Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Markerless Gene Deletion di Mamicino Scambio Allelicas in Chlamydia trachomatis

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60848
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

Descritto qui è un metodo per la delezione genica mirata e senza marcatori nella chlamydia trachomatis utilizzando la mutagenesi di scambio letale delle cassette scambiate, FLAEM.

Abstract

La chlamydia trachomatis è un patogeno intracellulare obbligatorio che è stato storicamente difficile da manipolare geneticamente. Il progresso definitivo nel chiarire i meccanismi che C. trachomatis utilizza per creare e mantenere una nicchia intracellulare privilegiata è stato limitato a causa della mancanza di strumenti genetici. Fortunatamente, di recente ci sono stati diversi nuovi progressi nelle tecniche di manipolazione genetica. Tra questi vi è lo sviluppo della mutagenesi dello scambio allelico segnalato dalla fluorescenza (FRAEM). Questo metodo consente la delezione mirata del gene accoppiato con l'inserimento di una cassetta di selezione codifica resistenza agli antibiotici e proteina fluorescente verde (GFP). La dipendenza da questa strategia può essere complicata quando si prendono di mira i geni all'interno di operoni polcistronici a causa del potenziale di effetti polari sui geni a valle. La mutagenesi allelica dello scambio di cassette flosche (FLAEM), il cui protocollo è descritto qui, è stato sviluppato per alleviare gli effetti polari indotti da cassette. FLAEM utilizza l'editing del genoma Cre-loxP per rimuovere la cassetta di selezione dopo la cancellazione mirata per scambio allelico. I ceppi risultanti contengono delezioni geniche senza marcatori di una o più sequenze di codifica. Questa tecnica facilita la valutazione diretta della funzione genica ed espande il repertorio di strumenti per la manipolazione genetica in C. tracommata.

Introduction

La clamidia transamata è la principale causa di malattie batteriche sessualmente trasmissibili e rappresenta un onere significativo per la salute umana. Oltre 100 milioni di persone sono infettate ogni anno da C. trachomatis1. Circa il 70% delle infezioni nelle donne sono asintomatiche nonostante gli effetti dannosi sulla salute riproduttiva, come la malattia infiammatoria pelvica, la gravidanza ectopica e/o l'infertilità. Il sequela della malattia è direttamente correlato all'immunopatologia iniziata da C. infezione da tracommatide 2. Un vaccino efficace deve ancora essere sviluppato; pertanto, comprendere la funzione dei fattori di virulenza batterica e di altri prodotti genici batterici è una questione di ricerca importante e urgente.

Come batteri intracellulari, l'invasione delle cellule ospiti, la replicazione intracellulare, il rilascio di progenie e l'evasione delle risposte immunologiche ospiti sono processi critici. C. tracommatide forma una membrana parassofosa legata vacuole, chiamato inclusione, per lo sviluppo intracellulare. L'istituzione dell'inclusione e di molti altri processi critici si ottiene mediante la secrezione di proteine efsiate tramite un sistema di secrezione di tipo III (T3SS)3. Chiarire le funzioni di questi efficaci secreti è stato limitato per molti anni a causa dell'intrattabilità genetica di C. tracomatis. A differenza di E. coli, molte tecniche di clonazione classiche non sono applicabili alla clamidia. Alcune limitazioni principali riguardano l'efficienza della trasformazione, la mancanza di controselezione dei reporter come sacB e la manutenzione del plasmide. Mentre i plasmidi E. coli possono generalmente essere mantenuti a tempo indeterminato con un'origine di replicazione e di adeguata pressione selettiva, C. trachomatis plasmis richiede altri otto frame di lettura aperti (pgp1-8) per la manutenzione che si trovano sul plasmide nativo di pL2 all'interno del sierovarL2 4.

Negli ultimi anni sono stati generati diversi strumenti genetici che ospitano la biologia unica della clamidia, eppure ci sono ancora limitazioni5,6,7. La mutagenesi chimica mediante trattamento con metanoesolino etilico (EMS) può introdurre mutazioni di fracivi o (meno frequentemente) può provocare transizioni nucleotidiche che introducono un codone di arresto prematuro per produrre una mutazione senza senso8. L'inserimento di trasposoni è efficiente per la disgregazione genica, ma la tecnologia attuale nella ricerca della clamidia è laboriosa e richiede moltotempo. Sia il trattamento EMS che le tecniche di mutagenesi trasposoni generano mutazioni casuali e richiedono rigorosi metodi di screening per isolare i ceppi mutanti. Un metodo per interrompere i geni mediante l'inserimento di introni di gruppo II (ad esempio, TargeTron) consente la mutagenesi diretta; tuttavia, questo metodo è limitato dall'efficienza e il sito di inserimento non è sempre previsto correttamente10.

La mutagenesi di scambio allelico segnalata dalla fluorescenza (FRAEM) è una strategia utilizzata per la cancellazione genica mirata accoppiata con l'inserimento di una cassetta di selezione che fornisce resistenza agli antibiotici e un reporter a fluorescenza11. Tuttavia, il FRAEM è complicato dal potenziale degli effetti polari indotti da cassette sui geni a valle, specialmente quando si prendono di mira i geni all'interno degli operoni polcistronici. La mutagenesi allelica allocante a cassette flosche (FLAEM) è un nuovo approccio genetico sviluppato per alleviare gli effetti polari indotti dalla cassetta precedentemente osservati con la cassetta di selezione FRAEM12. FLAEM utilizza l'editing del genoma Cre-loxP per rimuovere la cassetta di selezione e ripristinare l'espressione dei geni a valle. La cassetta di selezione contenente resistenza agli antibiotici e proteina fluorescente verde (GFP) è riprogettata con siti loxP di fianco. Questi siti loxP possono ricombinarsi in presenza di Cre ricombinase e provocare l'escissione della cassetta dal genoma13. Questa strategia ha dimostrato di alleviare gli effetti polari indotti in cassetta quando si mira tmeA perl'eliminazione 12,14.

Entrambi i metodi FRAEM e FLAEM utilizzano lo stesso vettore di suicidio, pSUmC 4.0, che può essere mantenuto in modo condizionale attraverso l'espressione inducibile di pgp6. L'espressione di pgp6 è stata precedentemente dimostrata necessaria per la ritenzione plasmide ed è quindi sfruttata per controllare la manutenzione del plasmide11,15. Quando C. trachomatis viene coltivato in media integrati con tetraciclina anidisca (aTc) per indurre l'espressione pgp6, il vettore viene mantenuto. In assenza di aTc, il vettore viene perso. La cancellazione mirata del gene si ottiene attraverso lo scambio allelico del gene per la cassetta di selezione. Le regioni da 3 kb direttamente a monte e a valle del gene bersaglio fungono da bracci di omologia per la ricombinazione. Questi bracci sono clonati nel vettore pSUmC 4.0 che fiancheggia la cassetta di selezione. Gli eventi di trasformazione e ricombinazione C. trachomatis di successo sono osservati attraverso la segnalazione della fluorescenza. L'espressione di mCherry sulla spina dorsale vettoriale e gfp all'interno della cassetta di selezione produce inclusioni fluorescenti rosse e verdi. Una volta che l'aTc viene rimosso dai mezzi di coltura, le inclusioni solo verdi indicano eventi di ricombinazione riusciti con la perdita del vettore suicida e l'integrazione della cassetta di selezione nel genoma batterico.

FLAEM rappresenta un'estensione del FRAEM attraverso la successiva trasformazione di un vettore che esprime Cre ricombinase, pSU-Cre, nel ceppo mutante appena creato. Cre ricombinase facilita la ricombinazione tra i siti loxP e l'escissione della cassetta di selezione. Gli eventi di ricombinazione sono indicati tramite segnalazione di fluorescenza. Il vettore pSU-Cre codifica mCherry; pertanto, la trasformazione riuscita è indicata dall'aggiunta di fluorescenza rossa alle inclusioni che esprimono gfp. La coltivazione in assenza di pressione selettiva per la cassetta comporta una ricombinazione mediata in Cre nei siti loxP, e la perdita della cassetta è indicata da inclusioni solo rosse. Come per pSUmC-4.0, l'espressione inducibile di pgp6 viene utilizzata per mantenere in modo condizionale pSU-Cre. Una volta rimossa la selezione aTc e antibiotica, il plasmide viene curato e il conseguente ceppo di delezione senza marcatore non è fluorescente. Questo metodo affronta la questione degli effetti polari indotti da cassette.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Progettazione e assemblaggio di pSUmC-4.0 con armi homologia specifiche per il gene di interesse

  1. Identificare le regioni da 3 kb direttamente a monte e a valle del gene oggetto di delezione per fungere da braccia omologhe da 5' e 3' per la ricombinazione omologa (Figura 1).
  2. Progettare i primer PCR a 1) amplificare il braccio homology da 3 kb 5' dal DNA genomico micoldiale e 2) contenere una sporgenza di 15-30 bp specifica per il pSUmC-4.0 quando viene digerita nel sito dell'enzima di restrizione Sall. Assicurarsi che le regioni di primer sovrapposte al pSUmC-4.0 abbiano temperature di fusione pari a 55 gradi centigradi e che le temperature di fusione dei tornanti per l'intero primer siano <35 .
  3. Progettare i primer PCR a 1) amplificare il braccio homology da 3 kb 3' dal DNA genomico minomico e 2) contenere una sporgenza di 15-30 bp specifica per il pSUmC-4.0 quando viene digerita nel sito dell'enzima di restrizione SbfI. Assicurarsi che le regioni di primer sovrapposte al pSUmC-4.0 abbiano temperature di fusione pari a 55 gradi centigradi e che le temperature di fusione dei tornanti per l'intero primer siano <35 .
  4. Progettare primer di screening PCR che amplificheranno l'inserimento di ogni braccio di omologia nel vettore pSUmC-4.0 dopo una reazione di assemblaggio del DNA16. Progettare questi primi che anneal 500 bp al di fuori dei siti di restrizione per consentire una facile visualizzazione di un prodotto PCR anche se l'inserimento non è riuscito (Figura 1).
  5. Amplifica i bracci di omologia 3 kb 5' e 3' dal DNA genomico clamidiale appena estratto dalla PCR in una o due reazioni per produrre abbastanza frammento per un successivo assemblaggio del DNA. Seguire il protocollo del produttore di polimerasi del DNA per una specifica configurazione di reazione e condizioni di ciclismo.
  6. Verificare che entrambi i prodotti PCR siano della dimensione corretta e che le reazioni non contengano bande contaminanti. Eseguire 5 l di ogni reazione PCR su un 1% DI gel di agarose di DNA.
  7. Purificare e concentrare i frammenti di PCR mediante estrazione fenolo/cloroformio e precipitazioni etanolo.
    1. Raggruppa tutte le reazioni PCR da 3' insieme in un tubo da 1,5 mL e porta ad un volume finale di 200 -L con H2O. Priva di nuclenonnontà per le reazioni PCR.
    2. Aggiungete 200 l di fenolo ad ogni tubo e vortice per 30-60 s. Ruotare ogni tubo in una microcentrifuga a >21.000 x g per 20 min a temperatura ambiente (RT).
    3. Trasferire lo strato superiore di fase acquoso di ogni tubo in un nuovo tubo da 1,5 mL, aggiungere un decimo del volume di acetato di sodio 3 M ad ogni tubo, quindi scorrere per mescolare.
    4. Aggiungere 3 volumi di etanolo al 100% ad ogni tubo e scorrere per mescolare. Incubare entrambi i tubi a -80 gradi centigradi per 20 min.
    5. Pellet il DNA ruotando ogni tubo a >21,000 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante.
    6. Lavare il pellet di DNA con 100 o lun di 70 % di etanolo. Girare ogni tubo a >21,000 x g per 5 min a RT. Scartare il supernatante.
    7. Lavare di nuovo il pellet di DNA con 100 l l di 100% di etanolo. Girare ogni tubo a >21,000 per 5 min a RT. Scartare il supernatante.
    8. Lasciare asciugare completamente il pellet all'aria, quindi risospendere delicatamente il DNA in 12 gradi di H2O senza nuclesiera facendo scorrere per mescolare.
  8. Digerire 500 ng di vettore pSUmC-4.0 in una reazione di 20 gradi con 1 unità di Sall e 1 unità di SbfI secondo il protocollo della manifattura. Incubare la reazione per circa 3 h o durante la notte per garantire la digestione completa del vettore.
  9. Purificare e concentrare la spina dorsale digerita mediante estrazione fenolo/cloroformio e precipitazioni etanolo come descritto in precedenza (passaggio 1.7.1–1.7.9).
  10. Combinare insieme il vettore pSUmC-4.0 digerito con i prodotti PCR braccio homologia 5' e 3' a un rapporto di 0,01 pmol pSUmC-4.0 a 0,09 pmol per ogni braccio di omologia. Assemblare i frammenti in una reazione di assemblaggio del DNA secondo il protocollo della manifattura.
  11. Trasformare 50 -L di E. coli elettrocompetente con 1 l di reazione all'assemblaggio del DNA. Placcare le piastre trasformate di E. coli su l'agar LB contenenti 100 g/mL di spettronomica spargendo 150 L per piastra. Incubare le piastre a 37 gradi durante la notte.
  12. Il giorno successivo, le colonie di schermo per la fluorescenza verde e rossa utilizzando un microscopio invertito a epifluorescenza. È previsto un totale di 5-30 colonie per piastra di agar.
  13. Scegliete 5-10 colonie per inoculare 4 mL di brodo LB integrate con 100 spectinomycin.g/mL. Incubare le colture a 37 gradi durante la notte con l'agitazione a 250 giri/min.
  14. Utilizzando le colture E. coli notturne, eseguire la purificazione del DNA su piccola scala. Eluire il DNA con 50 gradi di Nuclease-free H2O.
  15. Confermare l'inserimento di ciascun braccio di omologia nel vettore pSUmC-4.0 utilizzando i primer di screening PCR (progettati nel passaggio 1.4) per amplificare ogni inserimento. Se l'assemblaggio del DNA ha esito positivo, un prodotto PCR da 4 kb deve essere osservato in un gel di agarose di DNA dell'1% per entrambe le regioni 5' e 3' del braccio. Un prodotto PCR da 1 KB indica una mancanza di inserimento.
    NOTA: Se l'inserimento dei bracci di omologia non riesce in una reazione di assemblaggio a doppio frammento, eseguire due reazioni di assemblaggio per inserire il braccio 5' e il braccio 3', singolarmente. Digerire il vettore con solo Sall prima di assemblare con il braccio 5', quindi digerire il vettore con SbfI per assemblare il braccio 3'.
  16. Trasformare la diga-/dcm- competente E. coli con 200 ng di pSUmc-4.0 assemblati con entrambi i bracci di omologia. Placcare i batteri trasformati su piastre di agar LB contenenti 100 g/mL spettronomino diffondendo 25 L per piastra. Incubare le piastre a 37 gradi durante la notte. Si prevede un totale di 20-200 colonie.
  17. Schermare le piastre per le colonie fluorescenti rosse e verdi come descritto al punto 1.13.
  18. Creare una coltura per una purificazione del DNA su larga scala inoculando 100 mL di brodo LB contenente 100 spettronomici con colonie rosse e verdi. Incubare la coltura a 37 gradi durante la notte con l'agitazione a 250 giri/min.
  19. Raccogliere la coltura e purificare il DNA utilizzando una purificazione del DNA su larga scala.
    1. Risospendere il DNA plasmide purificato in 100 gradi L di NF-H2O. Una resa totale del DNA di almeno 2 g/l è ideale per la trasformazione di C. trachomatis.
    2. Sequenziare le regioni del braccio di omologia 5' e 3' per garantire il corretto assemblaggio in pSUmC-4.0 prima di trasformare C. trachomatis.

2. Trasformazione di C. tracommata con pSUmC 4.0 - Armi di homologia per la cancellazione genica da parte di Allelic Exchange

  1. Cellule McCoy di semi, fibroblasti murini standardmente utilizzati per coltivare la clamidia, in due 6 piastre di pozzo (1 x 106 cellule / bene) con mezzi di crescita #1. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2 fino a quando il monostrato non è confluente (circa 24 h).
  2. In un tubo da 1,5 mL, aggiungere un volume di C. trachomatis WT serovar L2 corpi elementari (EB) che è sufficiente per infettare 12 pozzi di una piastra 6 pozzo a un MOI di 2. Pellet gli EB a >20,000 x g per 30 min, quindi scartare il supernatante.
  3. Avviare la trasformazione della clamydiale risuspendendo delicatamente gli EB in 600, l'l di CaCl2 tampone, quindi aggiungere 24 g di pSUmC-4.0 - bracci omologia al tubo. Mescolare delicatamente la soluzione sfogliando. Incubare il tubo a RTfor 30 min e scorrere per mescolare ogni 10 min.
  4. Aggiungere la soluzione di trasformazione a 24 mL di soluzione di sale bilanciato di Hanks (HBSS) e mescolare pipettando delicatamente. Trasferire 2 mL di inoculum in ogni pozzo di cellule McCoy confluenti nelle 6 placche del pozzo e infettare con centrifugazione a 900 x g per 1 h a 20 .
  5. Rimuovere l'inoculum e sostituirlo con 2 mL/well RPMI growth media #2. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
  6. Dopo un minimo di 7 h, ma non più di 12 h, sostituire il supporto con 2 mL/pozzetto di supporto di selezione #1. Proseguire l'incubazione a 37 gradi centigradi per 48 h dal momento dell'infezione.
  7. Raccogliere e passare i batteri su un monostrato fresco di cellule McCoy.
    1. Utilizzando un raschietto per cellulari, raschiare delicatamente il monostrato McCoy per sollevare le cellule nel supporto. Trasferire il materiale da ogni pozzo in un tubo da 2 mL. Pellet il materiale cellulare a >20,000 x g in una microcentrifuga per 30 min a 4 gradi centigradi.
    2. Rimuovere e scartare il super-natante. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di HBSS con il pipettaggio delicatamente.
    3. Pellet i detriti delle cellule a 200 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Trasferire il supernatante su un pozzo fresco di cellule confluenti McCoy. Aggiungere altri 1 mL di HBSS ad ogni pozzo per un volume totale di 2 mL/pozzo.
    4. Infettare con centricità a 900 x g per 1 h a 20 gradi centigradi. Sostituire l'inoculum con i supporti di selezione #1 immediatamente successivi all'infezione.
  8. Continuare a passare i batteri su un monostrato fresco di cellule McCoy (sezione 2.7) ogni 48 h per tre o più passaggi fino a quando non vengono rilevate inclusioni rosse e verdi utilizzando un microscopio invertito di epifluorescenza 24 h post-infezione (24 hpi).
  9. Una volta rilevate le inclusioni rosse e verdi, continuare a passare il monostrato (sezione 2.7) utilizzando i #2 dei supporti di selezione.
  10. Continuare a passare il monostrato fino a quando non vengono rilevate inclusioni solo verdi 24 hpi (passaggio #3 o versioni successive), il che indica la perdita del vettore pSUmC-4.0 e l'incorporazione della cassetta di selezione loxP nel genoma.
  11. Scegli un pozzo di inclusioni solo verdi per arricchire passando. Raccogliere e congelare eventuali altri pozzi che contengono anche inclusioni solo verde nel buffer di saccarosio-fosfato-glutammato (SPG).
    1. Per arricchire le inclusioni solo verdi, trasferire il monostrato da un pozzo di un 6 pozzo come fatto nel passaggio 2.7, ma dopo aver spinto i detriti delle cellule (passaggio 2.7.3), trasferire il super-ataltuo in un conico con 12 mL di HBSS. Utilizzare questo inoculum per infettare due 6 piastre di pozzo aggiungendo 2 mL per bene, quindi girare le piastre a 900 x g per 60 min a 20 gradi centigradi.
    2. Per congelare ulteriori pozzi, raccogliere il monostrato come al punto 2.7.1, ma risospendere i pellet in 1 mL di SPG invece di HBSS. Pellet i detriti cellulari (passaggio 2.7.3) e trasferire il supernatante in un criotubo di 1,5 ml. Congelare il materiale a -80 gradi centigradi.
  12. Dopo aver arricchito le inclusioni verdi a un MOI di 0,5–1,0 (uno o due passaggi dopo il rilevamento), raccogli i monostrati in SPG come descritto al punto 2.11.2. Ottenere aliquote di 50 gradi in tubi da 1,5 mL e congelare a -80 gradi centigradi.
  13. Batteri titro solo verde per determinare l'inclusione, formando unità /L, secondo un protocollo di titorazione standard17.

3. Isolamento clonale di verde C. trachomatis Eliminazione MutantE Contenente la cassetta di selezione fiancheggiata loxP limitando la diluizione

  1. Semina una piastra di 384 pozzetto con 50 celle McCoy a 2.000 cellule/pozzo nei media di crescita #1. Incubare a 37 gradi centigradi con 5 % di CO2 per 24 ore o fino a confluente.
  2. Diluire una aliquota di batteri solo verdi in HBSS per ottenere 50 EB per 20 mL. Trasferire l'inoculum diluito in un vassoio serbatoio.
    1. Rimuovere il supporto dalla piastra 384 facendo scorrere saldamente l'intera piastra a testa in giù in un contenitore di rifiuti. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 50 -L di C. trachomatis inoculum ad ogni pozzo. Infettare con centricità a 900 x g per 1 h a 20 gradi centigradi.
      NOTA: Essere consapevoli di non sfogliare così forte che il monostrato si stacca. Se le cellule sono troppo confluenti, si staccheranno più facilmente.
  3. Rimuovere l'inoculum sfogliando e sostituire con un #2 media di crescita di 50 l/pozzo. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi con il 5% di CO2.
    NOTA: In questa fase, l'integrazione della cassetta di selezione nel genoma è stabile, quindi la selezione degli antibiotici con la spettronomicina non è più necessaria.
  4. Dopo aver incubato la piastra per 5-12 giorni, identificare i singoli pozzi con inclusioni fluorescenti verdi utilizzando un microscopio invertito dell'epifluorescenza o una piattaforma di screening ad alto contenuto.
  5. Raccogliere pozzi con inclusioni solo verdi raschiando il monostrato con una punta p-10 e trasferendo l'intero contenuto del pozzo in un tubo contenente 2 mL di HBSS. Mescolare delicatamente e applicare i 2 mL di inoculo a un nuovo monostrato McCoy confluente in un pozzo 6 per l'infezione.
    NOTA: quando si identificano singoli pozzi con inclusioni, le inclusioni saranno in un cluster a causa dell'espansione dall'inclusione iniziale. Se un pozzo ha più cluster, è probabile che più di un EB inizialmente infettato che bene. Questi pozzi non dovrebbero essere raccolti, e in alcuni casi, possono essere necessari più cicli di isolamento clonale per diluizione seriale.
  6. Infettare la piastra 6 di pozzo con centrifugazione a 900 x g per 1 h a 20 gradi centigradi. Sostituire l'inoculum con 2 mL/well growth media #2. Incubare a 37 gradi centigradi con 5 % DI CO2 per 48 h.
  7. Ripetere i passaggi da 2.11 a 2.13 per arricchire, congelare e titer clonare le popolazioni.
  8. Confermare l'eliminazione di geni mirati da tracomamatide C. clonalmente isolata utilizzando qPCR come descritto in precedenza12.

4. Trasformazione di C. trachomatis FRAEM Mutant con pSU-Cre per avviare la rimozione di loxP Flanked Selection Cassette

  1. Ripetere il processo di trasformazione in una piastra di 6 piani come descritto in precedenza (passaggi 2.1–2.8) utilizzando il mutante C. trachomatis FRAEM isolato clonalmente, vettore pSU-Cre e supporti di selezione #3.
    NOTA: Una trasformazione riuscita è indicata da inclusioni che sono fluorescenti rosse e verdi.
    1. Passaggio del monostrato fino a quando le inclusioni solo rosse vengono rilevate utilizzando un microscopio invertito a epifluorescenza, che indica la perdita della cassetta di selezione (da due a tre passaggi). Continuare a passare il monostrato fino a quando le inclusioni solo rosso sono arricchite a un MOI di 0,5 dollari.
  2. Isolare clonalmente le inclusioni solo rosse limitando la diluizione in una piastra 384 come descritto in precedenza (passaggi da 3.1 a 3,8); tuttavia, utilizzare i #3 multimediali di selezione per tutti i passaggi.
  3. popolazioni clonali arricchenti passando fino a un MOI di 0.1. Una volta arricchito, sostituire i media di sezione con i media di crescita #2 per avviare la perdita del vettore pSU-Cre (circa tre o quattro passaggi).
  4. Isolare clonalmente i batteri non fluorescenti (passaggi da 3.1 a 3,8); tuttavia, eseguire manualmente la scansione della piastra con un microscopio a campo luminoso per rilevare le inclusioni. Arricchire e congelare i batteri (passaggio 2.11–2.12).
  5. Schermo per il ceppo mutante utilizzando PCR quantitativo in tempo reale, gonfiore occidentale, e sequenziamento del DNA dell'intero genoma come descritto in precedenza12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il metodo per la delezione del gene senza marcatori in C. trachomatis utilizzando FLAEM si basa su accurate tecniche di clonazione e trasformazione. Il successo della ricombinazione allelica è un primo passo essenziale e richiede l'identificazione e l'inserimento di bracci di omologia nel vettore di clonazione pSUmC-4.0 (Figura 1). Un secondo passo essenziale per la delezione genica senza marcatori è la rimozione del reporter di fluorescenza e cassetta di selezione antibiotica mediante l'editing del genoma Cre-lox, rappresentato nella Figura 2. I vettori utilizzati per eseguire ognuno di questi passaggi sono annotati nella Figura 3. Figura 4 mostra una rappresentazione schematica della strategia di trasformazione per generare un mutante di eliminazione markerless quando si inizia con wild-tipo C. trachomatis.

I dati rappresentativi sono riportati nella Figura 5 e nella Figura 6, in cui il tmeA è destinato alla cancellazione genica. Il ceppo di delezione C. trachomatis tmeA viene generato utilizzando FRAEM, e il ceppo C. trachomatis tmeA-lx viene generato utilizzando FLAEM. Entrambi i ceppi mutanti contengono una delezione del locus tmeA; tuttavia, tmeA-lx non contiene la cassetta di selezione, come indicato dall'assenza di DNA gfp illustrata nella Figura 5. Il ceppo mutante tmeA ha diminuito l'espressione di tmeB, mostrato nella Figura 6 dai livelli di mRNA e proteine. Quando FLAEM viene utilizzato per generare il ceppo mutante tmeA-lx, la figura 6 mostra che l'espressione di tmeB viene ripristinata.

Figure 1
Figura 1: Rappresentazione schematica per l'identificazione di bracci di omologia 5' e 3' dal DNA genomico e screening PCR per il loro inserimento nel pSUmC-4.0. (A) Un gene mirato alla delezione dal genoma di C. trachomatis è rappresentato dalla freccia blu. Le regioni da 3 kb identificate come braccia homologia da 5' e 3' per la ricombinazione allelica sono tra parentesi in viola e rosso, rispettivamente. (B, C) L'inserimento dei bracci di omologia 5' e 3' in pSUmC-4.0 è determinato dallo screening PCR. I siti di enzimi di restrizione Sall e Sbfl sono mostrati che fiancheggiano la cassetta di selezione aadA (freccia nera) e gfp (freccia verde) che è affiancata da siti loxP (quadrati gialli) sul vettore pSUmC-4.0. (B) Nessun inserimento è determinato da un prodotto PCR da 1 kb quando vengono utilizzati i primer di screening 5 '(teste di freccia viola) per amplificare la PCR in tutto il sito sall, o vengono utilizzati 3 primi di screening (teste di freccia rosse) per amplificare in tutto il sito SbfI. (C) Il corretto inserimento è determinato da prodotti PCR da 3 kb alle stesse condizioni. Le braccia homologia da 5 e 3' sono rappresentate rispettivamente dalle parentesi viola e rossa. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Rappresentazione schematica della ricombinazione mediata Cre-lox per rimuovere la cassetta di selezione gfp-aadA. In presenza di Cre ricombinante, i siti loxP (giallo) si ricombinano, con conseguente escissione del gfp-aadA selection cassette (quadrati verdi e neri). Il locus risultante viene mostrato contenente una sequenza di cicatriciP loxrimanente. Le aree upstream (US) e downstream (DS) vengono visualizzate in grigio. Questa cifra è stata modificata da Keb etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Organizzazione genetica di pSUmC-4.0 e pSU-CRE. Per la manutenzione controllabile dei vettori in C. trachomatis, pgp6 è progettato a valle di un promotore di tetraciclina-inducibile. I restanti geni pgp sono a valle dei loro promotori clamydiali nativi, e mCherry è espresso in modo coniugale su entrambi i vettori. (A) pSUmC-4.0 contiene una codifica a cassetta espressa in modo complementare aadA e gfp geni per antibiotici e fluorescenza capacità di selezione, rispettivamente. I siti LoxP per la ricombinazione mediata Cre e i siti di enzimi di restrizione per l'inserimento di bracci omologia specifici del gene fiancheggiano la cassetta di selezione. (B) pSU-CRE contiene una spina dorsale simile a pSUmC-4.0; tuttavia, invece della cassetta di ricombinazione, blaM e cre sono esclusivamente espressi per la selettività antibiotica e la generazione ricombinante CRE, rispettivamente. Queste cifre sono state modificate da Keb etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rappresentazione schematica della strategia di trasformazione FLAEM utilizzata per creare un mutante di delezione senza marcatori. Il metodo FLAEM generale è rappresentato qui dove Wild-tipo C. tracommatis viene trasformato in sequenza e passaggio seriale per generare un mutante di delezione markerless. I passaggi di trasformazione sono rappresentati dall'aggiunta di piccole frecce e la perdita di elementi genetici è rappresentata dalla sottrazione di piccole frecce. C. tracomatis intermediates (cerchi) sono rappresentati con sensibilità agli antibiotici (resistente alla penicillina o alla penicillina-sensibile - PenGr o PenGs; spectinomycin-resistant o spectinomycin-sensitive - Specr o Specs) e qualità di segnalazione della fluorescenza (verde , gfp , rosso, mCherryornce, grigio , nessuna fluescenza). Di seguito sono riportate le rappresentazioni schematiche del locus genico ad ogni passo. Questa cifra è stata modificata da Keb etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: FRAEM e FLAEM vengono utilizzati per generare delezioni del gene tmeA. (A) FRAEM è stato utilizzato per generare tmeA, e FLAEM è stato utilizzato per generare tmeA-lx. Numeri di copia del DNA relativi di tmeA e tmeB a valle; gfp contenuti nella cassetta di selezione pSUmC-4.0; e cre contenuti nel vettore pSU-CRE sono tutti mostrati. Le cellule McCoy infettate da unità di formazione di inclusione equa di WT, L2 tmeAo L2RiftmeA-lx C. trachomatis sono state raccolte a 24 hpi, e il DNA è stato estratto per qPCR. I numeri di copia relativi sono stati valutati dalla normalizzazione del segnale al mistidiale 16sRNA. ND - nessuna rilevata. (B) Il locus tmeAB sequenziato di L2RiftmeA-lx viene mostrato con una singola sequenza di cicatrici loxP rimanente (sottolineata). Le regioni di fianco del DNA sono mostrate in blu, i codoni di inizio sono mostrati in verde e il codone di arresto TmeA è mostrato in rosso. È raffigurato anche il codon di inizio non canonico per TmeB. Queste cifre sono state modificate da Keb etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: L'escissione della cassetta di selezione utilizzando FLAEM ripristina l'espressione di tmeB quando si colpisce tmeA e non interrompe i geni a valle. (A) Livello relativo di mRNA di ceppi mutanti C. trachomatis tmeA e tmeB. La presenza di trascrizioni a valle del tmeA è stata determinata dalla trascrizione inversa (RT) PCR quantitativa. L'area immediatamente a valle dell'operaio tmeA/B codifica ct696. L'RNA totale è stato isolato a 24 hpi dalle cellule McCoy infettate a un MOI di 1 con WT, L2 tmeA, L2 tmeBo L2RiftmeA-lx. Le trascrizioni per tmeA, tmeBe ct696 sono state rilevate da qRT-PCR. I segnali vengono presentati dopo la normalizzazione a rpoD. ND - nessuna rilevata. (B) Macchia occidentale per la presenza di ceppi mutanti TmeA e TmeB in Ceppi mutanti C. trachomatis. Quantità uguali di materiale di coltura intera proveniente da 24 colture hpi infettate da unità di formazione di inclusione equa di WT, L2 tmeA, L2RiftmeA-lx o L2RiftmeA-lx ptmeA sono stati sondati in immunoblot per TmeA e TmeB. Hsp60 è stato utilizzato come controllo di carico, e le proteine sono state visualizzate dalla chemiluminescenza. La figura è stata modificata da Keb etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Il protocollo descritto qui per la generazione di delezioni di geni markerless in C. trachomatis da FLAEM consente la delezione mirata di geni non essenziali ed elimina gli effetti polari indotti da cassette. Il protocollo si basa su un'attenta progettazione di bracci di omologia 5' e 3' inseriti nel vettore suicida pSUmC 4.0, da una trasformazione efficiente della tracomatide DiC e da un attento screening di ceppi mutanti isolati. Il successo dell'ingegneria genomica tramite questo metodo produce batteri che non sono fluorescenti e contengono una singola sequenza di cicatrici loxP nel sito di delezione genica mirata. Inoltre, questo metodo ha il potenziale per essere adattato per il targeting sequenziale dei geni all'interno dello stesso ceppo C. trachomatis.

Un'attenta progettazione dei bracci di omologia 5' e 3' e l'inserimento nel vettore suicida è la prima e più critica fase del processo di clonazione. È stato scoperto che i bracci di omologia a 3 kb forniscono la ricombinazione allelica più efficiente. Mentre l'inserimento di questi bracci genera un vettore che è grande e talvolta difficile da lavorare, c'è stato meno successo con bracci più corti, con 2 kb che rappresentano un minimo di successo. L'utilizzo dei siti di restrizione Sall e Sbfl fornisce una comoda reazione di costruzione in un solo passaggio quando si esegue l'assemblaggio del DNA.

Altri metodi di clonazione, come l'inserimento della PCR, sono stati efficaci anche nell'inserimento di bracci di omologia, ma introducono una maggiore possibilità di errori basati sulla PCR. È interessante notare che è stato osservato che la clonazione del braccio 5 è relativamente più efficiente del braccio 3' . Se si verifica un problema, si raccomanda di dividere l'assemblaggio del DNA in due reazioni e costruire il vettore in modo graduale. Quindi, si consiglia di digerire la spina dorsale vettoriale con SbfI, inserire prima il braccio da 3', quindi digerire il vettore con Sall e inserire il braccio 5' in una seconda reazione di assemblaggio del DNA.

Quando si amplificano i frammenti di PCR per i bracci di omologia, si raccomanda anche di utilizzare DNA genomico C. tracommatis appena purificato che non è stato precedentemente congelato. Questo limita la possibilità di tosatura del DNA e aumenta l'efficienza per generare ampli più grandi. Se amplificando i bracci omologici di un altro vettore, il prodotto PCR purificato dovrà essere trattato come enzima di restrizione DpnI prima di procedere all'assemblaggio del DNA per ridurre le colonie di fondo durante la trasformazione di E. coli.

La trasformazione è un'altra fase critica di questo protocollo in cui possono sorgere problemi. Se la trasformazione con pSUmC 4.0 ha esito positivo, le inclusioni verdi e rosse devono essere visibili per passaggio #3; tuttavia, possono essere take diversi passaggi prima che i trasformatori si arricchiscano. Come altri approcci alla mutagenesi, questo metodo si limita al targeting di geni non essenziali, ma la trasformazione dovrebbe comunque essere facilmente compiuta. Il passaggio a lungo termine dei trasformatori in assenza di scambio allelico, indicato dalla conservazione della fluorescenza rossa, può indicare che la delezione del gene mirato è un evento letale.

Poiché i vettori di trasformazione per C. trachomatis contengono la stessa origine della replicazione del pL2 nativo, non è raro che il plasmide nativo venga curato dopo più passaggi (>5). I geni pgp sui vettori pSUmC sono in un ordine diverso rispetto al pL2 nativo; pertanto, la PCR può essere utilizzata per rilevare la presenza di pL2 in una deformazione isolata amplificando la regione che si estende su pgp7–pgp8. Se il plasmide nativo viene perso in eliminazione finale mutante, dovrà essere reintrodotto prima di condurre studi sullo sviluppo. Il trasferimento genico laterale (LGT) può essere utilizzato per reintrodurre il plasmide pL219.

In molti casi, i mutanti di cancellazione precoce con la cassetta di selezione contengono ancora il plasmide pL2. Abbiamo utilizzato questi ceppi per LGT con successo per reintrodurre pL2 ed evitare la riparazione del gene eliminato. LGT può anche essere utilizzato come metodo secondario per la trasformazione durante l'introduzione di pSU-Cre. In alcuni casi, LGT era più efficiente della trasformazione classica di CaCl2. Nei casi in cui LGT è utilizzato per introdurre pSU-Cre, è importante iniziare con C. trachomatis che esprimono un allele rpoB, che conferisce resistenza rifampin prima dello scambio allelico e l'inserimento della cassetta di selezione spettronomina12,19. Iniziare con i batteri resistenti alla rifampin permette la selezione dopo la co-coltura.

FLAEM consente approcci genetici inversi con la cancellazione mirata di intere sequenze di codifica, rispetto ad altri metodi genetici che si basano sulla mutagenesi casuale o sull'inserimento di sequenze nucleotidiche per ottenere la disgregazione genica. FLAEM è essenzialmente un'estensione di FRAEM, in quanto consente la rimozione della cassetta di selezione ed elimina gli effetti polari indotti da cassette precedentemente osservati. Questo metodo crea anche l'opportunità di generare più delezioni genetiche in un singolo ceppo C. trachomatis.

Le mutazioni multiple possono essere generate attraverso due meccanismi diversi. Nel primo, FLAEM può essere utilizzato per generare una mutazione genica markerless e utilizzato in sequenza per indirizzare un altro gene nello stesso ceppo. Il primo mutante di delezione può essere ritrasformato con il vettore pSUmC 4.0 contenente bracci di omologia specifici per il gene secondario di interesse. In questo caso, il protocollo deve essere ripetuto nello stesso modo della prima delezione e ripetuto più volte per colpire i geni in sequenza. Nel secondo meccanismo, il mutante di delezione senza marcatori isolato dopo FLAEM può essere co-infettato con un mutante di delezione che contiene ancora una cassetta di selezione. Tramite LGT, la seconda eliminazione viene acquisita e può essere selezionata per. Quando si utilizza questo approccio, ulteriori mutazioni sono limitate dal numero di cassette di selezione uniche lasciate nel genoma. Gli antibiotici comunemente usati come pressione selettiva durante la trasformazione sono limitati per la tracommatide C., ma includono penicillina, cloramoficolo e spettronomica. La rimozione della cassetta di selezione mediante l'editing del genoma Cre-loxP riduce la necessità di utilizzare più antibiotici per la pressione selettiva. L'eliminazione di più sequenze geniche contemporaneamente è utile quando si studiano proteine con funzioni correlate o processi biologici che possono avere più giocatori chiave.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Servizio Sanitario Pubblico del National Institute of Health, NIAID (concede A1065530 e Al124649), a K.A. Fields.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Tags

Immunologia e Infezione Numero 155 Ricombinante cremilo FLAEM FRAEM clamidia mutagenesi scambio allelico ricombinazione allelica
Markerless Gene Deletion di Mamicino Scambio Allelicas in <em>Chlamydia trachomatis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keb, G., Fields, K. A. Markerless… More

Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter