Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Markørløs gensletting av Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis i Chlamydia trachomatis

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60848
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

Beskrevet her er en metode for målrettet, markørløs gensletting i Chlamydia trachomatis ved hjelp av floxed kassett allelic exchange mutagenesis, FLAEM.

Abstract

Klamydia trachomatis er et obligatorisk intracellulært patogen som har vært historisk vanskelig å genetisk manipulere. Definitiv fremgang i å belyse mekanismene som C. trachomatis bruker til å skape og opprettholde en privilegert intracellulær nisje har vært begrenset på grunn av mangel på genetiske verktøy. Heldigvis har det nylig vært flere nye fremskritt i genetiske manipulasjonsteknikker. Blant disse er utviklingen av fluorescensrapportert allelic exchange mutagenesis (FRAEM). Denne metoden tillater målrettet gensletting kombinert med innsetting av en utvalgskassett koding antibiotikaresistens og grønt fluorescerende protein (GFP). Avhengighet av denne strategien kan være komplisert når du målretter mot gener innen polycistronic operons på grunn av potensialet for polareffekter på nedstrøms gener. Floxed kassett allelic utveksling mutagenesis (FLAEM), protokollen som er beskrevet her, ble utviklet for å lindre kassett-indusert polareffekter. FLAEM benytter Cre-loxP genomredigering for å fjerne valgkassetten etter målrettet sletting ved allelic exchange. De resulterende stammene inneholder markørløse genslettinger av en eller flere kodesekvenser. Denne teknikken forenkler direkte vurdering av genfunksjon og utvider repertoaret av verktøy for genetisk manipulasjon i C. trachomatis.

Introduction

Klamydia trachomatis er den ledende årsaken til bakteriell seksuelt overførbar sykdom og representerer en betydelig byrde for menneskers helse. Over 100 millioner mennesker er smittet hvert år med C. trachomatis1. Omtrent 70% av infeksjonene hos kvinner er asymptomatiske til tross for skadelige reproduktive helseeffekter, som bekkeninflammatorisk sykdom, ektopisk graviditet, og / eller infertilitet. Sykdomsoppfølgeren er direkte relatert til immunpatologi initiert av C. trachomatis infeksjon2. En effektiv vaksine er ennå ikke utviklet; Derfor er det viktig å forstå funksjonen til bakterielle virulensfaktorer og andre bakterielle genprodukter.

Som intracellulære bakterier er vertscelleinvasjon, intracellulær replikering, frigjøring av avkom og unndragelse av vertsimmunologiske responser kritiske prosesser. C. trachomatis danner en parasitophorous membran bundet vacuole, kalt en inkludering, for intracellulær utvikling. Etablering av inkludering og mange andre kritiske prosesser oppnås ved sekresjon av effektorproteiner via et type III sekresjonssystem (T3SS)3. Belyse funksjonene til disse utskillede effektene var begrenset i mange år på grunn av den genetiske intractability av C. trachomatis. I motsetning til E. coli, mange klassiske kloning teknikker gjelder ikke for Klamydia. Noen få store begrensninger innebærer transformasjoneffektivitet, mangel på motvalgsreportere som sacB og plasmid vedlikehold. Mens E. coli plasmids vanligvis kan opprettholdes på ubestemt tid med en opprinnelse av replikering og passende selektivt trykk, C. trachomatis plasmids krever ytterligere åtte åpne leserammer(pgp1-8) for vedlikehold som finnes på den opprinnelige pL2 plasmid i L2 serovar4.

I de senere årene har det vært flere genetiske verktøy generert som imøtekomme Chlamydia unike biologi, men det er fortsatt begrensninger5,6,7. Kjemisk mutagenesis ved etylmetansulfonat (EMS) behandling kan introdusere feilfølelse mutasjoner, eller (sjeldnere) kan resultere i nukleotid overganger innføre en for tidlig stopp codon å gi en tull mutasjon8. Transposon innsetting er effektiv for genforstyrrelser, men dagens teknologi i Klamydia forskning er arbeidskrevende og tidkrevende9. Både EMS-behandling og transposon mutagenesis teknikker genererer tilfeldige mutasjoner og krever strenge screeningmetoder for å isolere muterte stammer. En metode for å forstyrre gener ved innsetting av gruppe II introner (f.eks. TargeTron) gir mulighet for rettet mutogenese; Denne metoden er imidlertid begrenset av effektivitet, og innsettingsstedet er ikke alltid riktig spådd10.

Fluorescensrapportert allelic exchange mutagenesis (FRAEM) er en strategi som brukes for målrettet gensletting kombinert med innsetting av en utvalgskassett som gir antibiotikaresistens og en fluorescensreporter11. Likevel er FRAEM komplisert av potensialet i kassettinduserte polareffekter på nedstrøms gener, spesielt når man målretter mot gener innen polycistronic operons. Floxed kassett allelic utveksling mutagenesis (FLAEM) er en ny genetisk tilnærming utviklet for å lindre kassett-indusert polareffekter tidligere observert med FRAEM valgkassett12. FLAEM benytter Cre-loxP genomredigering for å fjerne utvalgskassetten og gjenopprette uttrykk for nedstrøms gener. Valgkassetten som inneholder antibiotikaresistens og grønt fluorescerende protein (GFP) er ombygd med flankerende loxP-steder. Disse loxP-områdene kan kombineres i nærvær av Cre recombinase og resultere i utskjæring av kassetten fra genomet13. Denne strategien har vist seg å lindre kassett indusert polareffekter når målretting tmeA for sletting12,14.

Både FRAEM- og FLAEM-metoder bruker samme selvmordsvektor, pSUmC 4.0, som betinget kan opprettholdes gjennom udukanbar uttrykk for pgp6. Uttrykk for pgp6 har tidligere vist seg å være nødvendig for plasmid oppbevaring og er derfor utnyttet til å kontrollere plasmid vedlikehold11,15. Når C. trachomatis dyrkes i media supplert med anhydrotisk tetracyklin (aTc) for å indusere pgp6-uttrykk, opprettholdes vektoren. I fravær av aTc går vektoren tapt. Målrettet gensletting oppnås gjennom allelic utveksling av genet for valgkassetten. De 3 kb regionene direkte oppstrøms og nedstrøms av det målrettede genet tjene som homology armer for rekombinasjon. Disse armene er klonet inn i pSUmC 4.0 vektorflankering av valgkassetten. Vellykket C. trachomatis transformasjon og rekombinasjon hendelser observeres gjennom fluorescens rapportering. Uttrykk for mCherry på vektorryggraden og gfpien innenfor utvalgskassetten gir røde og grønne fluorescerende inneslutninger. Når ATc er fjernet fra kulturmedier, indikerer inkluderte grønne inneslutninger vellykkede rekombinasjonshendelser med tap av selvmordsvektoren og integreringen av valgkassetten i bakteriegenomet.

FLAEM representerer en forlengelse av FRAEM via påfølgende transformasjon av en Cre recombinase-expressing vektor, pSU-Cre, inn i den nyopprettede mutant stammen. Cre recombinase forenkler rekombinasjon mellom loxP-områder og utskjæring av valgkassetten. Rekombinasjonshendelser indikeres via fluorescensrapportering. Den pSU-Cre vektorkoder mCherry; Dermed er vellykket transformasjon indikert ved tillegg av rød fluorescens til gfp-uttrykke inneslutninger. Dyrking i fravær av selektivt trykk for kassetten resulterer i Cre-mediert rekombinasjon på loxP-stedene, og tap av kassetten indikeres av kun rød inneslutninger. Som med pSUmC-4.0 brukes inducible uttrykk for pgp6 til betinget vedlikehold av pSU-Cre. Når aTc og antibiotikavalg er fjernet, er plasmiden kurert, og den resulterende markørløse slettingsstammen er ikke fluorescerende. Denne metoden løser spørsmålet om kassettinduserte polareffekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og montering av pSUmC-4.0 med homology Arms spesifikk for genet av interesse

  1. Identifiser ~3 kb regioner direkte oppstrøms og nedstrøms av genet målrettet for sletting for å tjene som 5 ' og 3 ' homology armer for homologous rekombinasjon (Figur 1).
  2. Design PCR primers til 1) forsterke 3 kb 5 ' homology arm fra chlamydial genomic DNA og 2) inneholder en 15-30 bp overheng som er spesifikk for pSUmC-4.0 når fordøyd på Sall begrensning enzym området. Sørg for at primerområdene overlapper med pSUmC-4.0 har smeltetemperaturer på 55 °C og at smeltetemperaturer for hårnålser for hele primeren er <35 °C.
  3. Design PCR primers til 1) forsterke 3 kb 3 ' homology arm fra chlamydial genomic DNA og 2) inneholder en 15-30 bp overheng som er spesifikk for pSUmC-4.0 når fordøyd på SbfI begrensning enzym området. Sørg for at primerområdene overlapper med pSUmC-4.0 har smeltetemperaturer på 55 °C og at smeltetemperaturer for hårnålser for hele primeren er <35 °C.
  4. Design PCR screening primere som vil forsterke innsetting av hver homologi arm i pSUmC-4.0 vektor etter en DNA montering reaksjon16. Design disse primere til anneal ~ 500 bp utenfor begrensning nettsteder for å tillate enkel visualisering av et PCR-produkt selv om innsettingen var mislykket (Figur 1).
  5. Forsterk 3 kb 5' og 3 ' homology armer fra nyutvunnet chlamydial genomisk DNA av PCR i en til to reaksjoner for å gi nok fragment for senere DNA montering. Følg DNA-polymeraseprodusentens protokoll for spesifikke reaksjonsoppsett- og sykkelforhold.
  6. Kontroller at begge PCR-produktene har riktig størrelse og at reaksjonene ikke inneholder forurensende bånd. Kjør 5 μL av hver PCR-reaksjon på en 1% DNA agarose gel.
  7. Rens og konsentrer PCR-fragmentene ved fenol/kloroformekstraksjon og etanolnedbør.
    1. Pool alle 3 ' PCR reaksjoner sammen i en 1,5 ml rør og bringe til et endelig volum på 200 μL med nuclease-fri H2O. Gjenta denne prosessen for 5 ' PCR reaksjoner.
    2. Tilsett 200 μL fenol til hvert rør og virvel i 30–60 s. Spinn hvert rør i en mikrocentrifuge ved >21 000 x g i 20 min ved romtemperatur (RT).
    3. Overfør det vandige fasetopplaget til hvert rør til et nytt 1,5 ml rør, tilsett en tiendedel av volumet på 3 M natriumacetat til hvert rør, og sveip deretter for å blande.
    4. Tilsett 3 volumer på 100% etanol til hvert rør og sveip for å blande. Inkuber begge rørene ved -80 °C i 20 min.
    5. Pellet DNA ved å spinne hvert rør på > 21.000 x g i 5 min på RT. Kast supernatanten.
    6. Vask DNA-pelleten med 100 μL 70 % etanol. Spinn hvert rør på > 21 000 x g i 5 min ved RT. Kast supernatanten.
    7. Vask DNA-pelleten igjen med 100 μL på 100% etanol. Spinn hvert rør på > 21 000 i 5 min ved RT. Kast supernatanten.
    8. La pelleten tørke helt luft, og deretter forsiktig resuspendere DNA i 12 μL nuclease-fri H2O ved å sveipe for å blande.
  8. Fordøye 500 ng av pSUmC-4.0 vektor i en 20 μL reaksjon med 1 enhet av Sall og 1 enhet av SbfI i henhold til produsentens protokoll. Inkuber reaksjonen i ca. 3 timer eller over natten for å sikre fullstendig fordøyelse av vektoren.
  9. Rens og konsentrer den fordøyde ryggraden ved fenol/kloroformekstraksjon og etanolnedbør som beskrevet tidligere (trinn 1.7.1–1.7.9).
  10. Kombiner den fordøyde pSUmC-4.0-vektoren og både 5' og 3' homology arm PCR-produkter sammen i forholdet 0,01 pmol pSUmC-4.0 til 0.09 pmol hver homologi arm. Monter fragmentene i en DNA-monteringsreaksjon i henhold til produsentens protokoll.
  11. Forvandle 50 μL elektrokompetent E. coli med 1 μL av DNA-monteringsreaksjonen. Plate den forvandlede E. coli på LB agar plater som inneholder 100 μg / ml spektrtinomycin ved å spre 150 μL per plate. Inkuber platene ved 37 °C over natten.
  12. Neste dag, skjerm kolonier for grønn og rød fluorescens ved hjelp av en epifluorescens invertert mikroskop. Det forventes totalt 5–30 kolonier per agarplate.
  13. Velg 5–10 kolonier for å inokulere 4 ml LB kjøttkraft supplert med 100 μg/ml spektrtinomycin. Inkuber kulturer ved 37 °C over natten med risting på 250 o/min.
  14. Bruk de over natten E. coli kulturer, utføre småskala DNA rensing. Elute DNA med 50 μL kjernefri H2O.
  15. Bekreft innsettingen av hver homologiarm i pSUmC-4.0-vektoren ved hjelp av PCR-screeningprimere (designet i trinn 1.4) for å forsterke hver innsetting. Hvis DNA-montering en vellykket, bør et PCR-produkt på ~4 kb observeres i en 1 % DNA-agarosegel for både 5- og 3-armområdene. Et PCR-produkt med ~1 kb angir mangel på innsetting.
    MERK: Hvis innsettingen av homologiarmene mislykkes i en dobbel fragmentmonteringsreaksjon, utfører du to monteringsreaksjoner for å sette inn 5-armen og deretter 3' armen, individuelt. Fordøye vektoren med bare Sall før du monterer med 5'-armen, og fordøye deretter vektoren med SbfI for å montere 3-armen.
  16. Transform dam-/ dcm- kompetent E. coli med 200 ng av pSUmc-4.0 montert med begge homologi armer. Plate de forvandlede bakteriene på LB agarplater som inneholder 100 μg/ml spektrin ved å spre 25 μL per tallerken. Inkuber platene ved 37 °C over natten. Det forventes totalt 20–200 kolonier.
  17. Screen platene for røde og grønne fluorescerende kolonier som beskrevet i trinn 1.13.
  18. Sett opp en kultur for en storstilt DNA-rensing ved å inokulere 100 ml LB kjøttkraft som inneholder 100 μg/ml spektrtinomycin med røde og grønne kolonier. Inkuber kulturen ved 37 °C over natten med risting på 250 o/min.
  19. Høst kulturen og rense DNA ved hjelp av en storstilt DNA rensing.
    1. Resuspender det rensede plasmid-DNAet på nytt i 100 μL NF-H2O. En total DNA-utbytte på minst 2 μg/μL er ideell for C. trachomatis transformasjon.
    2. Sekvens 5' og 3 ' homology arm regioner for å sikre riktig montering i pSUmC-4.0 før du transformerer C. trachomatis.

2. Transformasjon av C. trachomatis med pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion av Allelic Exchange

  1. Seed McCoy celler, mus fibroblaster som standard brukes til å dyrke Klamydia, i to 6 brønnplater (1 x 106 celler / brønn) med vekst media #1. Inkuber platene ved 37 °C med 5 % CO2 til monolayeren er konfluent (ca. 24 timer).
  2. I et 1,5 ml rør, tilsett et volum av C. trachomatis WT serovar L2 elementære organer (EBs) som er tilstrekkelig til å infisere 12 brønner av en 6 brønnplate på en MOI på 2. Pellet EB-ene på > 20 000 x g i 30 min, og kast deretter supernatanten.
  3. Start klamydial transformasjon ved å forsiktig resuspendere EB i 600 μL caCl2 buffer, og deretter legge til 24 μg pSUmC-4.0 + homology armer til røret. Bland oppløsningen forsiktig ved å sveipe. Inkuber røret ved RTfor 30 min og sveip for å blande hver 10 min.
  4. Tilsett transformasjonsløsningen til 24 ml Hanks' balanserte saltoppløsning (HBSS) og bland ved å forsiktig pipettere. Overfør 2 ml i nonotoiet til hver brønn av confluent McCoy-celler i de 6 brønnplatene og inmitter ved sentrifugering ved 900 x g i 1 t ved 20 °C.
  5. Fjern inoculum og erstatt med 2 ml /well RPMI vekstmedia #2. Inkuber platene ved 37 °C med 5 % CO2.
  6. Etter minimum 7 timer, men ikke mer enn 12 timer, erstatt mediene med 2 ml/brønn av utvalgsmedier #1. Fortsett inkubasjonen ved 37 °C i 48 timer fra infeksjonstidspunktet.
  7. Høst og passasje bakteriene på en frisk monolayer av McCoy celler.
    1. Bruk en celleskraper til å skrape McCoy-monolaget forsiktig for å løfte cellene inn i mediet. Overfør materialet fra hver brønn til et 2 ml rør. Pellet cellematerialet på > 20.000 x g i en mikrocentrifuge i 30 min ved 4 °C.
    2. Fjern og kast supernatanten. Sett cellepellet på nytt i 1 ml HBSS ved å forsiktig pipettere.
    3. Pellet cellerester ved 200 x g i 5 min ved 4 °C. Overfør supernatanten til en frisk brønn av confluent McCoy celler. Tilsett ytterligere 1 ml HBSS til hver brønn for et totalt volum på 2 ml/brønn.
    4. Infeksiasjon ved 900 x g i 1 t ved 20 °C. Erstatt inokulum et utvalgsmedium #1 umiddelbart etter infeksjon.
  8. Fortsett å passere bakteriene på et friskt monolayer av McCoy-celler (avsnitt 2.7) hver 48 timer for tre eller flere passasjer til røde og grønne inneslutninger oppdages ved hjelp av et epifluorescensinvertmikroskop 24 t postinfeksjon (24 hpi).
  9. Når røde og grønne inneslutninger oppdages, fortsetter du å passere monolayer (avsnitt 2.7) ved hjelp av utvalgsmedier #2.
  10. Fortsett å passere monolayer til grønne inkluderinger oppdages 24 hpi (passasje #3 eller senere), noe som indikerer tap av pSUmC-4.0 vektor og inkorporering av loxP valgkassetten i genomet.
  11. Velg en brønn av grønne inkluderinger for å berike ved å passere. Høst og frys eventuelle andre brønner som også inneholder inkluderte grønne inneslutninger i sukrose-fosfat-glutamatbuffer (SPG).
    1. For å berike grønn-bare inneslutninger, passasje monolayer fra en brønn av en 6 brønnplate som gjort i trinn 2.7, men etter pelleting cellen rusk (trinn 2.7.3), overføre supernatant en konisk med 12 ml HBSS. Bruk denne inoculum til å infisere to 6 brønnplater ved å legge til 2 ml per brønn, og spinn platene ved 900 x g i 60 min ved 20 °C.
    2. For å fryse flere brønner, høst monolayer som i trinn 2.7.1, men resuspenderpellets i 1 ml SPG i stedet for HBSS. Pellet cellen rusk (trinn 2.7.3) og overføre supernatant en 1,5 ml kryotube. Frys materialet ved -80 °C.
  12. Etter å ha beriket grønn-bare inneslutninger til en MOI på 0,5-1,0 (en til to flere passasjer etter deteksjon), høste monolagene i SPG som beskrevet i trinn 2.11.2. Oppnå aliquots på 50 μL i 1,5 ml rør og frys ved -80 °C.
  13. Titer grønne bakterier for å bestemme inkludering, forming enheter / μL, i henhold til en standard titrering protokoll17.

3. Klonal isolasjon av grønn-bare C. trachomatis Sletting Mutant Inneholder loxP flankert utvalgkassett ved å begrense fortynning

  1. Frø en 384 brønnvev kultur plate med 50 μL McCoy celler på ~ 2000 celler / godt i vekst media #1. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 for ~24 timer eller til konfluent.
  2. Fortynn en aliquot av grønne bakterier i HBSS for å oppnå ~ 50 EB per 20 ml. Overfør den fortynnede inokulumet til et reservoarbrett.
    1. Fjern mediet fra 384-brønnplaten ved å sveipe hele platen opp ned i en avfallsbeholder. Bruk en flerkanals pipette tilsett 50 μL C. trachomatis inokulum til hver brønn. Infeksiasjon ved 900 x g i 1 t ved 20 °C.
      MERK: Vær oppmerksom på ikke å knipse så hardt at monolayer løsner. Hvis cellene er over-confluent, vil de løsne lettere.
  3. Fjern inonotonen ved å sveipe og erstatte med 50 μL/brønnvekstmedier #2. Inkubatplater ved 37 °C med 5 % CO2.
    MERK: På dette stadiet er integrering av utvalgskassetten i genomet stabilt, så antibiotikavalg med spektrtinomycin er ikke lenger nødvendig.
  4. Etter å ha inkubert platen i 5–12 dager, må du identifisere individuelle brønner med grønne fluorescerende inneslutninger ved hjelp av et epifluorescensinert mikroskop eller en screeningplattform med høyt innhold.
  5. Høst brønner med inkluderte grønne inneslutninger ved å skrape monolayeren med en p-10-spiss og overføre hele innholdet i brønnen til et rør som inneholder 2 ml HBSS. Bland forsiktig og påfør 2 ml inokulum på en fersk konfluent McCoy monolayer i en 6 brønnplate for infeksjon.
    MERK: Ved identifisering av individuelle brønner med inneslutninger, vil inkluderingene være i en klynge på grunn av utvidelse fra den første inkluderingen. Hvis en brønn har flere klynger, er det sannsynlig at mer enn én EB i utgangspunktet smittet så godt. Disse brønnene bør ikke høstes, og i noen tilfeller kan det være nødvendig med flere runder med klonal isolasjon ved seriefortynning.
  6. Insmitter 6 brønnplate ved sentrifugering ved 900 x g i 1 t ved 20 °C. Erstatt inokulum med 2 ml/brønnvekst#2. Inkuber ved 37 °C med 5 % CO2 for 48 timer.
  7. Gjenta trinn 2.11–2.13 for å berike, fryse og titerklonale populasjoner.
  8. Bekreft slettingen av målrettede gener fra klonalt isolert C. trachomatis ved hjelp av qPCR som tidligere beskrevet12.

4. Transformasjon av C. trachomatis FRAEM Mutant med pSU-Cre for å initiere fjerning av loxP flankert utvalgkassett

  1. Gjenta transformasjonsprosessen i en 6 brønnplate som tidligere beskrevet (trinn 2.1–2.8) ved hjelp av klonalt isolert C. trachomatis FRAEM mutant, pSU-Cre vektor og utvalgsmedier #3.
    MERK: En vellykket transformasjon indikeres av inneslutninger som er røde og grønne fluorescerende.
    1. Passasje monolayer til rød-bare inneslutninger oppdages ved hjelp av en epifluorescens invertert mikroskop, noe som indikerer tap av valgkassetten (to til tre passasjer). Fortsett å passere monolayer til rød-bare inneslutninger er beriket til en MOI på ~ 0,5.
  2. Isolere rød-bare inneslutninger ved å begrense fortynning i en 384 brønnplate som tidligere beskrevet (trinn 3.1-3.8); Bruk imidlertid utvalgsmedier #3 for alle trinn.
  3. Berike klonale populasjoner ved å passere til en MOI på 0,1. Når beriket, erstatte seksjon media med vekst media #2 for å initiere tap av pSU-Cre vektor (ca tre til fire passasjer).
  4. Klonalt isolerer ikke-fluorescerende bakterier (trinn 3.1–3.8); Imidlertid manuelt skanne platen med et brightfield mikroskop for å oppdage inneslutninger. Berike og fryse bakterier (trinn 2.11–2.12).
  5. Skjerm for mutant belastning ved hjelp av kvantitative real-time PCR, Western blotting, og hele genom DNA Sekvensering som tidligere beskrevet12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden for markørløs gensletting i C. trachomatis ved hjelp av FLAEM er avhengig av forsiktig kloning og transformasjonteknikker. Vellykket allelic rekombinasjon er et viktig første skritt og krever identifisering og innsetting av homology armer i pSUmC-4.0 kloning vektor (Figur 1). Et viktig andre skritt for markørløs gensletting er fjerning av fluorescensreporteren og antibiotikavalgkassetten ved Cre-lox genomredigering, representert i figur 2. Vektorene som brukes til å utføre hvert av disse trinnene, kommenteres i figur 3. Figur 4 viser en skjematisk representasjon av transformasjonsstrategien for å generere en markørløs slettingmutant når du starter med villtype C. trachomatis.

Representative data er vist i figur 5 og figur 6, der tmeA er rettet mot gensletting. C. trachomatis tmeA sletting stamme genereres ved hjelp av FRAEM, og C. trachomatis tmeA-lx belastning genereres ved hjelp av FLAEM. Begge mutantstammer inneholder en sletting av tmeA locus; tmeA-lx inneholder imidlertid ikke valgkassetten, som indikert ved fravær av fp-DNA vist i figur 5. Den tmeA mutant stammen har redusert uttrykk for tmeB, vist i figur 6 av mRNA og proteinnivåer. Når FLAEM brukes til å generere tmeA-lx mutant belastning, Figur 6 viser at uttrykket av tmeB gjenopprettes.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon for å identifisere 5' og 3' homologi armer fra genomisk DNA og PCR screening for deres innsetting i pSUmC-4.0. (A) Et gen som er rettet mot sletting fra C. trachomatis genomet er representert av den blå pilen. De 3 kb regionene identifisert som 5 ' og 3 ' homology armer for allelic recombination er bracketed i lilla og rødt, henholdsvis. - Jeg har ikke noe åsi. Innsetting av 5' og 3' homology armer i pSUmC-4.0 bestemmes av PCR screening. Sall- og Sbfl-begrensningsenzymstedene vises flankering av aadA (svart pil) og gfp (grønn pil) valgkassett som er flankert av loxP-områder (gule firkanter) på pSUmC-4.0-vektoren. (B) Ingen innsetting bestemmes av et PCR-produkt på 1 kb når 5'-screeningprimere (lilla pilhoder) brukes til å forsterke PCR-forsterkeren over Sall-området, eller 3'-screeningprimere (røde pilhoder) brukes til å forsterke over SbfI-området. (C) Vellykket innsetting bestemmes av 3 kb PCR-produkter under samme forhold. 5' og 3' homology armer er representert ved de lilla og røde braketter, henholdsvis. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk representasjon av Cre-lox mediert rekombinasjon for å fjerne gfp-aadA utvalgkassett. I nærvær av Cre recombinase, kombinerer loxP-områdene (gul), noe som resulterer i utskjæring av gfp-aadA-markeringskassetten (grønne og svarte firkanter). Den resulterende locus vises som inneholder en gjenværende loxP arr sekvens. Oppstrøms (US) og nedstrøms (DS)-områder vises i grått. Dette tallet er endret fra Keb et al.12. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Genetisk organisering av pSUmC-4.0 og pSU-CRE. For kontrollerbar vedlikehold av vektorene i C. trachomatis, er pgp6 konstruert nedstrøms av en tetracyklin-inducible arrangør. De resterende pgp genene er nedstrøms av sine innfødte Chlamydial arrangører, og mCherry er konstitutivt uttrykt på begge vektorer. (A) pSUmC-4.0 inneholder en kassett koding constitutivly uttrykt aadA og gfp gener for antibiotika og fluorescens utvalg evne, henholdsvis. LoxP nettsteder for Cre mediert rekombinasjon samt begrensning enzym områder for innsetting av genspesifikke homology armer flankere valgkassetten. (B) pSU-CRE inneholder en lignende ryggrad som pSUmC-4.0; likevel, i stedet for rekombinasjonkassetten, blaM og cre er konstitutivt uttrykt for antibiotika selektivitet og CRE rekombinase generasjon, henholdsvis. Disse tallene er endret fra Keb et al.12. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk representasjon av FLAEM-transformasjonsstrategien som brukes til å skape en markørløs slettingmutant. Den generelle FLAEM-metoden er representert her hvor Wild-type C. trachomatis er sekvensielt forvandlet og seriemessig passasjer for å generere en markørløs sletting mutant. Transformasjonstrinn representeres av tillegg av små piler, og tap av genetiske elementer er representert ved subtraksjon av små piler. C. trachomatis intermediates (sirkler) er representert med antibiotikafølsomheter (penicillinresistente eller penicillinfølsomme = PenGr ellerPenGs; spectinomycinresistente eller spektrtinomycinfølsomme = Specr eller Specs) og fluorescensrapporteringskvaliteter (grønn = gfp +, rød = mCherry +, grå = ingen fluorescens). Skjematiske representasjoner av genlocus på hvert trinn er vist nedenfor. Dette tallet er endret fra Keb et al.12. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: FRAEM og FLAEM brukes til å generere tmeA genslettinger. (A) FRAEM ble brukt til å generere tmeA, og FLAEM ble brukt til å generere tmeA-lx. Relativ DNA kopi tall av tmeA og nedstrøms tmeB; gfp inneholdt på pSUmC-4.0 utvalgkassett; og cre som finnes på pSU-CRE-vektoren, vises alle. McCoy-celler infisert med like inklusjonsformingsenheter av WT, L2 tmeAeller L2RiftmeA-lx C. trachomatis ble høstet ved 24 hki, og DNA ble ekstrahert for qPCR. Relative kopinumre ble vurdert ved signalnormalisering til klamydial 16sRNA. ND = ingen oppdaget. (B) Den sekvenserte tmeAB-lokusen fra L2RiftmeA-lx vises med en enkelt gjenværende loxP-arrsekvens (understreket). De flankerende områdene av DNA er vist i blått, startkodonene vises i grønt, og TmeA-stoppkodonen vises i rødt. Den ikke-kanoniske startcodon for TmeB er også avbildet. Disse tallene er endret fra Keb et al.12. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Avgift for utvalgskassett ved hjelp av FLAEM gjenoppretter uttrykk for tmeB når du målretter mot tmeA og forstyrrer ikke nedstrømsgener. (A) Relativ mRNA nivå av C. trachomatis tmeA og tmeB mutant stammer. Tilstedeværelsen av transkripsjoner nedstrøms av tmeA ble bestemt av omvendt transkripsjonase (RT) kvantitativ PCR. Regionen rett nedstrøms av tmeA / B operon koder ct696. Total RNA ble isolert på 24 hki fra McCoy celler infisert på en MOI på 1 med WT, L2 tmeA,L2 tmeB,eller L2RiftmeA-lx. Transkripsjoner for tmeA, tmeBog ct696 ble oppdaget av qRT-PCR. Signaler presenteres etter normalisering til rpoD. ND = ingen oppdaget. (B) Vestlig blot for tilstedeværelse av TmeA og TmeB i C. trachomatis mutant stammer. Like mengder helkulturmateriale fra 24 hkikulturer smittet med like inklusjonsdannende enheter av WT, L2 tmeA,L2RiftmeA-lx eller L2RiftmeA-lx ptmeA ble undersøkt i immunbloter for TmeA og TmeB. Hsp60 ble brukt som en lasting kontroll, og proteiner ble visualisert av chemiluminescence. Figuren er endret fra Keb et al.12. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som er beskrevet her for generering av markørløse genslettinger i C. trachomatis fra FLAEM tillater målrettet sletting av ikke-essensielle gener og eliminerer kassettinduserte polareffekter. Protokollen er avhengig av forsiktig utforming av 5' og 3' homology armer satt inn i pSUmC 4.0 selvmord vektor, effektiv transformasjon av C. trachomatis, og forsiktig screening av isolerte mutant stammer. Vellykket genomteknikk via denne metoden resulterer i bakterier som ikke er fluorescerende og inneholder en enkelt loxP arrsekvens på stedet for målrettet gensletting. Videre har denne metoden potensial til å tilpasses for sekvensiell målretting av gener innenfor samme C. trachomatis belastning.

Forsiktig utforming av 5' og 3' homology armer og innsetting i selvmordororen er det første og mest kritiske trinnet i kloningsprosessen. Det har blitt funnet at 3 kb homology armer gir den mest effektive allelic rekombinasjon. Mens innsetting av disse armene genererer en vektor som er stor og noen ganger vanskelig å jobbe med, har det vært mindre suksess med kortere armer, med ~ 2 kb som representerer et minimum for suksess. Utnyttelse av Sall og Sbfl begrensning nettsteder gir en praktisk ett-trinns konstruksjon reaksjon når du utfører DNA montering.

Andre kloning metoder, for eksempel innsetting PCR, har også vært effektive i å sette inn homology armer, men de introduserer større mulighet for PCR-baserte feil. Interessant, det har blitt observert at kloning av 5 'armen er relativt mer effektiv enn 3 'arm. Hvis problemet oppstår, anbefales det å dele DNA-enheten i to reaksjoner og konstruere vektoren på en trinnvis måte. Deretter anbefales det å fordøye vektorryggraden med SbfI, sett inn 3-armen først, fordøye vektoren med Sall og sett inn 5'-armen i en annen DNA-monteringsreaksjon.

Når forsterke PCR fragmenter for homology armene, det anbefales også å bruke nyrenset C. trachomatis genomisk DNA som ikke har vært tidligere frosset. Dette begrenser muligheten for DNA-klipping og øker effektiviteten for å generere større ampuller. Hvis amplifisering av homologiarmer fra en annen vektor, må det rensede PCR-produktet være DpnI-restriksjonsenzym behandlet før du fortsetter til DNA-montering for å redusere bakgrunnskolonier under E. coli-transformasjon.

Transformasjon er et annet kritisk trinn i denne protokollen der det kan oppstå problemer. Hvis transformasjonen med pSUmC 4.0 er vellykket, bør grønne og røde inneslutninger være synlige ved å passere #3; Det kan imidlertid ta flere passasjer før transformanter blir beriket. Som andre mutagenesis tilnærminger, er denne metoden begrenset til målretting av ikke-essensielle gener, men transformasjon bør fortsatt gjøres lett. Langsiktig passaging av transformanter i fravær av allelic utveksling, indikert ved oppbevaring av rød fluorescens, kan tyde på at sletting av det målrettede genet er en dødelig hendelse.

Fordi transformasjonvektorer for C. trachomatis inneholder samme opprinnelse av replikering som den opprinnelige pL2, er det ikke uvanlig at den opprinnelige plasmiden blir kurert etter flere (>5) passasjer. PGP-genene på pSUmC-vektorene er i en annen rekkefølge sammenlignet med den innfødte pL2; Derfor kan PCR brukes til å oppdage tilstedeværelsen av pL2 i en isolert belastning ved å forsterke regionen som strekker seg over pgp7-pgp8. Hvis den innfødte plasmid går tapt i endelig sletting mutant, må det gjeninnføres før du gjennomfører utviklingsstudier. Lateral genoverføring (LGT) kan benyttes til å gjeninnføre pL2 plasmid19.

I mange tilfeller inneholder tidlige slettingsmutanter med valgkassetten fortsatt pL2 plasmid. Vi har benyttet disse stammene for LGT med suksess for å gjeninnføre pL2 og unngå reparasjon av det slettede genet. LGT kan også benyttes som en sekundær metode for transformasjon når du introduserer pSU-Cre. I noen tilfeller var LGT mer effektiv enn klassisk CaCl 2-transformasjon. I tilfeller der LGT benyttes til å introdusere pSU-Cre, er det viktig å starte med C. trachomatis som uttrykker en rpoB allele, som gir rifampin motstand før allelic utveksling og innsetting av spectinomycin utvalgkassett12,19. Fra og med rifampinresistente bakterier tillater valg etter co-kultur.

FLAEM muliggjør omvendt-genetiske tilnærminger med målrettet sletting av hele kodingsekvenser, sammenlignet med andre genetiske metoder som er avhengige av tilfeldig mutagenesis eller innsetting av nukleotidsekvenser for å oppnå genforstyrrelser. FLAEM er i hovedsak en forlengelse av FRAEM, da det tillater fjerning av valgkassetten og eliminerer tidligere observerte kassettinduserte polareffekter. Denne metoden skaper også muligheten til å generere flere genslettinger i en enkelt C. trachomatis belastning.

Flere mutasjoner kan genereres via to forskjellige mekanismer. I den første kan FLAEM brukes til å generere en markørløs genmutasjon og sekvensielt brukt til å målrette mot et annet gen i samme belastning. Den første slettingmutanten kan omtransformeres med pSUmC 4.0-vektoren som inneholder homologiarmer som er spesifikke for sekundært gen av interesse. I dette tilfellet bør protokollen gjentas på samme måte som den første slettingen og gjentas flere ganger for å målrette gener sekvensielt. I den andre mekanismen kan den markørløse slettingsmutanten isolert etter FLAEM bli infisert samtidig med en slettingsmutant som fortsatt inneholder en markeringskassett. Gjennom LGT er den andre slettingen anskaffet og kan velges for. Når du bruker denne tilnærmingen, er flere mutasjoner begrenset av antall unike utvalgskassetter igjen i genomet. Vanligvis brukes antibiotika som brukes som selektivt trykk under transformasjon er begrenset for C. trachomatis, men de inkluderer penicillin, kloramfenikol, og spektrtinomycin. Fjerning av utvalgskassetten ved Cre-loxP genomredigering reduserer behovet for å bruke flere antibiotika for selektivt trykk. Sletting av flere gensekvenser samtidig er gunstig når du studerer proteiner med relaterte funksjoner eller biologiske prosesser som kan ha flere nøkkelspillere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Public Health Service tilskudd fra National Institute of Health, NIAID (tilskudd A1065530 og Al124649), til K.A. Fields.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 155 Cre recombinase FLAEM FRAEM Klamydia mutagenesis allelic utveksling allelic recombination
Markørløs gensletting av Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis i <em>Chlamydia trachomatis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keb, G., Fields, K. A. Markerless… More

Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter