Summary
여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.
Abstract
클라미디아 트라코마티스는 유전적으로 조작하기가 역사적으로 어려웠던 의무적인 세포내 병원체입니다. C. trachomatis가 특권있는 세포 내 틈새 시장을 만들고 유지하기 위해 사용하는 메커니즘을 해명하는 데 결정적인 진전이 유전 도구의 부족으로 인해 제한되었습니다. 다행히도, 최근에 유전 조작 기술에 있는 몇몇 새로운 어드밴스가 있었습니다. 이들 중형-보고된 말투교환 돌연변이 발생(FRAEM)의 개발이다. 이 방법은 항생제 내성 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 선택 카세트의 삽입과 결합된 표적 유전자 결실을 허용한다. 이 전략에 대한 의존은 다운스트림 유전자에 대한 극성 효과의 잠재력으로 인해 다각형 오페론 내의 유전자를 표적으로 할 때 복잡할 수 있습니다. 플록스 카세트 알레릭 교환 돌연변이 발생(FLAEM)은 여기에 설명되어 있는 프로토콜로, 카세트-유도극성 효과를 완화하도록 개발되었다. FLAEM은 Cre-loxP 게놈 편집을 사용하여 알레릭 교환에 의한 표적 결실 후 선택 카세트를 제거합니다. 생성된 균주는 하나 이상의 코딩 서열의 마커리스 유전자 삭제를 포함합니다. 이 기술은 유전자 기능의 직접적인 평가를 용이하게하고 C. trachomatis에 있는 유전 조작을 위한 공구의 레퍼토리를 확장합니다.
Introduction
클라미디아 트라코마티스는 세균성 성병의 주요 원인이며 인간의 건강에 상당한 부담을 나타냅니다. 매년 1억 명 이상이 C. 트라코마티스1에감염됩니다. 여자에 있는 감염의 대략 70%는 골반 선동적인 선동적인 질병, 자궁 외 임신 및/또는 불모와 같은 해로운 생식 건강 효력에도 불구하고 자각 증상이 없습니다. 질병 후유증은 C. trachomatis 감염에 의해 개시된 면역 병리학과 직접 관련이있습니다 2. 효과적인 백신은 아직 개발되지 않았습니다. 따라서, 세균성 독성 인자 및 기타 세균성 유전자 제품의 기능을 이해하는 것은 중요하고 긴급한 연구 질문입니다.
세포 내 박테리아로서, 숙주 세포 침략, 세포 내 복제, 자손의 방출, 및 숙주 면역 반응의 회피는 중요한 과정입니다. C. trachomatis는 세포 내 발달을 위한 포함이라고 불리는 parasitophorous 막 결합 환액을 형성합니다. 포함 및 다른 많은 중요한 과정의 확립은 타입 III 분비 시스템(T3SS)을 통해 이펙터 단백질의 분비에 의해 달성된다3. 이러한 분비 이펙터의 기능을 해명하는 것은 C. trachomatis의유전적 난치성으로 인해 수년 동안 제한되었습니다. 대장균과는 달리, 많은 고전적인 복제 기술은 클라미디아에적용되지 않습니다. 몇 가지 주요 제한 사항에는 변환 효율성, sacB와 같은 카운터셀렉션 리포터 부족 및 플라스미드 유지 관리가 포함됩니다. 대장균 플라스미드는 일반적으로 복제 및 적절한 선택적 압력의 기원으로 무기한 유지될 수 있는 반면, C. 트라코마티스 플라스미드는 L2 혈청바르4내의 기본 pL2 플라스미드에서 발견되는 유지관리를 위해 8개의 개방 판독프레임(pgp1-8)을 추가로 필요로 한다.
최근 몇 년 동안 클라미디아의 독특한 생물학을 수용 하는 여러 유전 도구 생성 되었습니다., 아직 제한5,6,7. 에틸 메탄설포네이트(EMS) 치료에 의한 화학적 돌연변이 발생은 잘못된 돌연변이를 유발할 수 있거나, 또는 (덜 빈번하게) 넌센스 돌연변이를 산출하기 위해 조기 정지 코동을 도입하는 뉴클레오티드 전이를 초래할 수있다 8. 트랜스포종 삽입은 유전자 파괴에 효율적이지만 클라미디아 연구의 현재 기술은 힘들고 시간이 많이 소요되는9. EMS 처리와 트랜스포종 돌연변이 유발 기술은 무작위 돌연변이를 생성하고 돌연변이 균주를 분리하기 위해 엄격한 스크리닝 방법을 필요로 합니다. 그룹 II 인트론 (예를 들어, TargeTron)의 삽입에 의해 유전자를 방해하는 방법은 지시 된 돌연변이 발생을 허용; 그러나, 이 방법은 효율에 의해 제한되고, 삽입 부위가 항상 제대로 예측되지 는않는다(10).
형광-보고된 말투교환 돌연변이발생(FRAEM)은 항생제 내성 및 형광리포터(11)를제공하는 선택 카세트의 삽입과 결합된 표적 유전자 결실에 사용되는 전략이다. 그러나, FRAEM은 특히 polycistronic 오페론 내의 유전자를 표적으로 할 때 다운스트림 유전자에 카세트 유도한 극성 효력의 잠재력에 의해 복잡합니다. 플록스 카세트 알레릭 교환 돌연변이 유발(FLAEM)은 이전에 FRAEM 선택카세트(12)와함께 관찰된 카세트 유도 극성 효과를 완화하기 위해 개발된 새로운 유전적 접근법이다. FLAEM은 Cre-loxP 게놈 편집을 사용하여 선택 카세트를 제거하고 다운스트림 유전자의 발현을 복원합니다. 항생제 내성 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 포함하는 선택 카세트는 측면 loxP 사이트로 재설계됩니다. 이들 loxP 부위는 Cre 재조합아제의 존재속에서 재결합하고게놈(13)으로부터카세트를 절제할 수 있다. 이러한 전략은 결실을 위한 tmeA를 타겟팅할 때 카세트 유도 극성 효과를 완화하는 것으로 나타났다12,14.
FRAEM 및 FLAEM 방법 모두 pgp6의 유도성 발현을 통해 조건부로 유지될 수 있는 동일한 자살 벡터, pSUmC 4.0을 이용한다. pgp6의 발현은 이전에 플라스미드 유지에 필요한 것으로 나타났으며 따라서 플라스미드 유지보수11,15를제어하는 데 활용된다. C. 트라코마티스가 pgp6 발현을 유도하기 위해 무수 테트라사이클린(aTc)으로 보충된 매체에서 성장하면, 벡터가 유지된다. aTc가 없으면 벡터가 손실됩니다. 표적 유전자 결실은 선택 카세트에 대한 유전자의 전부 교환을 통해 달성된다. 표적 유전자의 상류 및 하류에 직접 3kb 영역은 재결합을 위한 상동성 무기역할을 한다. 이들 암은 선택 카세트를 측면으로 pSUmC 4.0 벡터로 복제된다. 성공적인 C. trachomatis 변환 및 재조합 이벤트는 형광 보고를 통해 관찰됩니다. 선택 카세트 내의 벡터 백본 및 gfp 상에서mCherry의 발현은 적색 및 녹색 형광 개재물산출한다. aTc가 배양 배지에서 제거되면, 녹색 전용 개재는 자살 벡터의 손실과 성공적인 재결합 이벤트를 나타내고 선택 카세트를 박테리아 게놈으로 통합합니다.
FLAEM은 새로 생성된 돌연변이 균주 내로, Cre 재조합 발현 벡터, pSU-Cre의 후속 변환을 통해 FRAEM의 확장을 나타낸다. Cre 재조합은 loxP 부위와 선택 카세트의 절제 사이의 재결합을 용이하게 한다. 재결합 이벤트는 형광 보고를 통해 표시됩니다. pSU-Cre 벡터는 mCherry를인코딩합니다. 따라서, 성공적인 변환은 gfp-표현포함에 적색 형광의 추가에 의해 지시된다. 카세트에 대한 선택적 압력의 부재에서 재배는 loxP 부위에서 Cre 매개 재조합을 초래하고, 카세트의 손실은 적색 전용 포함물로 지시된다. pSUmC-4.0과 마찬가지로, pgp6의 유도성 발현은 pSU-Cre를 조건부로 유지하는 데 사용된다. aTc 및 항생제 선택이 제거되면 플라스미드가 경화되고 생성된 마커리스 결실 균주는 불형성입니다. 이 방법은 카세트로 유도된 극성 효과의 문제를 해결합니다.
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Protocol
1. 관심 유전자에 특화된 상동성 무기를 사용하여 pSUmC-4.0의 설계 및 조립
- 상동 재조합에 대한 5' 및 3' 상동성 무기로서 역할을 하기 위해 결실을 위한 표적 유전자의 상류 및 하류 ~3kb 영역을 직접 식별한다(도1).
- 설계 PCR 프라이머를 1) 클라미다이얼 게놈 DNA로부터 3 kb 5' 상동성 암을 증폭시키고 2) Sall 제한 효소 부위에서 소화될 때 pSUmC-4.0에 특이적인 15-30 bp 오버행을 함유한다. pSUmC-4.0과 겹치는 프라이머 영역이 55°C의 용융 온도를 가지며 전체 프라이머의 헤어핀 용융 온도가 <35°C인지 확인합니다.
- 설계 PCR 프라이머는 1) 클라미다이얼 게놈 DNA로부터 3 kb 3' 상동성 암을 증폭시키고 2) SbfI 제한 효소 부위에서 소화될 때 pSUmC-4.0에 특이적인 15-30 bp 오버행을 함유한다. pSUmC-4.0과 겹치는 프라이머 영역이 55°C의 용융 온도를 가지며 전체 프라이머의 헤어핀 용융 온도가 <35°C인지 확인합니다.
- DNA 조립반응(16)후 pSUmC-4.0 벡터내로 각 상동성 암의 삽입을 증폭시키는 PCR 스크리닝 프라이머를 설계한다. 이러한 프라이머를 제한 사이트 외부로 설계하여 삽입이 실패한 경우에도 PCR 제품을 쉽게 시각화할 수 있도록합니다(도 1).
- PCR에 의해 갓 추출된 클라미디알 게놈 DNA로부터 3kb 5' 및 3' 상동성 무기를 1-2개의 반응으로 증폭시켜 나중에 DNA 조립을 위한 충분한 단편을 산출한다. 특정 반응 설정 및 사이클링 조건에 대한 DNA 폴리머라제 제조업체의 프로토콜을 따르십시오.
- 두 PCR 제품 모두 올바른 크기인지, 반응에 오염 밴드가 포함되어 있지 않은지 확인합니다. 1% DNA 아가로즈 겔에 대해 각 PCR 반응의 5 μL을 실행합니다.
- 페놀/클로로폼 추출 및 에탄올 침전으로 PCR 단편을 정화하고 농축합니다.
- 모든 3' PCR 반응을 1.5 mL 튜브에 함께 풀링하고 뉴클레아제 없는 H2O. 5' PCR 반응에 대해 이 과정을 반복하여 200 μL의 최종 부피를 가져옵니다.
- 각 튜브와 소용돌이에 200 μL의 페놀을 추가하여 30-60초 동안 각 튜브를 실온(RT)에서 20분 동안 >21,000 x g의 미세원심분리기로 회전시세요.
- 각 튜브의 수성 상 상부 층을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 각 튜브에 3M 나트륨 아세테이트의 1/10 볼륨을 추가한 다음 섞어 넣습니다.
- 각 튜브에 100% 에탄올 3부량을 넣고 섞어 넣습니다. 두 튜브를 -80°C에서 20분 동안 배양합니다.
- 각 튜브를 >21,000 x g에서 RT에서 5분 동안 회전시켜 DNA를 펠렛합니다.
- DNA 펠릿을 70 % 에탄올 100 μL로 씻으십시오. RT에서 5 분 동안 >21,000 x g에서 각 튜브를 회전.
- 100 % 에탄올의 100 μL로 DNA 펠릿을 다시 씻으십시오. RT에서 5 분 동안 >21,000에서 각 튜브를 회전.
- 펠릿을 완전히 공기 건조시키자, 뉴클레아제 프리H2O의 12 μL에서 DNA를 부드럽게 재혼하여 섞어 놓습니다.
- 제조 프로토콜에 따라 Sall의 1 단위 및 SbfI의 1 단위로 20 μL 반응에서 pSUmC-4.0 벡터의 500 ng를 소화합니다. 벡터의 완전한 소화를 보장하기 위해 약 3 시간 또는 하룻밤 동안 반응을 배양합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 페놀/클로로폼 추출 및 에탄올 침전으로 소화된 백본을 정화하고 농축한다(단계 1.7.1-1.7.9).
- 소화된 pSUmC-4.0 벡터와 5' 및 3' 상동성 암 PCR 제품을 각각 상동성 암에 0.01 pmol pSUmC-4.0 의 비율로 함께 결합합니다. 제조 프로토콜에 따라 DNA 조립 반응으로 단편을 조립합니다.
- DNA 조립 반응의 1 μL로 전기 유능한 대장균 의 50 μL을 변환하십시오. 변형된 대장균을 100 μg/mL 스펙티노마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트에 플레이트당 150 μL을 퍼뜨리게 한다. 플레이트를 밤새 37°C에서 배양합니다.
- 다음 날, 전형 역 현미경을 사용하여 녹색 및 적색 형광에 대한 콜로니를 스크린. 한천 접시 당 총 5-30 개의 식민지가 예상됩니다.
- 5-10개의 콜로니를 선택하여 100 μg/mL 스펙티노마이신으로 보충한 LB 국물 4mL를 접종합니다. 37°C에서 배양하여 밤새 250 rpm에서 흔들어.
- 하룻밤 대장균 배양을 사용하여, 소규모 DNA 정제를 수행한다. 50 μL의 뉴클레아제 없는H2O로 DNA를 용해시다.
- 각 삽입을 증폭시키기 위해 PCR 스크리닝 프라이머(단계 1.4에서 설계)를 사용하여 각 상형군암의 삽입을 pSUmC-4.0 벡터에 삽입하는 것을 확인한다. DNA 조립이 성공하면~ 4kb PCR 생성물은 5' 및 3' 암 부위 모두에 대해 1% DNA 아가로즈 겔에서 관찰되어야 한다. ~ 1 kb PCR 제품은 삽입부족을 나타냅니다.
참고 : 이중 조각 조립 반응에서 상동성 암의 삽입이 실패한 경우 두 개의 어셈블리 반응을 수행하여 5'arm 다음 3'팔을 개별적으로 삽입합니다. 5'팔로 조립하기 전에 Sall만으로 벡터를 소화한 다음 SbfI로 벡터를 소화하여 3' 암을 조립합니다. - 변환 댐-/ dcm- pSUmc-4.0의 200 ng와 유능한 대장균은 두 상동성 무기로 조립. 100 μg/mL 스펙티노마이신을 함유하는 LB 한천 플레이트에 변형된 박테리아를 플레이트당 25 μL을 퍼뜨리게 한다. 플레이트를 밤새 37°C에서 배양합니다. 총 20~200개의 식민지가 예상됩니다.
- 1.13단계에서 설명한 바와 같이 적색 및 녹색 형광 콜로니에 대한 플레이트를 스크리볼 수 있습니다.
- 적색 및 녹색 콜로니와 100 μg/mL spectinomycin을 포함하는 LB 국물의 100 mL를 접종하여 대규모 DNA 정제를위한 문화를 설정합니다. 250 rpm에서 흔들어 밤새 37°C에서 배양한다.
- 배양을 수확하고 대규모 DNA 정제를 사용하여 DNA를 정화합니다.
- NF-H2O의 100 μL에서 정제된 플라스미드 DNA를 재중단시켰다. 적어도 2 μg/μL의 총 DNA 수율은 C. 트라코마티스 형질전환에 이상적입니다.
- C. trachomatis를변환하기 전에 pSUmC-4.0으로 정확한 조립을 보장하기 위해 5'와 3'상동성 암 영역을 순서.
2. PSUmC 4.0 + 알레릭 교환에 의한 유전자 결실을 위한 상동성 무기로 C. 트라코마티스의 변형
- 씨 맥코이 세포, 콜라미디아를육성하기 위해 표준적으로 사용되는 마우스 섬유 아세포, 두 개의 6 웰 플레이트로 (1 x 106 세포 / 잘) 성장 매체 #1. 단층이 동량 (약 24 시간)이 될 때까지 5 %CO2로 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오.
- 1.5 mL 튜브에, C. trachomatis WT 혈청L2 초등학교 의 부피를 추가 (EBs) 감염하기에 충분한 12 감염에 충분한 6 의 MOI에서 웰 플레이트 2. 30 분 동안 >20,000 x g에서 EB를 펠렛 한 다음 상급을 버립니다.
- CaCl2 버퍼의 600 μL에서 EB를 부드럽게 재중단하여 클라미다이얼 변환을 시작한 다음 24 μg의 pSUmC-4.0 + 상형 암을 튜브에 추가합니다. 가볍게 쓸어넘기면서 용액을 부드럽게 섞으세요. RTfor에서 튜브를 30 분 동안 인큐베이션하고 10 분마다 섞는다.
- 행크스의 균형 잡힌 염분 용액(HBSS)의 24mL에 변환 솔루션을 추가하고 부드럽게 파이펫팅하여 혼합합니다. 6웰 플레이트에서 각각의 웰웰에 접종된 2 mL을 전달하고 20°C에서 1시간 동안 900 x g에서 원심분리에 의해 감염된다.
- 접종을 제거하고 2 mL / 웰 RPMI 성장 매체 #2 교체하십시오. 5%CO2로37 °C에서 플레이트를 배양합니다.
- 최소 7시간,12시간 이내의 경우, #1 2mL/well의 선택 용지로 미디어를 교체하십시오. 감염 시점부터 48시간 동안 37°C에서 인큐베이션을 계속한다.
- 수확 하 고 맥코이 세포의 신선한 단일 층으로 박테리아를 통과.
- 셀 스크레이퍼를 사용하여 McCoy 단층을 부드럽게 긁어 내어 세포를 매체로 들어 올립니다. 각 우물에서 2 mL 튜브로 재료를 옮김. 4 °C에서 30 분 동안 미세 원심 분리기에 >20,000 x g에서 세포 물질을 펠렛.
- 상급체를 제거하고 폐기하십시오. 부드럽게 파이펫팅하여 HBSS 의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 놓습니다.
- 4 °C에서 5 분 동안 200 x g에서 세포 파편을 펠렛. 상급을 신선한 맥코이 세포의 우물에 옮김을 옮김으로 옮김. 총 부피 2mL/well에 대해 각 웰에 1mL의 HBSS를 추가합니다.
- 20 °C에서 1 시간 동안 900 x g에서 원심 분리에 감염하십시오. 접종을 감염 직후 선택 매체 #1 교체하십시오.
- 맥코이 세포의 신선한 단층 (섹션 2.7)에 박테리아를 계속 전달 3 개 이상의 통로에 대 한 모든 48 빨강과 녹색 포함 을 사용 하 여 발견 될 때까지 24 h 감염 후 현미경 (24 hpi).
- 빨간색과 녹색 개재물이 감지되면 선택 미디어 #2 사용하여 단층(섹션 2.7)을 계속 전달합니다.
- 녹색 전용 개재물이 24hpi(통로 #3 이상)가 검출될 때까지 단층을 계속 통과하여 pSUmC-4.0 벡터의 손실과 loxP 선택 카세트가 게놈 내로 혼입됨을 나타냅니다.
- 패스에 의해 풍요로움을 위해 녹색 전용 포함 사항 중 하나를 선택하십시오. 자당 인산염 글루타메이트 완충제 (SPG)에 녹색 전용 포함을 포함하는 다른 우물을 수확하고 동결하십시오.
- 녹색 전용 개재를 풍부하게하기 위해, 2.7 단계에서 수행된 바와 같이 6 웰 플레이트의 한 웰에서 단층을 통과하지만, 세포 파편을 펠릿 (단계 2.7.3)한 후, 상판을 12 mL의 HBSS로 원뿔형으로 옮김을 옮김을 전달한다. 이 접종을 사용하여 웰 당 2 mL을 추가하여 두 개의 6 웰 플레이트를 감염한 다음 20 °C에서 60 분 동안 900 x g에서 플레이트를 회전시다.
- 추가 우물을 동결하려면 단계 2.7.1에서와 같이 단층을 수확하지만 HBSS 대신 SPG의 1 mL에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오. 세포 파편을 펠렛 (단계 2.7.3) 및 1.5 mL 저온 튜브로 상류를 전송합니다. 재료를 -80 °C에서 동결합니다.
- 0.5-1.0(검출 후 1~2개의 더 많은 통로)의 MOI에 녹색 전용 개재를 농축한 후, 2.11.2단계에서 설명한 대로 단층을 SPG로 수확한다. 1.5 mL 튜브에서 50 μL의 알리쿼트를 얻고 -80 °C에서 동결하십시오.
- 적정 녹색 전용 박테리아는 표준 적정 프로토콜17에따라 포함, 형성 단위/μL을 결정한다.
3. 희석을 제한하여 loxP 측면 선택 카세트를 포함하는 녹색 전용 C. 트라코마티스 결실 돌연변이체의 클로날 절연
- 종자 384 웰 조직 배양 플레이트와 맥코이 세포의 50 μL에서 ~ 2,000 세포/잘 성장 배지 #1. 37°C에서 5%CO2로 ~ 24시간 또는 부유할 때까지 배양합니다.
- 20 mL 당 ~ 50 EBs를 달성하기 위해 HBSS에서 녹색 전용 박테리아의 aliquot를 희석. 희석된 접종을 저장소 트레이로 옮긴다.
- 384 웰 플레이트에서 용지를 꺼내어 전체 플레이트를 거꾸로 폐기물 용기에 단단히 밀어 넣습니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 50 μL의 트라코마티스 접종을 추가합니다. 20 °C에서 1 시간 동안 900 x g에서 원심 분리에 감염하십시오.
참고: 단층이 분리되도록 너무 세게 쓸어넘기지 않도록 주의하십시오. 세포가 과도하게 수렴되면 더 쉽게 분리됩니다.
- 384 웰 플레이트에서 용지를 꺼내어 전체 플레이트를 거꾸로 폐기물 용기에 단단히 밀어 넣습니다. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에 50 μL의 트라코마티스 접종을 추가합니다. 20 °C에서 1 시간 동안 900 x g에서 원심 분리에 감염하십시오.
- 50 μL/웰 성장 매체 #2 플릭하여 접종을 제거하고 교체하십시오. 37 °C에서 5 %CO2로인큐베이트 플레이트.
참고 : 이 단계에서 선택 카세트를 게놈으로 통합하는 것이 안정적이므로 스펙토마이신을 가진 항생제 선택이 더 이상 필요하지 않습니다. - 5-12 일 동안 플레이트를 인큐베이션 한 후, 에피플루온 반전 현미경 또는 높은 함량의 스크리닝 플랫폼을 사용하여 녹색 형광 포함물로 개별 우물을 식별합니다.
- p-10 팁으로 단층을 긁어 내고 우물의 전체 내용을 HBSS 2 mL을 포함하는 튜브로 옮겨 녹색 전용 개재물로 우물을 수확하십시오. 감염을 위해 6 개의 웰 플레이트에 신선한 혼합 맥코이 단층에 접종 2 mL을 부드럽게 섞고 바릅니다.
참고: 포함된 개별 웰을 식별할 때 초기 포함에서 확장으로 인해 포함이 클러스터에 포함됩니다. 웰에 여러 클러스터가 있는 경우 처음에는 두 개 이상의 EB가 잘 감염될 수 있습니다. 이러한 우물은 수확해서는 안되며, 경우에 따라 직렬 희석에 의한 여러 차례의 클론 절연이 필요할 수 있습니다. - 20°C에서 1시간 동안 900 x g에서 원심분리에 의해 6웰 플레이트를 감염시다. 접종을 2 mL/웰 성장 매체 #2 교체하십시오. 37°C에서 48시간 동안 5%CO2로 배양합니다.
- 2.11-2.13 단계를 반복하여 클론 채우기를 풍부하게 하고, 동결하고, 적시합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 qPCR을 사용하여 클로론으로 단리된 C. 트라코마티스로부터 표적 유전자의 결실을확인한다 12.
4. c. trachomatis FRAEM 돌연변이를 pSU-Cre로 변환하여 loxP 측면 선택 카세트 제거를 시작합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 6웰 플레이트에서 변형 과정을 반복(단계 2.1-2.8) 클로론 단리된 C. 트라코마티스 FRAEM 돌연변이체, pSU-Cre 벡터, 및 선택 매체 #3 사용하여.
참고: 성공적인 변환은 빨간색과 녹색 형광등인 포함으로 표시됩니다.- 선택 카세트 (2 ~ 3 개의 대구)의 손실을 나타내는 epifluoresence 반전 현미경을 사용하여 적색 전용 개재물이 검출 될 때까지 단층을 통과합니다. 적색 전용 개재물이 ~0.5의 MOI로 보강될 때까지 단층을 계속 통과시다.
- 앞서 설명한 대로 384 웰 플레이트에서 희석을 제한하여 적색 전용 개재물(단계 3.1-3.8 단계)을 클로론적으로 분리합니다. 그러나 모든 단계에 대해 선택 미디어 #3 사용합니다.
- 0.1의 MOI까지 통과하여 클론 인구를 풍부하게. 일단 농축되면, pSU-Cre 벡터의 손실을 개시하기 위하여 #2 성장 매체로 단면도 매체를 대체합니다 (대략 3- 4 개의 통로).
- 복제 비형광 박테리아를 분리 (단계 3.1-3.8); 그러나, 수동으로 포함을 감지하기 위해 밝은 필드 현미경으로 플레이트를 스캔합니다. 박테리아를 풍부하게 하고 동결하십시오 (단계 2.11-2.12).
- 앞서 설명한바와같이 정량적 실시간 PCR, 웨스턴 블로팅 및 전체 게놈 DNA 시퀀싱을 이용한 돌연변이 균주에 대한 화면.
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Representative Results
FLAEM을 사용하여 C. trachomatis에서 마커리스 유전자 삭제를 위한 방법은 신중한 복제 및 변환 기술에 의존합니다. 성공적인 알레릭 재조합은 필수적인 첫 번째 단계이며 pSUmC-4.0 복제 벡터내로 상동성 암의 식별 및 삽입이필요합니다(도 1). 마커리스 유전자 결실을 위한 필수적인 제2단계는 도 2에나타난 Cre-lox 게놈 편집에 의한 형광 리포터 및 항생제 선택 카세트의 제거이다. 이러한 각 단계를 수행하는 데 사용되는 벡터는 그림 3에추가됩니다. 도 4는 야생형 C. 트라코마티스로시작할 때 마커리스 결실 돌연변이를 생성하는 변형 전략의 개략적 표현을 나타낸다.
대표적인 데이터는 tmeA가 유전자 결실을 표적으로 하는 도 5 및 도 6에나타내고 있다. C. 트라코마티스 tmeA 결실 균주는 FRAEM을 사용하여 생성되고, C. 트라코마티스 tmeA-lx 스트레인은 FLAEM을 사용하여 생성된다. 두 돌연변이 균주는 tmeA 궤적의 결실을 포함; 그러나, tmeA-lx는 도 5에도시된 gfp DNA의 부재에 의해 지시된 바와 같이 선택 카세트를 포함하지 않는다. tmeA 돌연변이 균주는 mRNA 및 단백질 수준에 의해 도 6에 나타난 tmeB의발현을 감소시켰습니다. FLAEM이 tmeA-lx 돌연변이 균주를 생성하기 위해 이용될 때, 도 6은 tmeB의 발현이 회복된다는 것을 나타낸다.
그림 1: pSUmC-4.0에 삽입하기 위한 게놈 DNA 및 PCR 스크리닝으로부터 5' 및 3' 상동성 무기를 식별하기 위한 회로도 표현. (a) C. 트라코마티스 게놈으로부터의 결실을 표적으로 하는 유전자는 청색 화살표로 나타낸다. 5' 및 3' 상동성 암으로 확인된 3kb 영역은 각각 보라색과 빨간색으로 괄호로 묶입니다. (B, C) pSUmC-4.0에 5' 및 3' 상동성 암의 삽입은 PCR 스크리닝에 의해 결정된다. Sall 및 Sbfl 제한 효소 부위는 pSUmC-4.0 벡터상에서 loxP 사이트(노란색 사각형)에 의해 측면에 있는 aadA(검정 화살표) 및 gfp(녹색 화살표) 선택 카세트를 측면에 나타내었다. (B)5' 스크리닝 프라이머(보라색 화살표 헤드)가 Sall 부위를 가로질러 PCR 증폭에 사용될 때 1kb PCR 제품에 의해 삽입되지 않으며, 3' 스크리닝 프라이머(빨간색 화살표 헤드)가 SbfI 부위 전반에 걸쳐 증폭되는 데 사용됩니다. (C)동일한 조건에서 3kb PCR 제품에 의해 성공적인 삽입이 결정됩니다. 5' 및 3' 상동성 암은 각각 보라색과 빨간색 괄호로 표현됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: gfp-aadA 선택 카세트를 제거하기 위해 크레록스 매개 재조합의 개략적 표현. Cre 재조합의 존재에서, loxP 사이트 (노란색) gfp의절제의 결과로 재결합 -aadA 선택 카세트 (녹색 과 검은 사각형). 생성된 궤적들은 하나의 잔류 loxP 흉터 서열을 함유하는 것을 도시한다. 업스트림(미국) 및 다운스트림(DS) 영역은 회색으로 표시됩니다. 이 그림은 Keb 등 에서수정되었습니다. 12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: pSUmC-4.0 및 pSU-CRE의 유전 조직. C. 트라코마티스에서 벡터의 제어 가능한 유지를 위해, pgp6는 테트라사이클린 유도성 프로모터의 하류로 설계된다. 나머지 pgp 유전자는 그들의 네이티브 클라미다이얼 프로모터의 하류이며, mCherry는 두 벡터 모두에서 구성적으로 발현된다. (a)pSUmC-4.0은 항생제 및 형광 선택 능력에 대해 각각 aadA 및 gfp 유전자를 생성한 카세트 인코딩을 포함한다. Cre 매개 재조합에 대한 LoxP 부위는 선택 카세트 측면에 유전자 특이적 상동성 무기의 삽입을 위한 제한 효소 부위뿐만 아니라 이다. (B)pSU-CRE는 pSUmC-4.0과 유사한 백본을 함유하고 있다; 아직, 재조합 카세트 대신에, blaM 및 cre는 각각 항생제 선택성 및 CRE 재조합 생성을 위해 구성적으로 발현된다. 이 수치는 Keb 등 에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 마커리스 결실 돌연변이를 생성하는 데 사용되는 FLAEM 변환 전략의 개략적 표현. 일반적인 FLAEM 방법은 여기서 야생형 C. 트라코마티스가 순차적으로 변형되고 연속적으로 계류되어 마커리스 결실 돌연변이를 생성하는 것으로 표현된다. 변환 단계는 작은 화살표의 추가로 표현되며 유전 요소의 손실은 작은 화살표의 빼기로 표시됩니다. C. trachomatis 중간체 (원)는 항생제 감도 (페니실린 내성 또는 페니실린 에민감한 = PenGr 또는 PenGs;spectinomy신 내성 또는 spectinomy신 민감성 = Specr 또는 Specs)및 형광 보고 자질 (녹색 = gfp +, 빨간색 = mCherry, += +) 형광으로 표현됩니다. 각 단계에서 유전자 궤적의 개략적 표현은 아래에 도시되어 있다. 이 그림은 Keb 등 에서수정되었습니다. 12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: FRAEM 및 FLAEM은 tmeA 유전자 삭제를 생성하는 데 사용된다. (a)FRAEM을 사용하여 tmeA를생성하고, FLAEM을 사용하여 tmeA-lx를 생성하였다. tmeA 및 다운스트림 tmeB의 상대 DNA 카피 번호; pSUmC-4.0 선택 카세트에 함유된 gfp; pSU-CRE 벡터에 포함된 cre는 모두 도시됩니다. WT, L2 tmeA,또는 L2RiftmeA-lx C. 트라코마티스의 동등한 포함 형성 단위로 감염된 맥코이 세포는 24hpi에서 수확되었고, DNA는 qPCR을 위해 추출되었다. 상대카피번호는 클라미다이얼 16sRNA에 대한 신호 정규화에 의해 평가되었다. ND = 감지되지 않았습니다. (b)L2RiftmeA-lx로부터의 서열된 tmeAB 궤적들은 단일 잔류 loxP 흉터 서열(밑줄)으로 도시된다. DNA의 측면 영역은 파란색으로 표시되고, 시작 코돈은 녹색으로 표시되고, TmeA 스톱 코돈은 빨간색으로 표시됩니다. TmeB에 대한 비 표준 스타트 코돈도 묘사됩니다. 이 수치는 Keb 등 에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: FLAEM을 이용한 선택 카세트의 절제는 tmeA를 표적으로 할 때 tmeB의 발현을 복원하고 다운스트림 유전자를 방해하지 않는다. (a) C. 트라코마티스 tmeA 및 tmeB 돌연변이 균주의 상대 mRNA 수준. tmeA의 하류 전사체의 존재는 역전사(RT) 정량적 PCR에 의해 결정되었다. tmeA/B 오페론의 하류 지역은 ct696을 인코딩합니다. 총 RNA는 WT, L2 tmeA,L2 tmeB,또는 L2RiftmeA-lx를가진 1의 MOI에서 감염된 맥코이 세포로부터 24 hpi에서 분리되었다. tmeA, tmeB및 ct696에 대한 전사체는 qRT-PCR에 의해 검출되었다. 신호는 rpoD로정규화 한 후 표시됩니다. ND = 감지되지 않았습니다. (B) C. 트라코마티스 돌연변이 균주에서 TmeA 및 TmeB의 존재에 대한 서쪽 얼룩. WT, L2 tmeA,L2RiftmeA-lx, 또는 L2RiftmeA-lx ptmeA의 동등한 포함 형성 단위로 감염된 24 hpi 배양물로부터 의 전체 배양 물질의 동등한 양을 TmeA 및 TmeB에 대한 면역 블롯에서 조사했다. Hsp60은 하중 조절제로서 사용되었고, 단백질은 화학발광에 의해 가시화되었다. 그림은 Keb 등에서 수정되었습니다. 12. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기에 설명된 프로토콜은 FLAEM에 의한 C. 트라코마티스의 마커리스 유전자 결실의 생성을 위해 비필수 유전자의 표적 삭제를 허용하고 카세트 유도 극성 효과를 제거한다. 이 프로토콜은 pSUmC 4.0 자살 벡터에 삽입된 5' 및 3' 상동성 무기의 신중한 설계, C. 트라코마티스의 효율적인 변형 및 분리된 돌연변이 균주의 신중한 스크리닝에 의존합니다. 이 방법을 통해 성공적인 게놈 공학은 불형성이고 표적으로 한 유전자 삭제의 사이트에 단 하나 loxP 흉터 순서를 포함하는 박테리아에서 유래합니다. 더욱이, 이 방법은 동일한 C. 트라코마티스 균주 내에서 유전자의 순차적 표적화에 적응될 가능성이 있다.
5' 및 3' 상동성 무기의 신중한 설계와 자살 벡터에 삽입하는 것은 복제 프로세스의 첫 번째이자 가장 중요한 단계입니다. 3 kb 상동성 무기가 가장 효율적인 전점 재조합을 제공한다는 것이 밝혀졌습니다. 이 무기의 삽입은 크고 때로는 작업하기 어려운 벡터를 생성하는 반면, ~ 2 kb는 성공을위한 최소를 나타내는 짧은 팔로 적은 성공이 있었다. Sall 및 Sbfl 제한 부위의 활용은 DNA 조립을 수행할 때 편리한 1단계 시공 반응을 제공한다.
삽입 PCR과 같은 다른 복제 방법도 상동성 무기를 삽입하는 데 효과적이었지만 PCR 기반 오류의 가능성이 더 큽입니다. 흥미롭게도, 5'팔의 복제는 3'팔보다 비교적 효율적이라는 것이 관찰되었습니다. 문제가 발생하면 DNA 어셈블리를 두 가지 반응으로 나누고 단계적으로 벡터를 구성하는 것이 좋습니다. 그런 다음, SbfI로 벡터 백본을 소화하고, 3' 팔을 먼저 삽입한 다음 Sall으로 벡터를 소화하고 두 번째 DNA 조립 반응에 5' 암을 삽입하는 것이 좋습니다.
상형 군을 위한 PCR 단편을 증폭할 때, 또한 이전에 동결되지 않은 신선하게 정제된 C. trachomatis 게놈 DNA를 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 DNA 전단의 가능성을 제한하고 더 큰 앰플리곤을 생성하기위한 효율성을 증가시킵니다. 다른 벡터로부터 상동성 무기를 증폭하는 경우, 정제된 PCR 생성물은 대장균 변형 동안 배경 콜로니를 감소시키기 위해 DNA 조립을 진행하기 전에 처리된 DpnI 제한 효소일 필요가 있을 것이다.
변환은 문제가 발생할 수 있는 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계입니다. pSUmC 4.0의 변환이 성공하면 #3 통로로 녹색 및 빨간색 개재물이 표시되어야 합니다. 그러나 변형제가 풍부해지기 전에 몇 구절이 더 걸릴 수 있습니다. 그밖 돌연변이 발생 접근 같이, 이 방법은 불필요한 유전자의 표적으로 하기 위하여 제한됩니다, 그러나 변환은 아직도 쉽게 성취되어야 합니다. 적색 형광의 보유에 의해 표시된 말기 교환의 부재에 있는 형질전환의 장기 통과는, 표적으로 한 유전자의 삭제가 치명적인 사건이다는 것을 나타낼 수 있습니다.
C. trachomatis에 대한 변환 벡터는 네이티브 pL2와 동일한 복제 기원을 포함하기 때문에 네이티브 플라스미드가 다중(>5) 대구 후에 경화되는 것은 드문 일이 아닙니다. pSUmC 벡터상에서의 pgp 유전자는 네이티브 pL2와 비교하여 상이한 순서로; 따라서 PCR은 pgp7–pgp8에걸쳐 있는 영역을 증폭하여 격리된 변형에서 pL2의 존재를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 네이티브 플라스미드가 최종 결실 돌연변이체에서 분실되면, 발달 연구를 수행하기 전에 재도입되어야 할 것이다. 측면 유전자 전달(LGT)은 pL2플라스미드(19)를재도입하는 데 활용될 수 있다.
많은 경우에, 선택 카세트를 가진 초기 결실 돌연변이는 여전히 pL2 플라스미드를 함유한다. 우리는 pL2를 다시 소개하고 삭제된 유전자의 수리를 피하기 위하여 성공과 함께 LGT를 위한 이 긴장을 이용했습니다. LGT는 pSU-Cre를 도입할 때 변환을 위한 보조 방법으로도 활용할 수 있습니다. 경우에 따라 LGT는 클래식 CaCl2 변환보다 더 효율적이였습니다. LGT가 pSU-Cre를 도입하는 데 활용되는 경우, rpoB 알레를 발현하는 C. 트라코마티스로 시작하는 것이 중요하며, 이는 스펙토마이신 선택 카세트(12,19)의알레릭 교환 및 삽입 전에 리팜핀 저항성을 부여한다. 리팜핀 내성 박테리아로 시작하여 공동 배양 후 선택을 할 수 있습니다.
FLAEM은 유전자 파괴를 달성하기 위해 임의의 돌연변이 발생 또는 뉴클레오티드 서열삽입에 의존하는 다른 유전 적 방법과 비교하여 전체 코딩 서열의 표적 삭제를 통해 역유전적 접근을 가능하게 합니다. FLAEM은 선택 카세트를 제거할 수 있고 이전에 관찰된 카세트 유도 극성 효과를 제거하기 때문에 본질적으로 FRAEM의 확장입니다. 이 방법은 또한 단일 C. trachomatis 긴장에 있는 다중 유전자 삭제를 생성하는 기회를 만듭니다.
다중 돌연변이는 2개의 다른 기계장치를 통해 생성될 수 있습니다. 제1에서, FLAEM은 마커리스 유전자 돌연변이를 생성하고 순차적으로 동일한 균주에서 다른 유전자를 표적화하는데 사용될 수 있다. 제1 결실 돌연변이는 관심 있는 이차 유전자에 특이적인 상동성 무기를 함유하는 pSUmC 4.0 벡터로 변형될 수 있다. 이 경우, 프로토콜은 제1 결실과 동일한 방식으로 반복되어야 하며 유전자를 순차적으로 표적화하기 위해 여러 번 반복되어야 한다. 제2 기작에서, FLAEM 이후에 분리된 마커리스 결실 돌연변이는 여전히 선택 카세트를 포함하는 결실 돌연변이체와 함께 감염될 수 있다. LGT를 통해 두 번째 삭제를 획득하고 선택할 수 있습니다. 이 접근을 사용하는 경우에, 추가 돌연변이는 게놈에 남아 있는 유일한 선택 카세트의 수에 의해 제한됩니다. 변환 도중 선택적인 압력으로 일반적으로 이용되는 항생제는 C. trachomatis를 위해 제한됩니다, 그러나 그(것)들은 페니실린, 클로람페니콜 및 spectinomycin를 포함합니다. Cre-loxP 게놈 편집에 의한 선택 카세트를 제거하면 선택적 압력에 대해 여러 항생제를 사용할 필요가 줄어듭니다. 다중 유전자 서열을 동시에 삭제하는 것은 여러 주요 선수가 있을 수 있는 관련 기능 또는 생물학적 프로세스를 가진 단백질을 공부할 때 유익합니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원, NIAID (보조금 A1065530 및 Al124649)에서 K.A. 필드에 공중 위생 서비스 보조금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam-/dcm- Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
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