Summary
Hier wird eine Methode zur gezielten, markerlosen Genlöschung bei Chlamydia trachomatis mit Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenese, FLAEM beschrieben.
Abstract
Chlamydia trachomatis ist ein obligate intrazellulärer Erreger, der historisch schwer zu manipulieren war. Der endgültige Fortschritt bei der Aufklärung der Mechanismen, die C. trachomatis verwenden, um eine privilegierte intrazelluläre Nische zu schaffen und zu erhalten, war aufgrund des Mangels an genetischen Werkzeugen begrenzt. Glücklicherweise hat es in letzter Zeit mehrere neue Fortschritte bei den Techniken der genetischen Manipulation gegeben. Dazu gehört die Entwicklung der fluoreszenzgemeldeten allelischen Austauschmutagenese (FRAEM). Diese Methode ermöglicht die gezielte Genlöschung in Verbindung mit dem Einsetzen einer Selektionskassette, die für Antibiotikaresistenz und grünes fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert. Die Abhängigkeit von dieser Strategie kann kompliziert sein, wenn Gene innerhalb polycistronischer Operonen auf das Potenzial polarer Effekte auf nachgeschaltete Gene abzielen. Floxed Kassette allelic Exchange Mutagenesis (FLAEM), das Protokoll, für das hier beschrieben wird, wurde entwickelt, um Kassetten-induzierte Polareffekte zu lindern. FLAEM nutzt die Cre-loxP-Genombearbeitung, um die Auswahlkassette nach gezieltem Löschen durch Allelaustausch zu entfernen. Die resultierenden Stämme enthalten markerlose Genlöschungen einer oder mehrerer Codierungssequenzen. Diese Technik erleichtert die direkte Beurteilung der Genfunktion und erweitert das Repertoire an Werkzeugen zur genetischen Manipulation bei C. trachomatis.
Introduction
Chlamydia trachomatis ist die Hauptursache für bakterielle sexuell übertragbare Krankheiten und stellt eine erhebliche Belastung für die menschliche Gesundheit dar. Über 100 Millionen Menschen sind jedes Jahr mit C. trachomatis1infiziert. Ungefähr 70% der Infektionen bei Frauen sind asymptomatisch, trotz schädlicher reproduktiver Gesundheitlichen Auswirkungen, wie beckenentzündliche Erkrankungen, ektopische Schwangerschaft, und/oder Unfruchtbarkeit. Krankheitsfortsetzungen stehen in direktem Zusammenhang mit der Immunpathologie, die durch die Infektion mit C. trachomatis initiiert wurde2. Ein wirksamer Impfstoff muss noch entwickelt werden; Daher ist das Verständnis der Funktion von bakteriellen Virulenzfaktoren und anderen bakteriellen Genprodukten eine wichtige und dringende Forschungsfrage.
Als intrazelluläre Bakterien, Wirtszellinvasion, intrazelluläre Replikation, Freisetzung von Nachkommen, und Ausweichen von Host immunologischen Reaktionen sind kritische Prozesse. C. trachomatis bildet ein parasitophores membrangebundenes Vakuol, das als Inklusion bezeichnet wird, für die intrazelluläre Entwicklung. Die Etablierung der Inklusion und viele andere kritische Prozesse werden durch Sekretion von Effektorproteinen über ein Typ-III-Sekretionssystem (T3SS)3erreicht. Die Aufklärung der Funktionen dieser sezernierten Effektoren war für viele Jahre aufgrund der genetischen Unnachgiebigkeit von C. trachomatisbegrenzt. Im Gegensatz zu E. colisind viele klassische Klontechniken nicht auf Chlamydienanwendbar. Einige wichtige Einschränkungen sind Transformationseffizienz, mangels Gegenauswahl-Reporter wie sacB und Plasmid-Wartung. Während E. coli-Plasmide in der Regel auf unbestimmte Zeit mit einem Ursprung der Replikation und einem angemessenen selektiven Druck aufrechterhalten werden können, benötigt C. trachomatis plasmide weitere acht offene Leserahmen(pgp1-8) für die Wartung, die auf dem nativen pL2-Plasmid innerhalb des L2-Serovar4gefunden werden.
In den letzten Jahren wurden mehrere genetische Werkzeuge generiert, die Chlamydias einzigartige Biologie aufnehmen, aber es gibt immer noch Einschränkungen5,6,7. Chemische Mutagenese durch Ethylmethansulfonat (EMS) Behandlung kann Fehlsinne Mutationen führen, oder (weniger häufig) kann in Nukleotid-Übergänge führen Einführung eines vorzeitigen Stop-Codon, um eine Unsinn-Mutation zu ergeben8. Transposon-Einfügung ist effizient für Genstörungen, aber die aktuelle Technologie in der Chlamydien-Forschung ist mühsam und zeitaufwändig9. Sowohl EMS-Behandlung als auch Transposon-Mutagenese-Techniken erzeugen zufällige Mutationen und erfordern strenge Screening-Methoden, um mutierte Stämme zu isolieren. Eine Methode zur Störung von Genen durch Einsetzen von Introns der Gruppe II (z. B. TargeTron) ermöglicht eine gerichtete Mutagenese; Diese Methode ist jedoch durch die Effizienz eingeschränkt, und die Einfügestelle wird nicht immer richtig vorhergesagt10.
Fluoreszenz-gemeldete allelische Austauschmutagenese (FRAEM) ist eine Strategie für die gezielte Genlöschung gekoppelt mit dem Einsetzen einer Selektionskassette mit Antibiotikaresistenz und einem Fluoreszenzreporter11. FraEM wird jedoch durch das Potenzial von kassetteninduzierten Polareffekten auf nachgeschaltete Gene erschwert, insbesondere wenn es um Gene innerhalb polycistronischer Operonen geht. Floxed Kassette allelic Exchange Mutagenesis (FLAEM) ist ein neuartiger genetischer Ansatz entwickelt, um die Kassette-induzierten Polareffekte zuvor mit der FRAEM-Auswahlkassette12beobachtet zu lindern. FLAEM nutzt die Cre-loxP-Genombearbeitung, um die Selektionskassette zu entfernen und die Expression nachgeschalteter Gene wiederherzustellen. Die Selektionskassette mit Antibiotikaresistenz und grünem Fluoreszenzprotein (GFP) wird mit flankierenden LoxP-Standorten umgestaltet. Diese loxP-Sites können in Gegenwart von Cre Recombinase rekombinieren und zur Exzision der Kassette aus dem Genom13führen. Diese Strategie hat gezeigt, Kassette induzierte Polareffekte zu lindern, wenn tmeA zum Löschen12,14.
Sowohl FRAEM- als auch FLAEM-Methoden verwenden denselben Selbstmordvektor, pSUmC 4.0, der durch induzierbare Expression von pgp6 bedingt aufrechterhalten werden kann. Die Expression von pgp6 hat sich bisher als notwendig für die Plasmidretention erwiesen und wird daher zur Kontrolle der Plasmidpflege11,15genutzt. Wenn C. trachomatis in Medien angebaut wird, die mit wasserfreiem Tetracyclin (aTc) ergänzt werden, um pgp6 Expression zu induzieren, wird der Vektor beibehalten. In Ermangelung von aTc geht der Vektor verloren. Die gezielte Genlöschung wird durch den allelischen Austausch des Gens für die Selektionskassette erreicht. Die 3 kb Regionen direkt vor und flussabwärts des Zielgens dienen als Homologiearme zur Rekombination. Diese Arme werden in den pSUmC 4.0-Vektor geklont, der die Auswahlkassette flankiert. Erfolgreiche C. Trachomatis Transformation und Rekombination summieren sich an Fluoreszenzberichten. Der Ausdruck von mCherry auf dem Vektor-Backbone und gfp innerhalb der Selektionskassette ergeben rote und grüne fluoreszierende Einschlüsse. Sobald aTc aus Kulturmedien entfernt wurde, weisen nur grüne Einschlüsse auf erfolgreiche Rekombinationsereignisse mit dem Verlust des Selbstmordvektors und der Integration der Selektionskassette in das bakterielle Genom hin.
FLAEM stellt eine Erweiterung von FRAEM durch nachfolgende Transformation eines Cre Recombinase-expressing Vektors, pSU-Cre, in den neu geschaffenen mutierten Stamm dar. Die Cre-Rekombinantase erleichtert die Rekombination zwischen loxP-Standorten und die Exzision der Selektionskassette. Rekombinationsereignisse werden über die Fluoreszenzberichterstattung angezeigt. Der pSU-Cre-Vektor kodiert mCherry; Daher wird eine erfolgreiche Transformation durch Zugabe von roter Fluoreszenz zu gfp-exezierenden Einschlüssen angezeigt. Der Anbau ohne selektiven Druck für die Kassette führt zu einer cre-vermittelten Rekombination an den LoxP-Standorten, und der Verlust der Kassette wird durch reine Roteinschlüsse angezeigt. Wie bei pSUmC-4.0 wird die induzierbare Expression von pgp6 verwendet, um pSU-Cre bedingt aufrechtzuerhalten. Sobald aTc und Antibiotika-Auswahl entfernt sind, wird das Plasmid ausgehärtet, und der resultierende markerlose Deletionsstamm ist nicht fluoreszierend. Diese Methode befasst sich mit dem Problem der kassetteninduzierten Polareffekte.
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Protocol
1. Entwurf und Montage von pSUmC-4.0 mit Homologie-Waffen spezifisch für das Gen von Interesse
- Identifizieren Sie 3 kb Regionen direkt vor und nach dem Gen, das zum Löschen bestimmt ist, um als 5' und 3' Homologiearme für homologe Rekombination zu dienen (Abbildung 1).
- Design PCR Primer auf 1) verstärken den 3 kb 5' Homologiearm aus chlamydialgenomer DNA und 2) enthalten einen 15–30 bp Überhang spezifisch für pSUmC-4.0, wenn er an der Sall-Restriktionsenzym-Site verdaut wird. Stellen Sie sicher, dass die mit pSUmC-4.0 überlappenden Primerbereiche Schmelztemperaturen von 55 °C aufweisen und dass die Haarnadelschmelztemperaturen für die gesamte Grundierung <35 °C betragen.
- Design PCR Primer auf 1) verstärken den 3 kb 3' Homologiearm aus chlamydialgenomer DNA und 2) enthalten einen 15–30 bp Überhang spezifisch für pSUmC-4.0, wenn er an der SbfI-Restriktionsenzym-Site verdaut wird. Stellen Sie sicher, dass die mit pSUmC-4.0 überlappenden Primerbereiche Schmelztemperaturen von 55 °C aufweisen und dass die Haarnadelschmelztemperaturen für die gesamte Grundierung <35 °C betragen.
- Entwerfen Sie PCR-Screening-Primer, die die Einfügung jedes Homologiearms in den pSUmC-4.0-Vektor nach einer DNA-Montagereaktion verstärken16. Entwerfen Sie diese Primer so, dass sie außerhalb der Restriktionsstellen 500 bp annealieren, um eine einfache Visualisierung eines PCR-Produkts zu ermöglichen, selbst wenn das Einfügen nicht erfolgreich war (Abbildung 1).
- Verstärken Sie die 3 kb 5' und 3' Homologiearme aus frisch extrahierter chlamydiergenomischer DNA durch PCR in ein bis zwei Reaktionen, um genügend Fragment für eine spätere DNA-Montage zu liefern. Befolgen Sie das Protokoll des HERSTELLERS der DNA-Polymerase für spezifische Reaktionsaufbau- und Zyklusbedingungen.
- Stellen Sie sicher, dass beide PCR-Produkte die richtige Größe haben und dass die Reaktionen keine kontaminierenden Bänder enthalten. Führen Sie 5 l jeder PCR-Reaktion auf einem 1% DNA-Agarorose-Gel aus.
- Reinigen und konzentrieren Sie die PCR-Fragmente durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung.
- Alle 3' PCR-Reaktionen in einem 1,5 ml-Rohr zusammensondielen und mit nukleasefreiemH2O auf ein Endvolumen von 200 l bringen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die 5' PCR-Reaktionen.
- Fügen Sie jedem Röhrchen 200 l Phenol und Wirbel für 30–60 s hinzu. Drehen Sie jedes Rohr in einer Mikrozentrifuge bei >21.000 x g für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
- Übertragen Sie die wässrige Phasendeckschicht jedes Rohres in ein neues 1,5 ml Rohr, fügen Sie ein Zehntel des Volumens von 3 M Natriumacetat zu jedem Rohr hinzu, und dann zum Mischen streichen.
- Fügen Sie 3 Volumen von 100% Ethanol zu jeder Röhre und Flick zu mischen. Inkubieren Sie beide Rohre bei -80 °C für 20 min.
- Pellet die DNA durch Spinnen jeder Röhre bei >21.000 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie das DNA-Pellet mit 100 l 70 % Ethanol. Drehen Sie jedes Rohr bei >21.000 x g für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand.
- Waschen Sie das DNA-Pellet erneut mit 100 l 100% Ethanol. Drehen Sie jedes Rohr bei >21.000 für 5 min bei RT. Entsorgen Sie den Überstand.
- Lassen Sie das Pellet vollständig lufttrocken, dann die DNA in 12 l Nuklease-freien H2O durch Flicken zum Mischen vorsichtig wieder aufhängen.
- Verdauen Sie 500 ng pSUmC-4.0 Vektor in einer 20-L-Reaktion mit 1 Einheit Sall und 1 Einheit SbfI nach dem Herstellerprotokoll. Inkubieren Sie die Reaktion für ca. 3 h oder über Nacht, um eine vollständige Verdauung des Vektors zu gewährleisten.
- Reinigen und konzentrieren Sie das verdaute Rückgrat durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Ethanolfällung wie zuvor beschrieben (Schritt 1.7.1–1.7.9).
- Kombinieren Sie den verdauten pSUmC-4.0-Vektor und sowohl die 5' als auch die 3' Homologiearm-PCR-Produkte im Verhältnis 0,01 pmol pSUmC-4.0 bis 0,09 pmol pro Homologiearm. Montieren Sie die Fragmente in einer DNA-Montagereaktion gemäß dem Herstellerprotokoll.
- Transformieren Sie 50 l elektrokompetenten E. coli mit 1 l der DNA-Montagereaktion. Die transformierte E. coli auf LB-Agarplatten mit 100 g/ml Spektinomycin unter Streuung von 150 l pro Platte aufblenden. Die Platten über Nacht bei 37 °C bebrüten.
- Am nächsten Tag werden Kolonien für grüne und rote Fluoreszenz mit einem invertierten Epifluoreszenzmikroskop untersucht. Insgesamt werden 5–30 Kolonien pro Agarplatte erwartet.
- Wählen Sie 5–10 Kolonien, um 4 ml LB-Brühe zu impfen, ergänzt mit 100 g/ml Spektinomycin. Inkubieren Sie Kulturen bei 37 °C über Nacht mit Schütteln bei 250 Rpm.
- Mit den über Nacht E. coli Kulturen, führen Sie kleine DNA-Reinigung. Elute die DNA mit 50 l nukleasefreiH2O.
- Bestätigen Sie das Einfügen jedes Homologiearms in den pSUmC-4.0-Vektor mithilfe der PCR-Screening-Primer (entworfen in Schritt 1.4), um jede Einfügung zu verstärken. Wenn die DNA-Montage erfolgreich ist, sollte ein PCR-Produkt mit 4 kb in einem 1% DNA-Agarose-Gel sowohl für die Armregionen 5' als auch für 3' beobachtet werden. Ein PCR-Produkt mit einer Größe von 1 KB weist auf einen Mangel an Einfügung hin.
HINWEIS: Wenn das Einfügen der Homologiearme in einer Doppelfragment-Montagereaktion erfolglos ist, führen Sie zwei Montagereaktionen durch, um den 5'-Arm dann einzeln 3' Arm einzufügen. Verdauen Sie den Vektor mit nur Sall, bevor Sie sich mit dem 5' Arm zusammensetzen, und verdauen Sie dann den Vektor mit SbfI, um den 3'-Arm zu montieren. - Transform dam-/dcm- kompetente E. coli mit 200 ng pSUmc-4.0 mit beiden Homologiearmen montiert. Die transformierten Bakterien auf LB-Agarplatten, die 100 g/ml Spektinomycin enthalten, durch Streuung von 25 l pro Platte verätzen. Die Platten über Nacht bei 37 °C bebrüten. Insgesamt werden 20 bis 200 Kolonien erwartet.
- Sieb die Platten für rote und grüne fluoreszierende Kolonien, wie in Schritt 1.13 beschrieben.
- Richten Sie eine Kultur für eine großangelegte DNA-Reinigung ein, indem Sie 100 ml LB-Brühe impfen, die 100 g/ml Spektinomycin mit roten und grünen Kolonien enthält. Die Kultur bei 37 °C über Nacht mit Schütteln bei 250 Umdrehungen von 150 Rpm bebrüten.
- Ernte die Kultur und reinigen Sie die DNA mit einer groß angelegten DNA-Reinigung.
- Setzen Sie die gereinigte Plasmid-DNA in 100l NF-H2 O wieder aus. Eine Gesamt-DNA-Ausbeute von mindestens 2 g/l ist ideal für die Umwandlung von C. trachomatis.
- Sequenzieren Sie die 5' und 3' HomologieArmbereiche, um die korrekte Montage in pSUmC-4.0 zu gewährleisten, bevor C. trachomatistransformiert wird.
2. Umwandlung von C. trachomatis mit pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion by Allelic Exchange
- Samen McCoy Zellen, Maus-Fibroblasten standardly für den Anbau von Chlamydienverwendet, in zwei 6 Brunnenplatten (1 x 106 Zellen/ well) mit Wachstumsmedien #1. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C mit 5%CO2, bis die Monoschicht konfluent ist (ca. 24 h).
- In einem 1,5 ml Rohr, fügen Sie ein Volumen von C. trachomatis WT serovar L2 Elementarkörper (EBs), die ausreichend ist, um 12 Brunnen einer 6 Brunnenplatte bei einem MOI von 2 zu infizieren. Pellet die EBs bei >20.000 x g für 30 min, dann entsorgen Sie den Überstand.
- Initiieren Sie die Chlamydientransformation, indem Sie die EBs in 600 L CaCl2-Puffer sanft wieder aufsetzen, und fügen Sie dann 24 g pSUmC-4.0 + Homologiearme in die Röhre ein. Mischen Sie die Lösung vorsichtig durch Flicken. Inkubieren Sie die Röhre bei RTfor 30 min und flicken Sie alle 10 min zu mischen.
- Fügen Sie die Transformationslösung zu 24 ml der ausgewogenen Salzlösung (HBSS) von Hanks hinzu und mischen Sie sie durch sanftes Pipetieren. 2 ml des Inokulums in jeden Brunnen der zufließenden McCoy-Zellen in den 6 Brunnenplatten übertragen und durch Zentrifugation bei 900 x g bei 1 h bei 20 °C infizieren.
- Entfernen Sie das Inoculum und ersetzen Sie es durch 2 ml/well RPMI-Wachstumsmedien #2. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C mit 5%CO2.
- Nach mindestens 7 h, aber nicht mehr als 12 h, ersetzen Sie die Medien durch 2 ml/Well der Auswahlmedien #1. Setzen Sie die Inkubation bei 37 °C für 48 h ab dem Zeitpunkt der Infektion fort.
- Ernten und durchführen Sie die Bakterien auf eine frische Monoschicht von McCoy-Zellen.
- Mit einem Zellschaber kratzen Sie die McCoy-Monoschicht vorsichtig, um die Zellen in die Medien zu heben. Übertragen Sie das Material von jedem Brunnen in ein 2 ml Rohr. Pellet das Zellmaterial bei >20.000 x g in einer Mikrozentrifuge für 30 min bei 4 °C.
- Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml HBSS durch sanftes Pipetieren wieder auf.
- Pellet die Zelle Schmutz bei 200 x g für 5 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand auf einen frischen Brunnen von konfluenten McCoy-Zellen. Fügen Sie jedem Bohrwert für ein Gesamtvolumen von 2 ml/Well weitere 1 ml HBSS hinzu.
- Durch Zentrifugation bei 900 x g bei 1 h bei 20 °C infizieren. Ersetzen Sie das Inokulum durch Auswahlmedien #1 unmittelbar nach der Infektion.
- Die Bakterien weiterhin alle 48 h für drei oder mehr Passagen auf eine frische Monoschicht von McCoy-Zellen (Abschnitt 2.7) zu übergeben, bis rote und grüne Einschlüsse mit einem epifluoreszenzinvertierten Mikroskop 24 h nach der Infektion (24 PSi) nachgewiesen werden.
- Sobald rote und grüne Einschlüsse erkannt wurden, fahren Sie mit dem Übergeben der Monolayer (Abschnitt 2.7) über Auswahlmedien #2 fort.
- Fahren Sie mit der Monoschicht fort, bis nur grüne Einschlüsse 24 PSi (Passage #3 oder später) erkannt werden, was auf den Verlust des pSUmC-4.0-Vektors und die Einbindung der loxP-Auswahlkassette in das Genom hinweist.
- Wählen Sie einen Brunnen von nur grünen Einschlüssen, um durch Passaging zu bereichern. Ernten und einfrieren Sie alle anderen Brunnen, die auch nur grüne Einschlüsse im Saccharose-Phosphat-Glutamat-Puffer (SPG) enthalten.
- Um nur grüne Einschlüsse anzureichern, durchgehen Sie die Monoschicht aus einem Brunnen einer 6-Well-Platte, wie in Schritt 2.7 getan, aber nach dem Granulieren der Zellablagerungen (Schritt 2.7.3), übertragen Sie den Überstand in einen kegelförmigen mit 12 ml HBSS. Verwenden Sie dieses Inokulum, um zwei 6 Wellplatten zu infizieren, indem Sie 2 ml pro Brunnen hinzufügen, dann drehen Sie die Platten bei 900 x g für 60 min bei 20 °C.
- Um zusätzliche Brunnen einzufrieren, ernten Sie die Monoschicht wie in Schritt 2.7.1, setzen Sie die Pellets jedoch in 1 ml SPG anstelle von HBSS wieder aus. Pellet die Zelle Schmutz (Schritt 2.7.3) und übertragen Sie den Überstand in eine 1,5 ml Kryotube. Einfrieren des Materials bei -80 °C.
- Nach der Anreicherung von nur grünen Einschlüssen auf ein MOI von 0,5–1,0 (ein bis zwei weitere Passagen nach der Detektion) ernten Sie die Monolayer in SPG, wie in Schritt 2.11.2 beschrieben. In 1,5 ml-Rohren Aliquots von 50 l erhalten und bei -80 °C einfrieren.
- Titer-Bakterien, die nur grün sind, um die Aufnahme zu bestimmen, bilden Einheiten/L, gemäß einem Standard-Titrationsprotokoll17.
3. Klonale Isolierung von nur Grün-C. trachomatis Deletion Mutant containing the loxP Flanked Selection Cassette by Limiting Dilution
- Säen Sie eine 384 Brunnengewebekulturplatte mit 50 L McCoy-Zellen bei 2.000 Zellen/gut in Wachstumsmedien #1. Bei 37 °C mit 5 %CO2 für 24 h oder bis zum Einfluss inkubieren.
- Verdünnen Sie ein Aliquot von nur grünen Bakterien in HBSS, um 50 EBs pro 20 ml zu erreichen. Das verdünnte Inokulum in eine Reservoirwanne geben.
- Entfernen Sie das Medium von der 384 Wellplatte, indem Sie die gesamte Platte kopfüber in einen Abfallbehälter schieben. Mit einer Mehrkanalpipette, fügen Sie 50 L C. trachomatis inoculum zu jedem Brunnen. Durch Zentrifugation bei 900 x g bei 1 h bei 20 °C infizieren.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht so stark zu flicken, dass sich die Monolayerlösten lösen. Wenn Zellen überlaufen sind, lösen sie sich leichter.
- Entfernen Sie das Medium von der 384 Wellplatte, indem Sie die gesamte Platte kopfüber in einen Abfallbehälter schieben. Mit einer Mehrkanalpipette, fügen Sie 50 L C. trachomatis inoculum zu jedem Brunnen. Durch Zentrifugation bei 900 x g bei 1 h bei 20 °C infizieren.
- Entfernen Sie das Inokulum durch Flicken und ersetzen Sie es durch 50 L/Well-Wachstumsmedien #2. Inkubieren Platten bei 37 °C mit 5%CO2.
HINWEIS: In diesem Stadium ist die Integration der Selektionskassette in das Genom stabil, so dass eine Antibiotikaauswahl mit Spektinomycin nicht mehr erforderlich ist. - Nach der Inkubation der Platte für 5-12 Tage, identifizieren Sie einzelne Brunnen mit grünen fluoreszierenden Einschlüssen mit einem epifluoreszenzinvertierten Mikroskop oder einer hochgehaltigen Screening-Plattform.
- Ernten Sie Brunnen mit nur grünen Einschlüssen, indem Sie die Monoschicht mit einer p-10-Spitze kratzen und den gesamten Inhalt des Brunnens in ein Rohr mit 2 ml HBSS übertragen. Mischen und tragen Sie die 2 ml Inokulum auf eine frische konfluente McCoy Monolayer in einer 6 Well Platte für Infektionen.
HINWEIS: Wenn einzelne Brunnen mit Einschlüssen identifiziert werden, befinden sich die Einschlüsse aufgrund der Erweiterung von der ersten Einschlussaufnahme in einem Cluster. Wenn ein Brunnen mehrere Cluster hat, ist es wahrscheinlich, dass mehr als ein EB anfangs so gut infiziert. Diese Brunnen sollten nicht geerntet werden, und in einigen Fällen können mehrere Runden klonaler Isolierung durch serielle Verdünnung notwendig sein. - Infizieren Sie die 6 Wellplatte durch Zentrifugation bei 900 x g für 1 h bei 20 °C. Ersetzen Sie das Inokulum durch 2 ml/Well-Wachstumsmedien #2. Bei 37 °C mit 5 %CO2 für 48 h inkubieren.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.11–2.13, um klonale Populationen anzureichern, einzufrieren und zu titern.
- Bestätigen Sie die Deletion von gezielten Genen aus klonal isoliertem C. trachomatis mit qPCR, wie zuvor beschrieben12.
4. Umwandlung von C. trachomatis FRAEM Mutant mit pSU-Cre zur Initiierung der Entfernung von loxP Flanked Selection Cassette
- Wiederholen Sie den Transformationsprozess in einer 6-Well-Platte, wie zuvor beschrieben (Schritte 2.1–2.8) mit dem klonal isolierten C. trachomatis FRAEM Mutant, PSU-Cre-Vektor und Selektionsmedien #3.
HINWEIS: Eine erfolgreiche Transformation wird durch Einschlüsse angezeigt, die rot und grün fluoreszierend sind.- Durchgehen sie die Monoschicht, bis nur rot gebundene Einschlüsse mit einem epifluoreszenzinvertierten Mikroskop erkannt werden, das auf den Verlust der Selektionskassette (zwei bis drei Passagen) hinweist. Fahren Sie mit dem Übergeben der Monolayer fort, bis nur rote Einschlüsse auf einen MOI von 0,5 angereichert sind.
- Isolierung von reinen Roteinschlüssen durch Begrenzung der Verdünnung in einer 384-Well-Platte wie zuvor beschrieben (Schritte 3.1–3.8); Verwenden Sie jedoch auswahlmedien#3 für alle Schritte.
- Bereichern Sie klonale Populationen durch Passaging bis zu einem MOI von 0,1. Ersetzen Sie nach der Anreicherung Abschnittsmedien durch Wachstumsmedien #2, um den Verlust des pSU-Cre-Vektors (ungefähr drei bis vier Passagen) zu initiieren.
- Klonal isolieren nicht fluoreszierende Bakterien (Schritte 3.1–3.8); Scannen Sie die Platte jedoch manuell mit einem Hellfeldmikroskop, um Einschlüsse zu erkennen. Bakterien anreichern und einfrieren (Schritt 2.11–2.12).
- Bildschirm für den mutierten Stamm mit quantitativer Echtzeit-PCR, Western Blotting und ganzer Genom-DNA-Sequenzierung wie zuvor beschrieben12.
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Representative Results
Die Methode zur markerlosen Genlöschung bei C. trachomatis mit FLAEM ist auf sorgfältige Klon- und Transformationstechniken angewiesen. Eine erfolgreiche allelische Rekombination ist ein wesentlicher erster Schritt und erfordert die Identifizierung und Einfügung von Homologiearmen in den pSUmC-4.0 Klonvektor (Abbildung 1). Ein wesentlicher zweiter Schritt für die markerlose Genlöschung ist die Entfernung des Fluoreszenzreporters und der Antibiotikaauswahlkassette durch Cre-lox-Genombearbeitung, dargestellt in Abbildung 2. Die Vektoren, die zum Ausführen der einzelnen Schritte verwendet werden, sind in Abbildung 3mit Anmerkungen zu finden. Abbildung 4 zeigt eine schematische Darstellung der Transformationsstrategie, um eine markerlose Löschmutation zu generieren, wenn sie mit dem Wildtyp C. trachomatisbeginnt.
Repräsentative Daten sind in Abbildung 5 und Abbildung 6dargestellt, in denen tmeA für die Genlöschung bestimmt ist. Der C. trachomatis tmeA Deletion Stamm wird mit FRAEM erzeugt, und der C. trachomatis tmeA-lx Stamm wird mit FLAEM erzeugt. Beide mutierten Stämme enthalten eine Löschung des tmeA-Lokus; TmeA-lx enthält jedoch nicht die Selektionskassette, wie das Fehlen von gfp-DNA in Abbildung 5zeigt. Der tmeA-Mutantstamm hat die Expression von tmeBverringert, dargestellt in Abbildung 6 durch mRNA und Proteinspiegel. Wenn FLAEM zum Generieren des mutierten TmeA-lx-Stamms verwendet wird, zeigt Abbildung 6, dass der Ausdruck von tmeB wiederhergestellt wird.
Abbildung 1: Schematische Darstellung zur Identifizierung von 5' und 3' Homologiearmen aus genomischer DNA und PCR-Screening für deren Einfügung in pSUmC-4.0. (A) Ein Gen, das zum Löschen aus dem Genom c. trachomatis bestimmt ist, wird durch den blauen Pfeil dargestellt. Die 3 kb-Regionen, die als 5' und 3' Homologiearme für die allel-Rekombination identifiziert wurden, sind in violett und rot geklammert. (B,C) Die Einfügung der 5' und 3' Homologiearme in pSUmC-4.0 wird durch PCR-Screening bestimmt. Die Sall- und Sbfl-Restriktionsenzymstellen werden flankiert, die die Auswahlkassette aadA (schwarzer Pfeil) und gfp (grüner Pfeil) flankieren, die von loxP-Sites (gelbe Quadrate) auf dem pSUmC-4.0-Vektor flankiert wird. (B) Kein Einstecken wird durch ein 1 kb PCR-Produkt bestimmt, wenn 5' Siebgrundierungen (lila Pfeilköpfe) verwendet werden, um PCR über die Sall-Site zu verstärken, oder 3' Siebgrundierungen (rote Pfeilköpfe) verwendet werden, um über die SbfI-Site zu verstärken. (C) Erfolgreiches Einsetzen wird durch 3 kb PCR-Produkte unter den gleichen Bedingungen bestimmt. 5' und 3' Homologiearme werden durch die violetten bzw. roten Klammern dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der cre-lox vermittelten Rekombination, um die gfp-aadA-Auswahlkassette zu entfernen. In Gegenwart der Cre-Rekombiinase werden die loxP-Standorte (gelb) neu kombiniert, was zur Exzision der gfp-aadA-Auswahlkassette (grüne und schwarze Quadrate) führt. Der resultierende Lokus wird mit einer verbleibenden Lox-P-Narbensequenz angezeigt. Vorgelagerte (US) und downstream (DS) Regionen werden grau dargestellt. Diese Zahl wurde von Keb et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Genetische Organisation von pSUmC-4.0 und pSU-CRE. Zur kontrollierbaren Wartung der Vektoren in C. trachomatis wird pgp6 nach geschaltet von einem tetracyclinininininuzierbaren Promotor entwickelt. Die verbleibenden pgp-Gene sind ihren nativen Chlamydien-Promotoren nachgelagert, und mCherry wird konstitutiv auf beiden Vektoren ausgedrückt. (A) pSUmC-4.0 enthält eine Kassette, die konstitutiv exprimierte AadA- und gfp-Gene für die Antibiotika- bzw. Fluoreszenzauswahlfähigkeit kodiert. LoxP-Sites für Cre vermittelte Rekombination sowie Restriktionsenzym-Sites für das Einführen genspezifischer Homologiearme flankieren die Selektionskassette. (B) pSU-CRE enthält ein ähnliches Rückgrat wie pSUmC-4.0; Doch anstelle der Rekombinationskassette werden blaM und cre konstitutiv für die Selektivität von Antibiotika bzw. die CRE-Rekombinatoa-Generation exprimiert. Diese Zahlen wurden von Keb et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Schematische Darstellung der FLAEM-Transformationsstrategie, die zum Erstellen eines markerlosen Löschmutanten verwendet wird. Die allgemeine FLAEM-Methode wird hier dargestellt, wo Wild-Typ C. trachomatis sequenziell transformiert und seriell durchgelassen wird, um eine markerlose Löschmutation zu erzeugen. Transformationsschritte werden durch die Zugabe kleiner Pfeile dargestellt, und der Verlust genetischer Elemente wird durch die Subtraktion kleiner Pfeile dargestellt. C. trachomatis intermediates (Circles) sind mit antibiotikaresistenten (penicillinresistenten oder penicillin-sensitiven = PenGr oder PenGs; spectinomycin-resistent oder spektinomycin-sensitive = Specr oder Specs)und Fluoreszenz-Reporting-Qualitäten (grün = gfp +, rot = mCherry +, grau = keine Fluoreszenz) dargestellt. Schematische Darstellungen des Genlokus bei jedem Schritt sind unten dargestellt. Diese Zahl wurde von Keb et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: FRAEM und FLAEM werden verwendet, um TmeA-Genlöschungen zu erzeugen. (A) FRAEM wurde verwendet, um tmeAzu generieren, und FLAEM wurde verwendet, um tmeA-lx zu generieren. Relative DNA-Kopiernummern von tmeA und downstream tmeB; gfp auf der pSUmC-4.0-Auswahlkassette; und Kresse, die auf dem pSU-CRE-Vektor enthalten sind, werden alle angezeigt. McCoy-Zellen, die mit gleichen Einschlussbildenden Einheiten von WT, L2 tmeAoder L2RiftmeA-lx C infiziert waren, wurden mit 24 PSi geerntet und DNA für qPCR extrahiert. Relative Kopierzahlen wurden durch Signalnormalisierung zu Chlamydien 16sRNA bewertet. ND = keine erkannt. (B) Der sequenzierte tmeAB-Lokus aus L2RiftmeA-lx wird mit einer einzigen verbleibenden LoxP-Narbensequenz (unterstrichen) angezeigt. Die flankierenden Bereiche der DNA sind blau, die Startcodons grün und das TmeA-Stopp-Codon rot dargestellt. Das nicht-kanonische Startcodon für TmeB wird ebenfalls dargestellt. Diese Zahlen wurden von Keb et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Das Exzisionsstück der Selektionskassette mit FLAEM stellt die Expression von tmeB bei der Ausrichtung auf tmeA wieder her und stört die nachgelagerten Gene nicht. (A) Relativer mRNA-Gehalt von C. trachomatis tmeA und tmeB mutierten Stämmen. Das Vorhandensein von Transkripten nach tmeA wurde durch Reverse Transcriptase (RT) quantitative PCR bestimmt. Die Region unmittelbar unterhalb des tmeA/B-Operons kodiert ct696. Total RNA wurde mit 24 PSi von McCoy-Zellen isoliert, die mit einem MOI von 1 mit WT, L2 tmeA,L2 tmeBoder L2RiftmeA-lxinfiziert wurden. Transkripte für tmeA, tmeBund ct696 wurden von qRT-PCR erkannt. Signale werden nach der Normalisierung zu rpoDangezeigt. ND = keine erkannt. (B) Western Blot für das Vorhandensein von TmeA und TmeB in C. trachomatis mutierten Stämmen. Gleiche Mengen an Vollkulturmaterial aus 24 HPi-Kulturen, die mit gleichen Einschlussbildenden Einheiten von WT, L2 tmeA,L2RiftmeA-lx oder L2RiftmeA-lx ptmeA infiziert waren, wurden in Immunoblots für TmeA und TmeB untersucht. Hsp60 wurde als Ladekontrolle verwendet, und Proteine wurden durch Chemilumineszenz visualisiert. Abbildung wurde von Keb et al.12geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll zur Erzeugung von markerlosen Genlöschungen in C. trachomatis durch FLAEM ermöglicht die gezielte Löschung nicht essentieller Gene und eliminiert kassetteninduzierte Polareffekte. Das Protokoll stützt sich auf eine sorgfältige Gestaltung von 5' und 3' Homologiearmen, die in den pSUmC 4.0 Selbstmordvektor eingesetzt werden, eine effiziente Transformation von C. trachomatis und ein sorgfältiges Screening isolierter mutierter Stämme. Erfolgreiche Genom-Engineering mit dieser Methode führt zu Bakterien, die nicht fluoreszierend sind und eine einzige LoxP-Narbensequenz an der Stelle der gezielten Genlöschung enthalten. Darüber hinaus hat diese Methode das Potenzial, für die sequenzielle Ausrichtung von Genen innerhalb desselben C. trachomatis-Stamms angepasst zu werden.
Die sorgfältige Gestaltung der 5' und 3' Homologiearme und das Einfügen in den Selbstmordvektor ist der erste und kritischste Schritt des Klonprozesses. Es wurde festgestellt, dass 3 kb Homologiearme die effizienteste Allelic-Rekombination bieten. Während das Einsetzen dieser Arme einen Vektor erzeugt, der groß und manchmal schwierig zu handarbeiten ist, gab es weniger Erfolg mit kürzeren Armen, wobei 2 kb ein Minimum für den Erfolg darstellten. Die Nutzung der Sall- und Sbfl-Restriktionsstandorte sorgt für eine komfortable einstufige Konstruktionsreaktion bei der DNA-Montage.
Andere Klonmethoden, wie z. B. das Einfügen von PCR, waren ebenfalls wirksam beim Einsetzen von Homologiearmen, aber sie führen zu einer größeren Möglichkeit von PCR-basierten Fehlern. Interessanterweise wurde beobachtet, dass das Klonen des 5'-Arms vergleichsweise effizienter ist als der 3'-Arm. Wenn ein Problem auftritt, wird empfohlen, die DNA-Baugruppe in zwei Reaktionen zu teilen und den Vektor schrittweise zu konstruieren. Dann wird empfohlen, das Vektor-Rückgrat mit SbfI zu verdauen, zuerst den 3'-Arm einzufügen, dann den Vektor mit Sall zu verdauen und den 5'-Arm in eine zweite DNA-Montagereaktion einzufügen.
Bei der Verstärkung von PCR-Fragmenten für die Homologiearme wird auch empfohlen, frisch gereinigte C. trachomatis genomische DNA zu verwenden, die zuvor nicht eingefroren wurde. Dies schränkt die Möglichkeit der DNA-Scherung ein und erhöht die Effizienz bei der Erzeugung größerer Amplicons. Wenn Homologiearme von einem anderen Vektor amplifizieren, muss das gereinigte PCR-Produkt dpnI-Restriktionsenzym behandelt werden, bevor es zur DNA-Montage übergeht, um Hintergrundkolonien während der E. coli-Transformation zu reduzieren.
Die Transformation ist ein weiterer wichtiger Schritt dieses Protokolls, in dem Probleme auftreten können. Wenn die Transformation mit pSUmC 4.0 erfolgreich ist, sollten grüne und rote Einschlüsse durch Passage #3 sichtbar sein. Es kann jedoch noch einige Passagen dauern, bis die Transformationsmittel bereichert werden. Wie andere Mutagenese-Ansätze beschränkt sich diese Methode auf die Ausrichtung auf nicht essentielle Gene, aber die Transformation sollte dennoch ohne weiteres durchgeführt werden. Eine langfristige Passierung von Transformationsmitteln in Ermangelung eines allelischen Austauschs, der durch die Retention roter Fluoreszenz angezeigt wird, kann darauf hindeuten, dass die Löschung des Zielgens ein tödliches Ereignis ist.
Da Transformationsvektoren für C. trachomatis den gleichen Ursprung der Replikation wie die native pL2 enthalten, ist es nicht ungewöhnlich, dass das native Plasmid nach mehreren (>5) Passagen geheilt wird. Die pgp-Gene auf den pSUmC-Vektoren sind in einer anderen Reihenfolge als die nativep2; Daher kann PCR verwendet werden, um das Vorhandensein von pL2 in einem isolierten Stamm zu erkennen, indem die Region pgp7–pgp8verstärkt wird. Wenn das native Plasmid in der endgültigen Deletionmutant verloren geht, muss es wieder eingeführt werden, bevor Entwicklungsstudien durchgeführt werden. Lateralgentransfer (LGT) kann zur Wiedereinführung des pL2-Plasmids19verwendet werden.
In vielen Fällen enthalten frühdeletionierte Mutanten mit der Selektionskassette noch das pL2-Plasmid. Wir haben diese Stämme für LGT mit Erfolg verwendet, um pL2 wieder einzuführen und eine Reparatur des gelöschten Gens zu vermeiden. LGT kann auch als sekundäre Methode für die Transformation bei der Einführung von pSU-Cre verwendet werden. In einigen Fällen war LGT effizienter als die klassische CaCl 2-Transformation. In Fällen, in denen LGT verwendet wird, um pSU-Cre einzuführen, ist es wichtig, mit C. trachomatis zu beginnen, die ein rpoB-Allel ausdrücken, das Rifampin-Widerstand vor dem allelischen Austausch und Einsetzen der Spektinomycin-Auswahlkassette12,19verleiht. Beginnend mit Rifampin resistenten Bakterien ermöglicht die Auswahl nach Co-Kultur.
FLAEM ermöglicht reverse-genetische Ansätze mit gezieltem Löschen ganzer Codierungssequenzen im Vergleich zu anderen genetischen Methoden, die auf zufälliger Mutagenese oder dem Einfügen von Nukleotidsequenzen basieren, um Eine Genstörung zu erreichen. FLAEM ist im Wesentlichen eine Erweiterung von FRAEM, da es das Entfernen der Selektionskassette ermöglicht und zuvor beobachtete kassetteninduzierte Polareffekte eliminiert. Diese Methode schafft auch die Möglichkeit, mehrere Genlöschungen in einem einzigen C. trachomatis Stamm zu generieren.
Mehrere Mutationen können über zwei verschiedene Mechanismen erzeugt werden. Im ersten kann FLAEM verwendet werden, um eine markerlose Genmutation zu erzeugen und sequenziell ein anderes Gen in demselben Stamm zu zielen. Die erste Deletionmutante kann mit dem pSUmC 4.0-Vektor, der Homologiearme enthält, die spezifisch für sekundäre Gene von Interesse sind, umtransformiert werden. In diesem Fall sollte das Protokoll auf die gleiche Weise wie die erste Löschung wiederholt und mehrmals wiederholt werden, um Gene sequenziell zu zielen. Im zweiten Mechanismus kann die nach FLAEM isolierte markerlose Deletionsmutante mit einer Löschmutante koinfiziert werden, die noch eine Selektionskassette enthält. Durch LGT wird die zweite Löschung erfasst und kann ausgewählt werden. Bei diesem Ansatz werden zusätzliche Mutationen durch die Anzahl der eindeutigen Selektionskassetten begrenzt, die im Genom verbleiben. Häufig verwendete Antibiotika, die als selektiver Druck während der Transformation verwendet werden, sind für C. trachomatis begrenzt, aber sie umfassen Penicillin, Chloramphenicol und Spectinomycin. Das Entfernen der Selektionskassette durch die Cre-loxP-Genombearbeitung reduziert die Notwendigkeit, mehrere Antibiotika für selektiven Druck zu verwenden. Das gleichzeitige Löschen mehrerer Gensequenzen ist nützlich, wenn Proteine mit verwandten Funktionen oder biologischen Prozessen untersucht werden, die mehrere Schlüsselakteure haben können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Institute of Health, NIAID (Grants A1065530 und Al124649) an K.A. Fields unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam-/dcm- Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
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