Summary
本文描述的是使用絮状盒状体等位基因突变（FLAEM）在衣原体沙眼中进行靶向、无标记基因删除的方法。
Abstract
衣原体沙眼是一种强制性的细胞内病原体，在历史上一直难以进行基因操作。由于缺乏遗传工具，在阐明沙眼菌用来创造和维持一个特权细胞内利基的机制方面，进展有限。幸运的是，基因操纵技术最近有了新的进展。其中包括荧光报告等位基因突变（FRAEM）的发展。该方法允许靶向基因删除，同时插入编码抗生素耐药性和绿色荧光蛋白（GFP）的选择盒。由于极性对下游基因的影响，在靶向多cistronic操作器中的基因时，依赖这种策略可能会很复杂。浮环盒等位基因交换突变（FLAEM），本文描述的方案，是为缓解盒引起极性效应而开发的。FLAEM利用Cre-loxP基因组编辑，在以等位交换定向删除后去除选择盒。生成的菌株包含一个或多个编码序列的无标记基因删除。该技术有助于直接评估基因功能，并扩展了C.沙眼遗传操作工具的系列。
Introduction
衣原体沙眼是细菌性传播疾病的主要原因，对人类健康构成重大负担。每年有超过1亿人感染沙眼病。尽管对生殖健康有害，如盆腔炎、宫外孕和/或不育，但大约70%的妇女感染无症状。疾病后遗症与由C.沙眼感染2引起的免疫病理学直接相关。有效的疫苗尚未开发;因此，了解细菌毒性因子和其他细菌基因产物的功能是一个重要而紧迫的研究课题。
由于细胞内细菌、宿主细胞入侵、细胞内复制、后代释放和宿主免疫反应的逃避是关键过程。C. 沙眼形成寄生膜结合的气穴，称为内含物，用于细胞内发育。通过III型分泌系统（T3SS）3分泌效应蛋白，可以建立内含物和许多其他关键过程。由于沙眼的遗传性不通性，这些分泌效应器的功能被限制了很多年。与大肠杆菌不同，许多经典的克隆技术不适用于衣原体。几个主要的限制包括转换效率，缺乏反选择记者，如sacB，和质粒维护。大肠杆菌质粒通常可以无限期地维持与复制的起源和适当的选择性压力，C.沙眼质粒需要额外的8个开放读取帧（pgp1-8）的维护，发现在原生pL2质粒在L2血清质粒4。
近年来，已经产生了多种基因工具，以适应衣原体的独特生物学，但仍有限制5，6，7。通过乙基甲酸酯（EMS）处理的化学诱变可以引入失义突变，或者（不太频繁）可能导致核苷酸转化，引入过早停止的柯顿，产生无意义突变8。转位子插入是有效的基因破坏，但目前技术在衣原体研究是费力和费时的9。EMS治疗和转波龙诱变技术都会产生随机突变，需要严格的筛选方法来分离突变菌株。一种通过插入II组内子（例如，TargeTron）来破坏基因的方法允许定向诱变;但是，此方法受效率的限制，并且插入站点并不总是正确预测10。
荧光报告等位基因交换突变（FRAEM）是一种用于靶向基因删除的策略，同时插入一个提供抗生素耐药性的选择盒和荧光报告器11。然而，FRAEM由于盒式极性效应对下游基因的影响而变得复杂，特别是当靶向多cistronic操作体中的基因时。花环状体等位基因交换突变（FLAEM）是一种新型的遗传方法，旨在缓解以前用FRAEM选择盒12观察到的盒式极性效应。FLAEM利用Cre-loxP基因组编辑来去除选择盒和恢复下游基因的表达。含有抗生素耐药性和绿色荧光蛋白（GFP）的选择盒通过侧翼loxP位点进行了重新设计。这些loxP位点可以在存在Cre重组酶的情况下重组，导致从基因组13中切除盒。这一策略已被证明，以减轻盒诱发的极性效应，当目标tmeA删除12，14。
FRAEM 和 FLAEM 方法都使用相同的自杀载体 pSUmC 4.0，可通过pgp6的诱导表达有条件地保持这种载体。pgp6的表达先前已被证明是质粒保留所必需的，因此用于控制质粒维持11，15。当C.沙眼在介质中生长，辅以无水四环素（aTc）诱导pgp6表达时，保持向量。在没有 aTc 的情况下，矢量将丢失。通过选择盒基因的等位交换，实现靶向基因删除。目标基因的上游和下游直接的3 kb区域作为重组的同源臂。这些手臂被克隆到选择盒的两侧pSUmC 4.0矢量中。通过荧光报告观察成功的C.沙眼转化和重组事件。在选带盒中的载体骨干和gfp上表达mCherry会产生红色和绿色荧光内含物。一旦从培养培养物中去除aTc，仅绿色内含物表示成功重组事件，自杀载体的丢失和选择盒与细菌基因组的整合。
FLAEM 代表 FRAEM 的扩展，它通过随后将 Cre 重组酶表达载体 pSU-Cre 转换为新创建的突变菌株。Cre 重组酶有助于loxP位点之间的重组和选择盒的切除。重组事件通过荧光报告表示。pSU-Cre矢量编码mCherry;因此，成功转化通过添加红色荧光到gfp-表达内含物。在没有选择性压力的情况下培养盒式磁带会导致在 loxP位点进行 Cre 介导重组，而盒式磁带的丢失由仅红色内含物指示。与 pSUmC-4.0 一样，pgp6的诱导表达用于有条件地维持 pSU-Cre。一旦消除aTc和抗生素选择，质粒被治愈，由此产生的无标记缺失菌株是非荧光的。该方法解决了盒式极性效应问题。
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Protocol
1. pSUmC-4.0的设计和组装，具有与兴趣基因特有的同源武器
- 识别直接用于删除的基因的上游和下游的 ±3 kb 区域，作为同源重组的 5' 和 3' 同源臂（图 1）。
- 设计 PCR 引源到 1） 从衣原基因组 DNA 和 2） 放大 3 kb 5' 同源臂和 2） 包含 15–30 bp 悬伸特定于 pSUmC-4.0 时在 Sall 限制酶位点消化。确保与 pSUmC-4.0 重叠的引基区域的熔融温度为 55°C，并且整个引基的发夹熔合温度为 <35 °C。
- 设计 PCR 引源到 1） 从衣原基因组 DNA 和 2） 放大 3 kb 3' 同源臂和 2） 包含 15–30 bp 悬伸特定于 pSUmC-4.0 时在 SbfI 限制酶位点消化。确保与 pSUmC-4.0 重叠的引基区域的熔融温度为 55°C，并且整个引基的发夹熔合温度为 <35 °C。
- 设计PCR筛选引源，在DNA组装反应16后，将每个同源臂放大到pSUmC-4.0载体中。在限制位点外设计这些引体以 ~500 bp，以便轻松可视化 PCR 产品，即使插入不成功（图 1）。
- 通过PCR从新鲜提取的衣原体基因组DNA中放大3 kb 5' 和3'同源性手臂，在一到二个反应中产生足够的片段，供以后的DNA组装。遵循DNA聚合酶制造商的协议，针对特定的反应设置和循环条件。
- 验证两种 PCR 产品的大小是否正确，并且反应不含任何污染带。在1%脱氧核糖凝胶上运行5μL的每种PCR反应。
- 通过苯酚/氯仿萃取和乙醇沉淀来净化和浓缩PCR片段。
- 将所有 3' PCR 反应汇集在 1.5 mL 管中，在无核酸酶 H2O 下最终体积达到 200 μL。
- 将200μL的苯酚加入每管和涡旋30-60秒。在室温（RT）下，在±gt;21，000 x g的微离心机中旋转每根管20分钟。
- 将每个管的水相顶层转移到新的1.5 mL管中，将3M醋酸钠的十分之一的体积添加到每个管中，然后轻拂混合。
- 在每个管子中加入3卷100%乙醇，然后轻弹混合。在-80°C下孵育两个管20分钟。
- 在RT处将每根管子旋转到>21，000 x g5分钟，从而将DNA压碎。
- 用 100 μL 的 70% 乙醇清洗 DNA 颗粒。在RT处将每根管子旋转5分钟，以>21，000 x g旋转5分钟。丢弃上清液。
- 用100μL的100%乙醇再次清洗DNA颗粒。在 RT 处旋转每个管材 >21，000 5 分钟。丢弃上清液。
- 让颗粒完全风干，然后轻轻重新悬浮DNA在12 μL的无核酸酶H2O通过轻拂混合。
- 根据制造方案，在20μL反应中，用1个单位的Sall和1个单位的SbfI，在20μL反应中消化500 ng的pSUmC-4.0载体。孵育反应约3小时或过夜，以确保对载体的完全消化。
- 如前所述，通过苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀（步骤1.7.1~1.7.9）净化和浓缩消化的骨干。
- 将消化的 pSUmC-4.0 矢量和 5' 和 3' 同源臂 PCR 产品结合在一起，每同源臂的比率为 0.01 pmol pSUmC-4.0 至 0.09 pmol。根据制造方案，在DNA组装反应中组装片段。
- 使用 1 μL 的 DNA 组装反应，将 50 μL 的电能大肠杆菌转化。将转化的大肠杆菌板板板板内含有 100 μg/mL 规格霉素，每板分布 150 μL。在37°C过夜孵育板。
- 第二天，使用荧光倒置显微镜进行绿色和红色荧光的屏幕菌落。每个琼脂板总共有5~30个菌落。
- 挑选5~10个菌落，接种4 mL的LB肉汤，辅以100微克/mL的霉素。在 37°C 过夜孵育培养物，在 250 rpm 下摇动。
- 使用隔夜大肠杆菌培养物，进行小规模DNA纯化。用50μL的无核酸酶H2O洗脱DNA。
- 使用 PCR 筛选引基（在步骤 1.4 中设计）确认每个同源臂插入 pSUmC-4.0 矢量中，以放大每次插入。如果 DNA 组装成功，应在 5' 和 3' 臂区域的 1% DNA Agarose 凝胶中观察到 ±4 kb PCR 产物。±1 kb PCR 产品表示缺少插入。
注：如果在双片段装配反应中插入同源臂失败，则单独执行两次装配反应以插入 5' 臂，然后插入 3' 臂。在与 5' 臂组装之前，仅用 Sall 消化矢量，然后用 SbfI 消化矢量以组装 3' 臂。 - 变换大坝-/dcm-具有 200 ng 的 pSUmc-4.0 的合格大肠杆菌，用两个同源臂组装。将转化后的细菌盘到含有100μg/mL的光谱霉素的LB琼脂板上，每盘散播25μL。在37°C过夜孵育板。预计总共有20-200个殖民地。
- 如步骤 1.13 所述，筛选红色和绿色荧光菌落的板。
- 通过接种含有100μg/mL光谱素的100 mL含有红色和绿色菌落的LB肉汤，建立大规模DNA纯化培养物。在 37°C 过夜孵育培养基，在 250 rpm 下摇动。
- 利用大规模DNA纯化收获培养物，纯化DNA。
- 在NF-H2O的100μL中重新悬浮纯化质粒DNA。总DNA收率至少为2微克/μL，是C型沙眼转化的理想选择。
- 对5'和3'同源臂区域进行序列，以确保在转化C.沙眼之前正确组装成pSUmC-4.0。
2. C.沙眼病与pSUmC 4.0的转化 – 同源性武器通过等位交换进行基因删除
- 种子麦科伊细胞，小鼠成纤维细胞标准用于培养衣原体，成两个6孔板（1 x 106细胞/孔）与生长培养基#1。在 37°C 下用 5% CO2孵育板，直到单层汇合（约 24 小时）。
- 在 1.5 mL 管中，加入一体积的C. 沙眼 WT血清Var L2 基本体 （HB），足以在 MOI 为 2 时感染 6 孔板的 12 口井。将 EB 在 >20，000 x g处进行 30 分钟，然后丢弃上清液。
- 通过轻轻地在 CaCl2缓冲液的 600 μL 中重新悬浮 EB，然后向管中加入 24 μg 的 pSUmC-4.0 + 同源臂，启动衣原体转化。轻拂轻轻混合溶液。在 RT 孵育管子 30 分钟，每 10 分钟轻拂一次混合。
- 将转化溶液添加到 24 mL 的汉克斯平衡盐溶液 （HBSS） 中，并通过轻轻移液进行混合。将2 mL的接种液转移到6个孔板中每个孔的汇合McCoy细胞，并在20°C下以900 x g离心感染1小时。
- 拆下接种液，并更换为 2 mL/well RPMI 增长介质#2。在37°C下用5%的CO2孵育板。
- 至少 7 小时后，但不超过 12 小时，将介质更换为 2 mL/井的选择介质#1。从感染时起，在37°C继续孵育48小时。
- 收获细菌，并将细菌转移到麦考伊细胞的新鲜单层上。
- 使用细胞刮刀，轻轻刮擦麦考伊单层，将细胞提升到介质中。将材料从每个井转移到 2 mL 管中。在4°C下，在微离心机中以>20，000 x g的细胞材料粒度30分钟。
- 拆下并丢弃上清液。通过轻轻移液将细胞颗粒重新悬浮在 1 mL 的 HBSS 中。
- 在 4°C 下以 200 x g将细胞碎屑颗粒 5 分钟。将上清液转移到一口新的康体麦考伊细胞井上。在每个井中额外添加 1 mL 的 HBSS，总体积为 2 mL/口。
- 在20°C下，在900 x g下离心1小时。感染后立即用选择介质#1更换接种。
- 继续将细菌传给每48小时一次的McCoy细胞（第2.7节），进行三个或三个以上通道，直到使用感染后24 h的荧光倒置显微镜（24 hpi）检测到红色和绿色内含物。
- 检测到红色和绿色夹杂物后，继续使用选型介质#2通过单层（第 2.7 节）。
- 继续传去单层，直到检测到仅绿色的内含物24 hpi（#3或更高版本），这表示pSUmC-4.0载体的丢失，并将loxP选择盒纳入基因组。
- 选择一口仅含绿色的内含物，通过传用来丰富。在蔗糖-磷酸盐-谷氨酸缓冲液（SPG）中也含有仅含绿色的含泥剂的任何其他油井进行收获和冷冻。
- 为了丰富仅含绿色的内含物，从步骤 2.7 中完成的 6 孔板的一口井中通过单层，但在对细胞碎片进行颗粒（步骤 2.7.3）后，将上清液转移到具有 12 mL HBSS 的锥形中。使用此接种液通过每口井加入 2 mL 来感染两个 6 孔板，然后在 20°C 下以 900 x g旋转板 60 分钟。
- 要冻结额外的油井，如步骤 2.7.1 中那样收获单层，但将颗粒重新悬浮在 1 mL SPG 而不是 HBSS 中。将细胞碎片（步骤2.7.3）粒化，并将上清液转移到1.5 mL冷冻管中。将材料冷冻在-80°C。
- 在将仅绿色内含物浓缩到 0.5–1.0 的 MOI（检测后再增加一到两个通道）后，如步骤 2.11.2 所述，将单层收获到 SPG 中。在 1.5 mL 管中获得 50 μL 的等分，并在 -80°C 冷冻。
- 滴青细菌测定内含物，形成单位/μL，根据标准滴定方案17。
3. 仅绿色C. 沙眼缺失突变体的克隆隔离，通过限制稀释，包含loxP带状选择盒
- 在生长培养基#1中，在+2，000个细胞/孔中，用50μL的McCoy细胞播种384孔组织培养板。在 37°C 下孵育，5 % CO 2，+24 小时或直到汇合。
- 稀释哈佛商学院中仅绿细菌的等分，达到每 20 mL 的 +50 EB。将稀释的接种液转移到储液罐托盘上。
- 将整个板倒置到废物容器中，将介质从 384 孔板中取出。使用多通道移液器，在每个井中加入 50 μL 的C. 沙眼接种液。在20°C下，在900 x g下离心1小时。
注意：请注意，不要轻弹太重，以至于单层分离。如果细胞过度汇入，它们将更容易分离。
- 将整个板倒置到废物容器中，将介质从 384 孔板中取出。使用多通道移液器，在每个井中加入 50 μL 的C. 沙眼接种液。在20°C下，在900 x g下离心1小时。
- 轻拂并更换50μL/井生长介质#2，取出接种。在 37°C 下孵育板，CO2为 5%。
注：在此阶段，选择盒与基因组的整合是稳定的，因此不再需要使用光谱霉素选择抗生素。 - 在培养板5~12天后，使用荧光倒置显微镜或高含量筛选平台，用绿色荧光内含物识别单个孔。
- 用p-10尖端刮取单层，并将油井的全部内容物转移到含有2 mL的HBSS管中，用仅含绿色的内含物收获油井。轻轻混合，将2 mL的接种液涂抹在6孔板中，将2 mL的接种液涂抹在一个新的康康麦科伊单层上，以进行感染。
注： 在确定包含物的单个井时，由于初始包含的扩展，内含物将位于群集中。如果一口井有多个群集，则可能有多个 EB 最初感染了该井。这些井不应被收获，在某些情况下，可能需要通过连续稀释进行多轮克隆隔离。 - 在20°C下，在900 x g下离心1小时，感染6孔板。将接种液更换为 2 mL/油井生长介质#2。在 37°C 下孵育，5 % CO2孵育 48 小时。
- 重复步骤 2.11–2.13 以丰富、冻结和位子克隆种群。
- 确认使用qPCR从克隆分离的C.沙眼病中删除靶向基因，如前所述12。
4. 用 pSU-Cre 转换C. 沙眼瘤FRAEM 突变体以启动去除loxP带刺的选录盒
- 使用克隆分离的C. 沙眼 FRAEM突变体、pSU-Cre 矢量和选择介质#3在 6 孔板中重复变换过程（步骤 2.1~2.8）。
注： 成功的变换由红色和绿色荧光的内含物指示。- 使用表氟倒置显微镜检测仅红色内含物，从而通过单层，指示选择盒（两到三个通道）丢失。继续传去单层，直到仅红色内含物浓缩到±0.5的MOI。
- 如前所述（步骤 3.1~3.8），通过限制 384 孔板中的稀释，从而完全隔离仅红色内含物;但是，对所有步骤使用选择媒体#3。
- 通过传递来丰富克隆种群，直到 MOI 为 0.1。一旦浓缩，用生长介质#2替换截面介质，以启动 pSU-Cre 矢量（大约三到四个段落）的损耗。
- 克隆分离非荧光细菌（步骤3.1~3.8）;但是，使用明场显微镜手动扫描板以检测内含物。丰富和冻结细菌（步骤 2.11~2.12）。
- 屏幕突变应变使用定量实时PCR，西方印迹，和全基因组DNA测序如前所述12。
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Representative Results
使用FLAEM在C.沙眼中无标记基因删除的方法依赖于谨慎的克隆和转化技术。成功的等位基因重组是一个基本的第一步，需要识别和插入同源臂到pSUmC-4.0克隆载体（图1）。无标记基因删除的一个基本第二步是通过Cre-lox基因组编辑去除荧光报告器和抗生素选择盒，如图2所示。用于完成每个步骤的矢量在图 3中进行了批出。图4显示了转换策略的示意图，用于在从野生型C.沙眼开始时生成无标记的缺失突变体。
代表性数据如图5和图6所示，其中tmeA是基因删除的目标。沙眼tmeA缺失菌株使用FRAEM生成，而C.沙眼tmeA-lx菌株使用FLAEM生成。两种突变菌株都含有tmeA位点的缺失;然而，tmeA-lx不包含选择盒，如图5所示的gfpDNA缺失就表明了这一点。tmeA突变菌株具有tmeB的表达，图6以mRNA和蛋白质水平显示。当FLAEM用于生成tmeA-lx突变应变时，图6显示tmeB的表达被恢复。
图1：从基因组DNA和PCR筛选中识别5'和3'同源性手臂的原理表表示形式，用于将其插入pSUmC-4.0中。（A） 从沙眼基因组中缺失的基因由蓝色箭头表示.被确定为用于等位复组合的 5' 和 3' 同源臂的 3 kb 区域分别以紫色和红色括起来。（B，C）将 5' 和 3' 同源臂插入 pSUmC-4.0 取决于 PCR 筛选。Sall 和 Sbfl 限制酶位点显示在aadA（黑色箭头）和gfp（绿色箭头）选择盒的两侧，后者由 pSUmC-4.0 矢量上的loxP位点（黄色方块）两侧显示。（B） 当 5' 筛选引基（紫色箭头）用于 PCR 在 Sall 站点上放大时，或使用 3' 筛选引基（红色箭头）在 SbfI 站点上放大时，1 kb PCR 产品不会通过插入来确定。（C） 在相同条件下，成功插入由 3 kb PCR 产品决定。5' 和 3' 同源臂分别由紫色和红色括号表示。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：Cre-lox介导重组的原理表示，以去除gfp-aadA选择盒。在 Cre 重组酶的存在下，loxP位点（黄色）重新组合，导致gfp-aadA选择盒（绿色和黑色方块）的切除。显示生成的位点包含一个剩余的loxP疤痕序列。上游 （US） 和下游 （DS） 区域显示为灰色。这个数字已由Keb等人12修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：pSUmC-4.0和pSU-CRE的遗传组织。为了控制C.沙眼病的载体的维护，pgp6在四环素诱导启动子的下游进行工程。其余的pgp基因是其原生衣原体启动子的下游，mCherry在两个载体上构成。（A） pSUmC-4.0 分别包含盒式编码，分别表达aadA和gfp基因，用于抗生素和荧光选择能力。用于 Cre 介导重组的LoxP位点以及用于插入基因特异性同源臂的限制性酶位点在选择盒的侧翼。（B） pSU-CRE 包含与 pSUmC-4.0 类似的骨干;然而，代替重组盒，blaM和cre分别构成抗生素选择性和CRE重组酶生成。这些数字已由Keb等人12日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：用于创建无标记删除突变体的 FLAEM 变换策略的架构表示。一般的FLAEM方法在这里表示，野生型C.沙眼被按顺序转换和连续传递，以生成无标记的缺失突变体。变换步骤由小箭头的添加表示，遗传元素的丢失用小箭头的减法表示。C. 沙眼中间体（圆圈）代表抗生素敏感性（青霉素耐药或青霉素敏感 + PenGr或PenGs;耐光谱霉素或光谱霉素敏感度 = 规格r或Specs）和荧光报告质量（绿色 = gfp +，红色 = mCherry +，灰色 =无荧光）。每个步骤中基因位点的原理表示如下所示。这个数字已由Keb等人12修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：FRAEM和FLAEM用于生成tmeA基因缺失。（A） FRAEM用于生成tmeA，FLAEM用于生成tmeA-lx.tmeA和下游tmeB的相对DNA拷贝编号;包含在pSUmC-4.0选择盒上的gfp;和包含在pSU-CRE向量上的crea都显示。感染WT、L2 tmeA或L2RiftmeA-lx C.沙眼等组分的麦科伊细胞在24 hpi处被采集，并提取DNA进行qPCR。相对拷贝数通过信号规范化评估到衣原体16sRNA。ND = 未检测到任何故障。（B） L2RiftmeA-lx的序列tmeAB位点与单个剩余loxP疤痕序列（带下划线）显示。DNA的侧翼区域以蓝色显示，起始科顿以绿色显示，TmeA 停止科顿以红色显示。还描述了 TmeB 的非规范启动科顿。这些数字已由Keb等人12日修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：使用FLAEM的选带在靶向tmeA时恢复tmeB的表达，不会破坏下游基因。（A） C. 沙眼tmea和tmeB突变菌株的相对 mRNA 水平.tmeA下游转录转录转录酶（RT）定量PCR确定转录本的存在。紧邻 tmeA/B操作数的下游区域编码ct696。总RNA在24 hpi从麦考伊细胞中分离出来，在MOI中感染1与WT，L2 tmeA，L2 tmeB，或L2RiftmeA-lx。qRT-PCR检测到tmeA、tmeB和ct696的转录。 信号在归一化为rpoD后呈现。ND = 未检测到任何故障。（B） 在C.沙眼突变菌株中存在TmeA和TmeB的西方污点。在TmeA和TmeB的免疫布槽中，从24个hpi培养物中，对同样数量的全培养物质进行探测，这些物质感染了WT、L2 tmeA、L2RiftmeA-lx或L2RiftmeA-lx ptmeA等均等内含形成单位。Hsp60用作载荷控制，蛋白质通过化学发光可视化。图已被修改从Keb等人12。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
此处描述的FLAEM在沙眼病中生成无标记基因缺失的协议允许有针对性地删除非必需基因，并消除盒式极性效应。该协议依赖于对插入pSUmC 4.0自杀载体的5'和3'同源臂的精心设计，对沙眼的有效转化，以及对分离的突变菌株的仔细筛选。通过这种方法成功的基因组工程导致细菌是非荧光的，并在靶向基因删除部位包含单个loxP疤痕序列。此外，该方法有可能适用于同一C型沙眼菌株中基因的连续靶向。
精心设计5'和3'的同源臂并插入自杀载体是克隆过程的第一步，也是最关键的一步。研究发现，3 kb同源臂提供最有效的等位复位重组。虽然插入这些手臂会产生一个很大，有时难以处理的矢量，但较短的手臂的成功程度较低，±2 kb 表示成功的最低要求。在执行 DNA 组装时，利用 Sall 和 Sbfl 限制位点提供了方便的一步构造反应。
其他克隆方法，如插入PCR，也有效地插入同源性手臂，但它们引入基于PCR的错误的可能性更大。有趣的是，人们观察到5'手臂的克隆比3'手臂更有效。如果出现问题，建议将DNA组装分为两种反应，并逐步构造载体。然后，建议用SbfI消化载体主干，先插入3'手臂，然后用Sall消化载体，然后将5'手臂插入第二个DNA组装反应中。
当为同源臂扩增PCR片段时，也建议使用未冷冻的新鲜纯化的C.沙眼基因组DNA。这限制了DNA剪切的可能性，并提高了产生较大放大的放大器的效率。如果从另一个载体中扩增同源臂，纯化的PCR产物将需要经过DpnI限制性酶处理，然后进行DNA组装，以减少大肠杆菌转化期间的背景菌落。
转换是该协议中可能出现问题的另一个关键步骤。如果使用 pSUmC 4.0 的转换成功，则绿色和红色内含物应通过通道#3可见;然而，在转化剂变富之前，它可能需要多走几段。与其他诱变方法一样，这种方法仅限于针对非必需基因，但转化仍应易于完成。在没有等位交换的情况下，通过保留红色荧光来指示转化剂的长期传递可能表明，删除靶向基因是一种致命事件。
由于C. 沙眼的变换载体包含与本机 pL2 相同的复制源，因此在多次（>5）通道后治愈原生质粒的情况并不少见。与原生pL2相比，pSUmC向量上的pgp基因顺序不同;因此，PCR 可用于通过放大跨越pgp7+pgp8的区域来检测分离应变中 pL2 的存在。如果原生质粒在最终缺失突变体中丢失，则需要在进行发育研究之前重新引入。横向基因转移（LGT）可用于重新引入pL2质粒19。
在许多情况下，使用选择盒的早期删除突变体仍含有pL2质粒。我们已经利用这些菌株LGT成功重新引入pL2和避免修复已删除的基因。在引入 pSU-Cre 时，LGT 也可以用作二次转换方法。在某些情况下，LGT 比经典 CaCl2转换更有效。在LGT用于引入pSU-Cre的情况下，重要的是从表达rpoB等位基因的C.沙眼开始，在等位交换和插入光谱霉素选择盒12，19之前，它赋予利夫帕平抗性。从抗瑞霉菌开始，允许在共同培养后进行选择。
FLAEM 支持反向遗传方法，有针对性地删除整个编码序列，而与其他依赖随机诱变或插入核苷酸序列来实现基因破坏的遗传方法相比。FLAEM本质上是FRAEM的延伸，因为它允许去除选择盒，并消除先前观察到的盒式极性效应。这种方法还创造了在单个C.沙眼菌株中产生多个基因缺失的机会。
多个突变可以通过两种不同的机制产生。在第一个，FLAEM可用于生成无标记基因突变，并按顺序用于针对同一菌株中的另一个基因。第一个缺失突变体可以使用pSUmC 4.0载体进行重组，该载体含有特定为感兴趣的二级基因而特有的同源性臂。在这种情况下，协议应该以与第一次删除相同的方式重复，并重复多次以按顺序定位基因。在第二个机制中，FLAEM 之后分离的无标记删除突变体可以与仍然包含选择盒的缺失突变体共同感染。通过 LGT，获取第二个删除，并可以选择。使用这种方法时，其他突变受基因组中剩余唯一选择盒的数量的限制。在转化过程中用作选择性压力的常用抗生素仅限于沙眼病，但它们确实包括青霉素、氯霉素和霉素。通过 Cre-loxP 基因组编辑去除选择盒，减少了使用多种抗生素进行选择性压力的需要。同时删除多个基因序列在研究具有相关功能或可能有多个关键角色的生物过程的蛋白质时是有益的。
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Disclosures
提交人没有利益冲突可披露。
Acknowledgments
这项工作得到了国家卫生研究所公共卫生服务部（国家卫生研究所）向K.A.Fields提供的赠款（A1065530和Al124649）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam-/dcm- Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
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