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Immunology and Infection

Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en Chlamydia trachomatis

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60848
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

Aquí se describe un método para la eliminación de genes dirigida y sin marcadores en Chlamydia trachomatis mediante mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed, FLAEM.

Abstract

La clamidia trachomatis es un patógeno intracelular obligatorio que ha sido históricamente difícil de manipular genéticamente. El progreso definitivo en la esclarecimiento de los mecanismos que C. trachomatis utiliza para crear y mantener un nicho intracelular privilegiado se ha limitado debido a la falta de herramientas genéticas. Afortunadamente, recientemente ha habido varios avances nuevos en las técnicas de manipulación genética. Entre ellos se encuentra el desarrollo de mutagénesis de intercambio alélico reportada por fluorescencia (FRAEM). Este método permite la eliminación de genes dirigida junto con la inserción de un casete de selección que codifica resistencia a los antibióticos y proteína fluorescente verde (GFP). La confianza en esta estrategia puede ser complicada cuando se dirige a genes dentro de operines policistricos debido al potencial de efectos polares en genes aguas abajo. Mutagénesis de intercambio alélico de casete floxed (FLAEM), el protocolo para el que se describe aquí, fue desarrollado para aliviar los efectos polares inducidos por casete. FLAEM utiliza la edición del genoma Cre-loxP para eliminar el casete de selección después de la eliminación dirigida por intercambio alélico. Las cepas resultantes contienen eliminaciones genéticas sin marcadores de una o más secuencias de codificación. Esta técnica facilita la evaluación directa de la función génica y amplía el repertorio de herramientas para la manipulación genética en C. trachomatis.

Introduction

La clamidia trachomatis es la principal causa de enfermedad bacteriana de transmisión sexual y representa una carga significativa para la salud humana. Más de 100 millones de personas se infectan cada año con C. trachomatis1. Aproximadamente el 70% de las infecciones en las mujeres son asintomáticas a pesar de los efectos perjudiciales para la salud reproductiva, como la enfermedad inflamatoria pélvica, el embarazo ectópico o la infertilidad. La secuencia de la enfermedad está directamente relacionada con la inmunopatología iniciada por la infección por C. trachomatis 2. Aún no se ha desarrollado una vacuna eficaz; por lo tanto, comprender la función de los factores de virulencia bacteriana y otros productos genéticos bacterianos es una cuestión de investigación importante y urgente.

Como bacterias intracelulares, la invasión de células huésped, la replicación intracelular, la liberación de progenie y la evasión de las respuestas inmunológicas del huésped son procesos críticos. C. trachomatis forma una vacuola ligada a la membrana parasitoforo, denominada inclusión, para el desarrollo intracelular. Establecimiento de la inclusión y muchos otros procesos críticos se logran mediante la secreción de proteínas efectoras a través de un sistema de secreción tipo III (T3SS)3. Elaludar las funciones de estos efectores secretados fue limitada durante muchos años debido a la intractabilidad genética de C. trachomatis. A diferencia de E. coli, muchas técnicas clásicas de clonación no son aplicables a la clamidia. Algunas limitaciones importantes implican la eficiencia de la transformación, la falta de reporteros de contraselección como sacB y mantenimiento de plásmidos. Mientras que los plásmidos de E. coli generalmente pueden mantenerse indefinidamente con un origen de replicación y una presión selectiva adecuada, C. trachomatis plásmido requiere ocho marcos de lectura abiertos adicionales (pgp1-8) para el mantenimiento que se encuentran en el plásmido pL2 nativo dentro del l2 serovar4.

En los últimos años se han generado múltiples herramientas genéticas que acomodan la biología única de La clamidia, pero todavía hay limitaciones5,6,7. La mutagénesis química por tratamiento de metanosulfonato etílico (EMS) puede introducir mutaciones erróneas, o (con menos frecuencia) puede dar lugar a transiciones de nucleótidos que introducen un codón de parada prematuro para producir una mutación sin sentido8. La inserción de transposon es eficiente para la interrupción de genes, pero la tecnología actual en la investigación de la clamidia es laboriosa y requiere mucho tiempo9. Tanto el tratamiento del SME como las técnicas de mutagénesis de transposón generan mutaciones aleatorias y requieren métodos de detección rigurosos para aislar las cepas mutantes. Un método para interrumpir genes mediante la inserción de intrones de grupo II (por ejemplo, TargeTron) permite la mutagénesis dirigida; sin embargo, este método está limitado por la eficiencia, y el sitio de inserción no siempre se predice correctamente10.

Mutagénesis de intercambio alélico reportada por fluorescencia (FRAEM) es una estrategia utilizada para la eliminación de genes dirigido según la inserción de un casete de selección que proporciona resistencia a los antibióticos y un reportero de fluorescencia11. Sin embargo, la FRAEM se complica por el potencial de los efectos polares inducidos por casetes en genes aguas abajo, especialmente cuando se dirige a genes dentro de operons policistricos. La mutagénesis del intercambio alélico de casete floxed (FLAEM) es un novedoso enfoque genético desarrollado para aliviar los efectos polares inducidos por casete observados previamente con el casete de selección FRAEM12. FLAEM utiliza la edición del genoma De xalo para eliminar el casete de selección y restaurar la expresión de genes aguas abajo. El casete de selección que contiene resistencia a los antibióticos y proteína fluorescente verde (GFP) se ha rediseñado con sitios loxP flanqueantes. Estos sitios loxP pueden recombinarse en presencia de Cre recombinase y dar lugar a la escisión del casete del genoma13. Esta estrategia se ha demostrado para aliviar los efectos polares inducidos por el casete al apuntar a tmeA para la eliminación12,14.

Los métodos FRAEM y FLAEM utilizan el mismo vector suicida, pSUmC 4.0, que se puede mantener condicionalmente mediante la expresión inducible de pgp6. Anteriormente se ha demostrado que la expresión de pgp6 es necesaria para la retención de plásmidos y, por lo tanto, se aprovecha para controlar el mantenimiento del plásmido11,15. Cuando C. trachomatis se cultiva en medios complementados con tetraciclina anhidra (aTc) para inducir la expresión pgp6, se mantiene el vector. En ausencia de aTc, el vector se pierde. La eliminación de genes dirigida se logra mediante el intercambio alélico del gen para el casete de selección. Las regiones de 3 kb directamente aguas arriba y aguas abajo del gen dirigido sirven como brazos homológicos para la recombinación. Estos brazos se clonan en el vector pSUmC 4.0 que flanquea el casete de selección. Los eventos exitosos de transformación y recombinación de C. trachomatis se observan a través de informes de fluorescencia. La expresión de mCherry en la columna vertebral vectorial y gfp dentro del casete de selección producen inclusiones fluorescentes rojas y verdes. Una vez que aTc se elimina de los medios de cultivo, las inclusiones de solo verde indican eventos de recombinación exitosos con la pérdida del vector suicida y la integración del casete de selección en el genoma bacteriano.

FLAEM representa una extensión de FRAEM a través de la transformación posterior de un vector cúdita-expresión de la recombinación Cre, pSU-Cre, en la cepa mutante recién creada. Cre recombinase facilita la recombinación entre los sitios loxP y la escisión del casete de selección. Los eventos de recombinación se indican mediante informes de fluorescencia. El vector pSU-Cre codifica mCherry; por lo tanto, la transformación exitosa se indica mediante la adición de fluorescencia roja a gfp-expresando inclusiones. El cultivo en ausencia de presión selectiva para el cassette da como resultado una recombinación mediada por Cre en los sitios loxP, y la pérdida del cassette se indica mediante inclusiones solo rojas. Al igual que con pSUmC-4.0, la expresión inducible de pgp6 se utiliza para mantener condicionalmente pSU-Cre. Una vez que se retiran las selecciones de aTc y antibióticos, el plásmido se cura y la cepa de eliminación sin marcadores resultante no es fluorescente. Este método aborda el problema de los efectos polares inducidos por casete.

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Protocol

1. Diseño y montaje de pSUmC-4.0 con armas de homología específicas para el gen de interés

  1. Identificar las regiones de 3 kb directamente aguas arriba y aguas abajo del gen destinado a la eliminación para servir como los brazos homtológicos de 5' y 3' para la recombinación homóloga(Figura 1).
  2. Diseñar imprimaciones PCR a 1) amplificar el brazo homológico de 3 kb 5' a partir del ADN genómico clamímico y 2) contienen un voladizo de 15 a 30 bp específico de pSUmC-4.0 cuando se digiere en el sitio de la enzima restricción Sall. Asegúrese de que las regiones de imprimación superpuestas con pSUmC-4.0 tengan temperaturas de fusión de 55 oC y de que las temperaturas de fusión de la horquilla para toda la imprimación sean <35 oC.
  3. Diseñar imprimaciones PCR a 1) amplificar el brazo homológico de 3 kb 3' a partir del ADN genómico clamidia y 2) contienen un voladizo de 15 a 30 bp específico de pSUmC-4.0 cuando se digiere en el sitio de la enzima de restricción SbfI. Asegúrese de que las regiones de imprimación superpuestas con pSUmC-4.0 tengan temperaturas de fusión de 55 oC y de que las temperaturas de fusión de la horquilla para toda la imprimación sean <35 oC.
  4. Diseñar imprimadores de cribado PCR que amplificarán la inserción de cada brazo de homología en el vector pSUmC-4.0 después de una reacción de ensamblaje de ADN16. Diseñe estas imprimaciones para recocido s 500 bp fuera de los sitios de restricción para permitir una fácil visualización de un producto PCR incluso si la inserción no tuvo éxito(Figura 1).
  5. Amplificar los brazos de homología de 3 kb 5' y 3' del ADN genómico clamídial recién extraído por PCR en una o dos reacciones para producir suficiente fragmento para el ensamblaje posterior del ADN. Siga el protocolo del fabricante de la polimerasa de ADN para una configuración de reacción específica y condiciones de ciclismo.
  6. Verifique que ambos productos PCR tengan el tamaño correcto y que las reacciones no contengan bandas contaminantes. Ejecutar 5 l de cada reacción de PCR en un gel de agarosa de ADN al 1%.
  7. Purificar y concentrar los fragmentos de PCR mediante la extracción de fenol/cloroformo y la precipitación de etanol.
    1. Agrupa todas las reacciones de PCR de 3' en un tubo de 1,5 ml y lleva a un volumen final de 200 l con H2O sin nucleasas. Repita este proceso para las reacciones de PCR de 5'.
    2. Añadir 200 l de fenol a cada tubo y vórtice durante 30–60 s. Girar cada tubo en una microcentrífuga a >21.000 x g durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT).
    3. Transfiera la capa superior de fase acuosa de cada tubo a un nuevo tubo de 1,5 ml, agregue una décima parte del volumen de acetato de sodio de 3 M a cada tubo y, a continuación, deslice para mezclar.
    4. Añadir 3 volúmenes de 100% etanol a cada tubo y flick para mezclar. Incubar ambos tubos a -80oC durante 20 min.
    5. Peletele el ADN girando cada tubo a >21,000 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.
    6. Lavar el pellet de ADN con 100 ml de etanol al 70 %. Gire cada tubo a >21.000 x g durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.
    7. Lave el pellet de ADN de nuevo con 100 ml de etanol al 100%. Gire cada tubo a >21.000 durante 5 min en RT. Deseche el sobrenadante.
    8. Deje que el pellet se seque completamente al aire, luego resuspenda suavemente el ADN en 12 sl de H2O sin nucleasas moviendo para mezclar.
  8. Digerir 500 ng del vector pSUmC-4.0 en una reacción de 20 l con 1 unidad de Sall y 1 unidad de SbfI según el protocolo de fabricación. Incubar la reacción durante aproximadamente 3 h o durante la noche para asegurar la digestión completa del vector.
  9. Purificar y concentrar la columna vertebral digerida por extracción de fenol/cloroformo y precipitación de etanol como se describió anteriormente (paso 1.7.1–1.7.9).
  10. Combine el vector pSUmC-4.0 digerido y los productos de PCR del brazo homtológico de 5' y 3' en una proporción de 0,01 pmol pSUmC-4.0 a 0,09 pmol cada brazo homtológico. Montar los fragmentos en una reacción de ensamblaje de ADN de acuerdo con el protocolo de la fabricación.
  11. Transformar 50 l de E. coli electrocompetente con 1 l de la reacción de ensamblaje del ADN. Placar la E. coli transformada en placas de agar LB que contengan 100 g/ml de espectromicina esparciendo 150 ml por placa. Incubar las placas a 37oC durante la noche.
  12. Al día siguiente, las colonias de pantalla para la fluorescencia verde y roja utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia. Se esperan un total de 5-30 colonias por placa de agar.
  13. Escoge de 5 a 10 colonias para inocular 4 ml de caldo LB complementado con espectromicina de 100 g/ml. Incubar cultivos a 37oC durante la noche con agitación a 250 rpm.
  14. Usando los cultivos nocturnos de E. coli, realice purificación de ADN a pequeña escala. Eluye el ADN con 50 l de H2O libre de nucleasas.
  15. Confirme la inserción de cada brazo de homología en el vector pSUmC-4.0 utilizando las imprimaciones de cribado PCR (diseñadas en el paso 1.4) para amplificar cada inserción. Si el ensamblaje de ADN es exitoso, se debe observar un producto de PCR de 4 kb en un gel de agarosa de ADN del 1% para las regiones del brazo de 5' y 3'. Un producto PCR de 1 kb indica una falta de inserción.
    NOTA: Si la inserción de los brazos de homología no tiene éxito en una reacción de ensamblaje de doble fragmento, realice dos reacciones de montaje para insertar el brazo de 5' y luego 3' brazo, individualmente. Digerir el vector con sólo Sall antes de ensamblar con el brazo de 5', luego digerir el vector con SbfI para ensamblar el brazo de 3'.
  16. Transformar presa-/dcm- competente E. coli con 200 ng de pSUmc-4.0 montado con ambos brazos de homología. Placar las bacterias transformadas en placas de agar LB que contienen 100 g/ml de espectromicina mediante la propagación de 25 ml por placa. Incubar las placas a 37oC durante la noche. Se esperan un total de 20-200 colonias.
  17. Busque las placas en busca de colonias fluorescentes rojas y verdes como se describe en el paso 1.13.
  18. Establecer un cultivo para una purificación de ADN a gran escala mediante la inoculación de 100 ml de caldo LB que contiene 100 g/ml de espectromicina con colonias rojas y verdes. Incubar el cultivo a 37oC durante la noche con agitación a 250 rpm.
  19. Cosecha el cultivo y purifica el ADN usando una purificación de ADN a gran escala.
    1. Resuspenda el ADN plásmido purificado en 100 ml de NF-H2O. Un rendimiento total de ADN de al menos 2 g/l es ideal para la transformación de C. trachomatis.
    2. Secuenciar las regiones del brazo de homología de 5' y 3' para asegurar el correcto montaje en pSUmC-4.0 antes de transformar C. trachomatis.

2. Transformación de C. trachomatis con pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion by Allelic Exchange

  1. Células McCoy de semilla, fibroblastos de ratón utilizados estándarmente para el cultivo de clamidia,en dos placas de 6 pozos (1 x 106 células/pozo) con medios de crecimiento #1. Incubar las placas a 37oC con un 5% deCO2 hasta que la monocapa sea confluente (aproximadamente 24 h).
  2. En un tubo de 1,5 ml, agregue un volumen de cuerpos elementales C. trachomatis WT serovar L2 que sea suficiente para infectar 12 pozos de una placa de 6 pocillos en un MOI de 2. Peletar los EBs a >20,000 x g durante 30 min, luego deseche el sobrenadante.
  3. Inicie la transformación clamidia mediante la resustitución suave de los EBs en 600 ml de tampón CaCl2, y luego agregue 24 g de pSUmC-4.0 + brazos homtológicos al tubo. Mezcle suavemente la solución moviendo. Incubar el tubo a RTfor 30 min y mover para mezclar cada 10 min.
  4. Añada la solución de transformación a 24 ml de la solución salina equilibrada (HBSS) de Hanks y mezcle pipeteando suavemente. Transfiera 2 ml del inóculo a cada pozo de células Confluentes de McCoy en las 6 placas de pozo e infecte por centrifugación a 900 x g durante 1 h a 20 oC.
  5. Retire el inóculo y sustitúyalo por medios de crecimiento RPMI de 2 ml/bien #2. Incubar las placas a 37oC con 5% co2.
  6. Después de un mínimo de 7 h, pero no más de 12 h, reemplace el soporte por 2 ml/bien de los medios de selección #1. Continuar la incubación a 37oC durante 48 h desde el momento de la infección.
  7. Cosecha y pasa las bacterias a una nueva monocapa de células McCoy.
    1. Usando un rascador de celdas, raspe suavemente la monocapa de McCoy para levantar las células en los medios. Transfiera el material de cada pozo a un tubo de 2 ml. Peletel el material celular a >20.000 x g en una microcentrífuga durante 30 min a 4 oC.
    2. Retire y deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet celular en 1 ml de HBSS pipeteando suavemente.
    3. Reventar los restos celulares a 200 x g durante 5 min a 4 oC. Transfiera el sobrenadante a un pozo fresco de células McCoy confluentes. Añadir 1 ml adicional de HBSS a cada pocal para un volumen total de 2 ml/bien.
    4. Infectar por centrifugación a 900 x g durante 1 h a 20oC. Sustituya el inóculo por un medio de selección #1 inmediatamente después de la infección.
  8. Continúe pasando la bacteria a una nueva monocapa de células McCoy (sección 2.7) cada 48 h durante tres o más pasajes hasta que se detecten inclusiones rojas y verdes utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia 24 h después de la infección (24 hpi).
  9. Una vez detectadas las inclusiones rojas y verdes, continúe paseando la monocapa (sección 2.7) utilizando medios de selección #2.
  10. Continuar el paso de la monocapa hasta que se detecten inclusiones sólo verdes 24 hpi (pasaje #3 o posterior), lo que indica la pérdida del vector pSUmC-4.0 y la incorporación del casete de selección loxP en el genoma.
  11. Elija un pozo de inclusiones solo verdes para enriquecer se enriquece con el passaging. Cosecha y congela cualquier otro pozo que también contenga inclusiones de solo verde en tampón de sacarosa-fosfato-glutamato (SPG).
    1. Para enriquecer las inclusiones sólo verdes, pasar la monocapa de un pozo de una placa de 6 pozos como se hace en el paso 2.7, pero después de peletizar los restos celulares (paso 2.7.3), transferir el sobrenadante en un cónico con 12 ml de HBSS. Utilice este inóculo para infectar dos 6 placas de pozo agregando 2 mL por pozo, luego gire las placas a 900 x g durante 60 min a 20 oC.
    2. Para congelar pozos adicionales, cosechar la monocapa como en el paso 2.7.1, pero resuspender los pellets en 1 mL de AAP en lugar de HBSS. Reventar los restos celulares (paso 2.7.3) y transferir el sobrenadante en un criotubo de 1,5 ml. Congele el material a -80 oC.
  12. Después de enriquecer las inclusiones de solo verde a un MOI de 0.5–1.0 (uno a dos pasajes más después de la detección), cosecha las monocapas en SPG como se describe en el paso 2.11.2. Obtener alícuotas de 50 ml en tubos de 1,5 ml y congelar a -80 oC.
  13. Bacterias de titer green-only para determinar la inclusión, formando unidades / L, de acuerdo con un protocolo de valoración estándar17.

3. Aislamiento Clonal de C. trachomatis Desovainado binario que contiene el casete de selección flanqueado loxP limitando la dilución

  1. Sembrar una placa de cultivo de tejido de 384 pozos con 50 ol de células McCoy a 2.000 células/bien en media de crecimiento #1. Incubar a 37oC con un 5 % deCO2 durante 24 h o hasta que confluente.
  2. Diluir una alícuota de bacterias sólo verdes en HBSS para lograr 50 EBs por 20 ml. Transfiera el inóculo diluido a una bandeja de depósito.
    1. Retire el medio de la placa de pozo 384 moviendo firmemente toda la placa boca abajo en un contenedor de residuos. Con una pipeta multicanal, añada 50 s de C. trachomatis inoculum a cada pocil. Infectar por centrifugación a 900 x g durante 1 h a 20oC.
      NOTA: Tenga en cuenta no mover tan fuerte que la monocapa se separa. Si las células son sobre-confluentes, se separarán más fácilmente.
  3. Retire el inóculo parpadeando y sustitúyalo por medios de crecimiento de 50 l/pozos #2. Incubar placas a 37oC con 5% co2.
    NOTA: En esta etapa, la integración del casete de selección en el genoma es estable, por lo que ya no es necesaria la selección de antibióticos con espectinomicina.
  4. Después de incubar la placa durante 5-12 días, identifique pozos individuales con inclusiones fluorescentes verdes utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia o una plataforma de cribado de alto contenido.
  5. Cosecha pozos con inclusiones sólo verdes raspando la monocapa con una punta p-10 y transfiriendo todo el contenido del pozo a un tubo que contiene 2 ml de HBSS. Mezcle suavemente y aplique los 2 ml de inóculo a una monocapa McCoy confluente fresca en una placa de 6 pocillos para la infección.
    NOTA: Al identificar pozos individuales con inclusiones, las inclusiones estarán en un clúster debido a la expansión de la inclusión inicial. Si un pozo tiene varios clústeres, es probable que más de un EB haya infectado inicialmente ese pozo. Estos pozos no deben ser cosechados, y en algunos casos, pueden ser necesarias múltiples rondas de aislamiento clonal por dilución en serie.
  6. Infectar la placa de 6 pocillos por centrifugación a 900 x g durante 1 h a 20 oC. Sustituya el inóculo por un medio de crecimiento de 2 ml/pozo #2. Incubar a 37oC con 5 %co2 durante 48 h.
  7. Repita los pasos 2.11–2.13 para enriquecer, congelar y titer poblaciones clonales.
  8. Confirmar la eliminación de genes dirigidos de C. trachomatis aislados clonalmente utilizando qPCR como se describió anteriormente12.

4. Transformación de C. trachomatis FRAEM Mutante con pSU-Cre para iniciar la eliminación de loxP Flanked Selection Cassette

  1. Repita el proceso de transformación en una placa de 6 pozos como se describió anteriormente (pasos 2.1–2.8) utilizando el mutante FRAEM aislado clonalmente, vector pSU-Cre y medios de selección #3.
    NOTA: Una transformación exitosa se indica mediante inclusiones que son fluorescentes rojas y verdes.
    1. Pasar la monocapa hasta que se detecten inclusiones sólo rojas utilizando un microscopio invertido de epifluorescencia, que indica la pérdida del casete de selección (dos a tres pasajes). Continúe pase la monocapa hasta que las inclusiones solo rojas se enriquezcan a un MOI de 0,5.
  2. Aislar clonalmente inclusiones sólo de color rojo limitando la dilución en una placa de pozo 384 como se describió anteriormente (pasos 3.1–3.8); sin embargo, utilice los medios de selección #3 para todos los pasos.
  3. Enriquecer las poblaciones clonales mediante el paso hasta un MOI de 0,1. Una vez enriquecidos, sustituya los medios de sección por medios de crecimiento #2 para iniciar la pérdida del vector pSU-Cre (aproximadamente de tres a cuatro pasajes).
  4. Aislar clonalmente bacterias no fluorescentes (pasos 3.1–3.8); sin embargo, escanee manualmente la placa con un microscopio de campo brillante para detectar inclusiones. Enriquecer y congelar bacterias (paso 2.11–2.12).
  5. Pantalla para la cepa mutante utilizando PCR cuantitativo en tiempo real, hincha occidental y secuenciación de ADN del genoma completo como se describió anteriormente12.

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Representative Results

El método para la eliminación de genes sin marcadores en C. trachomatis utilizando FLAEM depende de técnicas cuidadosas de clonación y transformación. La recombinación alélica exitosa es un primer paso esencial y requiere la identificación e inserción de brazos de homología en el vector de clonación pSUmC-4.0 (Figura 1). Un segundo paso esencial para la eliminación de genes sin marcadores es la eliminación del reportero de fluorescencia y el casete de selección de antibióticos mediante la edición del genoma de Cre-lox, representados en la Figura 2. Los vectores utilizados para realizar cada uno de estos pasos se anotan en la Figura 3. La Figura 4 muestra una representación esquemática de la estrategia de transformación para generar un mutante de eliminación sin marcadores al comenzar con C. trachomatisde tipo salvaje.

Los datos representativos se muestran en la Figura 5 y la Figura 6,en la que tmeA está dirigido a la eliminación de genes. La cepa de eliminación de C. trachomatis tmeA se genera utilizando FRAEM, y la cepa C. trachomatis tmeA-lx se genera utilizando FLAEM. Ambas cepas mutantes contienen una eliminación del locus tmeA; sin embargo, tmeA-lx no contiene el casete de selección, como lo indica la ausencia de ADN gfp que se muestra en la Figura 5. La cepa mutante tmeA ha disminuido la expresión de tmeB,que se muestra en la Figura 6 por los niveles de ARNm y proteínas. Cuando se utiliza FLAEM para generar la cepa mutante tmeA-lx, la Figura 6 muestra que se restaura la expresión de tmeB.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática para identificar brazos homológicos de 5' y 3' a partir de pruebas de detección de ADN genómico y PCR para su inserción en pSUmC-4.0. (A) Un gen destinado a la eliminación del genoma de C. trachomatis está representado por la flecha azul. Las regiones de 3 kb identificadas como los brazos homtológicos de 5' y 3' para la recombinación alélica están entre corchetes en púrpura y rojo, respectivamente. (B,C) La inserción de los brazos de homología de 5' y 3' en pSUmC-4.0 se determina mediante cribado de PCR. Los sitios de la enzima restricción Sall y Sbfl se muestran flanqueando el casete de selección aadA (flecha negra) y gfp (flecha verde) que está flanqueado por sitios loxP (cuadrados amarillos) en el vector pSUmC-4.0. (B) No se determina ninguna inserción mediante un producto PCR de 1 kb cuando se utilizan imprimaciones de cribado de 5' (cabezas de flecha púrpura) para amplificar PCR en todo el sitio de Sall, o las imprimaciones de cribado de 3' (cabezas de flecha roja) se utilizan para amplificar a través del sitio SbfI. (C) La inserción correcta se determina mediante productos PCR de 3 kb en las mismas condiciones. Los brazos de homología de 5' y 3' están representados por los corchetes púrpura y rojo, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Representación esquemática de la recombinación mediada por Cre-lox para eliminar el casete de selección gfp-aadA. En presencia de Cre recombinase, los sitios loxP (amarillo) se recombinan, lo que resulta en la escisión de la gfp- casete de selecciónaadA (cuadrados verdes y negros). El locus resultante se muestra que contiene una secuencia de cicatrices loxP restante. Las regiones ascendentes (EE. UU.) y aguas abajo (DS) se muestran en gris. Esta cifra ha sido modificada de Keb et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Organización genética de pSUmC-4.0 y pSU-CRE. Para el mantenimiento controlable de los vectores en C. trachomatis, pgp6 está diseñado aguas abajo de un promotor inducible de tetraciclina. Los genes pgp restantes son aguas abajo de sus promotores nativos de Chlamydial, y mCherry se expresa constitutivamente en ambos vectores. (A) pSUmC-4.0 contiene un casete que codifica los genes aadA y gfp expresados constitutivamente para la capacidad de selección de antibióticos y fluorescencia, respectivamente. Los sitios LoxP para la recombinación mediada por Cre, así como los sitios de enzimas de restricción para la inserción de brazos de homología específicos del gen flanquean el casete de selección. (B) pSU-CRE contiene una columna vertebral similar a pSUmC-4.0; sin embargo, en lugar del casete de recombinación, blaM y cre se expresan constitutivamente para la selectividad de los antibióticos y la generación de recombinasde CRE, respectivamente. Estas cifras han sido modificadas de Keb et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Representación esquemática de la estrategia de transformación FLAEM utilizada para crear un mutante de eliminación sin marcadores. El método FLAEM general se representa aquí donde El tipo salvaje C. trachomatis se transforma secuencialmente y se pasa en serie para generar un mutante de eliminación sin marcadores. Los pasos de transformación están representados por la adición de flechas pequeñas, y la pérdida de elementos genéticos está representada por la resta de flechas pequeñas. Losintermedios de C. trachomatis (círculos) están representados con sensibilidades antibióticas (resistentes a la penicilina o sensibles a la penicilina, a La pengr o a la PenGs;a la resistencia a la espectromicina o sensible a la espectromicina, a las cualidades de informe de fluorescencia (verde, gfp +, rojo, mCherry +, gris, no fluorescencia). A continuación se muestran las representaciones esquemáticas del locus genético en cada paso. Esta cifra ha sido modificada de Keb et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: FRAEM y FLAEM se utilizan para generar deleciones genéticas tmeA. (A) FRAEM se utilizó para generar tmeA,y FLAEM se utilizó para generar tmeA-lx. Números relativos de copia de ADN de tmeA y tmeB aguas abajo; gfp contenidos en el casete de selección pSUmC-4.0; y se muestran los cre contenidos en el vector pSU-CRE. Las células de McCoy infectadas con unidades formadoras de igual inclusión de WT, L2 tmeAo L2RiftmeA-lx C. trachomatis se cosecharon a 24 hpi, y se extrajo ADN para qPCR. Los números de copia relativos se evaluaron mediante la normalización de la señal a la arNM de clamidia 16s. ND: ninguno detectado. (B) El locus tmeAB secuenciado de L2RiftmeA-lx se muestra con una única secuencia de cicatrices loxP restante (subrayada). Las regiones flanqueantes del ADN se muestran en azul, los codones de inicio se muestran en verde, y el codón de parada TmeA se muestra en rojo. También se representa el codón de inicio no canónico para TmeB. Estas cifras han sido modificadas de Keb et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: La escisión del casete de selección mediante FLAEM restaura la expresión de tmeB al apuntar a tmeA y no interrumpe los genes descendentes. (A) Nivel relativo de ARNm de cepas mutantes C. trachomatis tmeA y tmeB. La presencia de transcripciones aguas abajo de tmeA se determinó mediante PCR cuantitativo de transcriptasa inversa (RT). La región inmediatamente aguas abajo del tmeA/B operon codifica ct696. El ARN total se aisló a 24 hpi de las células de McCoy infectadas a un MOI de 1 con WT, L2 tmeA,L2 tmeBo L2RiftmeA-lx. Las transcripciones de tmeA, tmeBy ct696 fueron detectadas por qRT-PCR. Las señales se presentan después de la normalización a rpoD. ND: ninguno detectado. (B) Western blot por presencia de TmeA y TmeB en cepas mutantes de C. trachomatis. Las mismas cantidades de material de cultivo entero de 24 cultivos de hpi infectados con unidades formadoras de igual inclusión de WT, L2 tmeA,L2RiftmeA-lx o L2RiftmeA-lx ptmeA fueron sondeadas en inmunoblots para TmeA y TmeB. Hsp60 se utilizó como control de carga, y las proteínas fueron visualizadas por quimioluminiscencia. La figura ha sido modificada de Keb et al.12. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo descrito aquí para la generación de deleciones de genes sin marcadores en C. trachomatis por FLAEM permite la eliminación dirigida de genes no esenciales y elimina los efectos polares inducidos por casete. El protocolo se basa en el diseño cuidadoso de los brazos de homología de 5' y 3' insertados en el vector suicida pSUmC 4.0, la transformación eficiente de C. trachomatis, y la detección cuidadosa de cepas mutantes aisladas. La ingeniería exitosa del genoma a través de este método da como resultado bacterias que no son fluorescentes y contienen una sola secuencia de cicatrices loxP en el sitio de la deleción genética dirigida. Además, este método tiene el potencial de ser adaptado para la focalización secuencial de genes dentro de la misma cepa de C. trachomatis.

El diseño cuidadoso de los brazos de homología de 5' y 3' y la inserción en el vector suicida es el primer y más crítico paso del proceso de clonación. Se ha encontrado que los brazos de homología de 3 kb proporcionan la recombinación alélica más eficiente. Mientras que la inserción de estos brazos genera un vector que es grande y a veces difícil de trabajar, ha habido menos éxito con brazos más cortos, con 2 kb representando un mínimo para el éxito. La utilización de los sitios de restricción Sall y Sbfl proporciona una reacción de construcción conveniente de un solo paso al realizar el ensamblaje de ADN.

Otros métodos de clonación, como la PCR de inserción, también han sido eficaces en la inserción de brazos homológicos, pero introducen una mayor posibilidad de errores basados en PCR. Curiosamente, se ha observado que la clonación del brazo de 5' es comparativamente más eficiente que el brazo de 3'. Si surge un problema, se recomienda dividir el conjunto de ADN en dos reacciones y construir el vector de manera escalonada. A continuación, se aconseja digerir la columna vertebral vectorial con SbfI, insertar el brazo de 3'primero, luego digerir el vector con Sall e insertar el brazo de 5' en una segunda reacción de ensamblaje de ADN.

Al amplificar fragmentos de PCR para los brazos de homología, también se recomienda utilizar ADN genómico C. trachomatis recién purificado que no haya sido previamente congelado. Esto limita la posibilidad de cizallamiento de ADN y aumenta la eficiencia para generar amplificadores más grandes. Si amplifica los brazos de homología de otro vector, el producto de PCR purificado tendrá que ser enzima de restricción DpnI tratada antes de proceder al ensamblaje del ADN para reducir las colonias de fondo durante la transformación de E. coli.

La transformación es otro paso crítico de este protocolo en el que pueden surgir problemas. Si la transformación con pSUmC 4.0 es exitosa, las inclusiones verde y roja deben ser visibles por pasaje #3; sin embargo, puede tomar varios pasajes más antes de que los transformantes se enriquezcan. Al igual que otros enfoques de mutagénesis, este método se limita a la orientación de genes no esenciales, sin embargo, la transformación todavía debe lograrse fácilmente. El passing a largo plazo de transformadores en ausencia de intercambio alélico, indicado por la retención de la fluorescencia roja, puede indicar que la deleción del gen dirigido es un evento letal.

Dado que los vectores de transformación para C. trachomatis contienen el mismo origen de replicación que el pL2 nativo, no es raro que el plásmido nativo se cure después de varios pasajes (>5). Los genes pgp en los vectores pSUmC están en un orden diferente en comparación con el pL2 nativo; por lo tanto, PCR se puede utilizar para detectar la presencia de pL2 en una cepa aislada amplificando la región que abarca pgp7–pgp8. Si el plásmido nativo se pierde en el mutante de eliminación final, tendrá que ser reintroducido antes de realizar estudios de desarrollo. La transferencia de genes laterales (LGT) puede utilizarse para reintroducir el plásmido pL219.

En muchos casos, los mutantes de eliminación temprana con el casete de selección todavía contienen el plásmido pL2. Hemos utilizado estas cepas para LGT con éxito para reintroducir pL2 y evitar la reparación del gen eliminado. LGT también se puede utilizar como un método secundario para la transformación al introducir pSU-Cre. En algunos casos, LGT fue más eficiente que la transformación clásica de CaCl2. En los casos en que se utiliza LGT para introducir pSU-Cre, es importante comenzar con C. trachomatis que expresan un alelo rpoB, que confiere resistencia a la rifampina antes del intercambio alélico y la inserción del casete de selección de esparmicina12,19. A partir de bacterias resistentes a la rifampicina permite la selección después del cocultivo.

FLAEM permite enfoques multigenéticos inversos con eliminación específica de secuencias de codificación completas, en comparación con otros métodos genéticos que se basan en mutagénesis aleatoria o inserción de secuencias de nucleótidos para lograr la interrupción genética. FLAEM es esencialmente una extensión de FRAEM, ya que permite la eliminación del casete de selección y elimina los efectos polares inducidos previamente por el casete. Este método también crea la oportunidad de generar múltiples deleciones genéticas en una sola cepa de C. trachomatis.

Se pueden generar múltiples mutaciones a través de dos mecanismos diferentes. En la primera, FLAEM se puede utilizar para generar una mutación genética sin marcadores y se utiliza secuencialmente para atacar otro gen en la misma cepa. El primer mutante de deleción puede ser retransformado con el vector pSUmC 4.0 que contiene brazos homológicos específicos para el gen secundario de interés. En este caso, el protocolo debe repetirse de la misma manera que la primera eliminación y repetirse varias veces para apuntar a los genes secuencialmente. En el segundo mecanismo, el mutante de eliminación sin marcador aislado después de FLAEM puede ser coinfectado con un mutante de eliminación que todavía contiene un casete de selección. A través de LGT, se adquiere la segunda eliminación y se puede seleccionar para. Cuando se utiliza este enfoque, las mutaciones adicionales están limitadas por el número de casetes de selección únicos que quedan en el genoma. Los antibióticos de uso común utilizados como presión selectiva durante la transformación son limitados para C. trachomatis, pero incluyen penicilina, cloramphenicol y espectinomicina. La eliminación del cassette de selección por edición del genoma Cre-loxP reduce la necesidad de utilizar múltiples antibióticos para la presión selectiva. Eliminar múltiples secuencias genéticas al mismo tiempo es beneficioso cuando se estudian proteínas con funciones relacionadas o procesos biológicos que pueden tener múltiples actores clave.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Servicio de Salud Pública del Instituto Nacional de Salud, NIAID (becas A1065530 y Al124649), a K.A. Fields.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

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References

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Inmunología e infección número 155 Cre recombinación FLAEM FRAEM clamidia,mutagénesis intercambio alélico recombinación alélica
Eliminación de genes sin marcadores por Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis en <em>Chlamydia trachomatis</em>
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Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

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