحمض النووي إلى اثنين من ردود الفعل وبناء ناقلات بطريقة تدريجية. ثم، ينصح لهضم العمود الفقري ناقلات مع SbfI، إدراج الذراع 3 'أولا، ثم هضم ناقلات مع سال وإدراج الذراع 5 'في رد فعل تجميع الحمض النووي الثاني.

عند تضخيم شظايا PCR لأذرع الهومسولوجيا ، يوصى أيضًا باستخدام الحمض النووي الجينومي منقى حديثًا C. trachomatis الذي لم يتم تجميده مسبقًا. وهذا يحد من إمكانية قص الحمض النووي ويزيد من الكفاءة لتوليد amplicons أكبر. إذا تضخيم الأسلحة homology من ناقل آخر، فإن المنتج PCR تنقية تحتاج إلى أن يكون DpnI تقييد الانزيم تعامل قبل الشروع في تجميع الحمض النووي للحد من مستعمرات الخلفية أثناء تحويل الإشريكية القولونية.

والتحول خطوة حاسمة أخرى في هذا البروتوكول قد تنشأ فيها مسائل. إذا كان التحول مع pSUmC 4.0 ناجحاً، يجب أن تكون التضمينات الخضراء والحمراء مرئية عن طريق مرور #3; ومع ذلك ، يمكن أن يستغرق عدة ممرات أخرى قبل أن تصبح التحويلات غنية. مثل غيرها من النهج الطفرات ، وتقتصر هذه الطريقة على استهداف الجينات غير الأساسية ، ولكن لا يزال ينبغي تحقيق التحول بسهولة. قد يشير تمرير التحوّل على المدى الطويل في غياب التبادل الأليلي، الذي يشير إلى الاحتفاظ بمضان أحمر، إلى أن حذف الجين المستهدف هو حدث قاتل.

لأن ناقلات التحويل لـ C. trachomatis تحتوي على نفس أصل النسخ المتماثل مثل pL2 الأصلي، فإنه ليس من غير المألوف لبلازميد الأصلي أن يشفى بعد مقاطع متعددة (>5). الجينات pgp على ناقلات pSUmC هي في ترتيب مختلف بالمقارنة مع pL2 الأصلي; لذلك ، يمكن استخدام PCR للكشف عن وجود pL2 في سلالة معزولة عن طريق تضخيم المنطقة التي تمتد pgp7-pgp8. إذا فقدت البلازميد الأصلي في حذف النهائي متحولة، وسوف تحتاج إلى إعادة إدخال قبل إجراء الدراسات التنموية. ويمكن استخدام نقل الجينات الجانبية (LGT) لإعادة تقديم pL2 plasmid19.

في كثير من الحالات، المسوخ الحذف المبكر مع كاسيت التحديد لا تزال تحتوي على البلازميد pL2. لقد استخدمنا هذه السلالات لLGT مع النجاح لإعادة pL2 وتجنب إصلاح الجين المحذوف. يمكن استخدام LGT أيضًا كطريقة ثانوية للتحول عند إدخال PSU-Cre. في بعض الحالات ، كان LGT أكثر كفاءة من التحول الكلاسيكي CaCl2. في الحالات التي تستخدم LGT لإدخال PSU-Cre، من المهم أن تبدأ مع C. trachomatis التي تعبر عن أليل rpoB، الذي يمنح مقاومة ريفامبين قبل تبادل أليليتش وإدراج كاسيت اختيار spectinomycin12،19. بدءا من البكتيريا المقاومة ريفامبين يسمح الاختيار بعد الثقافة المشتركة.

تمكن FLAEM النهج الجينية العكسية مع الحذف المستهدف لتسلسل الترميز بأكمله ، مقارنة بالطرق الوراثية الأخرى التي تعتمد على الطفرات العشوائية أو إدخال تسلسل النيوكليوتيدات لتحقيق اضطراب الجينات. FLAEM هو في الأساس امتداد لFRAEM ، لأنه يسمح بإزالة كاسيت الاختيار ويزيل الآثار القطبية التي لوحظت سابقا كاسيت الناجمة. هذه الطريقة يخلق أيضا فرصة لتوليد حذف الجينات متعددة في سلالة واحدة C. trachomatis.

يمكن توليد طفرات متعددة من خلال آليتين مختلفتين. في الأول ، يمكن استخدام FLAEM لتوليد طفرة جينية بدون علامة واستخدامها بالتسلسل لاستهداف جين آخر في نفس السلالة. يمكن إعادة تحويل أول حذف متحولة مع ناقلات pSUmC 4.0 التي تحتوي على الأسلحة homology محددة للجين الثانوي من الفائدة. في هذه الحالة، يجب تكرار البروتوكول بنفس الطريقة التي يتم بها الحذف الأول وتكراره عدة مرات لاستهداف الجينات بشكل تسلسلي. في الآلية الثانية، يمكن أن يكون حذف علامة متحولة معزولة بعد FLAEM أن تكون مصابة مع متحولة الحذف التي لا تزال تحتوي على كاسيت التحديد. من خلال LGT ، يتم الحصول على الحذف الثاني ويمكن تحديده. عند استخدام هذا النهج، يتم الحد من الطفرات الإضافية من خلال عدد من أشرطة الاختيار الفريدة المتبقية في الجينوم. المضادات الحيوية المستخدمة عادة الاستخدام كضغط انتقائي أثناء التحول محدودة لC. trachomatis, لكنها لا تشمل البنسلين, الكلورامفينيكول, وspectinomycin. إزالة كاسيت الاختيار عن طريق تحرير الجينوم Cre-loxP يقلل من الحاجة إلى استخدام المضادات الحيوية متعددة للضغط الانتقائي. حذف تسلسل اتّهات جين متعددة في نفس الوقت مفيد عند دراسة البروتينات ذات الوظائف ذات الصلة أو العمليات البيولوجية التي قد يكون لها العديد من اللاعبين الرئيسيين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من خلال منح خدمات الصحة العامة من المعهد الوطني للصحة ، NIAID (المنح A1065530 و Al124649) ، إلى حقول ك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 155، الكري recombinase، FLAEM، FRAEM، الكلاميديا،الطفرات، تبادل أليليك، إعادة تركيب أليلي
العلامة حذف الجينات من قبل Floxed كاسيت أليليتش تبادل Mutagenesis في <em>الكلاميديا trachomatis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keb, G., Fields, K. A. Markerless… More

Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter