Summary
Denne protokol præsenterer en detaljeret procedure til fremstilling af biologiske kryoprøveudler til synkrotronbaserede røntgenabsorptionsspektroskopieksperimenter. Vi beskriver alle de trin, der kræves for at optimere prøveforberedelse og kryopræservering med eksempler på protokollen med kræft- og fytoplanktonceller. Denne metode tilvejebringer en universel standard for prøve kryo-forberedelse.
Abstract
Undersøgelsen af elementer med røntgenabsorptionsspektroskopi (XAS) er af særlig interesse, når man studerer metallernes rolle i biologiske systemer. Prøveforberedelse er en vigtig og ofte kompleks procedure, især for biologiske prøver. Selvom røntgenspecieringsteknikker er meget udbredt, er der endnu ikke udbredt nogen detaljeret protokol for brugere af teknikken. Endvidere er kemisk tilstandsmodifikation bekymrende, og kryobaserede teknikker anbefales til at analysere de biologiske prøver i deres næsten indfødte hydrerede tilstand for at give den maksimale bevarelse af cellernes eller vævets kemiske integritet. Her foreslår vi en cellulær forberedelsesprotokol baseret på kryo-konserverede prøver. Det er påvist i en højenergiopløsning fluorescens detekteret røntgenabsorptionsspektroskopi undersøgelse af selen i kræftceller og en undersøgelse af jern i fytoplankton. Denne protokol kan bruges sammen med andre biologiske prøver og andre røntgenteknikker, der kan blive beskadiget af bestråling.
Introduction
Undersøgelsen af de cellulære biotransformationer af essentielle eller toksiske elementer kræver specieringsteknikker med høj følsomhed og bør minimere prøveforberedelsestrin, der ofte er tilbøjelige til modifikation af kemiske arter.
Fysiologiske elementer som selen og jern er kendt for at være særligt vanskelige at specificere på grund af deres komplekse kemi, forskellige stabiliteter af selen- eller jernarterne og deres lave koncentration i ppm (mg / kg) eller endda sub-ppm-området. Således kan undersøgelsen af specieringen af disse elementer af XAS være ekstremt udfordrende. Synkrotron XAS og især fluorescens med høj energiopløsning detekteret XAS (HERFD-XAS), som tillader et meget lavt signal-til-baggrund-forhold1, er tilgængelige ved synkrotronkilder for at specificere stærkt fortyndede elementer i komplekse biologiske matricer 2,3. Konventionelle fluorescens-XAS-målinger kan udføres ved hjælp af en energiopløst solid state-detektor (SSD) med en energibåndbredde ~ 150-250 eV på CRG-FAME-strålelinjen ved European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, mens HERFD-XAS-målinger har brug for et krystalanalysatorspektrometer (CAS) med en energibåndbredde ~ 1-3 eV på CRG-FAME-UHD-strålelinjen ved ESRF2 . Fluorescensfotoner diskrimineres med hensyn til deres energi med henholdsvis elektroniske eller optiske processer.
Prøve-kryo-præparatet er afgørende for at bevare strukturer og opretholde sammensætningsmæssig kemisk integritet, hvilket muliggør analyse tæt på den biologiske oprindelige tilstand5. Desuden tillader analyser udført ved kryogene temperaturer så lave som 10 K ved hjælp af flydende heliumkrogen køling (LN2), strålingsskader at bremse og bevare elementær speciering for XAS. Selvom nogle anmeldelser af XAS-teknikker anvendt på biologiske prøver rapporterer nødvendigheden af at forberede og analysere prøver under kryogene forhold (f.eks. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beskriver ingen af dem klart den relaterede detaljerede protokol. I denne publikation beskrives en metode til kryopræparation af kræftceller og planktonmikroorganismer for HERFD-XAS-speciering af Se8 og Fe9 ved kryogen temperatur.
God praksis for prøveforberedelse og miljø under state-of-the-art XAS-spektroskopimålinger kræver 1) en opsætning; 2) en analyseprocedure, der begrænser virkningerne af strålingsskader så meget som muligt og 3) en prøve (eller model sammensat reference) så homogen som muligt med hensyn til røntgenfotonernes strålestørrelse. Det første element tages i betragtning ved at udføre erhvervelsen ved en lav temperatur ved anvendelse af en flydende heliumkryostat. Det andet punkt behandles ved at udføre hver erhvervelse på et nyt område af prøven ved at flytte det i forhold til strålen. Endelig, i betragtning af den tredje betingelse, konditioneres prøver (pellets) og referencer (pulvere) i pressede bulkpellets for at begrænse porøsiteter og inhomogeniteter så meget som muligt og for at undgå ruhed med hensyn til strålestørrelsen på den røntgenpronderede prøveoverflade. Vi forklarer, hvordan protokollen behandler alle disse punkter.
Vi brugte human prostatacellelinje PC-3 (højt metastatisk potentiale) og ovariecellelinje OVCAR-3 (som tegner sig for op til 70% af alle tilfælde af kræft i æggestokkene) til at undersøge de antiproliferative egenskaber over for kræftceller i selennanopartikler (Se-NP'er) og Phaeodactylum tricornutum diatom som en modelart til at undersøge jernbinding i fytoplankton.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af humane PC-3 og OVCAR-3 kræftcellepiller til selenspeciering
BEMÆRK: Følgende protokol er tilpasset fra Weekley et al.10. Alle trin skal udføres under en cellekulturhætte under biosikkerhedsniveau 2-betingelser og -begrænsninger ved hjælp af aseptiske teknikker.
- Tæl cellerne ved hjælp af et Malassez-celletællingskammer. Frø 150.000-200.000 celler pr. kolbe til PC-3-cellelinjen og 300.000 celler til OVCAR-3-cellelinjen.
- Frøceller i T-75-kolber (tre kolber pr. tilstand for at få tre eksemplarer) i de passende cellekulturmedier (tabel 1) under den laminære strømningshætte.
- Lad cellekulturerne vokse i en inkubator ved 37 °C og en befugtet atmosfære med 5 % CO2 , indtil de når 80 % sammenløb. Normalt fordobles PC-3 prostatacancercellelinjer efter 24 timer, mens OVCAR-3 ovariecancercellelinjer tager 72 timer. Kolberne skal efterlades i inkubatoren.
- I mellemtiden fortyndes de Se-NP'er, der anvendes til behandling, til en endelig koncentration, der svarer til IC20 (hæmmende koncentration for at opnå 20% celledød), der er forudbestemt af MTT-assayet (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) til cytotoksicitetsvurdering. Disse koncentrationer er specifikke for hver Se-NPs type, men også specifikke for den undersøgte cellelinje.
- Anbring nanopartikelopløsningen (2 mg / ml kvægserumalbumin [BSA] eller chitosanbelagte Se-NP'er) i et ultralydsvandbad i 30 minutter ved stuetemperatur (RT).
- Fortynd Se-NPs-opløsningen ved serielle fortyndinger i komplet cellekulturmedium for at nå arbejdskoncentrationer. Mellem hver fortynding, hvirvel i 1 min.
- Forbered en selenpositiv kontrol med fortyndet selensalt til behandling.
- En vandig natriumselenitopløsning (1 mg/ml) fremstilles i et 15 ml polypropylenrør. Bland 1 mg natriumselenitpulver med 1 ml ultrarent vand.
- Vortex stamopløsningen i 1 min.
- Fortynd natriumselenitopløsningen ved serielle fortyndinger i komplet cellekulturmedium for at nå arbejdskoncentrationer.
BEMÆRK: Glem ikke at pipet flere gange før hver fortynding for at homogenisere opløsningen.
- Udsæt kræftcellerne for selenbehandlinger.
BEMÆRK: Denne del af protokollen skal gentages for hver nanopartikel (NP), der testes. Her er NP'erne af to typer, BSA og chitosanbelagte Se-NP'er plus kontrollerne. Natriumselenitopløsningen er den positive kontrol, og ingen behandling er den negative kontrol.- De tre T-75-kolber, der indeholder cellerne i den laminære flowhætte, åbnes.
- Fjern mediet, og vask cellerne forsigtigt 2x med 5 ml opvarmet (37 °C) fosfatbufret saltvand (PBS).
- Forsigtigt tilsættes 15 ml af behandlingen i hver kolbe på undersiden af kolben og ikke direkte på cellelaget ved hjælp af en automatisk pipette udstyret med 25 ml sterile plastpipetter. Læg lågene på kolberne. Luk ikke lågene tæt.
BEMÆRK: Som beskrevet i trin 1.3 og 1.4 skal behandlingsopløsninger være blevet resuspended på forhånd for at blive homogeniseret. - De tre kolber efterlades vandret i en inkubator ved 37 °C, og en atmosfære befugtes med 5 % CO2 i 24 timer.
- Fremstilling af cellepillerne
- Cellerne vaskes forsigtigt 2x med 5 ml opvarmet PBS (37 °C) direkte i T75-kolberne.
- Der tilsættes 6 ml opvarmet cellekulturmedium (37 °C) på cellelaget i T-75-kolben ved hjælp af en pipettedreng udstyret med 10 ml sterile plastpipetter.
- Saml cellerne ved blid skrabning ved hjælp af en celleskraber. Brug en celleskraber pr. Kolbe.
- Brug en pipettedreng og en 10 ml pipette til at aspirere væsken og skylle cellen/mediet tilbage på kolbeoverfladen for at opsamle alle cellerne. Gentag dette trin flere gange for at dissociere og individualisere cellerne. Saml mediet, der indeholder cellerne, i et 15 ml polypropylenrør.
- Spin ned ved 250 x g i 5 min ved RT. Aspirat supernatanten.
- Skyl cellerne ved at genbruge dem i 5 ml PBS.
- Spin ned ved 250 x g i 5 minutter ved RT. Aspirat supernatanten og gentag trin 1.6.5 og 1.6.6 2x for at slippe af med alle resterende spor af behandlingen.
- Resuspend cellerne i 1 ml PBS og overfør dem til et 1,5 ml polypropylenrør. Til sidst drejes dem ned ved 250 x g i 5 minutter ved RT. Figur 1 repræsenterer cellepillen opnået efter centrifugering og kassering af supernatanten.
- Fjern forsigtigt al PBS-supernatanten ved hjælp af en 200 μL pipette.
BEMÆRK: Pas på ikke at røre ved og beskadige cellepillen. Ideelt set skal pillen være 2-3 mm høj eller tyk, med en diameter på 3-6 mm. For PC-3-cellelinjen kræves 9 x 106-10 x 106 celler til analysen. For OVCAR-3-cellelinjen kræves 8 x 106-9 x 106 celler (figur 1). Nogle celler vil sandsynligvis gå tabt under de efterfølgende bufferskylningstrin. Jo højere cellenummer, jo bedre bliver pelleten.
- Flashfrysning af cellepillerne
- Dyk den nederste del af 1,5 ml røret, der indeholder pelleten i flydende nitrogen (LN2), til niveauet af cellepillen.
- I en handskeboks, der er helt renset med en inert atmosfære, såsom nitrogengas, opsamles cellepillen ved forsigtigt at banke på 1,5 ml-røret på den flade overflade af en LN 2-afkølet kobberblok (figur 2). Pelleten opsamles derefter uden celletab.
BEMÆRK: Brug kryobeskyttelsesudstyr, laboratoriefrakke, lukkede sko, kryohandsker og ansigtsskærm eller sikkerhedsbriller til LN2-håndtering . - Om nødvendigt kan en LN2 afkølet nål bruges til at hjælpe med at tage pillen ud.
BEMÆRK: Den resulterende frosne cellepille kan fragmenteres. Disse trin skal udføres i løbet af få minutter og stole på forskerens fingerfærdighed og hastighed. - De frosne pelletdimensioner skal passe til kryostatprøveholderen. Ved hjælp af det beskrevne udstyr kan prøven anvendes direkte, hvis cellepillen er større end 2 mm i højden og lidt mindre end hullet i prøveholderen, der anvendes til XAS. Hvis ikke, eller hvis der ønskes en flad overflade til analysen, skal der fremstilles en cylindrisk bulkpille, der stadig holder pelleten i frossen tilstand. Hvis cellepillen er fragmenteret, kan følgende trin ideelt set anvendes i en handskeboks, der er helt renset med en inert atmosfære.
- Fremstilling af de bulkfrosne cylindriske pellets
- Nedsænk alle de dele af en manuel hydraulisk presse, der vil være i kontakt med prøven i LN2 (figur 3A; 3- eller 5 mm diameter pelletsdyser, form, stempel / trådtræk).
- Overfør de hurtigt frosne pelletsfragmenter til formen fyldt med de relevante pelletsdyser (figur 3B).
- Hurtig pelletering med den hydrauliske presse. Anvendelse af 1,5 tons til en 5 mm diameter pellet eller 0,5 tons til en 3 mm diameter pellet er tilstrækkelig (figur 3C).
BEMÆRK: Efter hver pelletsforberedelse med den hydrauliske presse skal alle materialer optøes og tørres korrekt ved hjælp af nitrogengas for at undgå problemer med den resterende frost og fugtighed. - Saml bulkpillen af frosne celler hurtigt og læg den i et passende kryorør til opbevaring.
- Opbevar det tilbage i LN2-tanken til langtidsopbevaring.
- Overfør og monter kryopillerne til analyse. Pelleten, der opbevares i et LN 2-afkølet kryorør, overføres til en 77 K forkølet kryostatprøveholder i flydendeN2 (figur 4, som anvendt til en CRG-FAME-UHD-strålelinje). Dette trin skal udføres så hurtigt som muligt, men kan tage et par minutter. Overfør derefter prøveholderen til kryostaten, og hold den på 10 K under hele XAS-analysen.
BEMÆRK: Trin 1.9.3 og 1.9.6 er vanskelige, fordi de skal udføres hurtigt for at undgå frostdannelse, der blokerer stemplet og formen. Et alternativ er at udføre disse trin under et plasttelt, der er helt renset med nitrogengas. LN2-cool kobbermasse gør det muligt at holde pillen frosset.
2. Forberedelse af planktoncellerne til jernspeciering
BEMÆRK: Syntetisk havvand, der blev anvendt til denne protokol, blev fremstillet ved tilsætning af havsalte med ultrarent vand, morpholino propansulfonsyre, ammoniumnitrat, natriumnitrat, natriummetasilikatpentahydrat, natriumphosphatmonobasisk, vitaminbestand, spormetallager, antibiotikalager og HEPES-buffer ved pH = 7,9. Koncentrationerne af hver komponent er angivet i materialetabellen. Detaljer om kulturen kan findes i Sutak et al.11
- Centrifugering af en P. tricornutum diatomkultur i et 50 ml polypropylenrør ved 1,100 x g i 6 minutter og overførsel af pelleten til en kolbe med frisk medium.
- Lad kulturen vokse i syntetisk havvand i et vækstkammer i 24 timer.
- Centrifuger planktonkulturen i 6 minutter ved 1.100 x g og overfør pelleten til et frisk medium indeholdende Fe-citrat (1 μM i slutkulturen). Inkuber i 72 timer.
- Forbered planktoncellerne
- Centrifuger cellerne i 3 min ved 1.100 x g og skyl med medium uden jern.
- Overfør pillen til et 1,5 ml polypropylenrør, vask med ultrarent vand og centrifuger 2x i 3 minutter ved 1.100 x g. Fjern supernatanten.
- Dyk den nederste del af 1,5 ml polypropylenrøret, der indeholder pelleten i LN2 som beskrevet i trin 1.8.
- Overfør de frosne celler i en LN2 frossen støbeform, og tryk hurtigt ved hjælp af en XRF-pillepresse (figur 3 og figur 7) som beskrevet i trin 1.9.
- Fjern pillen og opbevar den i en LN2-tank til langtidsopbevaring.
- Følg trin 1.9.6 (se figur 4 for overførsel til kryostatprøveholderen).
3. Forberedelse og måling af referenceforbindelser
BEMÆRK: Referenceforbindelser (faste eller flydende), der er repræsentative for arten og forventes at blive fundet i det biologiske system, skal fremstilles og analyseres af XAS til sammenligning med eksperimentelle biologiske prøver. Referencespektre findes også i database 12,13,14 og kan anvendes, forudsat at målebetingelserne (f.eks. spektralopløsning) lignede forsøgsprøverne.
- Ved referencer i vandig opløsning vejes indledende forbindelser i pulverform eller flydende form under anaerob tilstand eller inert atmosfære. Forbered redoxfølsomme referencer i en inert atmosfære (dvs. i en anaerob handskeboks eller i en Schlenk-linje, se figur 5 og figur 6) for at undgå enhver oxidoreduktiv reaktion og for at bevare forbindelsens kemiske integritet, som kan være meget reaktiv og ustabil i den omgivende luft). Her blev alle selenreferencerne fremstillet ved hjælp af en Schlenk-linje og afgaset ultrarent vand (figur 6). Flydende FeIII-malat og ferritin blev fremstillet i luften.
- Bland med passende opløsning for at nå en endelig koncentration på 1 % vægt af det undersøgte grundstof (dvs. selen eller jern) til opsamling i fluorescenstilstand.
BEMÆRK: Ultrarent vand er den mest anvendte løsning til at forberede XAS-referencer. Tilsætning af glycerol (15%-20%) er påkrævet for væsker målt ved hjælp af standard XAS-fluorescens for at forhindre artefakter, der stammer fra røntgendiffraktion af iskrystaller og bevaret kvalitet af XAS-signalet indsamlet med solid state-detektoren. For HERFD-XAS er glycerol imidlertid ikke obligatorisk. Ved hjælp af et krystalanalysatorspektrometer i stedet for en solid state-detektor vælges energien med en ekstremt høj opløsning, og diffraktionen induceret af iskrystaller påvirker ikke dataindsamlingen af det studerede element1. - Den tilberedte opløsning bevares og opbevares i en forseglet Schlenk-ballon (figur 5) eller i et 1,5 ml polypropylenrør, indtil den måles under de samme betingelser som prøverne.
- For faste referencer vejes selen- eller jernmodelblandingspulvere i luften eller i en handskeboks, hvis arten er redoxfølsom. Her blev faste FeII-referencer (Fe II-acetat og vivianit) fremstillet i en gasformigN2-handskeboks, mens FeIII (Fe(OH)3 og FeIII-phosphat) blev fremstillet i luften.
- Bornitridpulver af høj renhed vejes, og der blandes med modelforbindelsespulverne for at nå en endelig koncentration på 1 % vægt af det undersøgte element (figur 7A).
- Slib til et fint pulver med en mørtel i mindst 15 minutter.
- Anbring pulverblandingen i støbeformen for at forberede pellets med den hydrauliske presse (figur 7B, svarende til figur 3A for prøvepillen).
- Luk støbeformen med stemplet (figur 7C, svarende til figur 3B for prøvepillen).
- Tryk for at opnå bulkpillen (figur 7D, svarende til figur 3C for prøvepillen).
- Opbevar de tilberedte bulkpiller i handskerummet, indtil de analyseres under de samme betingelser som prøverne.
BEMÆRK: Bulkpillen klæber undertiden til stemplerne, afhængigt af pulverkompaciteten, for eksempel. Det kan være svært at fjerne det blødt uden at bryde det. I så fald skal følgende procedure ved hjælp af polyimiddiske (f.eks. Kapton) anvendes. - Sæt en dråbe ethanol på hver side af stemplerne, der vil være i kontakt med pulveret (figur 8A).
- Forbered to polyimidskiver med en diameter, der er lidt mindre end stemplerne. Polyimidtykkelsen skal være 10-25 μm (tyndere vil være vanskeligere at manipulere, tykkere vil absorbere for meget af røntgenfotonerne under analysen).
- Sæt skiverne på stemplerne. De vil holde sig ved kapillær virkning (figur 8B).
- Monter støbeformen med stemplet, tilsæt pulveret, og sæt det andet stempel i (figur 8C).
- Tryk (se trin 3.11), og fjern den komprimerede bulkpille fra stemplerne.
BEMÆRK: De faste referencer kan monteres på den kryostatspecifikke prøveholder ligesom prøverne (se trin 1.8.6). Væskereferencerne kan monteres på den kryostatspecifikke prøveholder. Se figur 9A for en CRG-FAME kryostatprøveindehaver. Den samme procedure kan anvendes ved hjælp af en CRG-FAME-UHD-prøveholder, der er vist i figur 4D, ved hjælp af følgende procedure. - Montering af væskereference på kryostatprøveholderen.
- Indstil polyimidbåndet (f.eks. Kapton) (25 μm tykt) for at forsegle den ene side af hullet på prøveholderen ved RT (figur 9B).
- Brug en sprøjte til at fylde hulrummet langsomt med opløsningen, indtil den når toppen. Undgå bobler. Reservoiret skal fyldes (figur 9C, venstre).
- Forsegl den anden side af hulrummet med båndet (figur 9C, højre).
- Dyk den forseglede prøveholder ned i LN2 (figur 9D, T0-T3).
- En termisk reaktion inducerer LN2 boblende. Vent, indtil boblen stopper, hvilket signalerer reaktionens afslutning (figur 9D, T3-T 5).
- Overfør prøveholderen ved 77 K til strålelinjens kryostat, inden dataindsamlingen påbegyndes (figur 9D, T6) eller lagres i LN2 Dewar.
BEMÆRK: Den frosne opløsning spredes godt i hulrummet og danner en ensartet og homogen pellet (figur 9D, T7).
4. HERFD-XAS: måleprocedure
- Optimer alle krystaller fra CAS under Bragg-forhold med hensyn til fluorescenslinjens energi af interesse. Denne procedure kan udføres med en koncentreret referenceforbindelse.
- Kalibrer den indfaldende monokromatiske stråleenergi ved hjælp af en reference, for hvilken absorptionskantens energiposition er kendt (typisk en ren metalfolie). Denne reference kan placeres i et andet trin efter prøven i dobbelt transmissionstilstand for at kunne kontrollere kalibreringen for hvert opnået spektre og til sidst justere dem efterbehandlingen.
- Prøven anbringes i en flydende heliumkrøostat til biologiske prøver efter den relevante procedure, der er beskrevet i trin 1.9.6.
- Luk forsøgskabinen ved at følge synkrotronsikkerhedsreglerne.
- Udfør XAS-anskaffelsen på et energiområde, der dækker den valgte absorptionskant.
- Efter hver spektral erhvervelse skal prøven flyttes mindst dobbelt så stor strålestørrelse i bevægelsesretningen, inden du starter en ny erhvervelse.
BEMÆRK: I dette tilfælde blev målinger udført ved hjælp af Ge(440) krystaller til at vælge Fe Ka1 linje og ved hjælp af Ge (844) krystaller til at vælge Se Ka1 linje. Strålestørrelsen på prøven var 200 x 100 μm² (H x V Fuld bredde halv maksimum). Prøvebevægelsen mellem hver erhvervelse var 500 μm i begge retninger for at undersøge strukturel homogenitet og analysere et nyt område fri for tidligere mulige strålingsskader hver gang. Individuelle spektre sammenlignes og flettes, hvis de er overlejrelige inden for støjen. Målingen stoppes for en given prøve, når kvaliteten af det fusionerede spektrum er korrekt. Derefter kan dataanalyse udføres ved hjælp af enhver software dedikeret til XAS-analyse, især dem, der tillader en lineær kombinationstilpasning af normaliserede spektre, for eksempel Athena og Artemis (Demeter-gruppe af software)15, SixPack16 eller Viper17. Fuldstændige og detaljerede forklaringer på XAS-analyse falder uden for denne protokols anvendelsesområde og kan findes i nylige papirer18,19, hvoraf nogle mere specifikt er afsat til biologiske prøver20. Selen XANES referencespektre er allerede samlet i SSHADE-spektredatabasen21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hovedformålene med disse præparater var at undersøge interaktionen mellem selennanopartikler (Se-NP'er) og kræftceller og jernbinding og sekvestrering i fytoplankton.
HERFD-XANES-spektre af selen i indledende tilstand (BSA Se-NPs) og i celler inkuberet i næringsmedium (BSA Se-NPs efter 24 timers inkubation) er vist i figur 10. Resultaterne viste, at selen i de indledende Se-NP'er var til stede som både Se(0) og selenitlignende former, mens selen i celler efter interaktioner med PC-3-celler hovedsageligt var til stede som Se(0), hvilket viste en ændring af selenarter i celler. For jern viste HERFD-XANES-spektre af referencer forskellige kantpositioner afhængigt af jernoxidationstilstanden, med reducerede jernarter skiftet til lave energiværdier (figur 11). To på hinanden følgende spektre indsamlet på samme position af en kiselpille var ens, hvilket indikerer, at stråleskader var begrænset mellem to erhvervelser ved anvendelse af en He-kryostat ved 10 K. Desuden var spektre fra forskellige positioner af kiselpillen (her tre positioner) identiske, hvilket viste, at prøvepillen var homogen, og at spektrene kunne gennemsnitliggøres for at opnå et bedre signal-støj-forholdsspektrum (gennemsnitligt spektrum). Det gennemsnitlige spektrum for kiselalge viser kantegenskaber, der for det meste svarer til Fe (III). Lineær kombinationstilpasning af referencespektrene blev derefter udført for at kvantificere andelen af jernarterne som beskrevet i Sarret et al.6.
Figur 1: Typiske cellepiller. De 1,5 ml polypropylenrør (OVCAR-3-celler til venstre, PC-3-celler til højre) indeholder henholdsvis 8 x 106 celler og 1 x 107 celler. Kreditering: Caroline Bissardon. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Klargøring i anaerob handskeboks. (A) Anaerob handskeboks indeholdende et (B) 1,5 ml polypropylenrørstativ (blåt) helt nedsænket i flydende LN2. Den flydende LN2 er ikke præsenteret på billedet for klarhedens skyld. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Skema for cellepelletering. (A) Prøve pellet i pressen inden ilægning. B) Prøve under lastning. (C) Prøve bulk pellet efter lastning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Montering af kryo-prøven/-prøverne. Montering i prøveholderen, der er specifik for BM16 XAS-strålelinjen hos ESRF. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Anoxisk fremstilling af referenceopløsning. Eksempler på selenreferencepræparater opbevaret i Schlenk-balloner. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Opsætning til anoxisk fremstilling af referenceopløsninger. Opsætning af Schlenk rampen med afgasset ultrarent vand i flasken til højre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Forberedelse i fast referencepille. Fremstilling af pressede cylindriske pellets til pulverforbindelser enten i den omgivende luft eller under handskerummet. A) Referencepulverets vægt. (B) Pulveret i pressestøttens cylindriske hul. (C) Lukket pressestøtte. (D) Trykning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Fremstilling af en fast referencepille ved anvendelse af polyimidskiver. Fremstilling af presset cylindrisk pellet til klæbrige eller sprøde pulverforbindelser. (A) En dråbe ethanol på hver side af stemplerne, der vil være i kontakt med pulveret, gør det muligt for polyimidskiverne på stemplerne at klæbe til dem (B). Støbeformen er monteret med stemplet. Derefter kan pulveret deponeres, og støbeformen kan lukkes med det andet stempel (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Forberedelsestrin for kryostatprøveholderen til en flydende reference eller prøve. Af hensyn til billedets klarhed blev der taget billeder uden for handskerummet og uden farlige stoffer. Her brugte vi ddH2O vand. Om nødvendigt kan dette præparat foretages under en handskeboks eller inert atmosfære (N2) plasttelt. (A) Prøveholder. (B) Anbring polyimidtape på den buede overflade for at forsegle hullet. (C) Indsprøjt langsomt referenceopløsningerne dråbe for dråbe ved hjælp af en sprøjte, indtil hulrummet er fyldt. Ingen luftbobler må forblive. Forsegl det andet hul med polyimidtape. (D) Dyk i LN2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Se K-edge typisk HERFD-XANES-analyse. Se K-edge HERFD-XANES af BSA-belagte Se-NP'er, som modtaget og efterladt 24 timer i cellekulturmedium, og PC-3-celle udsat for BSA-belagte Se-NP'er. Spektre skiftes for klarhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Fe K-edge typisk HERFD-XANES-analyse. Eksempel på de spektre, der blev indsamlet under vores eksperiment med jernspeciering i plankton. De seks øverste spektre svarer til referencerne/standarderne. De overlejrede spektre (i rød og sort) svarer til to spektre opsamlet på samme position af pelleten. Spektrene mærket pos # 1, pos # 2 og pos # 3 blev indsamlet på tre forskellige positioner af prøvepillen. Spektret kaldet Diatoms Average svarer til de gennemsnitlige spektre indsamlet på forskellige positioner af pelleten og er den prøve, for hvilken specieringen skal bestemmes. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Produkter | PC3-cellelinje | OVCAR3 cellelinje |
| ATCC modificeret RPMI 1640 medium | 445 ml | 394,5 ml |
| Føkalt kvægserum | 50 ml | 100 ml |
| Penicillin-Streptomycin | 5 ml | 5 ml |
| Kvæginsulin | - | 500 μL |
Tabel 1. Cellekultur medie forberedelse. Cellerne dyrkes i American Type Culture Collection (ATCC) modificeret RPMI 1640 medium suppleret med 10% af føtalt bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (PS) til PC-3 prostatacancerceller og med 20% FBS og 1% penicillin-streptomycin og 0,01 mg/ml kvæginsulin til OVCAR-3 ovariecancerceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol blev brugt til at studere den kemiske form af selen og jern i biologiske prøver ved røntgenabsorptionsspektroskopi. Det fokuserer på kryo-forberedelse og opbevaring af biologiske prøver og referenceforbindelser samt på HERFD-XAS-målingerne.
Cryo-forberedelse og opbevaring
Kryopræparatet af de biologiske prøvepiller i bulk gør det muligt at bevare den kemiske integritet af de arter, der er til stede i prøverne. Dette er afgørende, fordi der er observeret artsdannelsesændringer ved anvendelse af frysetørring eller lufttørring til forberedelse6. Denne protokol skal anvendes, så snart den strålelinje, der er valgt til målinger, er udstyret med en heliumkrøostat.
For referenceforbindelser er det nødvendigt at arbejde i en anoxisk atmosfære, når der anvendes redoxfølsomme elementer for at bevare oxidationstilstanden. Dette kan derefter kontrolleres med variationer i spektralkantposition som vist for jernholdige og jernholdige referenceforbindelser (figur 11).
Denne prøveforberedelse kan udføres før synkrotronen eller laboratorieanalysen. I dette tilfælde skal den frosne pellet eller reference overføres til et kryorør og opbevares i en LN2-tank . Denne LN2-opbevaring er obligatorisk for at tilvejebringe et beskyttende inert miljø og undgå ændringer i de kemiske arter, især for reaktivt jern eller selenoforbindelser. Prøverne skal fortrinsvis fremstilles lige før måling eller opbevares et par dage før analysen. Det er bedst ikke at opbevare prøver i lang tid (dvs. måneder).
Cryo-analyse
Analyse ved lave temperaturer, ideelt set ved 10 K, anbefales stærkt for at bremse skader induceret af den intense røntgenstråle, især dannelsen af frie radikaler fra hydrolyse af vand, hvilket kan beskadige proteinmatrixen og skabe fotoredaktion af overgangsmetalioner eller fotodraktion af elementer som svovl22. Det er bedst at tage højde for disse mulige ændringer i de kemiske arter gennem hurtig erhvervelse af XAS-spektret. Prøven skal også scannes for at eksponere et ikke-bestrålet område for hvert spektrum. Som det fremgår af de spektre, der er indsamlet på fytoplanktonpillens tre forskellige positioner (figur 11), afslører en sådan strategi kraftige spektre, som derefter kan gennemsnitliggøres for at opnå et bedre signal-støj-forhold.
Fremtidige applikationer
I vores arbejde brugte vi en beamline dedikeret til HERFD-XAS-målinger (FAME-UHD, ESRF, Frankrig), men denne protokol til biologisk prøveforberedelse kan anvendes på enhver standard XAS-strålelinje udstyret med en kryostat, mens du bruger andre typer detektorer såsom multielement Ge Solid-State-Detector eller Silicon-Drift Detector. Den foreslåede arbejdsgang kan også anvendes på andre kemiske grundstoffer eller ethvert biologisk materiale, der forventes at blive undersøgt ved røntgenabsorptionsspektroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for økonomiske bidrag til beamline-udviklingen fra CEMHTI (Orleans, Frankrig, ANR-13-BS08-0012-01) og Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrig, ANR-10-LABX-0056). FAME-UHD-projektet støttes finansielt af det franske "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), CEA-CNRS CRG-konsortiet og INSU CNRS-instituttet. Vi er taknemmelige for alle bidragene under forsøgene, især alle de personer, der arbejder med BM30B og BM16. Forfatterne anerkender den europæiske synkrotronstrålingsfacilitet til levering af synkrotronstrålingsstråletid. Vi anerkender også PHYTOMET ANR-projektet for finansiel støtte (ANR-16-CE01-0008) og SEDMAC-projektet for finansiel støtte (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
- Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
- Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
