Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Markerless Gene Sletning af Floxed Kassette Allelic Exchange Mutagenesis i Klamydia trachomatis

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60848
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

Beskrevet her er en metode til målrettet, markørløs gensletning i Klamydia trachomatis ved hjælp af floxed kassette allelic udveksling mutagenese, FLAEM.

Abstract

Klamydia trachomatis er en forpligte intracellulær patogen, der har været historisk vanskeligt at genmanipulere. De endelige fremskridt med hensyn til at belyse de mekanismer, som C. trachomatis bruger til at skabe og opretholde en privilegeret intracellulær niche, har været begrænsede på grund af mangel på genetiske værktøjer. Heldigvis har der for nylig været flere nye fremskridt inden for genetiske manipulationteknikker. Blandt disse er udviklingen af fluorescensrapporterede allelic udveksling mutagenese (FRAEM). Denne metode giver mulighed for målrettet gensletning kombineret med indsættelse af en udvælgelsekassette kodning antibiotikaresistens og grøn fluorescerende protein (GFP). Afhængighed af denne strategi kan være kompliceret, når de målretter mod gener inden for polycistroniske operoner på grund af potentialet i polære virkninger på downstream-gener. Floxed kassette allelic udveksling mutagenese (FLAEM), protokollen for hvilken er beskrevet her, blev udviklet til at lindre kassette-induceret polareffekter. FLAEM udnytter Cre-loxP genom redigering for at fjerne udvælgelsen kassette efter målrettet sletning ved allelic udveksling. De resulterende stammer indeholder markørløse gensletninger af en eller flere kodningssekvenser. Denne teknik letter direkte vurdering af genfunktion og udvider repertoiret af værktøjer til genetisk manipulation i C. trachomatis.

Introduction

Klamydia trachomatis er den hyppigste årsag til bakteriel seksuelt overførte sygdomme og udgør en betydelig byrde for menneskers sundhed. Over 100 millioner mennesker er smittet hvert år med C. trachomatis1. Ca. 70% af infektioner hos kvinder er asymptomatisk på trods af skadelige reproduktive sundhedsmæssige virkninger, såsom underlivsbetændelse, graviditet uden for livmoderen, og/ eller infertilitet. Sygdomsequela er direkte relateret til immunpatologi initieret af C. trachomatis infektion2. En effektiv vaccine er endnu ikke udviklet; Derfor er forståelse af funktionen af bakterielle virulens faktorer og andre bakterielle genprodukter et vigtigt og presserende forskningsspørgsmål.

Som intracellulære bakterier, vært celle invasion, intracellulære replikation, frigivelse af afkom, og unddragelse af vært immunologiske reaktioner er kritiske processer. C. trachomatis danner en parasitophorous membran bundet vacuole, kaldes en optagelse, for intracellulære udvikling. Etablering af inklusion og mange andre kritiske processer opnås ved udskillelse af effektorproteiner via et type III-sekreionssystem (T3SS)3. Det var i mange år begrænset at belyse disse udskillede effektorers funktioner på grund af C. trachomatis'genetiske uhåndterlighed. I modsætning til E. coligælder mange klassiske kloningsteknikker ikke for Klamydia. Et par store begrænsninger indebærer transformation effektivitet, mangel på kontravalg journalister såsom sacB, og plasmid vedligeholdelse. Mens E. coli plasmider generelt kan holdes på ubestemt tid med en oprindelse af replikation og passende selektivt tryk, C. trachomatis plasmids kræver yderligere otte åbne læserammer(pgp1-8) for vedligeholdelse, der findes på den indfødte pL2 plasmid i L2 serovar4.

I de seneste år har der været flere genetiske værktøjer genereret, der rummer Klamydia unikke biologi, men der er stadig begrænsninger5,6,7. Kemisk mutagenese ved ethyl metanulfonat (EMS) behandling kan indføre missense mutationer, eller (mindre hyppigt) kan resultere i nukleotid overgange indføre en for tidlig stop codon til at give en nonsens mutation8. Transposon indsættelse er effektiv til genforstyrrelser, men den nuværende teknologi i Klamydia forskning er besværlig og tidskrævende9. Både EMS behandling og transposon mutagenesis teknikker generere tilfældige mutationer og kræver strenge screening metoder til at isolere mutant stammer. En metode til at forstyrre gener ved indsættelse af gruppe II introner (f.eks TargeTron) giver mulighed for rettet mutagenesis; Denne metode er dog begrænset af effektivitet, og indsætningsstedet er ikke altid korrekt forudsagt10.

Fluorescensrapporterede allelic udveksling mutagenese (FRAEM) er en strategi, der anvendes til målrettet gensletning kombineret med indsættelse af en udvælgelse kassette giver antibiotikaresistens og en fluorescens reporter11. Men FRAEM kompliceres af potentialet i kassette-induceret polareffekter på downstream gener, især når de målretter gener inden for polycistronic operons. Floxed kassette allelic udveksling mutagenese (FLAEM) er en ny genetisk tilgang udviklet til at lindre kassette-induceret polære virkninger tidligere observeret med FRAEM udvælgelse kassette12. FLAEM udnytter Cre-loxP genom redigering for at fjerne udvælgelsen kassette og genoprette udtryk for downstream gener. Den udvælgelse kassette, der indeholder antibiotikaresistens og grønne fluorescerende protein (GFP) er reengineered med flankerende loxP sites. Disse loxP steder kan rekombinere i overværelse af Cre rekombinase og resultere i excision af kassetten fra genomet13. Denne strategi har vist sig at afhjælpe kassetteinducerede polære effekter , når tmeA målrettes med henblik på sletning12,14.

Både FRAEM og FLAEM metoder udnytte den samme selvmord vektor, pSUmC 4,0, som kan konditioneres gennem utilgængelige udtryk for pgp6. Udtryk for pgp6 har tidligere vist sig at være nødvendigt for plasmid fastholdelse og er derfor gearet til at kontrollere plasmid vedligeholdelse11,15. Når C. trachomatis dyrkes i medier suppleret med vandfri tetracyklin (aTc) for at fremkalde pgp6 udtryk, vektoren opretholdes. I mangel af aTc, er vektoren tabt. Målrettet gensletning opnås gennem allelic udveksling af genet til udvælgelsekassetten. De 3 kb regioner direkte opstrøms og nedstrøms for det målrettede gen tjene som homology arme til rekombination. Disse arme er klonet ind i pSUmC 4.0 vektor flankerende udvælgelsekassetten. Vellykket C. trachomatis transformation og rekombination begivenheder observeres gennem fluorescens rapportering. Udtryk for mCherry på vektoren rygrad og gfp i udvælgelsen kassette udbytte rød og grøn fluorescerende indeslutninger. Når aTc er fjernet fra kulturmedier, green-only indeslutninger indikerer en vellykket rekombination begivenheder med tabet af selvmord vektor og integration af udvælgelsen kassette i bakteriel genom.

FLAEM repræsenterer en forlængelse af FRAEM gennem efterfølgende omdannelse af en Cre rekombinase-udtrykkende vektor, pSU-Cre, i den nyoprettede mutant stamme. Cre rekombinase letter rekombination mellem loxP steder og excision af udvælgelsen kassette. Rekombinationshændelser er angivet via fluorescensrapportering. PSU-Cre vektor koder mCherry; Således er en vellykket transformation angivet ved tilsætning af rød fluorescens til gfp-udtrykkeindeslutninger. Dyrkning i mangel af selektivt tryk på kassetten resulterer i en sammenkættet rekombination på loxP-stederne, og tab af kassetten angives med ikke-omfattende indeslutninger. Som med pSUmC-4.0, utilgængelig udtryk for pgp6 bruges til betinget at opretholde pSU-Cre. Når aTc og antibiotika udvælgelse er fjernet, plasmid er helbredt, og den resulterende markørløs sletning stamme er nonfluorescerende. Denne metode omhandler spørgsmålet om kassette-induceret polareffekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og samling af pSUmC-4.0 med Homology Arms Specific to the Gene of Interest

  1. Identificer ~3 kb-regioner direkte opstrøms og nedstrøms for det gen, der er beregnet til sletning, der skal fungere som 5' og 3' homologiarme til homolog rekombination (figur 1).
  2. Design PCR primere til 1) forstærke 3 kb 5 'homology arm fra klamydial genomisk DNA og 2) indeholder en 15-30 bp udhæng er specifikke for pSUmC-4.0, når fordøjet på Sall begrænsning enzym site. Sørg for, at de primerområder, der overlapper pSUmC-4.0, har smeltetemperaturer på 55 °C, og at smeltetemperaturer ne for hele primeren er <35 °C.
  3. Design PCR primere til 1) forstærke 3 kb 3 'homology arm fra klamydial genomisk DNA og 2) indeholder en 15-30 bp udhæng er specifikke for pSUmC-4.0, når fordøjet på SbfI begrænsning enzym site. Sørg for, at de primerområder, der overlapper pSUmC-4.0, har smeltetemperaturer på 55 °C, og at smeltetemperaturer ne for hele primeren er <35 °C.
  4. Design PCR screening primere, der vil forstærke indsættelsen af hver homology arm i pSUmC-4.0 vektor efter en DNA-samling reaktion16. Design disse primere til anneal ~ 500 bp uden for begrænsning websteder for at give nem visualisering af et PCR produkt, selv om indsættelsen mislykkedes (Figur 1).
  5. Forstærke 3 kb 5' og 3' homologiarme fra friskudvundet klamydial genomisk DNA fra PCR i en til to reaktioner til at give nok fragment til senere DNA-samling. Følg DNA-polymeraseproducentens protokol for specifikke reaktionsopsætnings- og cykelforhold.
  6. Kontroller, at begge PCR-produkter har den korrekte størrelse, og at reaktionerne ikke indeholder forurenende bånd. Kør 5 μL af hver PCR reaktion på en 1% DNA agarose gel.
  7. Udkæd og centrer PCR-fragmenterne ved fenol/chloroformekstraktion og ethanoludfældning.
    1. Saml alle 3' PCR-reaktioner sammen i et 1,5 ml rør, og bring til et slutvolumen på 200 μL med nuclease-fri H2O. Gentag denne proces for 5' PCR-reaktioner.
    2. Tilsæt 200 μL phenol til hvert rør og vortex i 30-60 s. Spin hvert rør i en mikrocentrifuge ved >21.000 x g i 20 min ved stuetemperatur (RT).
    3. Overfør det vandige faseøverste lag af hvert rør til et nyt 1,5 ml rør, tilsæt en tiendedel af mængden af 3 M natriumacetat til hvert rør, og svip derefter for at blande.
    4. Tilsæt 3 mængder 100% ethanol til hvert rør og svirp til at blande. Inkuber begge rør ved -80 °C i 20 min.
    5. Pellet DNA ved at dreje hvert rør på > 21,000 x g i 5 min på RT. Kassér supernatant.
    6. DNA-pellet med 100 μL ethanol på 70 %. Spin hvert rør på > 21.000 x g i 5 min på RT. Kassér supernatanten.
    7. Vask DNA-pellet igen med 100 μL 100% ethanol. Spin hvert rør på > 21.000 i 5 min på RT. Kassér supernatantet.
    8. Lad pelleten være helt lufttørre, og ophæng derefter forsigtigt DNA'et i 12 μL nuclease-fri H2O ved at svippe for at blande.
  8. Fordøje 500 ng pSUmC-4.0 vektor i en 20 μL reaktion med 1 enhed Sall og 1 enhed af SbfI i henhold til fremstillingens protokol. Inkuber reaktionen i ca. 3 timer eller natten over for at sikre fuldstændig fordøjelse af vektoren.
  9. Rens og koncentrer den fordøjede rygrad ved phenol/chloroform ekstraktion og ethanol nedbør som beskrevet tidligere (trin 1.7.1-1.7.9).
  10. Kombiner den fordøjede pSUmC-4.0 vektor og både 5 ' og 3 'homology arm PCR produkter sammen i et forhold på 0,01 pmol pSUmC-4,0 til 0,09 pmol hver homology arm. Saml fragmenterne i en DNA-samlingsreaktion i henhold til fremstillingens protokol.
  11. Transformer 50 μL elektrokompetent E. coli med 1 μL af DNA-monteringsreaktionen. Pladen de transformerede E. coli på LB agarplader, der indeholder 100 μg/ml spectinomycin, ved at sprede 150 μL pr. plade. Inkuber pladerne ved 37 °C natten over.
  12. Den næste dag, skærm kolonier for grøn og rød fluorescens ved hjælp af en epifluorescens omvendt mikroskop. Der forventes i alt 5-30 kolonier pr. agarplade.
  13. Pick 5-10 kolonier til at vaccinere 4 ml LB bouillon suppleret med 100 μg/ml spectinomycin. Inkuberkulturer ved 37 °C natten over med omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
  14. Brug natten E. coli kulturer, udføre små DNA rensning. Elute DNA med 50 μL nuclease-fri H2O.
  15. Bekræft indsættelsen af hver homologi arm i pSUmC-4.0 vektor ved hjælp af PCR screening primere (designet i trin 1,4) for at forstærke hver indsættelse. Hvis DNA-samling lykkes, skal der observeres et PCR-produkt på ~4 kb i en 1 % DNA agarosegel til både 5' og 3' armområder. Et PCR-produkt på ~1 kb indikerer manglende indsættelse.
    BEMÆRK: Hvis det ikke lykkes at indsætte homologiarmene i en dobbelt fragmentsamlingsreaktion, skal du udføre to monteringsreaktioner for at indsætte 5' arm og derefter 3' arm, individuelt. Du kan fordøje vektoren med kun Sall, før den samles med 5' arm, og fordøje derefter vektoren med SbfI for at samle 3 ' arm.
  16. Transformdæmning-/dcm- kompetent E. coli med 200 ng pSUmc-4.0 samlet med begge homologi arme. Plade de transformerede bakterier på LB agar plader, der indeholder 100 μg/ml spectinomycin ved at sprede 25 μL per plade. Inkuber pladerne ved 37 °C natten over. Der forventes i alt 20-200 kolonier.
  17. Screen pladerne for røde og grønne fluorescerende kolonier som beskrevet i trin 1.13.
  18. Indstil en kultur til en storstilet DNA-rensning ved at vaccinere 100 ml LB bouillon indeholdende 100 μg/ml spectinomycin med røde og grønne kolonier. Inkuber kulturen ved 37 °C natten over med omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
  19. Høst kulturen og rense DNA ved hjælp af en storstilet DNA rensning.
    1. Resuspendering af det rensede plasmid DNA i 100 μL nf-H2O. Et samlet DNA-udbytte på mindst 2 μg/μL er ideel til c. trachomatis transformation.
    2. Sekvens 5 ' og 3 'homology arm regioner for at sikre korrekt samling i pSUmC-4.0 før omdanne C. trachomatis.

2. Omdannelse af C. trachomatis med pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion by Allelic Exchange

  1. Seed McCoy celler, mus fibroblaster standard anvendes til dyrkning klamydia, i to 6 godt plader (1 x 106 celler / godt) med vækst medier #1. Inkuber pladerne ved 37 °C med 5% CO2, indtil monolaget er flydende (ca. 24 timer).
  2. I en 1,5 ml rør, tilsæt en volumen af C. trachomatis WT serovar L2 elementære organer (EBs), der er tilstrækkelig til at inficere 12 brønde af en 6 godt plade på en MOI på 2. Pellet eBs på > 20.000 x g i 30 min, derefter kasseres supernatant.
  3. Start klamydial transformation ved forsigtigt at ophænge EB'erne i 600 μL CaCl2 buffer, og tilsæt derefter 24 μg pSUmC-4.0 + homologi arme til røret. Bland forsigtigt opløsningen ved at svippe. Inkuber røret ved RTi 30 min og svirp til at blande hver 10 min.
  4. Tilsæt transformationsopløsningen til 24 ml hanks' afbalancerede saltopløsning (HBSS) og bland ved forsigtigt at pipettere. Overfør 2 ml af inoculum til hver brønd af sammenflydende McCoy celler i de 6 brøndplader og inficeres ved centrifugering ved 900 x g for 1 h ved 20 °C.
  5. Fjern inoculum og erstatte med 2 ml / godt RPMI vækst medier #2. Opkuber pladerne ved 37 °C med 5% CO2.
  6. Efter mindst 7 timer, men ikke mere end 12 timer, skal mediet udskiftes med 2 ml/brønd af markeringsmedier #1. Inkubationen fortsættes ved 37 °C i 48 timer fra infektionstidspunktet.
  7. Høst og passage bakterierne på en frisk monolayer af McCoy celler.
    1. Ved hjælp af en celleskraber skraber McCoy-monolaget forsigtigt for at løfte cellerne ind i medierne. Overfør materialet fra hver brønd i et 2 ml rør. Pille cellematerialet ved >20.000 x g i en mikrocentrifuge i 30 min ved 4 °C.
    2. Fjern og kassér supernatanten. Opslæm cellepellet i 1 ml HBSS ved forsigtigt at pipettere.
    3. Pille cellesnavs ved 200 x g i 5 min ved 4 °C. Overfør supernatantet til en frisk brønd af flydende McCoy-celler. Tilføj yderligere 1 ml HBSS til hver brønd for en samlet volumen på 2 ml/brønd.
    4. Ved centrifugering inficeres ved 900 x g i 1 time ved 20 °C. Udskift inoculum med markeringsmedier #1 umiddelbart efter infektion.
  8. Fortsæt med at overføre bakterierne til et frisk monolag af McCoy-celler (afsnit 2.7) hver 48 timer i tre eller flere passager, indtil der påvises røde og grønne indeslutninger ved hjælp af et epifluorescens omvendt mikroskop 24 timer efter infektion (24 hki).
  9. Når der registreres røde og grønne indeslutninger, skal du fortsætte med at passere monolaget (afsnit 2.7) ved hjælp af markeringsmedier #2.
  10. Fortsæt med at passere monolaget, indtil der registreres 24 hki (passage #3 eller nyere), hvilket indikerer tabet af pSUmC-4.0-vektoren og inkorporeringen af loxP-valgkassetten i genomet.
  11. Vælg en brønd af green-only indeslutninger for at berige ved passaging. Høst og fryse andre brønde, der også indeholder green-only indeslutninger i saccharose-fosfat-glutamat buffer (SPG).
    1. For at berige optagelser, der kun er grønne, skal du overføre monolaget fra en brønd på en 6 brøndplade som udført i trin 2.7, men efter pelletering af celleaffald (trin 2.7.3), overføres supernatantet til et konisk med 12 ml HBSS. Brug dette inoculum til at inficere to 6 brøndplader ved at tilføje 2 ml pr. brønd, og drej derefter pladerne ved 900 x g i 60 min ved 20 °C.
    2. For at fryse yderligere brønde, høste monolayer som i trin 2.7.1, men resuspendering af pellets i 1 ml SPG i stedet for HBSS. Pellet cellen snavs (trin 2.7.3) og overføre supernatant i en 1,5 ml cryotube. Materialet fryses ved -80 °C.
  12. Efter berigende green-only indeslutninger til en MOI på 0,5-1,0 (en til to flere passager efter påvisning), høste monolayers i SPG som beskrevet i trin 2.11.2. Der anskaffes aliquoter af 50 μL i 1,5 ml rør og fryses ved -80 °C.
  13. Titer grøn-only bakterier til at bestemme inklusion, danner enheder / μL, i henhold til en standard titrering protokol17.

3. Clonal Isolering af Grønne kun C. trachomatis Sletning Mutant Indeholder loxP Flankeret Selection Kassette ved at begrænse fortynding

  1. Seed en 384 godt væv kultur plade med 50 μL af McCoy celler på ~ 2.000 celler / godt i vækst medier #1. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 for ~ 24 timer eller indtil sammenflydende.
  2. Fortyndeen en aliquot af bakterier, der kun er grønne i HBSS, for at opnå ~50 EB pr. 20 ml. Overfør det fortyndede unokiulum til en reservoirbakke.
    1. Fjern mediet fra 384 brøndpladen ved at svippe hele pladen på hovedet ind i en affaldsbeholder. Ved hjælp af en multikanalpipette tilsættes 50 μL C. trachomatis inoculum til hver brønd. Ved centrifugering inficeres ved 900 x g i 1 time ved 20 °C.
      BEMÆRK: Vær opmærksom på ikke at svippe så hårdt, at monolaget løsner sig. Hvis cellerne er over-confluent, vil de frigøre lettere.
  3. Fjern inoculum ved at svippe og erstatte med 50 μL/well vækst medier #2. Inkuberplader ved 37 °C med 5% CO2.
    BEMÆRK: På nuværende tidspunkt er integrationen af udvælgelseskassetten i genomet stabil, så antibiotikavalg med spektinomycin er ikke længere påkrævet.
  4. Efter at have inkuberet pladen i 5-12 dage, identificere individuelle brønde med grønne fluorescerende indeslutninger ved hjælp af en epifluorescens omvendt mikroskop eller et højt indhold screening platform.
  5. Høst brønde med green-only indeslutninger ved at skrabe monolayer med en p-10 tip og overføre hele indholdet af brønden i et rør, der indeholder 2 ml HBSS. Bland forsigtigt og påfør 2 ml inoculum på en frisk sammenflydende McCoy monolayer i en 6 brøndplade til infektion.
    BEMÆRK: Når du identificerer individuelle brønde med indeslutninger, vil indeslutningerne være i en klynge på grund af udvidelse fra den oprindelige optagelse. Hvis en brønd har flere klynger, er det sandsynligt, at mere end én EB oprindeligt inficeret, at godt. Disse brønde bør ikke høstes, og i nogle tilfælde, flere runder af klonal isolation ved seriel fortynding kan være nødvendigt.
  6. 6 brøndpladen aninficeres ved centrifugering ved 900 x g i 1 time ved 20 °C. Udskift inoculum med 2 ml/brønd vækst medier #2. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 for 48 timer.
  7. Gentag trin 2.11-2.13 for at berige, fryse og titer klonale populationer.
  8. Bekræft sletningen af målrettede gener fra clonally isolerede C. trachomatis ved hjælp af qPCR som tidligere beskrevet12.

4. Omdannelse af C. trachomatis FRAEM Mutant med pSU-Cre at indlede fjernelse af loxP Flankeret Selection Kassette

  1. Gentag transformationsprocessen i en 6 brøndplade som tidligere beskrevet (trin 2.1-2.8) ved hjælp af den klonalt isolerede C. trachomatis FRAEM mutant, pSU-Cre vektor og udvælgelsesmedier #3.
    BEMÆRK: En vellykket transformation indikeres af indeslutninger, der er røde og grønne fluorescerende.
    1. Passage monolaget, indtil der registreres indeslutninger af rød kun ved hjælp af et epifluorescens omvendt mikroskop, hvilket indikerer tab af markeringskassetten (to til tre passager). Fortsæt med at passere monolaget, indtil optagelser kun for rød er beriget til en MOI på ~0,5.
  2. Clonally isolere rød-only indeslutninger ved at begrænse fortynding i en 384 godt plade som tidligere beskrevet (trin 3.1-3.8); Brug dog markeringsmedier #3 til alle trin.
  3. Berig clonal populationer ved passaging indtil en MOI på 0,1. Når beriget, erstatte sektion medier med vækst medier #2 at indlede tab af pSU-Cre vektor (ca. tre til fire passager).
  4. Clonally isolere nonfluorescerende bakterier (trin 3.1-3.8); Du kan dog manuelt scanne pladen med et brightfield mikroskop for at detektere indeslutninger. Berige og fryse bakterier (trin 2.11-2.12).
  5. Skærm til den mutante stamme ved hjælp af kvantitative real-time PCR, vestlige blotting, og hele genom DNA Sekventering som tidligere beskrevet12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden til markørløs gensletning i C. trachomatis ved hjælp af FLAEM er afhængig af omhyggelig kloning og transformationteknikker. Vellykket allelic rekombination er et vigtigt første skridt og kræver identifikation og indsættelse af homology arme i pSUmC-4.0 kloning vektor (Figur 1). Et vigtigt andet skridt for markørløs gensletning er fjernelse af fluorescens reporter og antibiotika udvælgelse kassette af Cre-lox genom redigering, repræsenteret i figur 2. De vektorer , der bruges til at udføre hvert af disse trin, er angivet i figur 3. Figur 4 viser en skematisk repræsentation af transformationsstrategien for at generere en markørløs sletningsmutant, når man starter med vildtype C. trachomatis.

Repræsentative data er vist i figur 5 og figur 6, hvor tmeA er målrettet mod gensletning. C. trachomatis tmeA sletning stamme genereres ved hjælp af FRAEM, og C. trachomatis tmeA-lx stamme genereres ved hjælp af FLAEM. Begge mutantstammer indeholder en sletning af tmeA locus; tmeA-lx indeholder dog ikke markeringskassetten, som det fremgår af fraværet af gfp-DNA vist i figur 5. TmeA mutant stammen er faldet ekspression af tmeB, vist i figur 6 af mRNA og protein niveauer. Når FLAEM anvendes til at generere den tmeA-lx mutant stamme, figur 6 viser, at udtryk for tmeB er genoprettet.

Figure 1
Figur 1: Skematisk repræsentation til identifikation af 5' og 3' homologiarme fra genomisk DNA- og PCR-screening for deres indsættelse i pSUmC-4.0. (A) Et gen, der er beregnet til sletning fra C. trachomatis genomet er repræsenteret ved den blå pil. De 3 kb-områder, der er identificeret som 5' og 3' homologiarme til allelakkompagneret, er henholdsvis parentes i lilla og rød. (B,C) Indsættelse af 5' og 3' homologiarme i pSUmC-4.0 bestemmes af PCR-screening. Sall og Sbfl begrænsning enzym steder er vist flankerende aadA (sort pil) og gfp (grøn pil) udvælgelse kassette, som er flankeret af loxP steder (gule firkanter) på pSUmC-4,0 vektor. (B) Ingen indsættelse bestemmes af et 1 kb PCR-produkt, når 5' screeningsprimere (lilla pilespidser) bruges til PCR-forstærkning på tværs af Sall-anlægget, eller 3' screeningsprimere (røde pilespidser) bruges til at forstærke sbfI-stedet. (C) Vellykket indsættelse bestemmes af 3 kb PCR-produkter på samme betingelser. 5' og 3' homologiarme er henholdsvis repræsenteret af de lilla og røde parenteser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skematisk repræsentation af Cre-lox medieret rekombination for at fjerne gfp-aadA-markeringskassetten. I overværelse af Cre rekombinase, loxP steder (gul) recombine, hvilket resulterer i excision af gfp-aadA udvælgelse kassette (grønne og sorte firkanter). Den resulterende locus vises, der indeholder en resterende loxP arsekvens. Opstrøms(US) og downstream-områder (DS) vises med gråt. Dette tal er blevet ændret fra Keb et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Genetisk organisering af pSUmC-4.0 og pSU-CRE. Til kontrollerbar vedligeholdelse af vektorerne i C. trachomatis er pgp6 konstrueret nedenfor af en tetracyclin-uudslettelig promotor. De resterende pgp gener er nedstrøms for deres indfødte Klamydial initiativtagere, og mCherry er konstituerende udtrykt på begge vektorer. (A) pSUmC-4.0 indeholder en kassettekodning, der udgør det udtrykkelige aadA- og gfp-gener for henholdsvis antibiotisk og fluorescensvalg. LoxP steder for Cre medieret rekombination samt begrænsning enzym steder til indsættelse af genspecifikke homology arme flanke udvælgelsekassetet. B) pSU-CRE indeholder en tilsvarende rygrad som pSUmC-4.0. men i stedet for rekombinationkassetten udtrykkes blaM og cre i henholdsvis antibiotisk selektivitet og CRE-rekombinasegeneration. Disse tal er blevet ændret fra Keb et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Skematisk repræsentation af FLAEM-transformationsstrategien, der anvendes til at skabe en markørløs sletningsmutant. Den generelle FLAEM-metode er repræsenteret her, hvor Wild-type C. trachomatis er sekventielle omdannet og serielt passage for at generere en markørløs sletning mutant. Transformation trin er repræsenteret ved tilsætning af små pile, og tabet af genetiske elementer er repræsenteret ved subtraktion af små pile. C. trachomatis mellemprodukter (cirkler) er repræsenteret med antibiotikafølsomheder (penicillinresistente eller penicillinfølsomme = PenGr eller PenGs; spectinomycin-resistente eller spectinomycin-følsomme = Specr ellerSpecs) og fluorescens-rapporteringskvaliteter (grøn = gfp +, rød = mCherry +, grå = ingen fluorescens). Skematiske gengivelser af genlocus på hvert trin er vist nedenfor. Dette tal er blevet ændret fra Keb et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: FRAEM og FLAEM anvendes til at generere tmeA-gensletninger. (A) FRAEM blev anvendt til at generere tmeA, og FLAEM blev anvendt til at generere tmeA-lx. Relative DNA-kopi numre af tmeA og nedstrøms tmeB; gfp indeholdt på pSUmC-4.0 udvælgelse kassette; og cre indeholdt på pSU-CRE vektor er alle vist. McCoy celler inficeret med lige inklusion danner enheder af WT, L2 tmeA, eller L2RiftmeA-lx C. trachomatis blev høstet på 24 hpi, og DNA blev udvundet til qPCR. Relative kopinumre blev vurderet ved signalnormalisering til klamydial 16sRNA. ND = der blev ikke fundet nogen. (B) Den sekvenserede tmeAB locus fra L2RiftmeA-lx vises med en enkelt resterende loxP arsekvens (understreget). De flankerende dna-områder vises med blåt, startcodons vises med grønt, og TmeA stop codon vises med rødt. Den ikke-kanoniske start codon for TmeB er også afbildet. Disse tal er blevet ændret fra Keb et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Excision af udvælgelseskassette ved hjælp af FLAEM genskaber udtryk for tmeB, når tmeA målrettes, og forstyrrer ikke downstream-gener. (A) Relative mRNA niveau af C. trachomatis tmeA og tmeB mutant stammer. Tilstedeværelsen af udskrifter nedstrøms for tmeA blev bestemt af omvendt transskriptionase (RT) kvantitative PCR. Regionen umiddelbart nedstrøms for tmeA/B-operonkoderct696. Total RNA blev isoleret på 24 hpi fra McCoy celler inficeret på en MOI på 1 med WT, L2 tmeA, L2 tmeB, eller L2RiftmeA-lx. Udskrifter for tmeA, tmeBog ct696 blev opdaget af qRT-PCR. Signaler præsenteres efter normalisering til rpoD. ND = der blev ikke fundet nogen. B) Vestlig skamplet for tilstedeværelse af TmeA og TmeB i C. trachomatis mutant stammer. Lige store mængder helkulturmateriale fra 24 hki-kulturer, der er inficeret med lige integrationsdannende enheder wt, L2 tmeA, L2RiftmeA-lx eller L2RiftmeA-lx ptmeA, blev undersøgt i immunblots for TmeA og TmeB. Hsp60 blev brugt som belastningskontrol, og proteiner blev visualiseret ved chemiluminescens. Figuren er blevet ændret fra Keb et al.12. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her for generering af markørløs gensletninger i C. trachomatis af FLAEM giver mulighed for målrettet sletning af uvæsentlige gener og eliminerer kassette-induceret polareffekter. Protokollen bygger på omhyggelig udformning af 5 ' og 3 'homology arme indsat i pSUmC 4.0 selvmord vektor, effektiv transformation af C. trachomatis, og omhyggelig screening af isolerede mutant stammer. Vellykket genom teknik via denne metode resulterer i bakterier, der er nonfluorescerende og indeholder en enkelt loxP ar sekvens på det sted, målrettet gensletning. Desuden har denne metode potentiale til at blive tilpasset til sekventiel målretning af gener inden for samme C. trachomatis stamme.

Omhyggelig udformning af 5' og 3' homologiarme og indsættelse i selvmordsvektoren er det første og mest kritiske trin i kloningsprocessen. Det er blevet konstateret, at 3 kb homology våben giver den mest effektive allelic rekombination. Mens indsættelse af disse arme genererer en vektor, der er stor og til tider vanskeligt at arbejde med, har der været mindre succes med kortere arme, med ~ 2 kb repræsenterer et minimum for succes. Udnyttelse af Sall og Sbfl begrænsning steder giver en bekvem et-trins konstruktion reaktion, når de udfører DNA-samling.

Andre kloningsmetoder, såsom indsættelse af PCR, har også været effektive til at indsætte homologiarme, men de indfører større mulighed for PCR-baserede fejl. Interessant, det er blevet bemærket, at kloning af 5 'arm er forholdsvis mere effektiv end 3 'arm. Hvis der opstår problemer, anbefales det at opdele DNA-samlingen i to reaktioner og konstruere vektoren på en trinvis måde. Derefter rådes det til at fordøje vektorrygraden med SbfI, indsætte 3 ' arm først, derefter fordøje vektoren med Sall og indsætte 5 'arm i en anden DNA-samling reaktion.

Når du forstærker PCR-fragmenter til homologiarmene, anbefales det også at bruge friskrenset C. trachomatis genomisk DNA, der ikke tidligere er blevet frosset. Dette begrænser muligheden for DNA klipning og øger effektiviteten for at generere større amplicons. Hvis forstærke nde homologi arme fra en anden vektor, den rensede PCR produkt bliver nødt til at dpni begrænsning enzym behandles før du fortsætter til DNA-samling for at reducere baggrundskolonier under E. coli transformation.

Transformation er endnu et kritisk skridt i denne protokol, hvor der kan opstå problemer. Hvis transformationen med pSUmC 4.0 lykkes, skal grønne og røde indeslutninger være synlig ved passage #3; Men det kan tage flere flere passager, før transformatanter bliver beriget. Ligesom andre mutagenesis tilgange, denne metode er begrænset til målretning af uvæsentlige gener, men transformation bør stadig være let udført. Langsigtet passaging af transformatorer i mangel af allelic udveksling, angivet ved opbevaring af rød fluorescens, kan indikere, at sletning af det målrettede gen er en dødelig begivenhed.

Da transformationsvektorer for C. trachomatis indeholder samme oprindelse som replikation som den oprindelige pL2, er det ikke ualmindeligt, at den indfødte plasmid helbredes efter flere (>5) passager. Pgp gener på pSUmC vektorer er i en anden rækkefølge i forhold til den indfødte pL2; derfor kan PCR bruges til at opdage tilstedeværelsen af pL2 i en isoleret stamme ved at forstærke regionen spænder pgp7-pgp8. Hvis den indfødte plasmid går tabt i den endelige sletning mutant, vil det være nødvendigt at genindføre, før du foretager udviklingsmæssige undersøgelser. Lateral genoverførsel (LGT) kan anvendes til at genindføre pL2 plasmid19.

I mange tilfælde indeholder mutanter med markeringskassetten stadig pL2-plasmid. Vi har udnyttet disse stammer til LGT med succes at genindføre pL2 og undgå reparation af det slettede gen. LGT kan også anvendes som en sekundær metode til transformation, når de indfører pSU-Cre. I nogle tilfælde var LGT mere effektiv end klassisk CaCl2 transformation. I tilfælde, hvor LGT anvendes til at indføre pSU-Cre, er det vigtigt at starte med C. trachomatis, der udtrykker en rpoB allel, som giver rifampin modstand forud for allelic udveksling og indsættelse af spectinomycin udvælgelse kassett1,19. Begyndende med rifampin resistente bakterier tillader udvælgelse efter co-kultur.

FLAEM muliggør reverse-genetiske tilgange med målrettet sletning af hele kodningsekvenser, sammenlignet med andre genetiske metoder, der er afhængige af tilfældige mutagenesis eller indsættelse af nukleotid sekvenser for at opnå genforstyrrelser. FLAEM er hovedsagelig en udvidelse af FRAEM, da det giver mulighed for fjernelse af udvælgelsekassette og eliminerer tidligere observerede kassette-induceret polareffekter. Denne metode skaber også mulighed for at generere flere gensletninger i en enkelt C. trachomatis stamme.

Flere mutationer kan genereres via to forskellige mekanismer. I den første kan FLAEM bruges til at generere en markørløs genmutation og sekventialt brugt til at målrette et andet gen i samme stamme. Den første sletning mutant kan omændres med pSUmC 4.0 vektor, der indeholder homologi arme specifikke for sekundære gen af interesse. I dette tilfælde bør protokollen gentages på samme måde som den første sletning og gentages flere gange for at målrette gener sekventialt. I den anden mekanisme kan den markørløse sletningsmutant isoleret efter FLAEM være co-inficeret med en sletningsmutant, der stadig indeholder en markeringskassette. Gennem LGT, er den anden sletning erhvervet og kan vælges til. Ved brug af denne fremgangsmåde er yderligere mutationer begrænset af antallet af unikke udvælgelseskassetter tilbage i genomet. Almindeligt anvendte antibiotika, der anvendes som selektivt tryk under transformation er begrænset til C. trachomatis, men de omfatter penicillin, chloramphenicol, og spectinomycin. Fjernelse af udvælgelsekassetten ved Cre-loxP genomredigering reducerer behovet for at bruge flere antibiotika til selektivt tryk. Sletning af flere gensekvenser på samme tid er gavnligt, når man studerer proteiner med relaterede funktioner eller biologiske processer, der kan have flere nøgleaktører.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Public Health Service tilskud fra National Institute of Health, NIAID (tilskud A1065530 og Al124649), til KA Fields.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Tags

Immunologi og infektion Cre rekombinase FLAEM FRAEM Klamydia mutagenesis allelic udveksling allelic rekombination
Markerless Gene Sletning af Floxed Kassette Allelic Exchange Mutagenesis i <em>Klamydia trachomatis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keb, G., Fields, K. A. Markerless… More

Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter