Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60848
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

Abstract

כלמידיה trachomatis היא פתוגן מחייב-תאיים כי כבר קשה היסטורית כדי לתמרן גנטית. התקדמות מוחלטת בהסבר המנגנונים כי C. trachomatis להשתמש כדי ליצור ולתחזק נישה תאיים מיוחסת הוגבלה בשל חוסר כלים גנטיים. למרבה המזל, לאחרונה היו מספר פיתוחים חדשים בטכניקות מניפולציה גנטית. בין השאר מדובר בהתפתחות של מוטסיס allelic exchange שדווחו על ידי קרינה פלואורסצנטית (FRAEM). שיטה זו מאפשרת מחיקה גנטית ממוקדת יחד עם החדרת קלטת בחירה קידוד עמידות לאנטיביוטיקה וחלבון פלורסנט ירוק (GFP). הסתמכות על אסטרטגיה זו יכולה להיות מסובכת בעת המיקוד גנים בתוך האופריונים polycistronic בשל הפוטנציאל של השפעות הקוטב על הגנים במטה. קסטה מallelic exchange מוטזיס (FLAEM), הפרוטוקול אשר מתואר כאן, פותחה כדי להקל על אפקטי הקוטב של הקלטת. FLAEM מנצל את הגנום לloxp העריכה כדי להסיר את הקלטת הבחירה לאחר ממוקד המחיקה על ידי allelic exchange. הזנים וכתוצאה מכך מכילים מחיקות גנים ללא מרסן של רצפי קידוד אחד או יותר. טכניקה זו מקלה על הערכה ישירה של פונקציית הגן ומרחיבה את הרפרטואר של כלים לטיפול גנטי ב- C. trachomatis.

Introduction

כלמידיה טרכוטיס היא הגורם המוביל למחלה מינית חיידקית ומהווה נטל משמעותי לבריאות האדם. מעל 100,000,000 אנשים נגועים בכל שנה עם C. trachomatis1. כ 70% של זיהומים בנשים הם אסימפטומטיים למרות השפעות בריאות הרבייה מזיקה, כגון מחלה דלקתית האגן, הריון חוץ רחמי, ו/או פוריות. סקוויה מחלה קשורים ישירות immunopathology ביוזמת C. trachomatis זיהום2. חיסון יעיל עדיין לא התפתח; לכן, הבנת הפונקציה של גורמים התקפה אלימה חיידקים ומוצרים אחרים גנים בקטריאליים היא שאלה חשובה ודחופה מחקר.

כמו חיידקים תאיים, הפלישה תא מארח, שכפול תאיים, שחרור של צאצאים, והתחמקות של תגובות אימונולוגיים מארח הם תהליכים קריטיים. ג. טראכוטיס יוצר קרום פרזיטוהורבי מאוגד, הנקרא הכללה, עבור פיתוח תאיים. הקמת הכללה ותהליכים קריטיים רבים אחרים מושגת על ידי הפרשת חלבונים של אפקטור דרך מערכת הפרשה מסוג III (T3SS)3. להבהיר את התפקודים של העריקים המופרשים הללו הוגבלה במשך שנים רבות בשל הצורך הגנטי של ה -trachomatis. בניגוד ל -E. coli, טכניקות שיבוט קלאסיות רבות אינן חלות על כלמידיה. מספר מגבלות גדולות כרוכות ביעילות שינוי, חוסר כתבים נגד כגון Sacb ותחזוקת פלביניים. בעוד E. coli החיידק יכול בדרך כלל להישמר ללא הגבלה עם מקור של שכפול והלחץ סלקטיבי המתאים, C. trachomatis פלמידים דורש שמונה נוספים מסגרות קריאה פתוחות (pgp1-8) עבור תחזוקה שנמצאו על הילידים pL2 פלמיד ב-L2 serovar4.

בשנים האחרונות היו כלים גנטיים מרובים שנוצרו המתאימים ביולוגיה ייחודית של כלמידיה , עדיין יש מגבלות עדיין5,6,7. מוטגנזה כימית על ידי הטיפול אתיל מתיונין (EMS) יכול להציג מוטציות missense, או (בתדירות נמוכה יותר) יכול לגרום מעברים נוקלאוטיד היכרות מוקדמת להפסיק קודון להניב מוטציה שטויות8. החדרת טרנספסון היא יעילה לשיבוש גנים, אך הטכנולוגיה הנוכחית של כלמידיה מחקר היא מפרך וגוזלת זמן9. הן שיטות הטיפול ב-EMS והן הטרנספסון מחוללים מוטציות אקראיות ודורשות שיטות סינון קפדניות לבידוד זנים מוטנטים. שיטה לשבש את הגנים על ידי החדרת introns קבוצה II (למשל, היעד) מאפשר מוטסיס מונחה; עם זאת, שיטה זו מוגבלת על-ידי יעילות, ואתר ההכנסה אינו צפוי תמיד10.

קרינה פלואורסצנטית דיווחו allelic exchange מוטגנזה (FRAEM) היא אסטרטגיה המשמשת עבור מחיקה גנטית ממוקדת בשילוב עם החדרת קלטת בחירה מתן עמידות לאנטיביוטיקה וכתבת פלואורסצנטית11. עם זאת, FRAEM הוא מסובך על ידי הפוטנציאל של השפעות הקוטב בקלטת המושרה על הגנים במורד הזרם, במיוחד כאשר מיקוד גנים בתוך האופרונים polycistronic. קסטה מallelic exchange מוטזיס (FLAEM) היא גישה גנטית הרומן שפותחה כדי להקל על השפעות הקוטב המושרה קלטת בעבר נצפתה עם קלטת בחירת FRAEM12. FLAEM מנצל את הגנום לloxp העריכה כדי להסיר את הקלטת בחירה ושחזור ביטוי של גנים במורד הזרם. הקלטת הבחירה המכילה עמידות לאנטיביוטיקה וחלבון פלורסנט ירוק (GFP) מהונדסים מחדש עם האגף Loxp אתרים. אתרים אלה Loxp יכול לשלב מחדש בנוכחות של הrecombinase היצור והתוצאה של כריתה של הקלטת מן הגנום13. אסטרטגיה זו הוכח להקל על משפיע הקלטת אפקטים קוטביים כאשר מיקוד tmea עבור מחיקה12,14.

הן FRAEM ו-FLAEM שיטות לנצל את אותו וקטור התאבדות, pSUmC 4.0, אשר ניתן לשמור באופן מותנה דרך inducible ביטוי של pgp6. ביטוי של pgp6 יש בעבר הוכח להיות הכרחי עבור החזקת פלסטלינה, ולכן ממונפת כדי לשלוט בתחזוקה הפלמיד11,15. כאשר C. trachomatis גדל בתקשורת בתוספת טטרציקלין הידרלי (האווירית) כדי לגרום pgp6 ביטוי, וקטור נשמר. בהיעדר האווירית, הווקטור אובד. מחיקת גנים ממוקדת מושגת באמצעות allelic exchange של הגן עבור הקלטת בחירה. האזורים 3 kb ישירות במעלה ובמורד הזרם של הגן המיועד לשמש כזרועות הומולוגיה עבור שילוב מחדש. זרועות אלה משוכפלות לתוך pSUmC 4.0 וקטור מאגף את הקלטת הבחירה. מוצלח C. trachomatis ואירועים שילוב מחדש הם נצפו באמצעות דיווח פלואורסצנטית. ביטוי של שרי על השדרה הווקטורית ו gfp בתוך הקלטת בחירה להניב פלורסנט אדום וירוק הכללות. לאחר הסרת התקשורת האווירית הוסר מן המדיה התרבותית, ירוק בלבד הכללות לציין אירועים מוצלחים שילוב מוצלח עם אובדן וקטור ההתאבדות ואינטגרציה של הקלטת הבחירה לתוך הגנום חיידקי.

FLAEM מייצג הרחבה של FRAEM באמצעות שינוי הבאים של recombinase ביטוי וקטור, pSU-היצור, לתוך זן מוטציה חדש שנוצר. היצור recombinase מאפשר שילוב מחדש בין אתרי Loxp לבין כריתה של קלטת הבחירה. אירועים שילוב מחדש מצוינים באמצעות דיווח על קרינה פלואורסצנטית. מקודד וקטורי בטעםpsu; לפיכך, שינוי מוצלח מצוין על-ידי הוספת פלואורסצנטית אדום ל- gfp-הבעת הכללות. טיפוח בהעדר לחץ סלקטיבי לתוצאות הקלטת בשילוב מחדש באתרי Loxp , ואובדן הקלטת מצוין על ידי הכללות אדומות בלבד. כמו עם pSUmC-4.0, ביטוי inducible של pgp6 משמש לשמור מותנה psu-היצורים. ברגע שהאווירית והבחירה האנטיביוטיים מוסרים, הפלסמיד נרפא, והזן המתקבל של מחיקת המחיקה אינו פלורסנט. שיטה זו מטפלת בנושא של אפקטי הקוטב המושרה בקלטת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. עיצוב והרכבה של pSUmC-4.0 עם כלי נשק הומולוגיה ספציפית לגנים המעניינים

  1. זהה ~ 3 kb אזורים ישירות במעלה ובמורד הזרם של הגן המיועד למחיקה כדי לשמש 5 ' ו 3 ' הומולוגיה הזרועות לשילוב מחדש הומוולוגי (איור 1).
  2. עיצוב PCR התחל 1) להגביר את 3 kb 5 ' הומולוגיה הזרוע מ-DNA לא גנומית ו 2) מכילים 15 – 30 bp לתלות מסוים pSUmC-4.0 כאשר מתעכל באתר האנזים הגבלת סל. ודא כי האזורים הפריימר חופפים עם pSUmC-4.0 יש טמפרטורות התכה של 55 ° c והטמפרטורה ההיתוך לאורך כל התחל הם < 35 ° c.
  3. עיצוב PCR התחל 1) להגביר את 3 kb 3 ' הומולוגיה זרוע מ-DNA לא גנומית ו 2) מכילים 15 – 30 bp לתלות מסוים pSUmC-4.0 כאשר מתעכל באתר האנזים הגבלת SbfI. ודא כי האזורים הפריימר חופפים עם pSUmC-4.0 יש טמפרטורות התכה של 55 ° c והטמפרטורה ההיתוך לאורך כל התחל הם < 35 ° c.
  4. עיצוב PCR הקרנה התחל כי להגביר את ההכנסה של כל זרוע הומולוגיה לתוך pSUmC-4.0 וקטור לאחר תגובת הרכבה DNA16. לעצב את הצבעי היסוד האלה כדי לספח ~ 500 bp מחוץ לאתרי ההגבלה כדי לאפשר הדמיה קלה של מוצר ה-PCR גם אם ההכנסה לא הצליחה (איור 1).
  5. להגביר את 3 kb 5 ' ו 3 ' מוולוגיה הזרועות מן שחולצו טרי DNA לא גנומית על ידי ה-PCR באחד לשתי תגובות כדי להניב מספיק רסיס להרכבת DNA מאוחר יותר. בצע את הפרוטוקול של יצרן ה-DNA פולימראז עבור תגובה ספציפית הגדרת תנאי אופניים.
  6. ודא כי שני מוצרי ה-PCR הם הגודל הנכון וכי התגובות אינן מכילות להקות מזהם. הפעל 5 μL של כל תגובת ה-PCR על 1% דנ א ג'ל.
  7. לטהר ולרכז את חלקיקי ה-PCR על ידי הוצאת פנול/כלורופורם ומשקעים אתנול.
    1. בריכת כל 3 ' PCR תגובות יחד בצינור 1.5 mL ולהביא נפח סופי של 200 μL עם nuclease-H חינם2O. חזור על תהליך זה עבור 5 ' התגובות PCR.
    2. הוסף 200 μL של פנול לכל צינור ומערבולת עבור 30-60 s. ספין כל צינור במיקרוצנטריפוגה ב > 21000 x g עבור 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    3. להעביר את השכבה העליונה השלב העליון של כל צינור לתוך שפופרת 1.5 mL חדש, להוסיף עשירית הנפח של 3 M נתרן אצטט לכל צינור, ואז קפיצי כדי לערבב.
    4. הוסף 3 כרכים של 100% אתנול לכל שפופרת ו קפיצי לערבב. מודקון שתי הצינורות ב-80 ° c עבור 20 דקות.
    5. גלולה ה-DNA על ידי ספינינג כל צינור ב > 21000 x g עבור 5 דקות ב-RT. להיפטר supernatant.
    6. לשטוף את הגלולה DNA עם 100 μL של 70% אתנול. ספין כל צינור ב > 21000 x g עבור 5 דקות ב RT. לבטל את הסופרנטאנט.
    7. לשטוף את הגלולה DNA שוב עם 100 μL של 100% אתנול. הספין כל צינור ב > 21000 עבור 5 דקות ב RT.. תבטל את הסופרנטאנט
    8. תן את הגלולה במלואה אוויר יבש, ואז בעדינות להשעות מחדש את ה-DNA ב 12 μL של nuclease-H חינם2O על ידי הצליף לערבב.
  8. לעכל 500 ng pSUmC-4.0 וקטור ב 20 μL תגובה עם 1 יחידה של סל ו 1 יחידה של SbfI לפי הפרוטוקול של הייצור. דגירה התגובה עבור כ 3 h או לילה כדי להבטיח את העיכול המלא של הווקטור.
  9. לטהר ולרכז את עמוד השדרה מתעכל על ידי הוצאת פנול/כלורופורם ומשקעים אתנול כמתואר קודם (שלב 1.7.1 – 1.7.9).
  10. לשלב את psumc מתעכל-4.0 וקטור ושניהם 5 ' ו 3 ' הומולוגיה זרוע PCR מוצרים יחד ביחס של 0.01 p, psumc-4.0 כדי 0.09 pמול כל זרוע הומולוגיה. הכנס את השברים בתגובת הרכבת DNA על פי פרוטוקול הייצור.
  11. שינוי הצורה 50 μL של האיי קולי אלקטרומוסמך עם 1 μl של תגובת ההרכבה של הדנ א. צלחת החיידק שהפך את ה-coli אל ליברות אגר צלחות המכילות 100 μg/mL spectinomycin על-ידי הפצת 150 μl לכל צלחת. מודאת הצלחות ב 37 ° c בלילה.
  12. למחרת, מושבות מסך עבור זריחה ירוק ואדום באמצעות מיקרוסקופ הפוך אפיפייתי. סך של 5 – 30 מושבות לכל צלחת אגר צפוי.
  13. בחר 5 – 10 מושבות לאיחסן 4 mL של מרק LB שיושלם עם 100 μg/mL spectinomycin. תרבות הדגירה ב 37 ° c לילה עם טלטול ב 250 סל ד.
  14. באמצעות התרבויות E. coli לילה, לבצע טיהור בקנה מידה קטן DNA. ליוט ה-DNA עם 50 μL של nuclease-H חינם2O.
  15. לאשר את ההוספה של כל זרוע הומולוגיה לתוך pSUmC-4.0 וקטור באמצעות ה-PCR הקרנת התחל (תוכנן בשלב 1.4) כדי להגביר כל הכנסה. אם הרכבת DNA מצליחה, a ~ 4 kb מוצר PCR יש לצפות ב 1% DNA agarose ג'ל עבור שני אזורי הזרוע 5 ' ו 3. מוצר ה-PCR של ~ 1 kb מציין חוסר הכנסה.
    הערה: אם החדרת הזרועות ההומנילוגיה אינה מוצלחת בתגובת הרכבה כפולה, בצע שתי תגובות הרכבה כדי להכניס את הזרוע של 5 ואז 3, בנפרד. לעכל את הווקטור עם רק סל לפני הרכבת עם הזרוע 5, ואז לעכל את וקטור עם SbfI להרכיב את 3 ' זרוע.
  16. שינוי הסכר-/dcm- המוסמכת E. Coli עם 200 ng של psumc-4.0 התאספו עם שתי זרועות הומולוגיה. צלחת חיידקים שהפכו על ליברות אגר לוחות המכילים 100 μg/mL spectinomycin ידי הפצת 25 μL לכל צלחת. מודאת הצלחות ב 37 ° c בלילה. סך של 20 – 200 מושבות צפויים.
  17. המסך את הצלחות עבור מושבות פלורסנט אדום וירוק כמתואר בשלב 1.13.
  18. הגדרת תרבות עבור טיהור בקנה מידה גדול של DNA על ידי הנלווה 100 mL של מרק LB המכיל 100 μg/mL spectinomycin עם מושבות אדום וירוק. מודאת התרבות ב 37 ° c לילה עם טלטול ב 250 סל ד.
  19. לקצור את התרבות ולטהר את ה-DNA באמצעות טיהור בקנה מידה גדול DNA.
    1. השהה מחדש את הדנ א הטהור ב-100 μL של NF-H2O. התשואה הכוללת של DNA של לפחות 2 μg/μL הוא אידיאלי עבור שינוי C. trachomatis .
    2. רצף the 5 ' ו 3 ' הומולוגיה באזורים הזרוע כדי להבטיח הרכבה נכונה לתוך pSUmC-4.0 לפני הפיכת C. trachomatis.

2. טרנספורמציה של C. trachomatis עם psumc 4.0 + הומולוגיה זרועות למחיקה גנטית על ידי Allelic Exchange

  1. תאי מקוי זרעים, העכבר משמש לעיבוד כלמידיה, לתוך שני 6 היטב צלחות (1 x 106 תאים/גם) עם מדיה צמיחה #1. מודאת הצלחות ב 37 ° c עם 5% CO2 עד המונאולייר הוא שוטף (כ 24 שעות).
  2. בצינור 1.5 mL, להוסיף נפח של C. trachomatis WT הגופים היסודיים L2 (בס) כי הוא מספיק כדי להדביק 12 בארות של 6 צלחת לוחית במשרד משרד הבית של 2. גלולה הבס ב > 20000 x g עבור 30 דקות, ואז להיפטר supernatant.
  3. הפעל שינוי לא על-ידי השעיית מחדש בעדינות של בס ב-600 μL של CaCl2 מאגר, ולאחר מכן להוסיף 24 μg של pSUmC-4.0 + הומולוגיה זרועות לצינור. בעדינות לערבב את הפתרון על ידי מצליף. מודלת את הצינור ב RTfor 30 דקות ותנועה לערבב כל 10 דקות.
  4. הוסף את פתרון השינוי ל 24 מ ל של הנקס ' מאוזנת תמיסת מלח (HBSS) ולערבב ידי בעדינות ליטוף. העברה 2 מ ל של האיתיות לכל טוב של תאים מקוי confluent ב 6 היטב צלחות ולהדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 x g עבור 1 h ב 20 ° c.
  5. הסר את האירשת והחלף ב-2 mL/RPMI מדיית גידול ב#2. מודטה את לוחיות ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
  6. לאחר מינימום של 7 שעות, אך לא יותר מ-12 שעות, החלף את המדיה עם 2 מ ל/באר של מדיית בחירה #1. המשך הדגירה ב 37 ° c עבור 48 h מן הזמן של זיהום.
  7. הקציר ומעבר החיידקים על מונאולייר טרי של תאים מקוי.
    1. מגרד בעדינות את המונאולייר. כדי להרים את התאים לתוך המדיה העבירו את החומר מכל הבאר לתוך צינור 2 מ ל. גלולה את החומר התא ב > 20000 x g ב מיקרוצנטריפוגה עבור 30 דקות ב 4 ° c.
    2. הסר והשמט את הסופרנטאנט. השהה מחדש את הגלולה בתא 1 מ ל של HBSS על ידי ליטוף בעדינות.
    3. גלולה פסולת תא ב 200 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c. העבר את הסופרנטנט אל הבאר מחדש של תאים מקקוי של קונשוטפת. הוסף בנוסף 1 מ ל של HBSS לקבלת נפח כולל של 2 מ"ל/ועוד.
    4. להדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 x g עבור 1 h ב 20 ° c. החלף את האפשרות במדיית בחירה #1 מיד לאחר ההדבקה.
  8. המשך לפרק את החיידקים על מונרוייר טרי של תאים מקוי (סעיף 2.7) כל 48 h עבור שלושה או יותר קטעים עד ההכללות אדום וירוק מזוהים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה epiפלואורסצנטית 24 שלאחר זיהום (24 hpi).
  9. לאחר זיהוי הכללות אדומות וירוקות, המשך לפרק את המונאולייר (סעיף 2.7) באמצעות מדיית בחירה #2.
  10. המשך מעבר הזדקנות המונרוייר עד ירוק בלבד הכללות מזוהים 24 hpi (המעבר #3 או מאוחר יותר), אשר מציין את אובדן pSUmC-4.0 וקטור ושילוב של הקלטת Loxp בחירה לתוך הגנום.
  11. בחרו באר אחת של הכללות ירוקות בלבד כדי להעשיר אותה על-ידי הפסנה. לקצור ולהקפיא כל בארות אחרות המכילות גם הכללות ירוקות בלבד בתוך מאגר של סוכרוז פוספט גלוטמט (SPG).
    1. כדי להעשיר את ההכללות ירוק-בלבד, מעבר את המונרוייר מבאר אחת של 6 צלחת הבאר כפי שנעשה בשלב 2.7, אבל לאחר הפלטינג הפסולת תא (שלב 2.7.3), להעביר את supernatant לתוך חרוט עם 12 מ ל של HBSS. השתמש באפשרות זו כדי להדביק 2 לוחות היטב על ידי הוספת 2 mL לכל טוב, ואז לסובב את לוחיות ב 900 x g עבור 60 דקות ב 20 ° c.
    2. כדי להקפיא בארות נוספות, לקצור את המונרוייר כמו בשלב 2.7.1, אבל להשעות מחדש את כדורי ב 1 מ ל של SPG במקום HBSS. גלולה פסולת תא (שלב 2.7.3) ולהעביר את supernatant לתוך 1.5 הקריו mL. הקפא את החומר ב-80 ° c.
  12. לאחר העשרת ירוק בלבד הכללות למשרד הבין של 0.5 – 1.0 (אחד לשני קטעים נוספים לאחר האיתור), הקציר monolayers לתוך SPG כמתואר בשלב 2.11.2. קבל ali, ts של 50 μL ב 1.5 מ ל צינורות ו להקפיא ב-80 ° c.
  13. Titer ירוק בלבד חיידקים כדי לקבוע הכללה, יצירת יחידות/μL, על פי פרוטוקול titer סטנדרטי17.

3. בידוד שבטים של גרין-בלבד C. trachomatis מחיקה מוטציה המכילה את הקלטות הבחירה מקיפים את ה- loxp על ידי הגבלת דילול

  1. זרעים a 384 היטב התרבות רקמה צלחת עם 50 μL של תאים מקוי ב ~ 2,000 תאים/גם במדיית הצמיחה #1. מודטה ב 37 ° c עם 5% CO2 עבור ~ 24 שעות או עד שוטפת.
  2. לדלל את סדרת מחלקים של ירוק בלבד חיידקים ב hbss כדי להשיג ~ 50 בס ל 20 מ ל. העבר את הנואת הדילול למגש של מאגר.
    1. להסיר את המדיה מ 384 צלחת הבאר על ידי מצליף בחוזקה את הצלחת כולה הפוך לתוך מכולה פסולת. שימוש בפיפטה רב-ערוצית, הוסף 50 μL של C. trachomatis . להדביק על ידי צנטריפוגה ב 900 x g עבור 1 h ב 20 ° c.
      הערה: היה מתחשב לא לחבוט כל כך חזק שהמונאולייר מתנתק. אם התאים הם מעבר לקשר, הם מתנתק ביתר קלות.
  3. הסר את החיסונים על ידי מצליף ולהחליף עם 50 μL/היטב מדיית הצמיחה #2. לוחיות הדגירה ב 37 ° צ' עם 5% CO2.
    הערה: בשלב זה, שילוב של קלטת הבחירה לתוך הגנום הוא יציב, כך בחירה אנטיביוטית עם spectinomycin כבר לא נדרש.
  4. לאחר הדגירה של הצלחת עבור 5 – 12 ימים, לזהות בארות בודדות עם הכללות פלורסנט ירוק באמצעות מיקרוסקופ הפוכה epiפלואורסצנט או פלטפורמת ההקרנה תוכן גבוה.
  5. בארות הקציר עם הכללות ירוק בלבד על ידי גירוד המונרוייר עם טיפ-10 והעברת התוכן כולו של הבאר לתוך צינור המכיל 2 מ ל של HBSS. בעדינות לערבב ולהחיל את 2 מ ל של האירשת למונאולייר מקקוי מחדש ב 6 היטב צלחת לזיהום.
    הערה: כאשר מזהים בארות בודדות עם הכללות, ההכללות יהיו באשכול בשל התרחבות מההכללה הראשונית. אם הבאר יש אשכולות מרובים, סביר להניח כי יותר מאחד EB בתחילה נגוע זה היטב. בארות אלה לא צריך להיות שנקטפו, ובמקרים מסוימים, כדורים מרובים של בידוד שבטים על ידי דילול סדרתי עשוי להיות הכרחי.
  6. להדביק את 6 צלחת הבאר על ידי צנטריפוגה ב 900 x g עבור 1 h ב 20 ° c. החלף את הנרשת באמצעות 2 mL/היטב מדיית גדילה #2. מודטה ב 37 ° צ' עם 5% CO2 עבור 48 h.
  7. חזור על שלבים 2.11 – 2.13 להעשיר, להקפיא, ולאוכלוסיות שבטים.
  8. אשר מחיקה של גנים ייעודיים מclonally מבודדים C. trachomatis באמצעות qpcr כמתואר בעבר12.

4. טרנספורמציה של C. trachomatis החשבונאי עם psu-היצורים ליזום הסרת loxp מוקף מסגרות בחירה

  1. חזור על תהליך השינוי בצלחת 6 היטב כפי שמתואר בעבר (שלבים 2.1 – 2.8) באמצעות clonally מבודדים C. trachomatis fraem, וקטור psu, ובחירה מדיה #3.
    הערה: שינוי מוצלח מצוין על-ידי הכללות הינן פלורסנט אדום וירוק.
    1. מעבר למונאולייר עד שההכללות האדומות בלבד מזוהות באמצעות מיקרוסקופ הפוך אפיפייתי, המציין אובדן של קלטת הבחירה (שניים עד שלושה מעברים). המשך בהמשך הזדקנות המונאולייר עד שההכללות האדומות מועשר למשרד משרד הבמה של ~ 0.5.
  2. Clonally לבודד אדום בלבד הכללות על ידי הגבלת דילול בצלחת 384 היטב כמתואר בעבר (שלבים 3.1 – 3.8); עם זאת, השתמש במדיית בחירה #3 עבור כל השלבים.
  3. העשרת אוכלוסיות שבטים על ידי הפסנה עד משרד ה0.1. ברגע שהוא מועשר, החלף מדיית מקטע עם מדיית צמיחה #2 ליזום אובדן של וקטור pSU-הספק (בערך שלושה עד ארבעה מעברים).
  4. Clonally בידוד חיידקים שאינם פלורסנט (שלבים 3.1 – 3.8); עם זאת, לסרוק באופן ידני את הצלחת עם מיקרוסקופ ברייטפילד כדי לזהות הכללות. העשרת והקפאת חיידקים (שלב 2.11 – 2.12).
  5. מסך עבור זן מוטציה באמצעות PCR כמותי בזמן אמת, בלוק המערבי, ואת רצפי DNA כל הגנום כמתואר בעבר12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השיטה עבור מחיקת גנים מרקרבלי ב -C. trachomatis באמצעות flaem מבוססת על שיבוט זהיר וטכניקות שינוי. מוצלח allelic רקומבינציה הוא צעד ראשון חיוני והוא דורש זיהוי והחדרת של זרועות הומולוגיה לתוך psumc-4.0 שיבוט וקטור (איור 1). צעד שנייה חיוני עבור מחיקת גנים markerless היא הסרת הכתב הפלואורסצנטית ואת הקלטת בחירה אנטיביוטי על ידי בעלי הגנום של ללקס לערוך, מיוצג באיור 2. הווקטורים המשמשים להשלמת כל אחד משלבים אלה מוארים באיור 3. איור 4 מציג ייצוג סכמטי של אסטרטגיית שינוי הצורה כדי ליצור מוטציה מרפבלי מחיקה כאשר מתחילים עם מסוג פראי C. trachomatis.

נתוני הנציג מוצגים באיור 5 ובאיור 6, שבו tmea מיועד למחיקה גנטית. The c. trachomatis tmea זן מחיקה מופק באמצעות fraem, ו C. trachomatis tmea-lx הזנים מופק באמצעות flaem. שני זני המוטציות מכילים מחיקה של מקור הטמאה ; עם זאת, Tmea-lx אינו מכיל את הקלטת בחירה, כפי שצוין על ידי העדר DNA gfp המוצג באיור 5. זן Tmea מוטציה ירדה ביטוי של tmeb, המוצג באיור 6 על ידי mrna ורמות החלבון. כאשר FLAEM מנוצל כדי ליצור את זן Tmea-lx מוטציה, איור 6 מראה כי הביטוי של tmeb משוחזר.

Figure 1
איור 1: ייצוג סכימטי לזיהוי 5 ' ו 3 ' הומולוגיה הזרועות מ גנומית ו-PCR הקרנה עבור ההכנסה שלהם pSUmC-4.0. (א) גן המיועד למחיקה מ -C. trachomatis הגנום מיוצג על ידי החץ הכחול. האזורים של 3 kb המזוהים כ-5 ' ו-3 ' זרועות הומולוגיה לallelic רקומבינציה משולבים בסגול ובאדום, בהתאמה. (ב, ג) החדרת הזרועות 5 ' ו 3 ' הומולוגיה לתוך pSUmC-4.0 נקבעת על ידי הקרנת PCR. הגבלת האתרים של האנזים "סל" ו-"בsbfl" מוצגים מחוצה לקלטת הבחירה (חץ שחור) ו- gfp ( החץ הירוק ), אשר מוקף באתרי loxp (ריבועים צהובים) בווקטור psumc-4.0. (ב) אין הכנסה שנקבעת על-ידי מוצר ה-pcr של 1 kb כאשר 5 ' הקרנת התחל (ראשי חץ סגולים) משמשים ל-PCR לפני השטח של סל, או 3 ' הקרנת הסרט התחל (ראשי החיצים האדומים) משמשות להגביר את האתר באמצעות sbfi. (ג) הכנסה מוצלחת נקבעת על-ידי 3 kb מוצרי PCR באותם תנאים. הזרועות של 5 ' ו -3 מיוצגות על ידי הסוגריים הסגולים והאדומים, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הייצוג הסכמטי של היצור-לקס מתווך מחדש כדי להסיר את הקלטת בחירת gfp-aadA . בנוכחות של recombinase, אתרים Loxp (צהוב) לשלב מחדש, וכתוצאה מכך כריתה של קלטת בחירת gfp-aada (ריבועים ירוק ושחור). הלוקוס שנוצר מוצג המכיל לקסאחד נותרP צלקת רצף. אזורי הזרם (US) ובמורד הזרם (DS) מוצגים באפור. דמות זו השתנתה מ-Keb ואח '12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: הארגון הגנטי של pSUmC-4.0 ו-pSU-היצורים. עבור תחזוקה לשליטה של וקטורים ב -C. trachomatis, pgp6 מהונדסים במורד הזרם של מקדם טטרציקלין inducible. הגנים הנותרים pgp הם במורד של היזמים יליד לא שלהם, ו mcherry הוא ביטוי מבחינה חוקתית על שני וקטורים. (א) psumc-4.0 מכיל קידוד קלטת באופן מכונן הביע הגנים aada ו- gfp עבור אנטיביוטיקה ויכולת בחירה פלואורסצנטית, בהתאמה. Loxp אתרים ליצור מתווך שילוב מחדש כמו גם אתרי אנזים הגבלה להוספה של גן הומולוגיה ספציפיים לאגף את הקלטת הבחירה. (ב) psu-היצורים מכיל עמוד שדרה דומה pSUmC-4.0; עדיין, במקום הקלטת שילוב מחדש , blam והיצור מבוטא באופן מכונן עבור בסלקטיביות אנטיביוטית וייצור recombinase, בהתאמה. נתונים אלה שונו מ-Keb ואח '12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ייצוג סכמטי של אסטרטגיית הטרנספורמציה של FLAEM המשמשת ליצירת מוטציה מחיקה ללא מרפטיות. השיטה הכללית FLAEM מיוצגת כאן כאשר פראי סוג C. trachomatis הוא השתנה ברציפות והוא בדרך החוצה כדי ליצור מוטציה המחיקה מטורף. צעדי המרה מיוצגים על-ידי הוספת חצים קטנים, ואובדן של אלמנטים גנטיים מיוצגים על ידי חיסור של חצים קטנים. ג. trachomatis intermediates (עיגולים) מיוצגים עם רגישויות אנטיביוטי (פניצילין עמידים או פניצילין-רגיש = פנגr או פנגs; spectinomycin עמידים או spectinomycin-רגיש = specr או specs) ו-הדיווח על-ידי קרינה פלואורסצנטית (ירוק = gfp +, אדום = mcherry +, אפור = ללא זריחה). ייצוגים סכמטית של מקור הגן בכל שלב מוצגים להלן. דמות זו השתנתה מ-Keb ואח '12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: FRAEM ו FLAEM משמשים להפקת Tmea מחיקות גנים. (א) fraem השתמשו כדי לייצר tmea, ו flaem שימש כדי לייצר tmea-lx. מספרי ה-DNA היחסיים של Tmea ו Tmeb במורד הזרם ; gfp הכלולים בקלטת הבחירה psumc-4.0; והיצורים הכלולים על וקטור psu-היצורים כולם מוצגים. תאים מקוי נגוע הכללה שווה להרכיב יחידות של WT, L2 Tmea, או l2ריףtmea-lx C. trachomatis נקצרו ב 24 hpi, ו-DNA הופק qpcr. מספרי עותקים יחסיים העריכו על-ידי נרמול אותות ל-לא 16sRNA. ND = none לא זוהה. (ב) לוקוס tmeab הרציף מ-L2ריףtmea-lx מוצג עם רצף הצלקת הנותרים loxp בודד (מסומן בקו תחתון). האזורים האגפים של ה-DNA מוצגים בכחול, ההתחלה מופיעים בירוק, ו TmeA לעצור codons מוצג באדום. ההתחלה הבלתי קאנונית של קודון עבור tmeb מתוארת אף היא. נתונים אלה שונו מ-Keb ואח '12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: כריתה של קלטת הבחירה באמצעות FLAEM משחזרת ביטוי של Tmeb כאשר מיקוד tmea ואינו משבש את הגנים במורד הזרם. (A) רמת mrna היחסי של C. trachomatis Tmea ו tmeb זנים מוטציה. הנוכחות של תעתיקים במורד Tmea נקבע על ידי היפוך הטרנסקריפטאז (RT) כמותי PCR. האזור מייד במורד הזרם של Tmea/B המבצע מקודד ct696. סה כ RNA היה מבודד 24 hpi מתאי מקוי נגוע ב-משרד הבין 1 עם WT, L2 Tmea, L2 tmeb, או l2ריףtmea-lx. התעתיקים של טמאה, tmeb, ו ct696 זוהו על ידי רביעיית-PCR. אותות מוצגים לאחר נורמליזציה ל- Rpod. ND = none לא זוהה. (ב) כתם מערבי לנוכחות tmea ו TmeB ב -C. trachomatis זנים מוטנטים. כמויות שוות של חומר התרבות השלמה מ 24 התרבויות hpi נגועים עם הכללה שווה היווצרות היחידות של WT, L2 Tmea, l2ריףtmea-lx, או l2ריףtmea-Lx פטין נחקר בגושים החיסונית של tmea ו tmeb. Hsp60 שימש כבקרת טעינה, חלבונים היו דמיינו על ידי כימויומימינסנס. הדמות השתנתה מ-Keb ואח '12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן עבור הדור של מחיקות גנים markerless ב- C. trachomatis ידי flaem מאפשרת מחיקה ממוקדת של גנים לא חיוניים ומבטלת המושרה קלטת אפקטי הקוטב. הפרוטוקול מסתמך על עיצוב קפדני של 5 ' ו 3 ' זרועות הומולוגיה שנוספו לתוך pSUmC 4.0 וקטור התאבדות, שינוי יעיל של C. trachomatis, והקרנה זהירה של זנים מוטנטים מבודדים. הנדסת הגנום מוצלחת דרך שיטה זו תוצאות חיידקים כי הם לא פלורסנט ומכילים רצף Loxp בודד צלקת באתר של מחיקת גנים ייעודיים. יתר על כן, שיטה זו יש את הפוטנציאל להיות מותאם לפילוח סדרתי של גנים בתוך המתח של C. trachomatis זהה.

עיצוב קפדני של 5 ' ו 3 ' הומולוגיה הזרועות הכניסה לתוך וקטור ההתאבדות הוא הצעד הראשון והקריטי ביותר של תהליך השכפול. זה נמצא כי 3 kb נשק הומולוגיה לספק את allelic recombination היעיל ביותר. בעוד החדרת זרועות אלה יוצרת וקטור גדול ולפעמים קשה לעבוד עם, יש פחות הצלחה עם זרועות קצרות יותר, עם ~ 2 kb המייצג מינימום להצלחה. השימוש באתרי ההגבלה של "סל" ובsbfl מספק תגובת בנייה נוחה של צעד אחד בעת ביצוע הרכבת DNA.

שיטות נוספות לשכפול, כגון החדרת PCR, היו גם יעילות בהכנסת זרועות הומולוגיה, אך הן מציגות אפשרות גדולה יותר של שגיאות מבוססות-PCR. מעניין, זה כבר נצפתה כי שיבוט של הזרוע 5 היא יחסית יעיל יותר של 3 ' זרוע. אם מתעוררות הבעיה, מומלץ לחלק את מכלול ה-DNA לשתי תגובות ולבנות את הווקטור בצורה החורגת. אז, מומלץ לעכל את השדרה הווקטורית עם SbfI, להכניס את 3 ' הזרוע הראשונה, ולאחר מכן לעכל את וקטור עם סל ולהכניס את 5 ' זרוע תגובת ההרכבה השנייה DNA.

כאשר מגביר את שברי ה-PCR לזרועות הומולוגיה, מומלץ גם להשתמש ב-DNA שעבר ניקוי טרי . זה מגביל את האפשרות של הטיית DNA ומגביר את היעילות ליצירת הגברה גדולה יותר. אם הגברה זרועות הומולוגיה מווקטור אחר, מוצר ה-PCR המטוהר יצטרך להיות הגבלה האנזים DpnI התייחס לפני שתמשיך הרכבה DNA כדי להפחית את מושבות הרקע במהלך הטרנספורמציה E. coli .

שינוי צורה הוא שלב קריטי נוסף בפרוטוקול זה, שבו עלולים להתעורר בעיות. אם השינוי עם pSUmC 4.0 מוצלח, הכללות ירוקות ואדומות צריך להיות גלוי על ידי מעבר #3; עם זאת, זה יכול להימשך מספר פסקאות לפני transformants להיות מועשר. כמו גישות מוטגנזה אחרות, שיטה זו מוגבלת למיקוד של גנים לא חיוניים, אך עדיין יש לבצע את השינוי בקלות. לטווח ארוך מעבר הtransformants בהעדר החליפין allelic, המצוין על ידי שמירה של פלואורסצנטית אדום, עשוי להצביע על כך מחיקה של הגן המיועד הוא אירוע קטלני.

מכיוון וקטורים שינוי עבור C. trachomatis מכילים את אותו מקור של שכפול כמו יליד pL2, זה לא נדיר עבור הפלמיד הטבעי להירפא לאחר (> 5) מעברים. גנים pgp על וקטורים pSUmC הם בסדר שונה לעומת יליד pL2; לכן, ה-PCR יכול לשמש כדי לזהות נוכחות של pL2 במתח מבודד על ידי הגברה של האזור הפורש pgp7–pgp8. אם הפלבין הטבעי יאבד את המוטציה הסופית, יהיה צורך להציג אותו מחדש לפני הביצוע של מחקרים התפתחותיים. העברה גנטית לרוחב (LGT) עשוי להיות מנוצל כדי להציג מחודש pL2 באמצע19.

במקרים רבים, מוטציות המחיקה מוקדם עם הקלטת הבחירה עדיין מכילים את pL2 פלמיד. יש לנו מנוצל אלה זנים עבור LGT עם הצלחה להציג מראש pL2 ולהימנע תיקון של הגן נמחק. LGT יכול גם להיות מנוצל כשיטה משנית עבור טרנספורמציה בעת היכרות pSU-היצורים. במקרים מסוימים, LGT היה יעיל יותר מאשר השינוי הקלאסי CaCl2 . במקרים שבהם lgt מנוצל להציג psu-היצורים, חשוב להתחיל עם C. trachomatis כי לבטא את rpob allele, אשר מפעיל את ההתנגדות רימפלין לפני allelic exchange והחדרת הקלטת הבחירה spectinomycin12,19. החל עם רימפב חיידקים עמידים מאפשר בחירה לאחר תרבות שיתוף.

FLAEM מאפשר הפוך גישות גנטיות עם מחיקה ממוקדת של רצפי קידוד שלם, לעומת שיטות גנטיות אחרות המסתמכים על מוטגנזה אקראית או החדרת רצפי נוקלאוטיד כדי להשיג הפרעה גנטית. FLAEM הוא בעיקרו הרחבה של FRAEM, כפי שהוא מאפשר הסרה של הקלטת בחירה ומבטלת בעבר נצפתה קלטת המושרה השפעות הקוטב. שיטה זו יוצרת גם את ההזדמנות ליצור מחיקות גנים מרובים במתח של C. trachomatis אחד.

מוטציות מרובות ניתן ליצור באמצעות שני מנגנונים שונים. ב הראשון, FLAEM יכול לשמש כדי לייצר מוטציה גנטית מרקרבלי וברצף המשמש למקד גן אחר באותו זן. מוטציה המחיקה הראשון יכול להיהפך מחדש עם pSUmC 4.0 וקטור המכיל זרועות הומולוגיה ספציפי גן משני של עניין. במקרה זה, יש לחזור על הפרוטוקול באותו אופן כמו המחיקה הראשונה וחזרה מספר פעמים כדי למקד את הגנים ברציפות. במנגנון השני, מוטציה המחיקה markerless מבודד לאחר FLAEM יכול להיות נגוע שיתוף עם מוטציה מחיקה עדיין מכיל קלטת בחירה. באמצעות LGT, המחיקה השנייה מועברת וניתן לבחור עבורה. בעת שימוש בגישה זו, מוטציות נוספות מוגבלות במספר קלטות הבחירה הייחודיות שנותרו בגנום. אנטיביוטיקה בשימוש נפוץ כמו לחץ סלקטיבי במהלך השינוי מוגבלים C. trachomatis, אבל הם כן כוללים פניצילין, כchloramphenicol, ו spectinomycin. הסרת הקלטת הבחירה על ידי הגנום באמצעות-loxP מפחית את הצורך להשתמש באנטיביוטיקה מרובים עבור לחץ סלקטיבי. מחיקת רצפי גנים מרובים באותו זמן היא מועילה בעת לימוד חלבונים עם פונקציות קשורות או תהליכים ביולוגיים שעשויים להיות בעלי מספר נגני מפתח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין קונפליקטים של עניין לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים שירות בריאות הציבור מן המכון הלאומי לבריאות, NIAID (מענקים A1065530 ו Al124649), כדי K.A. שדות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Tags

אימונולוגיה וזיהום סוגיה 155 recombinase מוטרים FLAEM FRAEM כלמידיה ממוטזיס allelic exchange allelic שילוב מחדש
מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה <em>בקלמידיה</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keb, G., Fields, K. A. Markerless… More

Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter