Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Märklös genborttagning av Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis i Chlamydia trachomatis

Published: January 30, 2020 doi: 10.3791/60848
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

Beskrivs här är en metod för riktade, markörlösa genborttagning i Chlamydia trachomatis med floxed kassett allelisk utbyte mutagenes, FLAEM.

Abstract

Klamydia trachomatis är en obligate intracellulär patogen som historiskt har varit svårt att genetiskt manipulera. Definitiva framsteg i att belysa de mekanismer som C. trachomatis använder för att skapa och upprätthålla en privilegierad intracellulär nisch har begränsats på grund av brist på genetiska verktyg. Lyckligtvis har det nyligen gjorts flera nya framsteg inom genetisk manipulation stekniker. Bland dessa är utvecklingen av fluorescens-rapporterade allelic utbyte mutagenes (FRAEM). Denna metod möjliggör riktad genborttagning i kombination med införandet av ett urval kassett kodning antibiotikaresistens och grönt fluorescerande protein (GFP). Beroendet av denna strategi kan vara komplicerat när man riktar gener inom polycistroniska operoner på grund av polareffekternas potential på gener i efterföljande led. Floxed kassettallelic utbyte mutagenes (FLAEM), det protokoll som beskrivs här, har utvecklats för att lindra kassett-inducerad polareffekter. FLAEM använder Cre-loxP genomredigering för att ta bort valet kassett efter riktad borttagning av allelic utbyte. De resulterande stammarna innehåller markörlösa genborttagningar av en eller flera kodningssekvenser. Denna teknik underlättar direkt bedömning av genfunktion och utökar repertoar av verktyg för genetisk manipulation i C. traomat.

Introduction

Klamydia trachomatis är den vanligaste orsaken till bakteriell sexuellt överförbara sjukdomar och utgör en betydande börda för människors hälsa. Över 100 miljoner människor är smittade varje år med C. trachomatis1. Cirka 70% av infektionerna hos kvinnor är asymtomatiska trots skadliga reproduktiva hälsoeffekter, såsom bäckeninflammation, utomkvedshavandeskap och/eller infertilitet. Disease sequela är direkt relaterade till immunpatologi initieras av C. trachomatis infektion2. Ett effektivt vaccin har ännu inte utvecklats. Därför är förståelse n hos bakteriellvirulensfaktorer och andra bakteriegenprodukter en viktig och brådskande forskningsfråga.

Som intracellulära bakterier, värdcellinvasion, intracellulär replikering, frisättning av avkomma och undanflykter av värdimmunologiska svar är kritiska processer. C. trasrör bildar ett parasitoforous membran bundet vacuole, kallas en inkludering, för intracellulär utveckling. Upprättandet av inkluderingen och många andra kritiska processer uppnås genom utsöndring av effektellerproteiner via ett sekretsystem av typ III (T3SS)3. Belysa funktionerna hos dessa utsöndrade effektorer var begränsad i många år på grund av den genetiska intractability av C. trasomat. Till skillnad från E. coliär många klassiska kloningstekniker inte tillämpliga på Klamydia. Några stora begränsningar innebär omvandling effektivitet, brist på motval reportrar såsom sacB, och plasmid underhåll. Medan E. coli plasmider i allmänhet kan upprätthållas på obestämd tid med ett ursprung i replikering och lämpligt selektivt tryck, C. traomatis plasmider kräver ytterligare åtta öppna läsramar(pgp1-8) för underhåll som finns på den ursprungliga pL2 plasmid inom L2 serovar4.

Under de senaste åren har det förekommit flera genetiska verktyg som har genererats som rymmer Chlamydia unika biologi, men det finns fortfarande begränsningar5,6,7. Kemisk mutagenes genom etylmetanulfonat (EMS) behandling kan införa missense mutationer, eller (mindre ofta) kan resultera i nukleotid övergångar införa en för tidig stopp kodon att ge en nonsens mutation8. Transposon insättning är effektiv för genstörningar, men nuvarande teknik i Klamydia forskning är mödosam och tidskrävande9. Både EMS behandling och transposon mutagenesis tekniker generera slumpmässiga mutationer och kräver rigorösa screening metoder för att isolera mutanta stammar. En metod för att störa gener genom införande av grupp II-introner (t.ex. TargeTron) möjliggör riktad mutagenes; Denna metod begränsas dock av effektivitet och insättningsplatsen är inte alltid korrekt förutspådd10.

Fluorescensrapporterade allelic utbyte mutagenes (FRAEM) är en strategi som används för riktade genborttagning i kombination med införandet av ett urval kassett som ger antibiotikaresistens och en fluorescens reporter11. Ändå kompliceras FRAEM av risken för kassettinducerade polareffekter på gener i efterföljande led, särskilt när gener inom polycistroniska operoner riktar sig. Floxed kassettallelutbyte (FLAEM) är en ny genetisk metod som utvecklats för att lindra de kassetter-inducerade polareffekter som tidigare observerats med FRAEM urvalkassetten12. FLAEM använder Cre-loxP genomredigering för att ta bort urvalkassetten och återställa uttryck för nedströms gener. Urvalskassetten som innehåller antibiotikaresistens och grönt fluorescerande protein (GFP) omkonstrueras med flankerande loxP-platser. Dessa loxP-platser kan kombineras i närvaro av Cre rekombinas och resultera i excision av kassetten frångenomet 13. Denna strategi har visat sig lindra kassettinducerade polareffekter när man riktar sig till tmeA för radering12,14.

Både FRAEM och FLAEM metoder använder samma självmord vektor, pSUmC 4.0, som kan villkorligt upprätthållas genom inducerbara uttryck för pgp6. Uttryck för pgp6 har tidigare visat sig vara nödvändigt för plasmid retention och är därför utnyttjas för att kontrollera plasmid underhåll11,15. När C. trasomat odlas i media kompletteras med vattenfri tetracyklin (aTc) för att inducera pgp6 uttryck, vektorn upprätthålls. I avsaknad av aTc, är vektorn förlorad. Riktad genborttagning uppnås genom allelic utbyte av genen för valet kassett. De 3 kb regionerna direkt uppströms och nedströms av den riktade genen fungera som homologi armar för rekombination. Dessa armar klonas in i pSUmC 4.0 vektor flankerande valet kassett. Framgångsrika C. trasrör omvandling och recombination händelser observeras genom fluorescens rapportering. Uttryck för mCherry på vektorn stamben och gfp inom valet kassett avkastning röda och gröna fluorescerande inneslutningar. När aTc tas bort från kulturmedia, grön-bara inneslutningar indikeraframgångsrika rekombination händelser med förlusten av självmord vektor och integration av valet kassett i bakteriegenomet.

FLAEM representerar en förlängning av FRAEM via efterföljande omvandling av en Cre rekombinas-uttrycka vektor, pSU-Cre, i den nyskapade mutant stam. Cre rekombinas underlättar rekombination mellan loxP-platser och excision av urvalskassetten. Rekombinationshändelser anges via fluorescensrapportering. PSU-Cre vektor kodar mCherry; således indikeras framgångsrik omvandling genom tillägg av röd fluorescens till gfp-uttryckainkluderingar. Odling i avsaknad av selektivt tryck för kassetten resulterar i kremedierad kombination på loxP-platserna, och förlust av kassetten indikeras av endast röda inkluderingar. Som med pSUmC-4.0 används inducerbart uttryck för pgp6 för att villkorligt upprätthålla pSU-Cre. När aTc och antibiotika urval tas bort, plasmid botas, och den resulterande markörlösa borttagning stam är nonfluorescerande. Den här metoden åtgärdar problemet med kassettinducerade polareffekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design och montering av pSUmC-4.0 med homologi vapen specifika för genen av intresse

  1. Identifiera ~ 3 kb regioner direkt uppströms och nedströms av genen riktade för radering att fungera som 5 och 3 homologi armar för homolog rekombination(figur 1).
  2. Design PCR primers till 1) förstärka 3 kb 5 homology arm från klamydial genomiska DNA och 2) innehåller en 15-30 bp överhäng som är specifika för pSUmC-4.0 när smält på Sall begränsning enzym webbplats. Se till att de primerregioner som överlappar pSUmC-4.0 har smälttemperaturer på 55 °C och att hårnålssmälttemperaturer för hela primern är <35 °C.
  3. Design PCR primers till 1) förstärka 3 kb 3 homology arm från klamydial genomiska DNA och 2) innehåller en 15-30 bp överhäng som är specifika för pSUmC-4.0 när smält på SbfI begränsning enzym webbplats. Se till att de primerregioner som överlappar pSUmC-4.0 har smälttemperaturer på 55 °C och att hårnålssmälttemperaturer för hela primern är <35 °C.
  4. Design PCR screening primers som kommer att förstärka införandet av varje homologi arm i pSUmC-4.0 vektor efter en DNA-montering reaktion16. Designa dessa grundfärger till anneal ~ 500 bp utanför begränsningen platser för att möjliggöra enkel visualisering av en PCR-produkt även om införandet misslyckades(figur 1).
  5. Förstärk 3 kb 5 och 3 homologi armar från nyextraherade chlamydial genomiska DNA av PCR i en till två reaktioner för att ge tillräckligt med fragment för senare DNA-montering. Följ DNA-polymerastillverkarens protokoll för specifika reaktionsinställnings- och cykelförhållanden.
  6. Kontrollera att båda PCR-produkterna är rätt storlek och att reaktionerna inte innehåller några förorenande band. Kör 5 μL av varje PCR-reaktion på en 1% DNA agarose gel.
  7. Rena och koncentrera PCR-fragmenten genom fenol/kloroformextraktion och etanolutfällning.
    1. Slå samman alla 3 PCR-reaktioner na i ett 1,5 ml-rör och för med en slutlig volym på 200 μL med nucleasefri H2O. Upprepa denna process för 5' PCR-reaktionerna.
    2. Tillsätt 200 μl fenoler till varje rör och virvel i 30–60 s. Snurra varje rör i en mikrocentrifug vid >21 000 x g i 20 min vid rumstemperatur (RT).
    3. Överför det vattenhaltiga fastoppskiktet för varje rör till ett nytt 1,5 ml-rör, tillsätt en tiondel av volymen 3 M natriumacetat till varje rör och snärta sedan för att blanda.
    4. Tillsätt 3 volymer av 100% etanol till varje rör och flick för att blanda. Inkubera båda rören vid -80 °C i 20 min.
    5. Pellet DNA genom att snurra varje rör på >21,000 x g i 5 min på RT. Kassera supernatanten.
    6. Tvätta DNA-pelleten med 100 μl 70 % etanol. Snurra varje rör vid >21 000 x g i 5 min vid RT. Kassera supernatanten.
    7. Tvätta DNA-pelleten igen med 100 μl 100% etanol. Snurra varje rör på >21 000 i 5 min vid RT. Kassera supernatanten.
    8. Låt pelleten helt lufttorka och sedan försiktigt omblandas DNA:t i 12 μL nucleasefri H2O genom att snärta för att blanda.
  8. Digest 500 ng av pSUmC-4.0 vektor i en 20 μL reaktion med 1 enhet Sall och 1 enhet SbfI enligt tillverkningens protokoll. Inkubera reaktionen i ca 3 h eller över natten för att säkerställa fullständig matsmältning av vektorn.
  9. Rena och koncentrera den smälta ryggraden genom fenol/kloroformextraktion och etanolutfällning enligt beskrivningen ovan (steg 1.7.1–1.7.9).
  10. Kombinera den smälta pSUmC-4.0 vektoroch både 5 och 3 homologi arm PCR produkter tillsammans med ett förhållande av 0,01 pmol pSUmC-4,0 till 0,09 pmol varje homologi arm. Montera fragmenten i en DNA-monteringsreaktion enligt tillverkningens protokoll.
  11. Omvandla 50 μl elektrokompetent E. coli med 1 μL av DNA-monteringsreaktionen. Platta till de transformerade E. coli på LB agarplattor som innehåller 100 μg/ml spektinomycin genom att sprida 150 μl per platta. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten.
  12. Nästa dag, skärmkolonier för grönt och rött fluorescens med hjälp av ett epifluorescens inverterat mikroskop. Totalt väntas 5–30 kolonier per agarplatta.
  13. Välj 5–10 kolonier för att inokulera 4 ml LB buljong kompletterat med 100 μg/ml spectinomycin. Inkubera kulturer vid 37 °C över natten med skakning vid 250 varv/min.
  14. Med hjälp av natten E. coli kulturer, utföra småskalig DNA-rening. Elute DNA med 50 μl nuclease-fri H2O.
  15. Bekräfta att varje homologi-arm försätts i pSUmC-4.0-vektorn med hjälp av PCR-skärmprimererna (konstruerade i steg 1.4) för att förstärka varje insättning. Om DNA-sammansättningen lyckas, bör en ~4 kb PCR-produkt observeras i en 1% DNA agarose gel för både 5 och 3 arm regioner. En PCR-produkt på ~1 kb anger en brist på insättning.
    OBS: Om infogningen av homologi armarna misslyckas i en dubbel fragment montering reaktion, utför två monteringsreaktioner för att sätta in 5 arm sedan 3 arm, individuellt. Smält vektorn med endast Sall innan du monterar med 5 arm, sedan smälta vektorn med SbfI för att montera 3 arm.
  16. Transform damm-/dcm- kompetent E. coli med 200 ng av pSUmc-4.0 monteras med båda homologi armar. Platta de transformerade bakterierna på LB agarplattor som innehåller 100 μg/ml spectinomycin genom att sprida 25 μL per platta. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten. Totalt förväntas 20–200 kolonier.
  17. Screenplattorna för röda och gröna fluorescerande kolonier enligt beskrivningen i steg 1.13.
  18. Skapa en kultur för en storskalig DNA-rening genom att vaccinera 100 ml LB buljong som innehåller 100 μg/ml spectinomycin med röda och gröna kolonier. Inkubera kulturen vid 37 °C över natten med skakning vid 250 varv/min.
  19. Skörda kulturen och rena DNA med hjälp av en storskalig DNA-rening.
    1. Omblanda det renade plasmidens DNA i 100 μl NF-H2O. En total DNA-avkastning på minst 2 μg/μL är idealisk för Omvandling av c. trarachomatis.
    2. Sekvens 5' och 3 homology arm regioner för att säkerställa korrekt montering i pSUmC-4.0 innan omvandla C. trachomatis.

2. Omvandling av C. trachomatis med pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion av Allelic Exchange

  1. Seed McCoy celler, mus fibroblaster som standard används för att odla Klamydia, i två 6 brunnsplattor (1 x 106 celler / brunn) med tillväxt media #1. Inkubera plattorna vid 37 °C med 5% CO2 tills monoskiktet är konfluent (ca 24 h).
  2. I ett 1,5 ml-rör, tillsätt en volym C. trachomatis WT serovar L2 elementära kroppar (EBs) som är tillräcklig för att infektera 12 brunnar av en 6 brunnsplatta vid en MOI av 2. Pellet eBs på > 20.000 x g i 30 min, sedan kasta supernatant.
  3. Påbörja klamydial omvandling genom att försiktigt ompausa DE eBs i 600 μl CaCl2 buffert, och tillsätt sedan 24 μg pSUmC-4,0 + homology armar till röret. Blanda försiktigt lösningen genom att snärta. Inkubera röret på RTfor 30 min och flick för att blanda var 10 min.
  4. Tillsätt omvandlingslösningen till 24 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och blanda genom att försiktigt leda. Överför 2 ml inokulat till varje brunn av konfluenta McCoy-celler i de 6 brunnsplattorna och infektera genom centrifugering vid 900 x g i 1 h vid 20 °C.
  5. Ta bort inokulatet och ersätt med 2 ml/brunns RPMI-tillväxtmedia #2. Inkubera plattorna vid 37 °C med 5 % CO2.
  6. Efter minst 7 timmar, men inte mer än 12 timmar, byt ut mediet med 2 ml/brunn av urvalsmedia #1. Fortsätt inkubationen vid 37 °C i 48 timmar från infektionstillfället.
  7. Skörda och passage bakterierna på en ny monolayer av McCoy celler.
    1. Med hjälp av en cell skrapa, försiktigt skrapa McCoy monolayer att lyfta cellerna i media. Överför materialet från varje brunn till ett 2 ml rör. Pellet cellmaterialet vid >20 000 x g i en mikrocentrifug i 30 min vid 4 °C.
    2. Ta bort och kassera supernatanten. Omblanda cellpelleten i 1 ml HBSS genom att försiktigt leda.
    3. Pellet cellskräpet vid 200 x g i 5 min vid 4 °C. Överför supernatant en fräsch brunn av konfluenta McCoy celler. Tillsätt ytterligare 1 ml HBSS till varje brunn för en total volym på 2 ml/brunn.
    4. Infektera genom centrifugering vid 900 x g i 1 h vid 20 °C. Byt ut inokulatet mot markeringsmedia #1 omedelbart efter infektion.
  8. Fortsätt passera bakterierna på en ny monolayer av McCoy celler (avsnitt 2.7) varje 48 h i tre eller fler passager tills röda och gröna inneslutningar upptäcks med hjälp av en epifluorescens inverterad mikroskop 24 h efter infektion (24 hpi).
  9. När röda och gröna inneslutningar har upptäckts fortsätter du att passera monolayer (avsnitt 2.7) med hjälp av urvalsmedia #2.
  10. Fortsätt passera monolayer tills grön-bara inneslutningar upptäcks 24 hpi (passage #3 eller senare), vilket indikerar förlusten av pSUmC-4.0 vektor och införlivande av loxP urvalkassett i genomet.
  11. Välj en brunn av grön-bara inneslutningar att berika genom passaging. Skörda och frysa andra brunnar som också innehåller gröna endast inneslutningar i sackaros-fosfat-glutamat buffert (SPG).
    1. För att berika grön-bara inneslutningar, passage monolayer från en brunn av en 6 väl tallrik som görs i steg 2.7, men efter pelletering cellen skräp (steg 2.7.3), överföra supernatant till en konisk med 12 ml HBSS. Använd detta inokulat för att infektera två 6 brunnsplattor genom att tillsätta 2 ml per brunn och snurra sedan plattorna vid 900 x g i 60 min vid 20 °C.
    2. För att frysa ytterligare brunnar, skörda monolayer som i steg 2.7.1, men omfördela pellets i 1 ml SPG istället för HBSS. Pellet cellskräpet (steg 2.7.3) och överför supernatanten till en 1,5 ml kryotube. Frys materialet vid -80 °C.
  12. Efter att ha berikat gröna inkluderingar till en MOI på 0,5–1,0 (ytterligare en till två passager efter detektion) skördar du monolagren i SPG enligt beskrivningen i steg 2.11.2. Få alikvoter av 50 μL i 1,5 ml rör och frys vid -80 °C.
  13. Titer gröna bakterier för att bestämma inkludering, bildar enheter/μL, enligt ett standardtitreringsprotokoll17.

3. Klonal isolering av grön-only C. trachomatis Borttagning Mutant innehåller loxP flankerad urvalkassett genom att begränsa utspädning

  1. Seed a 384 well tissue culture plate with 50 μL of McCoy cells at ~2,000 cells/well in growth media #1. Inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 för ~24 timmar eller tills konfluent.
  2. Späd en alikvot av gröna bakterier i HBSS för att uppnå ~ 50 EBs per 20 ml. Överför det utspädda inokulumtill en reservoarbricka.
    1. Ta bort media från 384 brunnsplattan genom att ordentligt snärta hela plattan upp och ner i en avfallsbehållare. Använd en flerkanalig pipett, tillsätt 50 μL C. trachomatis inoculum till varje brunn. Infektera genom centrifugering vid 900 x g i 1 h vid 20 °C.
      OBS: Var uppmärksam på att inte snärta så hårt att monolayer lossnar. Om cellerna är överkonfluenta, kommer de att lossna lättare.
  3. Ta bort inokulatet genom att snärta och byt ut med 50 μL/brunnstillväxtmedia #2. Inkubera plattor vid 37 °C med 5 % CO2.
    OBS: I detta skede är integrationen av urvalskassetten i genomet stabil, så antibiotikaval med spectinomycin krävs inte längre.
  4. Efter att ha inkuberat plattan i 5–12 dagar, identifiera enskilda brunnar med gröna fluorescerande inneslutningar med hjälp av ett epifluorescens inverterat mikroskop eller en screeningplattform med högt innehåll.
  5. Skörda brunnar med grön-bara inneslutningar genom skrapning monolayer med en p-10 spets och överföra hela innehållet i brunnen i ett rör som innehåller 2 ml HBSS. Blanda försiktigt och applicera 2 ml inokulum på en färsk konfluent McCoy monolayer i en 6 väl platta för infektion.
    När enskilda brunnar identifieras med inkluderingar kommer inkluderingar att finnas i ett kluster på grund av expansion från den första inkluderingen. Om en brunn har flera kluster, är det troligt att mer än en EB ursprungligen smittade så bra. Dessa brunnar bör inte skördas, och i vissa fall kan flera rundor av klonal isolering genom seriell utspädning vara nödvändiga.
  6. Infektera 6 brunnsplattan genom centrifugering vid 900 x g i 1 tim vid 20 °C. Byt ut inokulatet med 2 mL/well-tillväxtmedia #2. Inkubera vid 37 °C med 5 % CO2 för 48 timmar.
  7. Upprepa steg 2.11–2.13 för att berika, frysa och titerklonala populationer.
  8. Bekräfta borttagningen av riktade gener från kloniskt isolerade C. trachomatis med qPCR enligt tidigare beskrivning12.

4. Omvandling av C. trachomatis FRAEM Mutant med pSU-Cre att initiera avlägsnande av loxP flankerad urvalkassett

  1. Upprepa omvandlingsprocessen i en 6-brunnsplatta enligt beskrivningen (steg 2.1–2.8) med hjälp av den kloniskt isolerade C. trachomatis FRAEM-mutanten, pSU-Cre-vektorn och urvalsmediet #3.
    OBS: En lyckad omvandling indikeras av inneslutningar som är röda och gröna fluorescerande.
    1. Passage monolayer tills röd-bara inneslutningar upptäcks med hjälp av en epifluorescens inverterad mikroskop, vilket indikerar förlust av urvalkassetten (två till tre passager). Fortsätt passera monolayer tills röd-bara inneslutningar berikas till en MOI på ~ 0,5.
  2. Clonally isolera röd-bara inneslutningar genom att begränsa utspädning i en 384-brunnsplatta enligt vad som tidigare beskrivits (steg 3.1–3.8); Använd dock #3 för alla steg.
  3. Berika klonala populationer genom passaging fram till en MOI på 0,1. När berikat, ersätta avsnitt media med tillväxt media #2 att initiera förlust av pSU-Cre vektor (cirka tre till fyra passager).
  4. Clonally isolera ickefluorescerande bakterier (steg 3.1–3.8); Dock manuellt skanna plattan med ett brightfield mikroskop för att upptäcka inneslutningar. Berika och frysa bakterier (steg 2.11–2.12).
  5. Skärm för mutantstam med kvantitativ pcr i realtid, westernblotting och hela genomet DNA-sekvensering enligtbeskrivningen 12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Metoden för markörlös genborttagning i C. trachomatis med FLAEM är beroende av noggrann kloning och omvandling tekniker. Framgångsrik allelisk rekombination är ett viktigt första steg och kräver identifiering och införande av homologi armar i pSUmC-4.0 kloning vektor(figur 1). Ett viktigt andra steg för markörlös genborttagning är avlägsnande av fluorescens reporter och antibiotika urval kassett av Cre-lox genomredigering, representerade i figur 2. Vektorerna som används för att utföra vart och ett av dessa steg kommenteras i figur 3. Figur 4 visar en schematisk representation av omvandlingsstrategin för att generera en markörlös borttagningmutant när den börjar med jokertecken C. trachomat .

Representativa data visas i figur 5 och figur 6, där tmeA är avsett för genradering. C. trachomatis tmeA borttagning stam genereras med FRAEM, och C. trachomatis tmeA-lx stam genereras med FLAEM. Båda mutantstammarna innehåller en borttagning av tmeA locus; tmeA-lx innehåller dock inte urvalskassetten, vilket indikeras av frånvaron av gfp-DNA som visas i figur 5. TmeA mutantstam har minskat uttryck för tmeB, som visas i figur 6 av mRNA och proteinnivåer. När FLAEM används för att generera tmeA-lx mutant stam, visar figur 6 att uttrycket av tmeB återställs.

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation för identifiering av 5- och 3- homologiarmar från genomisk DNA- och PCR-screening för att de ska införas i pSUmC-4.0. (A) En gen som är avsedd för borttagning från C. trachomatisgenomet representeras av den blå pilen. De 3 kb-regioner som identifieras som 5- och 3-homologiarmarna för allelic rekombination är grupperade i lila respektive rött. (B,C) Införande av 5- och 3- homologiarmarna i pSUmC-4.0 bestäms av PCR-screening. Sall- och Sbfl-begränsningsenzymplatserna visas flankerande aadA (svart pil) och gfp (grön pil) markeringskassett som flankeras av loxP-platser (gula rutor) på pSUmC-4.0-vektorn. (B) Ingen insättning bestäms av en 1 kb PCR-produkt när 5' screening primers (lila pilhuvuden) används för att PCR förstärka över Sall-platsen, eller 3 screening primers (röda pilhuvuden) används för att förstärka över SbfI-platsen. (C) En lyckad insättning bestäms av 3 kb PCR-produkter under samma förhållanden. 5' och 3' homology armar representeras av de lila och röda parentes, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk representation av Cre-lox medierad kombination för att ta bort gfp-aadA-urvalskassetten. I närvaro av Cre rekombinas kombineras loxP-platserna (gul) recombine, vilket resulterar i excision av gfp-aadA urvalkassett (gröna och svarta rutor). Den resulterande locus visas som innehåller en återstående loxP ärr sekvens. Uppströms (USA) och nedströms (DS) regioner visas i grått. Denna siffra har ändrats från Keb m.fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Genetisk organisation av pSUmC-4.0 och pSU-CRE. För kontrollerbart underhåll av vektorerna i C. trachomatis, är pgp6 konstruerad nedströms en tetracyklin-inducerbar promotor. De återstående pgp gener är nedströms sina inhemska Chlamydial initiativtagare, och mCherry är constitutively uttryckt på båda vektorerna. (A) pSUmC-4.0 innehåller en kassettkodning som samtidigt uttryckts aadA- och gfp-gener för antibiotika- respektive fluorescensval. LoxP-platser för kreatmedierad rekombination samt begränsningsenzymplatser för införande av genspecifika homologiarmar flankerar urvalskassetten. bpSU-CRE innehåller en liknande stamryggrad som pSUmC-4.0. Men i stället för rekombinationkassetten uttrycks blaM och cre institutively för antibiotikaselektivitet och CRE rekombinasgenerering. Dessa siffror har ändrats från Kebm.fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Schematisk representation av FLAEM-omvandlingsstrategin som används för att skapa en markörlös borttagningsmutant. Den allmänna FLAEM-metoden representeras här där Wild-typ C. trachomatis sekventiellt omvandlas och serially passageras för att generera en markörlös borttagning mutant. Omvandlingssteg representeras av tillägg av små pilar, och förlusten av genetiska element representeras av subtraktion av små pilar. C. trasomatintermedier (cirklar) är representerade med antibiotikakänslighet (penicillinresistenta eller penicillinkänsliga = PenGr eller PenGs; spectinomycinresistent eller spectinomycinkänsliga = Specr eller Specs) och fluorescensrapporteringskvaliteter (grön = gfp +, röd = mCherry +, grå = ingen fluorescens). Schematiska representationer av genlocus vid varje steg visas nedan. Denna siffra har ändrats från Keb m.fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: FRAEM och FLAEM används för att generera tmeA genborttagningar. (A) FRAEM användes för att generera tmeA, och FLAEM användes för att generera tmeA-lx. Relativt DNA-kopieringsnummer för tmeA och nedströms tmeB; gfp som finns på pSUmC-4.0 urvalskassetten; och cre som finns på pSU-CRE-vektorn visas alla. McCoy celler infekterade med lika integration bildar enheter av WT, L2 tmeA, eller L2RiftmeA-lx C. trachomatis skördades på 24 hpi, och DNA extraherades för qPCR. Relativa kopieringsnummer bedömdes genom signalnormalisering till klamytur 16sRNA. ND = ingen upptäckt. (B) Den sekvenserade tmeAB locus från L2RiftmeA-lx visas med en enda återstående loxP ärr sekvens (understruken). De flankerande områdena av DNA visas i blått, startkodonvisas i grönt, och TmeA stop codon visas i rött. Den icke-kanoniska startcodon för TmeB avbildas också. Dessa siffror har ändrats från Kebm.fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Excision av urvalkassett med FLAEM återställer uttryck för tmeB när du riktar sig till tmeA och stör inte nedströms gener. (A) Relativ mRNA-nivå av muterade stammar c. trachomatis tmeA och tmeB. Förekomsten av utskrifter nedströms tmeA bestämdes av omvänd transkriptas (RT) kvantitativa PCR. Regionen omedelbart nedströms tmeA / B operon kodar ct696. Totalt RNA isolerades vid 24 hki från McCoy celler smittade vid en MOI på 1 med WT, L2 tmeA, L2 tmeB, eller L2RiftmeA-lx. Avskrifter för tmeA, tmeBoch ct696 upptäcktes av qRT-PCR. Signaler presenteras efter normalisering till rpoD. ND = ingen upptäckt. (B) Västra fläck för förekomst av TmeA och TmeB i C. trachomatis mutant stammar. Lika stora mängder helkulturmaterial från 24 hpi kulturer infekterade med lika integration bildar enheter av WT, L2 tmeA, L2RiftmeA-lx, eller L2RiftmeA-lx ptmeA undersöktes i immunoblots för TmeA och TmeB. Hsp60 användes som en lastkontroll, och proteiner visualiserades av chemiluminescens. Siffran har ändrats från Kebm.fl. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskrivs här för generering av markörlösa genborttagningar i C. trachomatis av FLAEM möjliggör riktad borttagning av onödiga gener och eliminerar kassettinducerade polareffekter. Protokollet bygger på noggrann utformning av 5 och 3 homologi armar in i pSUmC 4.0 självmord vektor, effektiv omvandling av C. trakomat, och noggrann screening av isolerade mutantstammar. Framgångsrik genomteknik via denna metod resulterar i bakterier som är nonfluorescent och innehåller en enda loxP ärr sekvens på platsen för riktade genborttagning. Dessutom har denna metod potential att anpassas för sekventiell inriktning av gener inom samma C. trasomatstam.

Noggrann utformning av 5 och 3 homologi armar och införande i självmordvektorn är det första och mest kritiska steget i kloningsprocessen. Det har visat sig att 3 kb homology armar ger den mest effektiva alelska rekombination. Medan införandet av dessa armar genererar en vektor som är stor och ibland svårt att arbeta med, har det varit mindre framgång med kortare armar, med ~ 2 kb som representerar ett minimum för framgång. Utnyttjandet av Sall- och Sbfl-begränsningsplatserna ger en bekväm konstruktionsreaktion i ett steg när dna-montering utförs.

Andra kloningsmetoder, såsom insättning PCR, har också varit effektiva för att infoga homologi armar, men de införa större möjlighet till PCR-baserade fel. Intressant nog har det konstaterats att kloning av 5 arm är jämförelsevis effektivare än 3 arm. Om problemet uppstår rekommenderas att DNA-enheten delas upp i två reaktioner och konstruera vektorn på ett stegvis sätt. Sedan rekommenderas att smälta vektorn stambenet med SbfI, sätta in 3 arm först, sedan smälta vektorn med Sall och föra in 5 arm i en andra DNA-sammansättning reaktion.

Vid förstärkning av PCR-fragment för homologiarmarna rekommenderas det också att använda nyrenat C. trasrörgenomiskt DNA som inte tidigare har frusit. Detta begränsar möjligheten till DNA-klippning och ökar effektiviteten för att generera större amplicons. Om förstärka homologi armar från en annan vektor, den renade PCR produkten måste dpni begränsning enzym behandlas innan du fortsätter till DNA-montering för att minska bakgrundskolonier under E. coli omvandling.

Omvandling är ett annat kritiskt steg i det här protokollet där problem kan uppstå. Om omvandlingen med pSUmC 4.0 lyckas bör gröna och röda inneslutningar synas genom passage #3. Det kan dock ta flera fler passager innan transformanter blir berikade. Liksom andra mutagenesis metoder, är denna metod begränsad till inriktning av onödiga gener, men omvandling bör fortfarande vara lätt att uppnå. Långvarig passage av transformanter i avsaknad av allelic utbyte, som anges genom kvarhållande av röd fluorescens, kan tyda på att borttagning av den riktade genen är en dödlig händelse.

Eftersom omvandlingsvektorer för C. trarachomat is innehåller samma ursprung replikering som den ursprungliga pL2, är det inte ovanligt att den inhemska plasmid botas efter flera (>5) passager. Pgp-generna på pSUmC-vektorerna är i en annan ordning jämfört med den inhemska pL2; Därför kan PCR användas för att upptäcka förekomsten av pL2 i en isolerad stam genom att förstärka regionen som spänner över pgp7–pgp8. Om den inhemska plasmid går förlorad i slutlig radering mutant, kommer det att behöva återinföras innan du genomför utvecklingsstudier. Lateral genöverföring (LGT) kan användas för att återinföra pL2 plasmid19.

I många fall innehåller tidig borttagning mutanter med urvalkassetten fortfarande pL2 plasmid. Vi har utnyttjat dessa stammar för LGT med framgång att återinföra pL2 och undvika reparation av den borttagna genen. LGT kan också användas som en sekundär metod för omvandling när pSU-Cre introduceras. I vissa fall var LGT effektivare än klassisk CaCl2 omvandling. I fall där LGT används för att införa pSU-Cre, det viktigt att börja med C. trachomatis som uttrycker en rpoB allel, vilket ger rifampin motstånd före allelic utbyte och införande av spectinomycin urval kassett12,19. Från och med rifampinresistenta bakterier möjliggör val efter samkultur.

FLAEM möjliggör omvänd genetiska metoder med riktad borttagning av hela kodningsekvenser, jämfört med andra genetiska metoder som är beroende av slumpmässigmutagenes eller införande av nukleotidsekvenser för att uppnå genstörningar. FLAEM är i huvudsak en förlängning av FRAEM, eftersom det gör det möjligt att ta bort urvalskassetten och eliminerar tidigare observerade kassetter-inducerad polareffekter. Denna metod skapar också möjlighet att generera flera genborttagningar i en enda C. trachomatis stam.

Flera mutationer kan genereras via två olika mekanismer. I den första kan FLAEM användas för att generera en markörlös genmutation och sekventiellt används för att rikta en annan gen i samma stam. Den första borttagningen mutant kan omvandlas med pSUmC 4.0 vektor som innehåller homologi armar specifika för sekundära gen av intresse. I detta fall bör protokollet upprepas på samma sätt som den första raderingen och upprepas flera gånger för att rikta gener sekventiellt. I den andra mekanismen kan den markörlösa borttagningsmutanten isolerad efter FLAEM samtidigt ha smittats med en borttagningsmutant som fortfarande innehåller en urvalskassett. Genom LGT hämtas den andra borttagningen och kan väljas för. När du använder denna metod begränsas ytterligare mutationer av antalet unika urvalskassetter kvar i genomet. Vanliga antibiotika som används som selektivt tryck under omvandlingen är begränsade för C. trachomatis, men de inkluderar penicillin, kloramfenikol och spectinomycin. Ta bort urvalkassetten genomredigering av Cre-loxP minskar behovet av att använda flera antibiotika för selektivt tryck. Ta bort flera gensekvenser samtidigt är fördelaktigt när man studerar proteiner med relaterade funktioner eller biologiska processer som kan ha flera nyckelaktörer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Public Health Service bidrag från National Institute of Health, NIAID (bidrag A1065530 och Al124649), till KA Fields.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose KSE Scientific BMK-A1705 Molecular Biology Grade
Anhydrotetracycline hydrochloride ACROS Organics 233131000
CaCl2 Buffer 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate
Calcium Chloride Dihydrate Sigma C7902-500G Suitable for cell culture
Cycloheximide Sigma 7698-1G
dam-/dcm- Competent E. coli New England BioLabs C2925H
DMSO ATCC 4-X Sterile filtered cell culture tested
Glutamic acid Sigma G8415-100G L-Glutamic acid
Growth Media #1 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS).
Growth Media #2 RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) Gibco 24020-117
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) Gibco A38402-02
McCoy Cells ATCC CRL-1696
Monarch Plasmid Miniprep Kit New England BioLabs T1010S Small scale DNA purification
NaH2PO4 Sigma S3139-250G Sodium phosphate monobasic
Na2HPO4 Sigma S5136-500G Sodium phosphate dibasic
NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells New England BioLabs C3020K
NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit New England BioLabs E5520S Gibson Assembly Kit
Penicillin G sodium salt Sigma P3032-10MU Bioreagent suitable for cell culture
QIAGEN Plasmid Maxi Kit QIAGEN 12162 Large scale DNA purification
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase New England BioLabs M0515 Fragment PCR Polymerase
RPMI 1640 Medium (1x) Gibco 11875-093 Containing 2mM L-glutamine
Sall-HF New England BioLabs R3138S
Sbfl-HF New England BioLabs R3642S
Selection Media #1 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO
Selection Media #2 RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin
Selection Media #3 RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin
Sodium Acetate Buffer Solution Sigma S7899-100ML 3M
SOC Outgrowth Medium New England BioLabs B9020SVIAL
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade Alfa Aesar J61820
Sucrose Sigma S1888-1KG Bioreagent suitable for cell culture
Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water
Tris AMRESCO 0497-5KG Ultrapure grade
Trypsin-EDTA (1x) Gibco 25200-056 0.25%
Water Sigma W3500-500ML Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization. Global Incidence and Prevalence of Selected Curable Sexually Transmitted Infections: 2008: World Health Organization. Sexual and Reproductive Health Matters. 20, World Health Organization. World Health Organization, Department of Reproductive Health and Research, 2012 ISBN 978 92 4 1503839 207-208 (2012).
  2. Stephen, R. S. The Cellular Paradigm of Chlamydial Pathogenesis. Trends in Microbiology. 11, 44-51 (2003).
  3. Mueller, K. E., Plano, G. V., Fields, K. A. New Frontiers in Type III Secretion Biology: the Chlamydia Perspective. Infection and Immunity. 82, 2-9 (2014).
  4. Seth-Smith, H. M. B., et al. Co-evolution of genomes and plasmids within Chlamydia trachomatis and the emergence in Sweden of a new variant strain. BMC Genomics. 10, 239 (2009).
  5. Brothwell, J. A., Muramatsu, M. K., Zhong, G., Nelson, D. E. Advances and obstacles in genetic dissection of chlamydial virulence. Current Topics in Microbiology and Immunology. 412, 133-158 (2018).
  6. McClure, E. E., et al. Engineering of obligate Intracellular bacteria: progress, challenges and paradigms. Nature Reviews Microbiology. 15, 544-558 (2017).
  7. Rahnama, M., Fields, K. A. Transformation of Chlamydia: current approaches and impact on our understanding of chlamydial infection biology. Microbes and Infection. 20 (7-8), 445-450 (2018).
  8. Kari, L., et al. Generation of targeted Chlamydia trachomatis null mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 7189-7193 (2011).
  9. LaBrie, S. D., et al. Transposon Mutagenesis in Chlmaydia trachomatis Identifies CT339 as a ComEC Homolog Important for DNA Uptake and Later Gene Transfer. mBio. 10 (4), 01343 (2019).
  10. Johnson, C. M., Fisher, D. J. Site-specific, insertional inactivation of incA in Chlamydia trachomatis using a group II intron. PLoS One. 8, 83989 (2013).
  11. Mueller, K. E., Wolf, K., Fields, K. A. Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. mBio. 7, 01817 (2016).
  12. Keb, G., Hayman, R., Fields, K. A. Floxed cassette Allelic Exchange Mutagenesis Enables Markerless Gene Deletion in Chlamydia trachomatis and can Reverse Cassette-Induced Polar Effects. Journal of Bacteriology. 200, 00479 (2018).
  13. Yarmolinsky, M., Hoess, R. THe legacy of Nat Sternberg: the genesis of Cre-lox technology. Annual Review of Virology. 2, 25-40 (2015).
  14. McKuen, M. J., Mueller, K. E., Bae, Y. S., Fields, K. A. Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis Reveals a Role for Chlamydia trachomatis TmeA in Invasion that is Independent of Host AHNAK. Infection and Immunity. 85 (12), 00640 (2017).
  15. Song, L., et al. Chlamydia trachomatis Plasmid-Encoded Pgp4 is a Transcriptional Regulator of Virulence-Associated Genes. Infection and Immunity. 81 (3), 636-644 (2013).
  16. Silayeva, O., Barnes, A. C. Gibson Assembly facilitates bacterial allelic exchange mutagenesis. Journal of Microbiological Methods. 144, 157-163 (2017).
  17. Hackstadt, T., Scidmore, M., Rockey, D. Lipid Metabolism in Chlamydia trachomatis-Infected Cells: Directed Trafficking of Golgi-Derived Sphingolipids to the Chlamydial Inclusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 4877-4881 (1995).
  18. Jeffrey, B. M., Suchland, R. J., Eriksen, S. G., Sandoz, K. M., Rockey, D. D. Genomic and phenotypic characterization of in vitro-generated Chlamydia trachomatis recombinants. BMC Microbiology. 13, 142 (2013).
  19. Suchland, R. J., Bourillon, A., Denamur, E., Stamm, W. E., Rothstein, D. M. Rifampin-resistant RNA polymerase mutants of Chlamydia trachomatis remain susceptible to the ansamycin rifalazil. Antimicrobial Agents Chemotherapy. 49, 1120-1126 (2005).

Tags

Immunologi och infektion Cre rekombinas FLAEM FRAEM Klamydia mutagenes allelic utbyte allelic rekombination
Märklös genborttagning av Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis i <em>Chlamydia trachomatis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Keb, G., Fields, K. A. Markerless… More

Keb, G., Fields, K. A. Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis. J. Vis. Exp. (155), e60848, doi:10.3791/60848 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter