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Immunology and Infection

Markerless Gene Deletion par Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60848
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

Décrit ici est une méthode pour la suppression ciblée et sans marqueur de gène dans Chlamydia trachomatis utilisant la mutagénèse allélique d'échange allélique de cassette floxed, FLAEM.

Abstract

Chlamydia trachomatis est un agent pathogène intracellulaire obligatoire qui a été historiquement difficile à manipuler génétiquement. Les progrès définitifs dans l'élucidation des mécanismes que C. trachomatis emploient pour créer et maintenir une niche intracellulaire privilégiée ont été limités en raison d'un manque d'outils génétiques. Heureusement, il y a eu récemment plusieurs nouvelles avancées dans les techniques de manipulation génétique. Parmi ceux-ci est le développement de la mutagénèse allélique d'échange de fluorescence-rapportée (FRAEM). Cette méthode permet la suppression ciblée des gènes couplée à l'insertion d'une cassette de sélection codant la résistance aux antibiotiques et la protéine fluorescente verte (GFP). La dépendance à l'égard de cette stratégie peut être compliquée lorsque l'on cible les gènes dans les opérons polycistroniques en raison du potentiel d'effets polaires sur les gènes en aval. La mutagénèse d'échange allélique de cassette floxed (FLAEM), dont le protocole est décrit ici, a été développée pour alléger des effets polaires cassette-induits. FLAEM utilise l'édition du génome Cre-loxP pour supprimer la cassette de sélection après suppression ciblée par échange allélique. Les souches résultantes contiennent des suppressions de gènes sans marqueur d'une ou de plusieurs séquences de codage. Cette technique facilite l'évaluation directe de la fonction génique et élargit le répertoire d'outils de manipulation génétique chez C. trachomatis.

Introduction

La chlamydia trachomatis est la principale cause de maladies bactériennes sexuellement transmissibles et représente un fardeau important pour la santé humaine. Plus de 100 millions de personnes sont infectées chaque année par C. trachomatis1. Environ 70% des infections chez les femmes sont asymptomatiques en dépit des effets néfastes sur la santé reproductive, tels que la maladie inflammatoire pelvienne, la grossesse extra-utérine, et / ou l'infertilité. La séquelle de la maladie est directement liée à l'immunopathologie initiée par l'infection à C. trachomatis 2. Un vaccin efficace n'a pas encore été mis au point; par conséquent, la compréhension de la fonction des facteurs de virulence bactérienne et d'autres produits de gène bactérien est une question importante et urgente de recherche.

Comme bactéries intracellulaires, l'invasion de cellules d'hôte, la réplication intracellulaire, la libération de la progéniture, et l'évasion des réponses immunologiques d'hôte sont des processus critiques. C. trachomatis forme un vacuole lié de membrane parasitophore, appelé une inclusion, pour le développement intracellulaire. L'établissement de l'inclusion et de nombreux autres processus critiques sont obtenus par la sécrétion de protéines effecteurs via un système de sécrétion de type III (T3SS)3. L'élucidation des fonctions de ces effecteurs sécrétés a été limitée pendant de nombreuses années en raison de l'intraitabilité génétique de C. trachomatis. Contrairement à E. coli, de nombreuses techniques classiques de clonage ne sont pas applicables à la chlamydia. Quelques limitations majeures impliquent l'efficacité de transformation, le manque de journalistes de contre-sélection tels que sacB, et l'entretien plasmide. Alors que les plasmides E. coli peuvent généralement être maintenus indéfiniment avec une origine de réplication et une pression sélective appropriée, les plasmides de C. trachomatis nécessitent huit cadres de lecture ouverts supplémentaires(pgp1-8) pour l'entretien qui se trouvent sur le plasmide pL2 indigène dans le sérovarL2 4.

Ces dernières années, il ya eu de multiples outils génétiques générés qui accueillent la biologie unique de la chlamydia, mais il ya encore des limitations5,6,7. La mutagénèse chimique par le traitement de l'éthylique methanesulfonate (EMS) peut introduire des mutations de mauvais sens, ou (moins fréquemment) peut avoir comme conséquence des transitions de nucléotide introduisant un codon prématuré d'arrêt pour produire une mutation non-sens8. L'insertion de Transposon est efficace pour la perturbation des gènes, mais la technologie actuelle dans la recherche sur la chlamydia est laborieuse et prend du temps9. Le traitement du SME et les techniques de mutagénèse transposon génèrent des mutations aléatoires et nécessitent des méthodes de dépistage rigoureuses pour isoler les souches mutantes. Une méthode pour perturber les gènes par l'insertion d'introns du groupe II (p. ex. TargeTron) permet une mutagénèse dirigée; cependant, cette méthode est limitée par l'efficacité, et le site d'insertion n'est pas toujours correctement prédit10.

La mutagénèse d'échange allélique (FRAEM) rapportée par fluorescence est une stratégie utilisée pour la suppression ciblée de gène couplée à l'insertion d'une cassette de sélection fournissant la résistance antibiotique et d'un journaliste de fluorescence11. Pourtant, FRAEM est compliqué par le potentiel des effets polaires induits par cassette sur les gènes en aval, en particulier lors du ciblage des gènes dans les operons polycistroniques. La mutagénèse d'échange allélique de cassette floxed (FLAEM) est une nouvelle approche génétique développée pour alléger les effets polaires cassette-induits précédemment observés avec la cassette de sélection de FRAEM12. FLAEM utilise l'édition du génome De Cre-loxP pour enlever la cassette de sélection et restaurer l'expression des gènes en aval. La cassette de sélection contenant une résistance aux antibiotiques et une protéine fluorescente verte (GFP) est repensée avec des sites de loxP flanquants. Ces sites loxP peuvent se recombiner en présence de Cre recombinase et entraîner l'excision de la cassette du génome13. Cette stratégie a été montrée pour alléger les effets polaires induits par cassette en ciblant tmeA pour la suppression12,14.

Les méthodes FRAEM et FLAEM utilisent le même vecteur de suicide, le pSUmC 4.0, qui peut être maintenu sous condition par l'expression inductible du pgp6. L'expression du pgp6 a été précédemment montrée pour être nécessaire pour la conservation de plasmide et est donc exploitée pour commander l'entretien de plasmide11,15. Lorsque C. trachomatis est cultivé dans des médias complétés par la tétracycline anhydre (aTc) pour induire l'expression pgp6, le vecteur est maintenu. En l'absence d'aTc, le vecteur est perdu. La suppression ciblée de gène est réalisée par l'échange allélique du gène pour la cassette de sélection. Les régions de 3 kb directement en amont et en aval du gène ciblé servent de bras d'homologie pour la recombinaison. Ces bras sont clonés dans le vecteur pSUmC 4.0 flanquant la cassette de sélection. Des événements réussis de transformation et de recombinaison de C. trachomatis sont observés par le rapport de fluorescence. L'expression de mCherry sur l'épine dorsale vectorielle et le gfp dans la cassette de sélection donnent des inclusions fluorescentes rouges et vertes. Une fois que l'aTc est retiré des médias de culture, les inclusions vertes seulement indiquent des événements réussis de recombinaison avec la perte du vecteur de suicide et l'intégration de la cassette de sélection dans le génome bactérien.

FLAEM représente une extension de FRAEM par la transformation ultérieure d'un vecteur cre recombinase-exprimant, pSU-Cre, dans la souche mutante nouvellement créée. Cre recombinase facilite la recombinaison entre les sites loxP et l'excision de la cassette de sélection. Les événements de recombinaison sont indiqués par rapport de fluorescence. Le vecteur pSU-Cre code mCherry; ainsi, la transformation réussie est indiquée par l'addition de la fluorescence rouge aux inclusions gfp-exprimant. La culture en l'absence de pression sélective pour la cassette entraîne une recombinaison à médiation cre sur les sites de loxP, et la perte de la cassette est indiquée par des inclusions rouges seulement. Comme avec pSUmC-4.0, l'expression inductible de pgp6 est employée pour maintenir conditionnellement pSU-Cre. Une fois que la sélection d'aTc et d'antibiotiques est enlevée, le plasmide est guéri, et la souche de suppression sans marqueur résultante est non fluorescente. Cette méthode aborde la question des effets polaires induits par les cassettes.

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Protocol

1. Conception et assemblage de pSUmC-4.0 avec des armes homologiques spécifiques au gène d'intérêt

  1. Identifier les régions de 3 kb directement en amont et en aval du gène ciblé pour la suppression pour servir de bras d'homologie de 5' et 3' pour la recombinaison homologue (figure 1).
  2. Conception PCR amorces à 1) amplifier le bras d'homologie de 3 kb 5 ' de l'ADN génomique chlamydial et 2) contiennent un surplomb de 15 à 30 bp spécifique à pSUmC-4.0 lorsqu'il est digéré au site d'enzymes de restriction Sall. Assurez-vous que les régions d'amorce qui se chevauchent avec le pSUmC-4.0 ont des températures de fonte de 55 oC et que les températures de fonte en épingle à cheveux pour l'ensemble de l'amorce sont de 35 oC.
  3. Conception PCR amorces à 1) amplifier le bras d'homologie 3 kb 3 ' de l'ADN génomique chlamydiale et 2) contiennent un surplomb de 15 à 30 bp spécifique à pSUmC-4.0 lorsqu'il est digéré au site d'enzymes de restriction SbfI. Assurez-vous que les régions d'amorce qui se chevauchent avec le pSUmC-4.0 ont des températures de fonte de 55 oC et que les températures de fonte en épingle à cheveux pour l'ensemble de l'amorce sont de 35 oC.
  4. Concevoir des amorces de criblage PCR qui amplifieront l'insertion de chaque bras d'homologie dans le vecteur pSUmC-4.0 après une réaction d'assemblage d'ADN16. Concevoir ces amorces pour anneal 500 bp en dehors des sites de restriction pour permettre une visualisation facile d'un produit PCR, même si l'insertion a échoué (Figure 1).
  5. Amplifiez les bras d'homologie de 3 kb 5' et 3' à partir de l'ADN génomique chlamydial fraîchement extrait par PCR en une à deux réactions pour produire suffisamment de fragment pour l'assemblage ultérieur de l'ADN. Suivez le protocole du fabricant de polymérase d'ADN pour les conditions spécifiques de configuration de réaction et de cyclisme.
  6. Vérifiez que les deux produits PCR sont de la bonne taille et que les réactions ne contiennent pas de bandes contaminantes. Exécuter 5 L de chaque réaction PCR sur un gel d'agarose d'ADN de 1%.
  7. Purifiez et concentrez les fragments de PCR par extraction de phénol/chloroforme et précipitation d'éthanol.
    1. Repooliez les réactions PCR de 3' dans un tube de 1,5 ml et amenez-les à un volume final de 200 l avec H2O sans nucléane. Répétez ce processus pour les réactions PCR de 5'.
    2. Ajouter 200 l de phénol à chaque tube et vortex pendant 30 à 60 s. Tourner chaque tube dans un microcentrifugeà 21 000 x g pour 20 min à température ambiante (RT).
    3. Transférer la couche supérieure de phase aqueuse de chaque tube dans un nouveau tube de 1,5 ml, ajouter un dixième du volume de 3 M d'acétate de sodium à chaque tube, puis faire glisser pour mélanger.
    4. Ajouter 3 volumes d'éthanol à 100 % à chaque tube et mélanger. Incuber les deux tubes à -80 oC pendant 20 min.
    5. Pelletll l'ADN en faisant tourner chaque tube à 21 000 x g pour 5 min à RT. Jetez le supernatant.
    6. Laver le granule d'ADN avec 100 l de 70 % d'éthanol. Faites tourner chaque tube à 21 000 x g pendant 5 min à RT. Jetez le supernatant.
    7. Laver à nouveau la pastille d'ADN avec 100 l de 100 % d'éthanol. Faites tourner chaque tube à 21 000 euros pour 5 min à RT. Jetez le supernatant.
    8. Laisser le granule complètement sec à l'air, puis resuspendre doucement l'ADN en 12 OL de H2O sans nauséabonde en clignotant pour mélanger.
  8. Digest 500 ng de vecteur pSUmC-4.0 dans une réaction de 20 L avec 1 unité de Sall et 1 unité de SbfI selon le protocole de la manufacture. Incuber la réaction pendant environ 3 h ou pendant la nuit pour assurer une digestion complète du vecteur.
  9. Purifiez et concentrez l'épine dorsale digérée par l'extraction de phénol/chloroforme et les précipitations d'éthanol comme décrit précédemment (étape 1.7.1-1.7.9).
  10. Combinez le vecteur pSUmC-4.0 digéré et les produits PCR de 5' et 3' de bras d'homologie ensemble à un rapport de 0.01 pmol pSUmC-4.0 à 0.09 pmol chaque bras d'homologie. Assembler les fragments dans une réaction d'assemblage d'ADN selon le protocole de la manufacture.
  11. Transformez 50 L d'E. coli électrocompétente avec 1 l de la réaction d'assemblage de l'ADN. Déposer la bactérie E. coli transformée sur des plaques d'agar LB contenant 100 g/mL de spectinomycine en répandant 150 L par assiette. Incuber les assiettes à 37 oC pendant la nuit.
  12. Le lendemain, filtrer les colonies de fluorescence verte et rouge à l'aide d'un microscope inversé épifluorescence. On s'attend à un total de 5 à 30 colonies par plaque d'agar.
  13. Choisissez de 5 à 10 colonies pour inoculer 4 ml de bouillon LB complété par une spectinomycine de 100 g/mL. Incuber les cultures à 37 oC pendant la nuit en secouant à 250 tr/min.
  14. En utilisant les cultures E. coli du jour au lendemain, effectuer une purification de l'ADN à petite échelle. Éluter l'ADN avec 50 OL de H2O sans nucléane.
  15. Confirmer l'insertion de chaque bras d'homologie dans le vecteur pSUmC-4.0 à l'aide des amorces de criblage PCR (conçues à l'étape 1.4) pour amplifier chaque insertion. Si l'assemblage de l'ADN est réussi, un produit PCR de 4 kb doit être observé dans un gel d'agarose d'ADN de 1% pour les régions de bras de 5' et 3'. Un produit PCR de 1 kb indique un manque d'insertion.
    REMARQUE : Si l'insertion des bras d'homologie est infructueuse dans une réaction d'assemblage à double fragment, effectuez deux réactions d'assemblage pour insérer le bras de 5' puis le bras de 3', individuellement. Digdilez le vecteur avec seulement Sall avant de monter avec le bras de 5', puis digérez le vecteur avec SbfI pour assembler le bras de 3'.
  16. Transformer le barrage-/dcm- E. coli compétent avec 200 ng de pSUmc-4.0 assemblés avec les deux bras d'homologie. Déposer les bactéries transformées sur des plaques d'agar LB contenant 100 g/mL de spectinomycine en répandant 25 L par assiette. Incuber les assiettes à 37 oC pendant la nuit. Au total, 20 à 200 colonies sont attendues.
  17. Filtrer les plaques pour les colonies fluorescentes rouges et vertes telles que décrites à l'étape 1.13.
  18. Mettre en place une culture pour une purification de l'ADN à grande échelle en inoculant 100 ml de bouillon LB contenant 100 g/mL de spectinomycine avec des colonies rouges et vertes. Incuber la culture à 37 oC pendant la nuit en secouant à 250 tr/min.
  19. Récolter la culture et purifier l'ADN à l'aide d'une purification de l'ADN à grande échelle.
    1. Resuspendre l'ADN plasmide purifié en 100 O L de NF-H2O. Un rendement total de l'ADN d'au moins 2 g/L est idéal pour la transformation de C. trachomatis.
    2. Séquencez les régions de bras d'homologie de 5' et 3' pour assurer un assemblage correct en pSUmC-4.0 avant de transformer C. trachomatis.

2. Transformation de C. trachomatis avec pSUmC 4.0 - Homology Arms for Gene Deletion par Allelic Exchange

  1. Seed McCoy cells, mouse fibroblasts standardly used for cultivating Chlamydia, into two 6 well plates (1 x 106 cells/well) with growth media #1. Incuber les plaques à 37 oC avec 5 % de CO2 jusqu'à ce que la monocouche soit confluente (environ 24 h).
  2. Dans un tube de 1,5 ml, ajouter un volume de C. trachomatis WT serovar L2 corps élémentaires (EBs) qui est suffisant pour infecter 12 puits d'une plaque de 6 puits à un MOI de 2. Pelletles les EB à 20 000 x g pendant 30 min, puis jetez le supernatant.
  3. Initier la transformation chlamydiale en rependant doucement les EBs dans 600 'L de caCl2 tampon, puis ajouter 24 g de pSUmC-4.0 - bras d'homologie au tube. Mélanger délicatement la solution en clignotant. Incuber le tube à RTpendant 30 min et faire glisser pour mélanger toutes les 10 minutes.
  4. Ajoutez la solution de transformation à 24 ml de la solution de sel équilibrée (HBSS) de Hanks et mélangez en pipetting délicatement. Transférer 2 ml de l'inoculum dans chaque puits de cellules McCoy confluentes dans les 6 plaques de puits et infecter par centrifugation à 900 x g pour 1 h à 20 oC.
  5. Retirez l'inoculum et remplacez-le par un support de croissance RPMI de 2 mL/puits #2. Incuber les plaques à 37 oC avec 5 % de CO2.
  6. Après un minimum de 7 h, mais pas plus de 12 h, remplacez les médias par 2 mL/puits de #1 de sélection. Poursuivre l'incubation à 37 oC pendant 48 h à partir du moment de l'infection.
  7. Récolteet et passage de la bactérie sur une monocouche fraîche de cellules McCoy.
    1. À l'aide d'un grattoir cellulaire, gratter délicatement la monocouche McCoy pour soulever les cellules dans les médias. Transférer le matériau de chaque puits dans un tube de 2 ml. Pelleter le matériel cellulaire à 20 000 x g dans un microcentrifugependant pendant 30 min à 4 oC.
    2. Retirez et jetez le supernatant. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de HBSS en pipetting doucement.
    3. Pelleter les débris cellulaires à 200 x g pendant 5 min à 4 oC. Transférer le supernatant sur un puits frais de cellules McCoy confluentes. Ajouter 1 ml de HBSS supplémentaire à chaque puits pour un volume total de 2 ml/puits.
    4. Infecter par centrifugation à 900 x g pendant 1 h à 20 oC. Remplacer l'inoculum par des #1 de médias de sélection immédiatement après l'infection.
  8. Continuer à transmettre les bactéries sur une monocouche fraîche de cellules McCoy (section 2.7) tous les 48 h pour trois passages ou plus jusqu'à ce que les inclusions rouges et vertes soient détectées à l'aide d'un microscope inversé épifluorescence 24 h post-infection (24 hpi).
  9. Une fois que les inclusions rouges et vertes sont détectées, continuez à passer le monocouche (section 2.7) à l'aide des #2 de médias de sélection.
  10. Continuer à passer le monocouche jusqu'à ce que les inclusions vertes seulement soient détectées 24 hpi (passage #3 ou plus tard), ce qui indique la perte du vecteur pSUmC-4.0 et l'incorporation de la cassette de sélection loxP dans le génome.
  11. Choisissez un puits d'inclusions vertes uniquement à enrichir en passant. Récolter et congeler tous les autres puits qui contiennent également des inclusions vertes seulement dans le tampon saccharose-phosphate-glutamate (SPG).
    1. Pour enrichir les inclusions vertes seulement, passer la monocouche d'un puits d'une plaque de 6 puits comme fait à l'étape 2.7, mais après pelletage des débris cellulaires (étape 2.7.3), transférer le supernatant dans un conique avec 12 ml de HBSS. Utilisez cet inoculum pour infecter deux plaques de 6 puits en ajoutant 2 ml par puits, puis faites tourner les plaques à 900 x g pendant 60 min à 20 oC.
    2. Pour congeler d'autres puits, récoltez la monocouche comme à l'étape 2.7.1, mais suspendez les granulés dans 1 ml de SPG au lieu de HBSS. Pelleter les débris cellulaires (étape 2.7.3) et transférer le supernatant dans un cryotube de 1,5 ml. Congeler le matériau à -80 oC.
  12. Après avoir enrichi les inclusions vertes seulement à un MOI de 0,5 à 1,0 (un à deux passages de plus après la détection), récoltez les monocouches en SPG tel que décrit à l'étape 2.11.2. Obtenir des aliquots de 50 oL dans des tubes de 1,5 ml et congeler à -80 oC.
  13. Bactéries vertes pour déterminer l'inclusion, formant des unités/L, selon un protocole de titration standard17.

3. Isolement clonal de Green-only C. trachomatis Deletion Mutant Contenant la Cassette de sélection flanquée loxP en limitant la dilution

  1. Ensemencer une plaque de culture de tissu de puits de 384 avec 50 l de cellules De McCoy à 2 000 cellules/puits dans les #1 de médias de croissance. Incuber à 37 oC avec 5 % de CO2 pendant 24 h ou jusqu'à confluent.
  2. Diluer un aliquot de bactéries vertes seulement dans HBSS pour atteindre 50 EBs par 20 ml. Transférer l'inoculum dilué sur un plateau de réservoir.
    1. Retirez le support de la plaque de puits 384 en faisant glisser fermement toute la plaque à l'envers dans un contenant à déchets. À l'aide d'une pipette multicanal, ajouter 50 oL d'inoculum C. trachomatis à chaque puits. Infecter par centrifugation à 900 x g pendant 1 h à 20 oC.
      REMARQUE: Soyez attentif à ne pas clignoter si fort que le monocouche se détache. Si les cellules sont trop confluentes, elles se détachent plus facilement.
  3. Retirez l'inoculum en clignotant et remplacez-le par un #2 de support de croissance de 50 l/puits. Incuber les plaques à 37 oC avec 5 % de CO2.
    REMARQUE : À ce stade, l'intégration de la cassette de sélection dans le génome est stable, de sorte que la sélection d'antibiotiques avec la spectinomycine n'est plus nécessaire.
  4. Après avoir incubé la plaque pendant 5 à 12 jours, identifiez les puits individuels à l'aide d'inclusions fluorescentes vertes à l'aide d'un microscope inversé à l'épifluorescence ou d'une plate-forme de dépistage à haute teneur.
  5. Récoltez les puits avec des inclusions vertes seulement en grattant la monocouche avec une pointe p-10 et en transférant tout le contenu du puits dans un tube contenant 2 ml de HBSS. Mélanger délicatement et appliquer les 2 ml d'inoculum sur une monocouche McCoy confluente fraîche dans une plaque de 6 puits pour l'infection.
    REMARQUE : Lors de l'identification des puits individuels avec inclusions, les inclusions seront dans un cluster en raison de l'expansion de l'inclusion initiale. Si un puits a plusieurs grappes, il est probable que plus d'un EB initialement infecté ce puits. Ces puits ne devraient pas être récoltés et, dans certains cas, plusieurs cycles d'isolement clonal par dilution en série peuvent être nécessaires.
  6. Infecter la plaque de 6 puits par centrifugation à 900 x g pendant 1 h à 20 oC. Remplacer l'inoculum par un #2 de 2 mL/puits de support de croissance. Incuber à 37 oC avec 5 % de CO2 pour 48 h.
  7. Répétez les étapes 2.11-2.13 pour enrichir, congeler et titer les populations clonales.
  8. Confirmer la suppression des gènes ciblés de C. trachomatis isolé sérodement en utilisant qPCR comme décrit précédemment12.

4. Transformation de C. trachomatis FRAEM Mutant avec pSU-Cre pour initier l'enlèvement de la cassette de sélection flanquée de loxP

  1. Répétez le processus de transformation dans une plaque de 6 puits comme décrit précédemment (étapes 2.1-2.8) en utilisant le mutant C. trachomatis FRAEM isolé par le cononal, le vecteur pSU-Cre et les #3 de médias de sélection.
    REMARQUE : Une transformation réussie est indiquée par des inclusions qui sont fluorescentes rouges et vertes.
    1. Passer la monocouche jusqu'à ce que les inclusions rouges seulement soient détectées à l'aide d'un microscope inversé à l'épifluorescence, ce qui indique la perte de la cassette de sélection (deux à trois passages). Continuer à passer le monocouche jusqu'à ce que les inclusions rouges seulement soient enrichies en un MOI de 0,5.
  2. Isoler les inclusions rouges uniquement en limitant la dilution dans une plaque de puits de 384 comme décrit précédemment (étapes 3.1-3.8); cependant, utilisez les #3 de médias de sélection pour toutes les étapes.
  3. Enrichir les populations clonales en passant jusqu'à un MOI de 0,1. Une fois enrichis, remplacez les supports de section par des #2 de médias de croissance pour initier la perte du vecteur pSU-Cre (environ trois à quatre passages).
  4. Isoler les bactéries non fluorescentes (étapes 3.1-3.8); cependant, scannez manuellement la plaque avec un microscope de brightfield pour détecter des inclusions. Enrichir et congeler les bactéries (étape 2.11-2.12).
  5. Dépistage de la souche mutante à l'aide de PCR quantitatif en temps réel, de ballonnements occidentaux et de séquençage de l'ADN du génome entier tel que décrit précédemment12.

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Representative Results

La méthode pour la suppression de gène sans marqueur dans C. trachomatis utilisant FLAEM dépend des techniques soigneuse de clonage et de transformation. La recombinaison allélique réussie est une première étape essentielle et nécessite l'identification et l'insertion de bras homologiques dans le vecteur de clonage pSUmC-4.0 (Figure 1). Une deuxième étape essentielle pour la suppression de gène sans marqueur est l'enlèvement du journaliste de fluorescence et de la cassette de sélection d'antibiotiques par l'édition de génome de Cre-lox, représenté dans la figure 2. Les vecteurs utilisés pour accomplir chacune de ces étapes sont annotés à la figure 3. La figure 4 montre une représentation schématique de la stratégie de transformation pour générer un mutant de suppression sans marqueur s'il commence avec le type sauvage C. trachomatis.

Les données représentatives sont présentées à la figure 5 et à la figure 6, dans lesquelles la tMEA est ciblée pour la suppression des gènes. La souche de suppression C. trachomatis tmeA est générée à l'aide de FRAEM, et la souche C. trachomatis tmeA-lx est générée à l'aide de FLAEM. Les deux souches mutantes contiennent une suppression du locus tmeA; cependant, tmeA-lx ne contient pas la cassette de sélection, comme l'indique l'absence d'ADN gfp indiqué à la figure 5. La souche mutante tmeA a diminué l'expression du tmeB, montré dans la figure 6 par les niveaux d'ARNm et de protéines. Lorsque FLAEM est utilisé pour générer la souche mutante tmeA-lx, figure 6 montre que l'expression de tmeB est restaurée.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique pour l'identification des bras d'homologie de 5' et 3' à partir du dépistage génomique de l'ADN et du PCR pour leur insertion dans le pSUmC-4.0. (A) Un gène ciblé pour la suppression du génome de C. trachomatis est représenté par la flèche bleue. Les régions de 3 kb identifiées comme les bras d'homologie de 5' et 3' pour la recombinaison allélique sont entre crochets en violet et rouge, respectivement. (B,C) L'insertion des bras d'homologie de 5' et 3' dans le pSUmC-4.0 est déterminée par le criblage de PCR. Les sites d'enzymes de restriction Sall et Sbfl sont représentés en flanquant la cassette de sélection aadA (flèche noire) et gfp (flèche verte) qui est flanquée de sites loxP (carrés jaunes) sur le vecteur pSUmC-4.0. (B) Aucune insertion n'est déterminée par un produit PCR de 1 kb lorsque des amorces de criblage de 5' (têtes de flèche sifettes) sont utilisées pour amplifier pcR sur le site Sall, ou des amorces de criblage 3' (têtes de flèche sifflures) sont utilisées pour amplifier à travers le site SbfI. (C) L'insertion réussie est déterminée par des produits PCR de 3 kb dans les mêmes conditions. Les bras d'homologie de 5' et 3' sont représentés respectivement par les supports violets et rouges. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Représentation schématique de la recombinaison médiée par Cre-lox pour enlever la cassette de sélection gfp-aadA. En présence de Cre recombinase, les sites loxP (jaune) se recombinent, résultant en l'excision de la cassette de sélection gfp-aadA (carrés verts et noirs). Le locus résultant est montré contenant une séquence restante de cicatrice de loxP. Les régions en amont (États-Unis) et en aval (DS) sont indiquées en gris. Ce chiffre a été modifié à partir de Keb et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Organisation génétique du pSUmC-4.0 et du pSU-CRE. Pour l'entretien contrôlable des vecteurs dans C. trachomatis, le pgp6 est conçu en aval d'un promoteur inductible de tétracycline. Les gènes pgp restants sont en aval de leurs promoteurs chlamydial indigènes, et mCherry est constitutivement exprimé sur les deux vecteurs. (A) pSUmC-4.0 contient une cassette codant des gènes aadA et gfp exprimés de façon constitutive pour la capacité de sélection des antibiotiques et de la fluorescence, respectivement. Les sites LoxP pour la recombinaison de Cre ont négocié aussi bien que les emplacements d'enzyme de restriction pour l'insertion des bras d'homologie spécifiques de gène flanquent la cassette de sélection. (B) pSU-CRE contient une colonne vertébrale similaire à pSUmC-4.0; pourtant, au lieu de la cassette de recombinaison, le blaM et la cre sont constitutivement exprimés pour la sélectivité d'antibiotique et la génération de recombinase de CRE, respectivement. Ces chiffres ont été modifiés à partir de Keb et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Représentation schématique de la stratégie de transformation FLAEM utilisée pour créer un mutant de suppression sans marqueur. La méthode générale FLAEM est représentée ici où Wild-type C. trachomatis est séquentiellement transformé et traduit en série pour générer un mutant de suppression sans marqueur. Les étapes de transformation sont représentées par l'ajout de petites flèches, et la perte d'éléments génétiques est représentée par la soustraction de petites flèches. Les intermédiaires C. trachomatis (cercles) sont représentés par des sensibilités antibiotiques (résistantà la pénicilline ou sensible à la pénicilline - PenGr ou PenGs;résistant à la spectinomycine ou sensible à la spectinomycine - Specr ou Specs)et des qualités de déclaration de fluorescence (vert , gfp, rouge , mCherry, gris nofluorescence). Des représentations schématiques du locus de gène à chaque étape sont montrées ci-dessous. Ce chiffre a été modifié à partir de Keb et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : FRAEM et FLAEM sont utilisés pour générer des suppressions de gènes tmeA. (A) FRAEM a été utilisé pour générer tmeA, et FLAEM a été utilisé pour générer tmeA-lx. Nombres relatifs de copies d'ADN de tmeA et de tmeB en aval; gfp contenu sur la cassette de sélection pSUmC-4.0; et cre contenu sur le vecteur pSU-CRE sont tous montrés. Les cellules McCoy infectées par l'inclusion égale formant des unités de WT, L2 tmeA, ou L2RiftmeA-lx C. trachomatis ont été récoltées à 24 hpi, et l'ADN a été extrait pour qPCR. Les nombres relatifs de copie ont été évalués par normalisation de signal au chlamydial 16sRNA. ND - aucun détecté. (B) Le locus tmeAB séquencé de L2RiftmeA-lx est montré avec une seule séquence de cicatricelle restante (soulignée). Les régions d'ADN flanquées sont représentées en bleu, les codons de départ sont représentés en vert, et le codon d'arrêt TmeA est représenté en rouge. Le codon de démarrage non canonique pour TmeB est également représenté. Ces chiffres ont été modifiés à partir de Keb et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : L'excision de la cassette de sélection à l'aide de FLAEM restaure l'expression du tmeB en ciblant la tmeA et ne perturbe pas les gènes en aval. (A) Niveau relatif d'ARNm de C. trachomatis tmeA et tmeB souches mutantes. La présence de transcriptions en aval de la tMEA a été déterminée par le PCR quantitatif de transcriptase inverse (RT). La région immédiatement en aval de l'opéron tmeA/B code ct696. L'ARN total a été isolé à 24 hpi des cellules McCoy infectées à un MOI de 1 avec WT, L2 tmeA, L2 tmeB, ou L2RiftmeA-lx. Les transcriptions pour tmeA, tmeB,et ct696 ont été détectées par qRT-PCR. Les signaux sont présentés après la normalisation à la rpoD. ND - aucun détecté. (B) Tache occidentale pour la présence de TmeA et de TmeB dans les souches mutantes de C. trachomatis. Des quantités égales de matériel de culture entière provenant de 24 cultures hpi infectées par une inclusion égale formant des unités de WT, L2 tmeA, L2RiftmeA-lx, ou L2RiftmeA-lx ptmeA ont été sondées dans des immunoblots pour TmeA et TmeB. Hsp60 a été employé comme contrôle de chargement, et les protéines ont été visualisées par chemiluminescence. La figure a été modifiée à partir de Keb et coll.12. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole décrit ici pour la génération des suppressions de gènes sans marqueurdans C. trachomatis par FLAEM permet la suppression ciblée des gènes non essentiels et élimine les effets polaires induits par cassette. Le protocole repose sur la conception soignée de 5' et 3' bras d'homologie insérés dans le vecteur de suicide pSUmC 4.0, la transformation efficace de C. trachomatis, et le dépistage minutieux des souches mutantes isolées. L'ingénierie génomique réussie par cette méthode a comme conséquence des bactéries qui sont non fluorescentes et contiennent une séquence simple de cicatrice de loxP au site de la suppression ciblée de gène. En outre, cette méthode a le potentiel d'être adaptée pour le ciblage séquentiel des gènes au sein de la même souche c. trachomatis.

La conception soignée des bras d'homologie de 5' et 3' et l'insertion dans le vecteur de suicide est la première et la plus critique étape du processus de clonage. Il a été constaté que les bras homologiques de 3 kb fournissent la recombinaison allélique la plus efficace. Bien que l'insertion de ces bras génère un vecteur qui est grand et parfois difficile à travailler avec, il ya eu moins de succès avec des bras plus courts, avec 2 kb représentant un minimum pour le succès. L'utilisation des sites de restriction Sall et Sbfl offre une réaction pratique en une seule étape lors de l'assemblage d'ADN.

D'autres méthodes de clonage, telles que l'insertion PCR, ont également été efficaces dans l'insertion des bras homologiques, mais ils introduisent une plus grande possibilité d'erreurs basées sur PCR. Fait intéressant, il a été observé que le clonage du bras de 5' est comparativement plus efficace que le bras de 3'. En cas de problème, il est recommandé de diviser l'assemblage d'ADN en deux réactions et de construire le vecteur de manière progressive. Ensuite, il est conseillé de digérer l'épine dorsale vectorielle avec SbfI, d'insérer le bras de 3', puis de digérer le vecteur avec Sall et d'insérer le bras de 5' dans une deuxième réaction d'assemblage d'ADN.

Lors de l'amplification des fragments de PCR pour les bras d'homologie, il est également recommandé d'utiliser l'ADN génomique c. trachomatis fraîchement purifié qui n'a pas été préalablement congelé. Cela limite la possibilité de tonte de l'ADN et augmente l'efficacité pour générer de plus grands amplicons. Si l'amplification des bras d'homologie d'un autre vecteur, le produit PCR purifié devra être l'enzyme de restriction d'IDP traitée avant de procéder à l'assemblage de l'ADN pour réduire les colonies de fond pendant la transformation d'E. coli.

La transformation est une autre étape critique de ce protocole dans lequel des problèmes peuvent survenir. Si la transformation avec pSUmC 4.0 est réussie, les inclusions vertes et rouges devraient être visibles par passage #3; cependant, il peut prendre plusieurs autres passages avant que les transformateurs s'enrichissent. Comme d'autres approches de mutagénèse, cette méthode se limite au ciblage des gènes non essentiels, mais la transformation doit encore être facilement accomplie. Le passage à long terme des transformateurs en l'absence d'échange allélique, indiqué par la rétention de fluorescence rouge, peut indiquer que la suppression du gène ciblé est un événement mortel.

Étant donné que les vecteurs de transformation de C. trachomatis contiennent la même origine de réplication que le pL2 natif, il n'est pas rare que le plasmide indigène soit guéri après plusieurs passages (no 5). Les gènes pgp sur les vecteurs pSUmC sont dans un ordre différent par rapport au pL2 indigène; par conséquent, PCR peut être utilisé pour détecter la présence de pL2 dans une souche isolée en amplifiant la région couvrant pgp7-pgp8. Si le plasmide indigène est perdu dans le mutant de suppression finale, il devra être réintroduit avant de mener des études développementales. Le transfert latéral de gène (LGT) peut être utilisé pour réintroduire le plasmidepL2 19.

Dans de nombreux cas, les mutants de suppression précoce avec la cassette de sélection contiennent encore le plasmide pL2. Nous avons utilisé ces souches pour LGT avec succès pour réintroduire pL2 et éviter la réparation du gène supprimé. LGT peut également être utilisé comme une méthode secondaire pour la transformation lors de l'introduction de pSU-Cre. Dans certains cas, LGT a été plus efficace que la transformation classique caCl2. Dans les cas où LGT est utilisé pour introduire pSU-Cre, il est important de commencer par C. trachomatis qui expriment un allèle rpoB, qui confère une résistance à la rifampine avant l'échange allélique et l'insertion de la cassette de sélection de spectinomycine12,19. En commençant par la rifampin bactéries résistantes permet la sélection après la co-culture.

FLAEM permet des approches inversées-génétiques avec la suppression ciblée des séquences de codage entières, par rapport à d'autres méthodes génétiques qui s'appuient sur la mutagénèse aléatoire ou l'insertion de séquences de nucléotides pour atteindre la perturbation des gènes. FLAEM est essentiellement une extension de FRAEM, car il permet l'enlèvement de la cassette de sélection et élimine les effets polaires précédemment observés induits par cassette. Cette méthode crée également la possibilité de générer plusieurs suppressions de gènes dans une seule souche de C. trachomatis.

De multiples mutations peuvent être générées par deux mécanismes différents. Dans le premier, FLAEM peut être utilisé pour générer une mutation génétique sans marqueur et séquentiellement utilisé pour cibler un autre gène dans la même souche. Le premier mutant de suppression peut être retransformé avec le vecteur pSUmC 4.0 contenant des bras d'homologie spécifiques pour le gène secondaire d'intérêt. Dans ce cas, le protocole doit être répété de la même manière que la première suppression et répété plusieurs fois pour cibler les gènes séquentiellement. Dans le deuxième mécanisme, le mutant de suppression sans marqueur isolé après FLAEM peut être co-infecté avec un mutant de suppression qui contient toujours une cassette de sélection. Grâce à LGT, la deuxième suppression est acquise et peut être sélectionnée pour. Lors de l'utilisation de cette approche, les mutations supplémentaires sont limitées par le nombre de cassettes de sélection uniques laissées dans le génome. Les antibiotiques couramment utilisés comme pression sélective pendant la transformation sont limités pour C. trachomatis, mais ils comprennent la pénicilline, la chloramphenicol et la spectinomycine. La suppression de la cassette de sélection par l'édition du génome De Cre-loxP réduit la nécessité d'utiliser plusieurs antibiotiques pour la pression sélective. La suppression de plusieurs séquences génétiques en même temps est bénéfique lors de l'étude des protéines ayant des fonctions connexes ou des processus biologiques qui peuvent avoir plusieurs acteurs clés.

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Disclosures

Les auteurs n'ont aucun conflit d'intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions du Service de santé publique du National Institute of Health, NIAID (subventions A1065530 et Al124649), à K.A. Fields.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

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References

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Immunologie et infection numéro 155 Cre recombinase FLAEM FRAEM Chlamydia mutagénèse échange allélique recombinaison allélique
Markerless Gene Deletion par Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in <em>Chlamydia trachomatis</em>
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Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

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