Summary
ここで説明する、フラミジア・トラコマティスにおける標的化されたマーカーレス遺伝子欠失の方法であり、フロキサセット対立遺伝子交換変異誘発、FLAEMを用いた。
Abstract
クラミジア・トラコマティスは、歴史的に遺伝的に操作することが困難であった細胞内病原体である。C.トラコマティスが特権的な細胞内ニッチを作成し維持するために使用するメカニズムを解明する上で決定的な進歩は、遺伝的ツールの欠如のために限られている。幸いなことに、最近、遺伝子操作技術のいくつかの新しい進歩がありました。これらの中には、蛍光報告されたアレリック交換変異誘発(FRAEM)の開発がある。この方法は、抗生物質耐性と緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするセレクションカセットの挿入と結合した標的遺伝子欠失を可能にする。下流の遺伝子に対する極性作用の可能性があるため、ポリシストロニックオペロン内の遺伝子を標的とする場合、この戦略への依存は複雑になる可能性があります。フロクサセットアレリック交換変異型(FLAEM)は、ここで説明するプロトコルを、カセット誘発極性の影響を緩和するために開発された。FLAEMは、アレリック交換による標的欠失後の選択カセットを除去するためにCre-loxPゲノム編集を利用する。得られた株は、1つ以上のコード配列のマーカーレス遺伝子欠失を含む。この技術は、遺伝子機能の直接評価を容易にし、C.トラコマティスにおける遺伝子操作のためのツールのレパートリーを拡大する。
Introduction
クラミジア・トラコマティスは、細菌性感染症の主な原因であり、人間の健康に大きな負担を表しています。毎年1億人以上の人々がC.トラコマティス1に感染しています。女性の感染の約70%は、骨盤炎症性疾患、子宮外妊娠、および/または不妊症などの有害な生殖健康への影響にもかかわらず、無症候性である。病気の後遺症は、C.トラコマティス感染によって開始される免疫病理学に直接関連している2.効力のあるワクチンはまだ開発されていません。したがって、細菌の病原性因子および他の細菌遺伝子産物の機能を理解することは、重要かつ緊急の研究課題である。
細胞内細菌として、宿主細胞の侵入、細胞内複製、子孫の放出、および宿主免疫応答の回避は重要なプロセスである。C.トラコマティスは、細胞内発達のために、インクルージョンと呼ぶ、寄生虫膜結合液胞を形成する。この包接および他の多くの重要なプロセスの確立は、III型分泌システム(T3SS)3を介したエフェクタータンパク質の分泌によって達成される。これらの分泌されたエフェクターの機能を解明することは、C.トラコマティスの遺伝的難治性のために長年にわたって制限されていた。大腸菌とは異なり、クラミジアには多くの古典的なクローニング技術は適用されません。いくつかの大きな制限は、変換効率、sacBなどのカウンターセレクションレポーターの欠如、プラスミドのメンテナンスを含みます。大腸菌プラスミドは、一般に複製の起源および適切な選択圧力を有して無期限に維持することができるが、C.トラコマティスプラスミドは、L2セロバー4内の天然pL2プラスミド上に見られる維持のために追加の8つのオープンリーディングフレーム(pgp1-8)を必要とする。
近年、クラミジアのユニークな生物学に対応する複数の遺伝的ツールが生成されていますが、まだ限界5、6、7があります。エチルメタンスルホン酸(EMS)治療による化学変異は、ミスセンス突然変異を導入することができ、または(より少ない頻度で)ヌクレオチド遷移を生じ、ナンセンス突然変異を生じさせる早期停止コドンを導入し得る。トランスポゾン挿入は遺伝子破壊に有効ですが、クラミジアの研究における現在の技術は手間がかかり、時間がかかる9.EMS治療とトランスポゾン変異発生法の両方がランダムな突然変異を生成し、変異株を分離するために厳格なスクリーニング方法を必要とします。グループIIイントロンの挿入によって遺伝子を破壊する方法(例えば、TargeTron)は、指示された変異発生を可能にする。ただし、この方法は効率によって制限され、挿入部位が常に適切に予測されるわけではありません。
蛍光報告された対立遺伝子交換(FRAEM)は、抗生物質耐性および蛍光レポーター11を提供する選択カセットの挿入と相まって標的遺伝子欠失に使用される戦略である。しかし、FRAEMは、特にポリシストロニックオペロン内の遺伝子を標的とする場合、カセット誘発性の極性作用が下流遺伝子に及ぼす可能性によって複雑化する。フロキスカセットアレリック交換変異型(FLAEM)は、FRAEM選択カセット12で以前に観察されたカセット誘発性極性作用を緩和するために開発された新しい遺伝的アプローチである。FLAEMは、Cre-loxPゲノム編集を利用して、選択カセットを除去し、下流遺伝子の発現を回復させます。抗生物質耐性および緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む選択カセットは、横並びのloxP部位で再設計される。これらのloxP部位は、Cre recombinaseの存在下で再結合し、ゲノム13からのカセットの切除をもたらす。この戦略は、欠失12、14のためにtmeAを標的とする場合のカセット誘導極性の影響を緩和することが示されている。
FRAEM法およびFLAEM法は、pgp6の誘導式を通じて条件付きで維持することができる同じ自殺ベクトルpSUmC 4.0を利用する。pgp6の発現は、プラスミド保持に必要であることが以前に示されており、したがってプラスミド維持11、15を制御するために活用される。C.トラコマティスが無水テトラサイクリン(aTc)を加えた培地で増殖してpgp6発現を誘導すると、ベクターは維持される。aTc がない場合、ベクトルは失われます。標的遺伝子欠失は、選択カセットに対する遺伝子の対立遺伝子交換を通じて達成される。標的遺伝子の上流と下流の3kb領域は、組換えのための相同性アームとして機能する。これらの腕は選択カセットに隣接するpSUmC 4.0ベクトルにクローン化される。C.トラコマティス変換と再結合事象の成功は、蛍光報告によって観察される。ベクターバックボーン上のmCherryの発現と選択カセット内のgfpの生成赤と緑の蛍光包括体。培養培地からaTcが除去されると、グリーンのみのインクルージョンは、自殺ベクターの喪失と細菌ゲノムへの選択カセットの統合との正常な組み換え事象を示す。
FLAEMは、新たに作成された変異株へのCreリコンビナーゼ発現ベクターpSU-Creのその後の変換を介してFRAEMの延長を表す。Cre recombinaseは、loxP部位と選択カセットの切除との再結合を容易にする。再結合事象は、蛍光報告を介して示される。pSU-Cre ベクトルはmCherryをコードします。したがって、正常な変換は、gfp-発現インクルージョンに赤蛍光を加えることによって示される。カセットに対する選択的圧力がない場合の培養は、loxP部位でのCre媒介的再結合をもたらし、かつカセットの損失は、赤色のみの含有物によって示される。pSUmC-4.0 と同様に、pGP6の誘導式は条件付きで pSU-Cre を維持するために使用されます。aTcおよび抗生物質の選択が除去されると、プラスミドは硬化し、結果として生じるマーカーレス欠失株は非蛍光である。この方法はカセット誘発性極性効果の問題に取り組む。
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Protocol
1. 対象遺伝子に特異的な相同性アームを用いたpSUmC-4.0の設計と組立
- 同種組換えのための5'および3'相同性アームとして機能する欠失を目的とした遺伝子の上流および下流の~3kb領域を特定する(図1)。
- 1)クラミジアゲノムDNAから3kb 5'ホモロジーアームを増幅し、2)Sall制限酵素部位で消化するとpSUmC-4.0に特異的な15~30 bpのオーバーハングを含むPCRプライマーを1)に設計します。pSUmC-4.0 と重なるプライマー領域の溶融温度が 55 °C、プライマー全体のヘアピン融解温度が <35 °C であることを確認します。
- 1)クラミジアゲノムDNAから3kb 3'相同性アームを増幅するPCRプライマーを設計し、2)SbfI制限酵素部位で消化するとpSUmC-4.0に特異的な15~30 bpのオーバーハングを含む。pSUmC-4.0 と重なるプライマー領域の溶融温度が 55 °C、プライマー全体のヘアピン融解温度が <35 °C であることを確認します。
- DNAアセンブリ反応16の後にpSUmC-4.0ベクターへの各相同性アームの挿入を増幅するPCRスクリーニングプライマーを設計する。これらのプライマーを制限部位の外側にアニーリング〜500 bpに設計し、挿入が失敗した場合でもPCR産物を容易に可視化できるようにしました(図1)。
- PCRにより新たに抽出されたクラミジアゲノムDNAから3kb 5'および3'の相同性アームを1~2回の反応で増幅し、後のDNAアセンブリに十分な断片を生成します。特定の反応セットアップとサイクリング条件については、DNAポリメラーゼメーカーのプロトコルに従ってください。
- 両方の PCR 産物のサイズが正しいこと、および反応に汚染バンドが含まれていないことを確認します。1%のDNAアガロースゲルで各PCR反応の5μLを実行します。
- フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿によりPCR断片を精製し濃縮します。
- 1.5 mLチューブで3'PCR反応をすべてプールし、ヌクレアーゼフリーのH2Oで最終体積200μLに持ち込み、5'PCR反応のためにこのプロセスを繰り返します。
- 30~60秒のチューブと渦に200μLのフェノールを加え、各チューブをマイクロ遠心分離機(21,000 x g)で室温(RT)で20分間回転させます。
- 各チューブの水相最上層を新しい1.5mLチューブに移し、各チューブに3M酢酸ナトリウムの体積の10分の1を加え、次いでフリックして混ぜます。
- 各チューブに100%エタノールの3巻を加え、混ぜ合わせます。両管を-80°Cで20分間インキュベートします。
- RTで5分間>21,000 x gで各チューブを紡いでDNAをペレット化します。
- 70%エタノールの100μLでDNAペレットを洗浄します。RTで5分間>21,000 x gで各チューブを回転させます。
- 100%エタノールの100μLで再びDNAペレットを洗浄します。RTで5分間>21,000で各チューブを回転させ、上清を捨てます。
- ペレットを完全に空気乾燥させ、その後、混合するためにフリックすることによってヌクレアーゼフリーのH2Oの12 μLでDNAを穏やかに再懸濁させます。
- 製造のプロトコルに従って、Sallの1単位およびSbfIの1つの単位との20 μLの反応でpSUmC-4.0のベクトルの500 ngを消化する。約3時間または一晩反応をインキュベートして、ベクターの完全な消化を確実にする。
- フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿(ステップ1.7.1~1.7.9)により消化した骨格を精製し濃縮します。
- 消化された pSUmC-4.0 ベクターと 5' および 3' の相同性アーム PCR 製品を、0.01 pMol pSUmC-4.0 ~ 0.09 pmol の各相同アームの比率で組み合わせます。製造のプロトコルに従ってDNAアセンブリ反応で断片を組み立てます。
- DNAアセンブリ反応の1 μLで電気管大腸菌の50μLを変換します。1プレートあたり150 μLを広げる100 μg/mLスペクチノマイシンを含むLB寒天プレートに、形質転換大腸菌をプレートします。プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。
- 翌日、蛍光上転向顕微鏡を用いて緑色および赤色蛍光のスクリーンコロニーをスクリーニングした。寒天板1個につき合計5~30個のコロニーが予想される。
- 5~10個のコロニーを選び、100μg/mLのスペクチノマイシンを補充したLBブロス4mLを接種します。250rpmで振とうとともに一晩37°Cで培養物をインキュベートする。
- 一晩の大腸菌培養物を用いて、小規模なDNA精製を行う。ヌクレアーゼフリーH2Oの50 μLでDNAを溶出させる。
- PCR スクリーニングプライマー(ステップ 1.4 で設計)を使用して各々の相同性アームをpSUmC-4.0ベクターに挿入し、各挿入を増幅します。DNAアセンブリが成功した場合、5'および3'アーム領域の両方の1%のDNAアガロースゲルで〜4kbのPCR産物を観察する必要があります。~1 kb の PCR 産物は、挿入の欠如を示します。
注: 二重フラグメントアセンブリ反応で相同性アームの挿入が失敗した場合は、2つのアセンブリリアクションを実行して、5'アーム、3'アームを個別に挿入します。5'アームで組み立てる前に、Sallだけでベクトルを消化し、SbfIでベクトルを消化して3'アームを組み立てます。 - 変換ダム-/dcm-両方の相同性アームで組み立てられたpSUmc-4.0の200 ngを持つ有能な大腸菌。プレートあたり25 μLを広げる100 μg/mLスペクチノマイシンを含むLB寒天プレートに形質転換細菌をプレートします。プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。合計20~200のコロニーが予想されます。
- ステップ 1.13 で説明したように、赤と緑の蛍光コロニーのプレートをスクリーニングします。
- 赤と緑のコロニーを持つ100 μg/mLのスペクチノマイシンを含むLBスープ100mLを接種して、大規模なDNA精製のための培養液を設定します。250rpmで振とうして一晩37°Cで培養液をインキュベートする。
- 大規模なDNA精製を用いて培養を収穫し、DNAを精製する。
- 精製したプラスミドDNAをNF-H2Oの100μLに再懸濁する。少なくとも2μg/μLの全DNA収率は、C.トラコマティス変換に最適です。
- C. トラコマティスを変換する前に、5' および 3' の相同性アーム領域をシーケンスして正しいアセンブリを pSUmC-4.0 に変換します。
2. pSUmC 4.0 + アレリック交換による遺伝子欠失のための相同性アームズによるC.トラコマティスの変態
- 種子マッコイ細胞は、クラミジアを培養するために標準的に使用されるマウス線維芽細胞を、成長培地#1を用いて2つの6ウェルプレート(1 x 106細胞/ウェル)にする。単層がコンフルエントになるまで5%のCO2で37°Cでプレートをインキュベートします(約24時間)。
- 1.5 mLチューブで、2のMOIで6ウェルプレートの12ウェルに感染するのに十分であるC.トラコマティスWTセロバーL2素体(EB)の体積を追加します。30 分の 20,000 x gで EJB をペレットし、上清を破棄します。
- CaCl2バッファーの600μLでEJBを静かに再サスペンディングし、24 μgのpSUmC-4.0 + 相同性アームをチューブに加えてクラミジア変換を開始します。フリックして溶液をそっと混ぜます。RTforでチューブを30分でインキュベートし、10分ごとに混ぜるようにフリックします。
- ハンクスのバランスの取れた塩溶液(HBSS)の24 mLに変換液を加え、穏やかにピペッティングして混合します。接種の2 mLを6つのウェルプレートの各ウェルにコンフルエントマッコイ細胞の各ウェルに移し、20°Cで1時間900xgで遠心分離によって感染する。
- 接種を取り外し、2 mL/well RPMI成長メディア#2に置き換えます。プレートを5%CO2で37°Cでインキュベートします。
- 7 時間以上を経過しても 12 時間を超え、メディアを選択メディア #1の 2 mL/ウェルに置き換えます。感染時から48時間、37°Cでインキュベーションを続ける。
- 収穫し、マッコイ細胞の新鮮な単一層に細菌を通過します。
- セルスクレーパーを使用して、マッコイ単層をそっと削り取り、細胞をメディアに持ち上げます。各ウェルから2 mLチューブに材料を移します。4 °Cで30分間の微小遠心分離機で、細胞材料を20,000 x gでペレット化します。
- 上清を取り除き、廃棄します。穏やかにピペッティングして、1 mLのHBSSで細胞ペレットを再懸濁する。
- 細胞の破片を4°Cで5分間200 x gでペレット化する。上清をコンフルエントマッコイ細胞の新鮮な井戸に移します。2 mL/ウェルの総体積に対して、各ウェルに1 mLのHBSSを追加します。
- 20°Cで1時間900xgで遠心分離により感染する。感染直後の#1、接種を選択媒体に置き換えます。
- 赤と緑の含まれていることが感染後24時間の上蛍光顕微鏡(24hpi)を使用して検出されるまで、3つ以上の通路のためにマッコイ細胞の新鮮な単層(セクション2.7)に細菌を受け継ぎ続けます。
- 赤と緑の含まれていることが検出されたら、選択メディア#2を使用して単層(セクション2.7)を通過し続けます。
- 緑色のみの含まれる物が検出されるまで単層を通過し続ける 24 hpi (通過#3以降) これは、pSUmC-4.0ベクターの損失と、ゲノム中へのloxP選択カセットの取り込みを示す。
- パスエイジングによって豊かにする緑のみのインクルージョンの1つの井戸を選択してください。収穫し、また、スクロース- リン酸グルタミン酸バッファー (SPG) に緑のみの含む含む含むを含む他の井戸を凍結します。
- 緑のみの含まれる物を濃縮するには、ステップ2.7で行われた6ウェルプレートの1つのウェルから単層を通過させますが、細胞の破片をペレット化した後(ステップ2.7.3)、上清を12 mLのHBSSで円錐状に移します。この接種を使用して、ウェルあたり2 mLを加えて2つの6ウェルプレートに感染させ、20°Cで60分間900 x gでプレートを回転させます。
- 追加の井戸を凍結するには、ステップ2.7.1のように単層を収穫しますが、HBSSの代わりにSPGの1 mLでペレットを再懸濁します。細胞の破片(ステップ2.7.3)をペレットし、上清を1.5mLのクライオチューブに移します。材料を-80°Cで凍結します。
- 緑のみのインクルージョンを 0.5 ~ 1.0 (検出後に 1 ~ 2 箇所) に濃縮した後、ステップ 2.11.2 で説明されているように、単層を SPG に収穫します。1.5 mLのチューブで50μLのアリコートを取得し、-80°Cで凍結します。
- 標準滴定プロトコル17に従って、封入、形成単位/μLを決定するティターグリーンのみの細菌。
3. 限定希釈によるloxPフランクセレクションカセットを含む緑のみのC.トラコマティス欠失変異のクローナル分離
- 成長培地#1に、McCoy細胞50μL~2,000個の細胞/井戸を用いて384ウェル組織培養プレートを播種します。〜24時間またはコンフルエントまで5%のCO2で37°Cでインキュベートします。
- HBSSで緑のみの細菌のアリコートを希釈して、20mLあたり50個のEBを達成します。希釈した接種を貯水トレイに移します。
- プレート全体を廃棄物容器にしっかりと向けてフリックして、384ウェルプレートからメディアを取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50μLのC.トラコマチス接種を加えます。20°Cで1時間900xgで遠心分離により感染する。
メモ:単層が取り外されるほど強くフリックしないように注意してください。細胞が過剰にコンフルエントであれば、より簡単に切り離されます。
- プレート全体を廃棄物容器にしっかりと向けてフリックして、384ウェルプレートからメディアを取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50μLのC.トラコマチス接種を加えます。20°Cで1時間900xgで遠心分離により感染する。
- フリックで接種を取り外し、50 μL/ウェル成長メディア#2で交換します。5%CO2で 37 °C でプレートをインキュベートします。
注:この段階では、ゲノムへの選択カセットの統合は安定しているので、スペクチノマイシンを用いた抗生物質の選択は不要になりました。 - プレートを5~12日間インキュベートした後、蛍光の反転顕微鏡または高含量スクリーニングプラットフォームを使用して、緑色蛍光包接物を用いて個々のウェルを同定します。
- p-10チップで単層を削り、井戸の内容物全体を2 mLのHBSSを含むチューブに移すことによって、緑色のみのインクルージョンで井戸を収穫します。2 mLの接種を穏やかに混ぜ合わせ、感染用の6ウェルプレートの新鮮なコンフルエントマッコイ単層に塗布します。
注: 包含を持つ個々のウェルを識別する場合、最初の包含からの拡張により、包含がクラスター内に含まれます。ウェルに複数のクラスターがある場合、複数の EB が最初にこの井戸に感染した可能性があります。これらの井戸は収穫されるべきではなく、場合によっては、連続希釈によるクローン分離の複数のラウンドが必要な場合があります。 - 20°Cで1時間900xgで遠心分離することにより6ウェルプレートに感染する。接種を2 mL/ウェル成長メディア#2に交換します。48時間5%のCO2で37°Cでインキュベート。
- 手順 2.11 ~ 2.13 を繰り返して、クローンの集団を強化、フリーズ、および強化します。
- 先に説明したように、qPCRを用いてクローン分離されたC.トラコマティスから標的遺伝子の欠失を確認する。
4. pSU-Creを用いたC.トラコマティスFRAEM変異体の変換により、loxPフランクセレクションカセットの除去を開始
- 前に説明した 6 ウェルプレート(ステップ 2.1~2.8)で、クローン分離されたC.トラコマティスFRAEM変異体、pSU-Cre ベクター、選択メディア#3を使用して、変換プロセスを繰り返します。
注: 正常な変換は、赤と緑の蛍光を含めることによって示されます。- 赤のみのインクルージョンが検出されるまで単層を通行するには、蛍光上転覆顕微鏡を用いて、選択カセット(2〜3本の通路)の喪失を示す。赤のみの包含が~0.5のMOIに富むまで、単層の通過を続けます。
- 前に説明した 384 ウェルプレートの希釈を制限することにより、赤のみのインクルージョンを限定します(ステップ 3.1~3.8)。ただし、すべてのステップに対して選択メディア #3を使用してください。
- MOI 0.1まで通過することによってクローン集団を豊かにする。一旦濃縮されたら、pSU-Creベクター(約3〜4節)の損失を開始するために、#2成長培地でセクションメディアを交換します。
- 非蛍光菌をクローン分離する(ステップ3.1~3.8);ただし、明視野顕微鏡でプレートを手動でスキャンして、インクルージョンを検出します。細菌を濃縮し、凍結する(ステップ2.11–2.12)。
- 定量的リアルタイムPCRを用いた変異株のスクリーン、ウェスタンブロッティング、および全ゲノムDNAシーケンシング(12)。
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Representative Results
FLAEMを用いたC.トラコマティスにおけるマーカーレス遺伝子欠失の方法は、慎重なクローニングおよび形質転換技術に依存する。成功したアレル酸再結合は、重要な第一歩であり、pSUmC-4.0クローニングベクターへの相同性アームの同定と挿入を必要とします(図1)。マーカーレス遺伝子欠失のための必須の第2のステップは、Cre-loxゲノム編集による蛍光レポーターおよび抗生物質選択カセットの除去であり、図2に表される。これらの各手順を実行するために使用するベクトルは、図 3に示されています。図4は、野生型C.トラコマティスで始まる時にマーカーレス欠失変異体を生成する変換戦略の概略図を示す。
代表的なデータは、tmeAが遺伝子欠失を目的とする図5および図6に示されている。C. トラコマティス tmeA欠失株は FRAEM を使用して生成され、C. トラコマチス tmeA-lx株は FLAEM を使用して生成されます。両方の変異株は、tmeA遺伝子座の欠失を含む;しかし、図5に示すgfp DNAの不在によって示されるように、tmeA-lxは選択カセットを含んでいない。tmeA変異株はtmeBの発現が減少しており、図6にmRNAおよびタンパク質レベルによって示されている。FLAEMがtmeA−lx変異株を生成するために利用されるとき、図6はtmeBの発現が回復したことを示す。
図1:ゲノムDNAから5'および3'の相同性アームを同定するための模式図と、pSUmC-4.0への挿入のためのPCRスクリーニング。(A)C.トラコマティスゲノムからの欠失を目的とする遺伝子は青色の矢印で表される。アレル酸再結合のための5'および3'相同性の腕として識別される3つのkbの領域は、それぞれ紫と赤で括弧で囲まれています。(B,C)pSUmC-4.0への5'および3'相同性アームの挿入はPCRスクリーニングによって決定される。SallおよびSbfl制限酵素部位は、pSUmC-4.0ベクター上のloxP部位(黄色の正方形)によって横たわっているaadA(黒い矢印)およびgfp(緑色の矢印)選択カセットに隣接して示されている。(B)5' スクリーニングプライマー (紫色の矢印ヘッド) を使用して Sall サイト全体で PCR 増幅を行うとき、または 3' スクリーニングプライマー (赤い矢印ヘッド) を使用して SbfI サイト全体に増幅する場合、挿入は 1 kb PCR 産物によって決定されません。(C) 正常な挿入は、同じ条件下で 3 kb PCR 産物によって決定されます。5' と 3' の相同性の腕は、それぞれ紫と赤の括弧で表されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:cre-loxを媒介した組換えの模式表現がgfp-aadA選択カセットを除去する。Cre recombinaseの存在下で、loxP部位(黄色)は再結合し、gfp-aadA選択カセット(緑および黒の正方形)の切除をもたらす。得られた軌跡は、残りの1つのloxP瘢痕配列を含む示されている。アップストリーム(米国)と下流(DS)の領域はグレーで表示されます。この図は Keb ら12から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: pSUmC-4.0およびpSU-CREの遺伝的組織C.トラコマティスにおけるベクターの制御可能な維持のために、pgp6はテトラサイクリン誘導性プロモーターの下流で設計される。残りのpgp遺伝子は、そのネイティブクラミジアプロモーターの下流にあり、mCherryは両方のベクター上で構成的に発現される。(a)pSUmC-4.0は、それぞれ抗生物質および蛍光選択能力に対して構成的に発現したaadAおよびgfp遺伝子をコードするカセットを含む。CreのLoxP部位は、遺伝子特異的相同性アームの挿入のための制限酵素部位と同様に、選択カセットを横切る。(B) pSU-CRE には、pSUmC-4.0 と同様のバックボーンが含まれています。しかし、組換えカセットの代わりに、blaMおよびcreはそれぞれ抗生物質選択性およびCREリコンビナーゼ生成のために構成的に発現している。これらの数値は Keb ら12から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:マーカーレス欠失変異体の作成に使用されるFLAEM変換戦略の模式図。一般的なFLAEM法は、ここでは、野生型C.トラコマティスが順次変換され、マーカーレス欠失変異体を生成するために連続的に継代される場所に表される。形質転換ステップは小さな矢印の加算によって表され、遺伝的要素の喪失は小さな矢印の減算によって表される。C. トラコマティス中間体(円)は、抗生物質感受性(ペニシリン耐性またはペニシリン感受性=PenGrまたはPenGs;スペチノマイシン耐性またはスペクチノマイシン感受性=スペックrまたはスペックs)および蛍光性特性(緑= gfp +、赤= mCherry+、灰色=蛍光不全)で表される。各ステップにおける遺伝子遺伝子軌跡の概略的な表現を以下に示す。この図は Keb ら12から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:FRAEMおよびFLAEMは、tmeA遺伝子欠失を生成するために使用される。(A) FRAEM はtmeAの生成に使用され、FRAEM はtmeA-lxの生成に使用されました。tmeAおよび下流tmeBの相対DNAコピー数;pSUmC-4.0選択カセットに含まれるgfp;そして、pSU-CREベクトルに含まれるcreがすべて示されている。MCCoy細胞は、WT、L2 tmeA、またはL2RiftmeA-lx C.トラコマティスの等しい包接形成単位で感染し、24hpiで採取し、DNAをqPCRについて抽出した。相対コピー数は、クラミジア16sRNAに対するシグナル正常化によって評価された。ND = 何も検出されませんでした。(B) L2RiftmeA-lxからの配列化されたtmeAB遺伝子座は、残りのloxP瘢痕配列 (下線付き) で示されます。DNAの隣接領域は青色で示され、開始コドンは緑色で示され、TmeAストップコドンは赤色で示される。TmeBの非正規開始コドンも描かれています。これらの数値は Keb ら12から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:FLAEMを用いたセレクションカセットの切除は、tmeAを標的とする際にtmeBの発現を回復させ、下流遺伝子を破壊しない。(A)C.トラコマティスtmeAおよびtmeB変異株の相対mRNAレベル。tmeAの下流の転写産物の存在は、逆転写酵素(RT)定量PCRによって決定した。tmeA/Bオペロンの直下流の領域はct696をコードします。総RNAは、WT、L2tmeA、L2 tmeB、またはL2RiftmeA-lxを有するMOIで感染したマッコイ細胞から24hpiで単離された。 tmeA 、tmeB、およびct696のトランスクリプトは qRT-PCR によって検出されました。信号はrpoDに正規化した後に提示されます。ND = 何も検出されませんでした。(B) C. トラコマティス変異株における TmeA および TmeB の存在に関するウェスタンブロット。WT、L2 tmeA、L2RiftmeA-lx、または L2RiftmeA-lx ptmeA の等しい封入形成単位に感染した24のhpi培養物からの同じ量の全培養物質を、TmeAおよびTmeBの免疫ブロットで調査した。Hsp60をローディングコントロールとして使用し、化学発光によりタンパク質を可視化した。図は Keb ら12から変更されました。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
FLAEMによるC.トラコマティスにおけるマーカーレス遺伝子欠失の発生に関してここで説明するプロトコルは、非必須遺伝子の標的欠失を可能にし、カセット誘発性極性作用を排除する。このプロトコルは、pSUmC 4.0自殺ベクターに挿入された5'および3'の相同性アームの慎重な設計、C.トラコマティスの効率的な変換、および分離された変異株の慎重なスクリーニングに依存する。この方法によるゲノム解析が成功すると、非蛍光性の細菌が、標的遺伝子欠失部位に単一のloxP瘢痕配列を含む。さらに、この方法は、同じC.トラコマティス株内の遺伝子の逐次標的化に適応される可能性を有する。
5' と 3' の相同性の腕と自殺のベクトルへの挿入の慎重な設計はクローニングプロセスの最初の、最も重大なステップである。3 kb の相同性アームが最も効率的なアレルの組換えを提供することが分かってきました。これらの武器の挿入は、大きく、時には作業が困難なベクトルを生成しますが、より短い腕で成功が少なく、成功のための最小値を表す〜2 kbです。SallおよびSbflの制限の場所の利用はDNAアセンブリを行うときの便利な一段階の構造の反作用を提供する。
挿入 PCR などの他のクローニング方法も、相同性アームの挿入に有効であったが、PCR ベースのエラーの可能性が高い。興味深いことに、5'アームのクローニングは3'アームよりも比較的効率的である。問題が発生した場合は、DNAアセンブリを2つの反応に分割し、段階的にベクターを構築することをお勧めします。次に、SbfIでベクターバックボーンを消化し、最初に3'アームを挿入し、次にSallでベクターを消化し、第2のDNAアセンブリ反応で5'アームを挿入することをお勧めします。
相同性アームのPCR断片を増幅する場合、これまで凍結されていない新たに精製されたC.トラコマティスゲノムDNAを使用することも推奨されます。これにより、DNA剪断の可能性が制限され、より大きなアンプリコンを生成するための効率が向上します。別のベクターから相同性アームを増幅する場合、精製されたPCR産物は、大腸菌形質転換中のバックグラウンドコロニーを減少させるためにDNAアセンブリに進む前に処理されるDpnI制限酵素である必要があります。
変換は、問題が発生する可能性があるこのプロトコルのもう一つの重要なステップです。pSUmC 4.0 による変換が成功した場合、#3の一節で緑と赤の包含が表示されます。しかし、形質転換体が濃縮されるまでにはさらにいくつかの箇所を要する可能性があります。他の変異型のアプローチと同様に、この方法は、非本質的な遺伝子の標的化に限定されるが、まだ容易に形質転換を達成すべきである。アレリック交換の不在時の形質転換体の長期経過は、赤色蛍光の保持によって示され、標的遺伝子の欠失が致死的事象であることを示し得る。
C. trachomatisの変換ベクターには、ネイティブ pL2 と同じ複製の起点が含まれているため、複数の (>5) の通路の後にネイティブ プラスミドが硬化することは珍しくありません。pSUmCベクター上のpgp遺伝子は、天然pL2と比較して異なる順序である。したがって、PCRはpgp7–pgp8に及ぶ領域を増幅することによって、単離株におけるpL2の存在を検出するために使用することができる。最終的な欠失変異体で天然プラスミドが失われた場合、発達研究を行う前に再導入する必要があります。横型遺伝子導入(LGT)は、pL2プラスミド19を再導入するために利用され得る。
多くの場合、選択カセットを有する早期欠失変異体は、依然としてpL2プラスミドを含有している。これらの菌株をLGTに活用し、pL2を再導入し、削除した遺伝子の修復を回避することに成功しました。LGTは、pSU-Creを導入する際の二次的な変換方法としても利用できる。いくつかのケースでは、LGTは古典的なCaCl2変換よりも効率的でした。LGTがpSU-Creを導入するために利用されている場合には、rpoBアレを発現するC.トラコマティスから始める事が重要であり、これは、スペクトルの交換およびスペクチノマイシン選択カセットの挿入前にリパンピン抵抗を与える12、19である。リパンポン耐性菌から始まり、共培養後の選択が可能となる。
FLAEMは、遺伝子破壊を達成するためにランダムな突然変異またはヌクレオチド配列の挿入に依存する他の遺伝的方法と比較して、コード配列全体の標的欠失を伴う逆遺伝的アプローチを可能にする。FLAEMは、選択カセットの除去を可能にし、以前に観察されたカセット誘発極性の影響を排除するので、本質的にFRAEMの延長である。この方法はまた、単一のC.トラコマティス株で複数の遺伝子欠失を生成する機会を作り出す。
複数の突然変異は、2つの異なるメカニズムを介して生成することができる。第1に、FLAEMはマーカーレス遺伝子変異を生成するために使用され、同じ株の別の遺伝子を標的にするために逐次的に使用することができる。第1の欠失変異体は、目的とする二次遺伝子に特異的な相同性アームズを含むpSUmC 4.0ベクターで再形転換することができる。この場合、プロトコルは、最初の欠失と同様に繰り返し、遺伝子を順次に標的にするために複数回繰り返す必要がある。第2のメカニズムでは、FLAEM後に分離されたマーカーレス欠失変異体は、選択カセットをまだ含む欠失変異体と共感染させることができる。LGTを通じて、2番目の削除が取得され、選択することができます。このアプローチを使用する場合、追加の突然変異は、ゲノムに残されたユニークな選択カセットの数によって制限される。変換中に選択的圧力として使用される一般的に使用される抗生物質は、C.トラコマティスに限られますが、ペニシリン、クロラムフェニコール、およびスペクチノマイシンが含まれます。Cre-loxPゲノム編集によって選択カセットを除去することで、選択的圧力に複数の抗生物質を使用する必要性が減少します。複数の遺伝子配列を同時に削除することは、関連する機能を持つタンパク質や複数の主要なプレーヤーを持つ可能性のある生物学的プロセスを研究する場合に有益です。
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Disclosures
著者らは開示する利益相反はない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(助成金A1065530とAl124649)からK.A.フィールズへの公衆衛生サービス助成金によって支えられていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam-/dcm- Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
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