Summary
Dit protocol presenteert een gedetailleerde procedure om biologische cryosamples voor synchrotron-gebaseerde röntgenabsorptiespectroscopie-experimenten voor te bereiden. We beschrijven alle stappen die nodig zijn om de monstervoorbereiding en cryopreservatie te optimaliseren met voorbeelden van het protocol met kanker- en fytoplanktoncellen. Deze methode biedt een universele standaard voor cryo-voorbereiding van monsters.
Abstract
De studie van elementen met röntgenabsorptiespectroscopie (XAS) is van bijzonder belang bij het bestuderen van de rol van metalen in biologische systemen. Monstervoorbereiding is een belangrijke en vaak complexe procedure, met name voor biologische monsters. Hoewel röntgenspeciatietechnieken veel worden gebruikt, is er nog geen gedetailleerd protocol verspreid voor gebruikers van de techniek. Verder is chemische toestandsmodificatie van belang en worden cryo-gebaseerde technieken aanbevolen om de biologische monsters in hun bijna-inheemse gehydrateerde toestand te analyseren om het maximale behoud van de chemische integriteit van de cellen of weefsels te bieden. Hier stellen we een cellulair voorbereidingsprotocol voor op basis van cryo-geconserveerde monsters. Het wordt aangetoond in een hoge energie resolutie fluorescentie gedetecteerdE röntgenabsorptie spectroscopie studie van selenium in kankercellen en een studie van ijzer in fytoplankton. Dit protocol kan worden gebruikt met andere biologische monsters en andere röntgentechnieken die door bestraling kunnen worden beschadigd.
Introduction
De studie van de cellulaire biotransformaties van essentiële of toxische elementen vereist soortvormingstechnieken met een hoge gevoeligheid en moet monstervoorbereidingsstappen minimaliseren die vaak vatbaar zijn voor modificatie van chemische soorten.
Fysiologische elementen zoals selenium en ijzer staan erom bekend bijzonder moeilijk te specificeren zijn vanwege hun complexe chemie, verschillende stabiliteiten van de selenium- of ijzersoorten en hun lage concentratie in het ppm (mg / kg) of zelfs sub-ppm-bereik. De studie van de soortvorming van deze elementen door XAS kan dus uiterst uitdagend zijn. Synchrotron XAS en met name hoge energie resolutie fluorescentie gedetecteerde XAS (HERFD-XAS), die een zeer lage signaal-tot-achtergrondverhouding1 mogelijk maakt, zijn beschikbaar bij synchrotronbronnen om sterk verdunde elementen in complexe biologische matrices te speciëren 2,3. Conventionele fluorescentie-XAS-metingen kunnen worden uitgevoerd met behulp van een energy resolved solid state detector (SSD) met een energiebandbreedte ~ 150-250 eV, op de CRG-FAME-bundellijn bij de European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, terwijl HERFD-XAS-metingen een kristalanalysatorspectrometer (CAS) nodig hebben, met een energiebandbreedte ~ 1-3 eV, op de CRG-FAME-UHD-bundellijn op de ESRF2 . Fluorescentiefotonen worden gediscrimineerd met betrekking tot hun energie met respectievelijk elektronische of optische processen.
De cryopreparaat van het monster is essentieel om structuren te behouden en de chemische integriteit van de samenstelling te behouden, waardoor analyse dicht bij de biologische inheemse toestand5 mogelijk is. Bovendien zorgen analyses uitgevoerd bij cryogene temperaturen zo laag als 10 K met behulp van vloeibare helium cryogene koeling (LN2), ervoor dat stralingsschade vertraagt en elementaire speciatie voor XAS behoudt. Hoewel sommige beoordelingen van XAS-technieken toegepast op biologische monsters de noodzaak melden om monsters in cryogene omstandigheden voor te bereiden en te analyseren (bijv. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), beschrijft geen van hen duidelijk het gerelateerde gedetailleerde protocol. In deze publicatie wordt een methode beschreven voor cryo-voorbereiding van kankercellen en planktonmicro-organismen voor HERFD-XAS-speciatie van Se8 en Fe9 bij cryogene temperatuur.
Goede praktijken voor monstervoorbereiding en omgeving tijdens state-of-the-art XAS-spectroscopiemetingen vereisen 1) een opstelling; 2) een analyseprocedure die de effecten van stralingsschade zoveel mogelijk beperkt; en 3) een monster (of model samengestelde referentie) dat zo homogeen mogelijk is ten opzichte van de bundelgrootte van röntgenfotonen. Het eerste item wordt in aanmerking genomen door de acquisitie bij een lage temperatuur uit te voeren, met behulp van een vloeibare helium cryostaat. Het tweede item wordt behandeld door elke acquisitie uit te voeren op een vers deel van het monster door het ten opzichte van de balk te verplaatsen. Ten slotte worden, rekening houdend met de derde voorwaarde, monsters (pellets) en referenties (poeders) geconditioneerd in geperste bulkpellets om porositeiten en inhomogeniteiten zoveel mogelijk te beperken en ruwheid te voorkomen met betrekking tot de bundelgrootte op het oppervlak van het röntgensonde monster. We leggen uit hoe het protocol met al deze punten omgaat.
We gebruikten menselijke prostaatcellijn PC-3 (hoog gemetastaseerd potentieel) en ovariumcellijn OVCAR-3 (die goed is voor maximaal 70% van alle gevallen van eierstokkanker) om de antiproliferatieve eigenschappen ten opzichte van kankercellen van selenium nanodeeltjes (Se-NP's) en Phaeodactylum tricornutum diatomeeën te onderzoeken als een modelsoort om ijzervastlegging in fytoplankton te onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van de menselijke PC-3 en OVCAR-3 kankercelkorrels voor seleniumspeciatie
OPMERKING: Het volgende protocol is aangepast van Weekley et al.10. Alle stappen moeten worden uitgevoerd onder een celkweekkap onder bioveiligheidsniveau 2-omstandigheden en -beperkingen, met behulp van aseptische technieken.
- Tel de cellen met behulp van een Malassez-celtelkamer. Zaad 150.000-200.000 cellen per kolf voor de PC-3 cellijn en 300.000 cellen voor de OVCAR-3 cellijn.
- Zaadcellen in T-75 kolven (drie kolven per conditie om triplicaten te hebben) in de geschikte celkweekmedia (tabel 1) onder de laminaire stroomkap.
- Laat de celculturen groeien in een incubator bij 37 °C en een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 totdat ze 80% samenvloeiing bereiken. Meestal verdubbelen PC-3 prostaatkankercellijnen na 24 uur, terwijl OVCAR-3 eierstokkankercellijnen 72 uur duren. De kolven moeten in de couveuse worden gelaten.
- Verdun ondertussen de Se-NP's die voor de behandeling worden gebruikt tot een eindconcentratie die overeenkomt met de IC20 (remmende concentratie om 20% celdood te bereiken) die vooraf is bepaald door de MTT-test (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) voor cytotoxiciteitsbeoordeling. Deze concentraties zijn specifiek voor elk Se-NP-type, maar ook specifiek voor de bestudeerde cellijn.
- Plaats de nanodeeltjesvoorraadoplossing (2 mg/ml runderserumalbumine [BSA] of chitosan gecoate Se-NP's) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) in een ultrasoon waterbad.
- Verdun de Se-NP-oplossing door seriële verdunningen in volledig celkweekmedium om werkconcentraties te bereiken. Tussen elke verdunning, vortex gedurende 1 min.
- Bereid een seleniumpositieve controle voor met verdund seleniumzout voor de behandeling.
- Bereid een waterige natriumseleniet stockoplossing (1 mg/ml) in een polypropyleenbuis van 15 ml. Meng 1 mg natriumselenietpoeder met 1 ml ultrapuur water.
- Vortex de voorraadoplossing gedurende 1 min.
- Verdun de natriumselenietvoorraadoplossing door seriële verdunningen in volledig celkweekmedium om werkconcentraties te bereiken.
OPMERKING: Vergeet niet om vóór elke verdunning meerdere keren te pipetteren om de oplossing te homogeniseren.
- Stel de kankercellen bloot aan seleniumbehandelingen.
OPMERKING: Dit deel van het protocol moet worden herhaald voor elk getest nanodeeltje (NP). Hier zijn de NP's van twee typen, BSA en chitosan gecoate Se-NP's, plus de controles. De natriumselenietoplossing is de positieve controle en geen enkele behandeling is de negatieve controle.- Open de drie T-75 kolven met de cellen in de laminaire stromingskap.
- Verwijder het medium en was de cellen voorzichtig 2x met 5 ml verwarmd (37 °C) fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).
- Voeg voorzichtig aan de onderkant van de kolf en niet direct op de cellaag 15 ml van de behandeling toe in elke kolf met behulp van een automatische pipet uitgerust met 25 ml steriele plastic pipetten. Plaats de deksels op de kolven. Sluit de deksels niet goed.
OPMERKING: Zoals beschreven in stap 1.3 en 1.4 moeten de behandelingsoplossingen vooraf opnieuw zijn uitgegeven om te worden gehomogeniseerd. - Laat de drie kolven horizontaal in een incubator bij 37 °C en een atmosfeer bevochtigd met 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Bereiding van de celkorrels
- Was de cellen voorzichtig 2x met 5 ml opgewarmde PBS (37 °C) direct in de T75-kolven.
- Voeg 6 ml verwarmd celkweekmedium (37 °C) toe aan de cellaag in de T-75-kolf met behulp van een pipet die is uitgerust met steriele plastic pipetten van 10 ml.
- Verzamel de cellen door zachtjes te schrapen met behulp van een celschraper. Gebruik één celschraper per kolf.
- Gebruik een pipet en een pipet van 10 ml om de vloeistof op te zuigen en de cel /het medium terug te spoelen op het kolfoppervlak om alle cellen te verzamelen. Herhaal deze stap meerdere keren om de cellen te dissociëren en te individualiseren. Verzamel het medium met de cellen in een polypropyleenbuis van 15 ml.
- Draai 5 min naar beneden bij 250 x g bij RT. Adem het supernatant op.
- Spoel de cellen door ze opnieuw te suspenderen in 5 ml PBS.
- Draai 5 minuten lang naar beneden bij 250 x g bij RT. Zuig het supernatant op en herhaal stap 1.6.5 en 1.6.6 2x om alle resterende sporen van de behandeling te verwijderen.
- Resuspend de cellen in 1 ml PBS en breng ze over in een polypropyleenbuis van 1,5 ml. Draai ze ten slotte gedurende 5 minuten op 250 x g bij RT. Figuur 1 geeft de celkorrel weer die wordt verkregen na het centrifugeren en weggooien van het supernatant.
- Verwijder voorzichtig al het PBS-supernatant met een pipet van 200 μL.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u de celkorrel niet aanraakt en beschadigt. Idealiter moet de pellet 2-3 mm hoog of dik zijn, met een diameter van 3-6 mm. Voor de PC-3 cellijn zijn 9 x 106-10 x 106 cellen nodig voor de test. Voor de OVCAR-3 cellijn zijn 8 x 106-9 x 106 cellen nodig (figuur 1). Sommige cellen zullen waarschijnlijk verloren gaan tijdens de daaropvolgende bufferspoelstappen. Hoe hoger het celnummer, hoe beter de pellet zal zijn.
- Flash-bevriezing van de celkorrels
- Dompel het onderste deel van de buis van 1,5 ml met de pellet in vloeibare stikstof (LN2) tot het niveau van de celpellet.
- In een handschoenenkastje dat volledig is gezuiverd met een inerte atmosfeer zoals stikstofgas, verzamelt u de celkorrel door voorzichtig op de buis van 1,5 ml op het vlakke oppervlak van een LN2-gekoeld koperblok te tikken (figuur 2). De pellet wordt vervolgens verzameld zonder celverlies.
OPMERKING: Gebruik cryoprotectieapparatuur, laboratoriumjas, gesloten schoenen, cryohandschoenen en een gezichtsscherm of veiligheidsbril voor LN2-behandeling . - Indien nodig kan een LN2 gekoelde naald worden gebruikt om de pellet eruit te halen.
OPMERKING: De resulterende bevroren celkorrel kan fragmenteren. Deze stappen moeten in een tijdsbestek van een paar minuten worden uitgevoerd en vertrouwen op de behendigheid en snelheid van de onderzoeker. - De afmetingen van de bevroren pellet moeten passen bij de houder van het cryostaatmonster. Als de celkorrel met behulp van de beschreven apparatuur groter is dan 2 mm hoog en iets kleiner dan het gat van de monsterhouder die voor XAS wordt gebruikt, kan het monster direct worden gebruikt. Als dat niet het geval is, of als een vlak oppervlak voor de analyse gewenst is, moet een cilindrische pellet in bulk worden bereid, waarbij de pellet nog steeds in bevroren toestand blijft. Als de celkorrel gefragmenteerd is, kunnen de volgende stappen idealiter worden gebruikt in een handschoenenkastje dat volledig is gezuiverd met een inerte atmosfeer.
- Bereiding van de bulk bevroren cilindrische pellets
- Dompel alle onderdelen van een handmatige hydraulische pers die in contact komen met het monster onder in LN2 (figuur 3A; pelletmatrijzen met een diameter van 3 of 5 mm, mal, zuiger- / draadtrekken).
- Breng de snel bevroren pelletfragmenten over in de mal die is geladen met de juiste pelletmatrijzen (figuur 3B).
- Snel pelletiseren met de hydraulische pers. Het gebruik van 1,5 ton voor een pellet met een diameter van 5 mm of 0,5 ton voor een pellet met een diameter van 3 mm is voldoende (figuur 3C).
OPMERKING: Na elke pelletbereiding met de hydraulische pers moeten alle materialen op de juiste manier worden ontdooid en gedroogd met behulp van stikstofgas om problemen met de resterende vorst en vochtigheid te voorkomen. - Verzamel de bulkkorrel van bevroren cellen snel en plaats deze in een geschikte cryobuis voor opslag.
- Bewaar het terug in de LN2-tank voor langdurige opslag.
- Breng de cryo-pellets over en monteer ze voor analyse. De pellet die is opgeslagen in een LN2-gekoelde cryobuis wordt overgebracht naar een 77 K voorgekoelde cryostaatmonsterhouder in vloeistof N2 (figuur 4, zoals gebruikt voor een CRG-FAME-UHD-bundellijn). Deze stap moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd, maar kan enkele minuten duren. Breng vervolgens de monsterhouder over naar de cryostaat en houd deze gedurende de hele XAS-analyse op 10 K.
OPMERKING: Stappen 1.9.3 en 1.9.6 zijn moeilijk omdat ze snel moeten worden uitgevoerd om vorstvorming te voorkomen die de zuiger en de mal blokkeert. Een alternatief is om deze stappen uit te voeren onder een plastic tent die volledig is gezuiverd met stikstofgas. De LN2-koele kopermassa maakt het mogelijk om de pellet bevroren te houden.
2. Voorbereiding van de planktoncellen op ijzersoortvorming
OPMERKING: Synthetisch zeewater dat voor dit protocol werd gebruikt, werd bereid door toevoeging van ultrapuur water zeezouten, morfolinopropanenulfonzuur, ammoniumnitraat, natriumnitraat, natriummetasilicaat pentahydraat, natriumfosfaat monobasisch, vitaminevoorraad, sporenmetaalvoorraad, antibioticavoorraad en HEPES-buffer bij pH = 7,9. De concentraties van elk bestanddeel worden aangegeven in de materialentabel. Details over de cultuur zijn te vinden in Sutak et al.11
- Centrifugeer een P. tricornutum diatomeeëncultuur in een polypropyleenbuis van 50 ml bij 1.100 x g gedurende 6 minuten en breng de pellet over in een kolf met vers medium.
- Laat de cultuur 24 uur lang groeien in synthetisch zeewater in een groeikamer.
- Centrifugeer de planktoncultuur gedurende 6 minuten bij 1.100 x g en breng de pellet over in vers medium dat Fe-citraat bevat (1 μM in de uiteindelijke cultuur). Incubeer gedurende 72 uur.
- Bereid de planktoncellen voor
- Centrifugeer de cellen gedurende 3 minuten bij 1.100 x g en spoel af met medium zonder ijzer.
- Breng de pellet over in een polypropyleenbuis van 1,5 ml, was met ultrapuur water en centrifugeer 2x gedurende 3 minuten bij 1.100 x g. Verwijder het supernatant.
- Dompel het onderste deel van de polypropyleenbuis van 1,5 ml met de pellet in LN2 zoals beschreven in stap 1.8.
- Breng de bevroren cellen over in een LN2 bevroren vormmachine en druk snel met een XRF-pelletpers (figuur 3 en figuur 7) zoals beschreven in stap 1.9.
- Verwijder de pellet en bewaar deze in een LN2-tank voor langdurige opslag.
- Volg stap 1.9.6 (zie figuur 4 voor de overdracht in de cryostaatmonsterhouder).
3. Bereiding en meting van referentieverbindingen
OPMERKING: Referentieverbindingen (vast of vloeibaar) die representatief zijn voor de soort en naar verwachting in het biologische systeem zullen worden aangetroffen, moeten door XAS worden voorbereid en geanalyseerd voor vergelijking met experimentele biologische monsters. Referentiespectra zijn ook te vinden in databases 12,13,14 en kunnen worden gebruikt op voorwaarde dat de meetomstandigheden (bijv. Spectrale resolutie) vergelijkbaar waren met de experimentele monsters.
- Voor verwijzingen in waterige oplossing, weeg de oorspronkelijke verbindingen in poeder- of vloeibare vorm onder anaërobe toestand of inerte atmosfeer. Bereid redoxgevoelige referenties voor in een inerte atmosfeer (d.w.z. in een anaëroob handschoenenkastje of in een Schlenk-lijn, zie figuur 5 en figuur 6) om oxido-reductieve reacties te voorkomen en de chemische integriteit van de verbinding te behouden, die zeer reactief en onstabiel kan zijn in de omgevingslucht). Hier werden alle seleniumreferenties bereid met behulp van een Schlenk-lijn en ontgast ultrapuur water (figuur 6). Vloeibare FeIII-malaat en ferritine werden bereid in de omgevingslucht.
- Meng met de juiste oplossing om een eindconcentratie van 1% wt van het bestudeerde element (d.w.z. selenium of ijzer) te bereiken voor verzameling in fluorescentiemodus.
OPMERKING: Ultrapuur water is de meest gebruikte oplossing om XAS-referenties te bereiden. Toevoeging van glycerol (15% -20%) is vereist voor vloeistoffen die zijn gemeten met behulp van standaard XAS-fluorescentie om artefacten te voorkomen die voortvloeien uit röntgendiffractie door ijskristallen en de kwaliteit van het XAS-signaal dat wordt verzameld met de vastestofdetector. Echter, voor HERFD-XAS, glycerol is niet verplicht. Met behulp van een kristalanalysatorspectrometer in plaats van een solid-state detector wordt de energie geselecteerd met een extreem hoge resolutie en de diffractie geïnduceerd door ijskristallen heeft geen invloed op de gegevensverzameling van het bestudeerde element1. - Bewaar de bereide oplossing in een afgesloten Schlenk-ballon (figuur 5) of in een polypropyleenbuis van 1,5 ml tot de meting onder dezelfde omstandigheden als de monsters.
- Weeg selenium of ijzersamenstellingspoeders voor vaste referenties in de omgevingslucht of in een handschoenenkastje als de soort redoxgevoelig is. Hier werden vaste FeII-referenties (Fe II-acetaat en vivianiet) bereid in een gasvormig N2-handschoenenkastje, terwijl FeIII (Fe(OH)3 en FeIII-fosfaat) in de omgevingslucht werden bereid.
- Weeg boornitridepoeder met hoge zuiverheid af en meng met de poeders van de modelverbindingen om een eindconcentratie van 1% wt van het bestudeerde element te bereiken (figuur 7A).
- Maal met een vijzel minstens 15 min tot een fijn poeder.
- Plaats het poedermengsel in de vormmachine om pellets te bereiden met de hydraulische pers (figuur 7B, vergelijkbaar met figuur 3A voor de monsterpellet).
- Sluit de vormmachine met de zuiger (figuur 7C, vergelijkbaar met figuur 3B voor de monsterpellet).
- Druk om de bulkpellet te verkrijgen (figuur 7D, vergelijkbaar met figuur 3C voor de monsterpellet).
- Bewaar de bereide bulkpellets in het handschoenenkastje totdat ze onder dezelfde omstandigheden als de monsters worden geanalyseerd.
OPMERKING: De bulkpellet kleeft soms aan de zuigers, afhankelijk van bijvoorbeeld de poedercompatimeter. Het zachtjes verwijderen zonder het dan te breken kan moeilijk zijn. In dat geval moet de volgende procedure met polyimide (bijv. Kapton) schijven worden gebruikt. - Plaats een druppel ethanol aan elke kant van de zuigers die in contact komen met het poeder (figuur 8A).
- Bereid twee polyimideschijven voor met een diameter die iets kleiner is dan de zuigers. De polyimidedikte moet 10-25 μm zijn (dunner zal moeilijk te manipuleren zijn, dikker zal tijdens de analyse te veel van de röntgenfotonen absorberen).
- Plaats de schijven op de zuigers. Ze blijven plakken door capillaire werking (figuur 8B).
- Monteer de vormmachine met de zuiger, voeg het poeder toe en plaats de tweede zuiger (figuur 8C).
- Druk (zie stap 3.11) en verwijder de samengeperste bulkpellet uit de zuigers.
OPMERKING: De vaste referenties kunnen net als de monsters op de cryostaatspecifieke monsterhouder worden gemonteerd (zie stap 1.8.6). De vloeistofreferenties kunnen op de cryostaatspecifieke monsterhouder worden gemonteerd. Zie figuur 9A voor een CRG-FAME cryostaat monsterhouder. Dezelfde procedure kan worden toegepast met behulp van een CRG-FAME-UHD-monsterhouder, weergegeven in figuur 4D, met behulp van de volgende procedure. - Montage van vloeistofreferentie op de cryostaatmonsterhouder.
- Plaats de polyimide (bijv. Kapton) tape (25 μm dik) om één kant van het gat op de monsterhouder bij RT af te dichten (figuur 9B).
- Gebruik een spuit om de holte langzaam te vullen met de oplossing totdat deze de bovenkant bereikt. Vermijd bubbels. Het reservoir moet worden gevuld (figuur 9C, links).
- Sluit de andere kant van de holte af met de tape (figuur 9C, rechts).
- Dompel de verzegelde monsterhouder in LN2 (figuur 9D, T0–T3).
- Een thermische reactie induceert LN2 bubbelen. Wacht tot het borrelen stopt en het einde van de reactie aangeeft (figuur 9D, T3-T 5).
- Breng de monsterhouder bij 77 K over in de cryostaat van de bundellijn voordat u begint met het verzamelen van gegevens (figuur 9D, T6) of het opslaan in de LN2 Dewar.
OPMERKING: De bevroren oplossing is goed verspreid in de holte en vormt een uniforme en homogene pellet (figuur 9D, T7).
4. HERFD-XAS: meetprocedure
- Optimaliseer alle kristallen uit de CAS in Bragg-omstandigheden met betrekking tot de fluorescentielijnenergie van belang. Deze procedure kan worden uitgevoerd met een geconcentreerde referentieverbinding.
- Kalibreer de invallende monochromatische bundelenergie met behulp van een referentie waarvoor de energiepositie van de absorptierand bekend is (meestal een zuivere metaalfolie). Deze referentie kan in een tweede stap na het monster worden geplaatst, in dubbele transmissiemodus, om de kalibratie voor elke verkregen spectra te kunnen controleren en uiteindelijk na de behandeling uit te lijnen.
- Plaats het monster in een vloeibare helium cryostaat voor biologische monsters volgens de passende procedure beschreven in stap 1.9.6.
- Sluit het experimentele hok volgens de synchrotron-veiligheidsregels.
- Voer de XAS-acquisitie uit op een energiebereik dat de geselecteerde absorptierand bedekt.
- Verplaats na elke spectrale acquisitie het monster ten minste tweemaal de bundelgrootte in de richting van de beweging voordat u met een nieuwe acquisitie begint.
OPMERKING: In dit geval werden metingen uitgevoerd met Behulp van Ge(440) kristallen om de Fe Ka1 lijn te selecteren en met behulp van Ge(844) kristallen om de Se Ka1 lijn te selecteren. De balkgrootte op het monster was 200 x 100 μm² (H x V Full Width Half Maximum). De monsterbeweging tussen elke acquisitie was 500 μm in beide richtingen, om de structurele homogeniteit te onderzoeken en om telkens een nieuw gebied te analyseren dat vrij was van eerdere mogelijke stralingsschade. Individuele spectra worden vergeleken en samengevoegd als ze over elkaar heen kunnen worden gelegd binnen de ruis. De meting wordt voor een bepaald monster gestopt wanneer de kwaliteit van het samengevoegde spectrum correct is. Vervolgens kan gegevensanalyse worden uitgevoerd met behulp van elke software die is gewijd aan XAS-analyse, vooral die welke een lineaire combinatie van genormaliseerde spectra mogelijk maken, bijvoorbeeld Athena en Artemis (Demeter-groep van software)15, SixPack16 of Viper17. Volledige en gedetailleerde uitleg van XAS-analyse valt buiten het bestek van dit protocol en is te vinden in recente artikelen18,19, waarvan sommige meer specifiek gewijd zijn aan biologische monsters20. Selenium XANES referentiespectra zijn al verzameld in de SSHADE spectra database21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De belangrijkste doelen van deze preparaten waren het onderzoeken van de interactie tussen selenium nanodeeltjes (Se-NP's) en kankercellen, en ijzerbinding en sekwestratie in fytoplankton.
HERFD-XANES spectra van het selenium in de begintoestand (BSA Se-NP's) en in cellen geïncubeerd in voedingsmedium (BSA Se-NP's na 24 uur incubatie) zijn weergegeven in figuur 10. De resultaten toonden aan dat selenium in de initiële Se-NP's aanwezig was als zowel Se(0) als selenietachtige vormen, terwijl na interacties met PC-3-cellen het selenium in cellen voornamelijk aanwezig was als Se(0), wat een verandering van seleniumsoorten in cellen aantoont. Voor ijzer vertoonden HERFD-XANES-referentiespectra verschillende randposities afhankelijk van de ijzeroxidatietoestand, waarbij verminderde ijzersoorten werden verschoven naar lage energiewaarden (figuur 11). Twee opeenvolgende spectra verzameld op dezelfde positie van een diatomeeënkorrel waren vergelijkbaar, wat aangeeft dat bundelschade beperkt was tussen twee acquisities bij gebruik van een He-cryostaat bij 10 K. Bovendien waren spectra van verschillende posities van de diatomeeënkorrel (hier drie posities) identiek, wat aantoont dat de monsterpellet homogeen was en dat de spectra konden worden gemiddeld om een beter signaal-ruisverhoudingsspectrum (gemiddeld spectrum) te verkrijgen. Het gemiddelde spectrum voor diatomeeën vertoont randkenmerken die meestal overeenkomen met Fe(III). Lineaire combinatieaanpassing van de referentiespectra werd vervolgens uitgevoerd om het aandeel van de ijzersoorten te kwantificeren zoals beschreven in Sarret et al.6.
Figuur 1: Typische celkorrels. De 1,5 ml polypropyleen buizen (OVCAR-3 cellen links, PC-3 cellen rechts) met respectievelijk 8 x 106 cellen en 1 x 107 cellen. Bronvermelding: Caroline Bissardon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bereiding in anaeroob handschoenenkastje. (A) Anaeroob handschoenenkastje met daarin een (B) polypropyleen buizenrek van 1,5 ml (blauw) volledig ondergedompeld in vloeibare LN2. De vloeistof LN2 is niet voor de duidelijkheid op de foto weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schema van celpelletie. (A) Monsterpellet in de pers vóór het laden. B) Monster tijdens het laden. C) Monsterpellet in bulk na het laden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Montage van het(de) cryomonster(s). Montage in de monsterhouder specifiek voor BM16 XAS beamline bij ESRF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Anoxische bereiding van de referentieoplossing. Voorbeelden van seleniumreferentiepreparaten die zijn opgeslagen in Schlenk-ballonnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Opstelling voor anoxische bereiding van referentieoplossingen. Opstelling van de Schlenk-oprit met ontgast ultrapuur water in de fles aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Bereiding in vaste referentiepellet. Bereiding van geperste cilindrische pellets voor poederverbindingen in de omgevingslucht of onder het handschoenenkastje. (A) Gewicht van het referentiepoeder. (B) Het poeder in het cilindrische gat van de perssteun. (C) Gesloten persondersteuning. (D) Indrukken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Bereiding van een vaste referentiekorrel met behulp van polyimideschijven. Bereiding van geperste cilindrische pellet voor kleverige of broze poederverbindingen. (A) Een druppel ethanol aan elke kant van de zuigers die in contact komt met het poeder zal de polyimideschijven op de zuigers in staat stellen eraan te blijven kleven (B). De molder wordt gemonteerd met de zuiger. Vervolgens kan het poeder worden afgezet en kan de vormer worden gesloten met de tweede zuiger (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Voorbereidingsstappen voor de cryostaatmonsterhouder voor een vloeistofreferentie of monster. Voor de duidelijkheid van de foto zijn foto's gemaakt buiten het handschoenenkastje en zonder gevaarlijke stoffen. Hier gebruikten we ddH2O water. Indien nodig kan dit preparaat worden gemaakt onder een handschoenenkastje of inerte atmosfeer (N2) plastic tent. (A) Monsterhouder. (B) Plaats polyimidetape op het gebogen oppervlak om het gat af te dichten. (C) Injecteer de referentieoplossingen langzaam druppelsgewijs met een spuit totdat de holte is gevuld. Er mogen geen luchtbellen achterblijven. Sluit het andere gat af met polyimidetape. (D) Duik in LN2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Se K-edge typische HERFD-XANES analyse. Se K-edge HERFD-XANES van BSA-gecoate Se-NP's, zoals ontvangen en 24 uur achtergelaten in celkweekmedium, en PC-3-cel blootgesteld aan BSA-gecoate Se-NP's. Spectra worden verschoven voor de duidelijkheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Fe K-edge typische HERFD-XANES analyse. Voorbeeld van de spectra verzameld tijdens ons experiment over de ijzersoortvorming in plankton. De zes bovenste spectra komen overeen met de referenties/standaarden. De gesuperponeerde spectra (in rood en zwart) komen overeen met twee spectra die op dezelfde positie van de pellet worden verzameld. De spectra met het label pos#1, pos#2 en pos#3 werden verzameld op drie verschillende posities van de monsterkorrel. Het spectrum genaamd Diatoms Average komt overeen met de gemiddelde spectra verzameld op verschillende posities van de pellet en is het monster waarvoor de soortvorming moet worden bepaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Producten | PC3 cellijn | OVCAR3 cellijn |
| ATCC gemodificeerde RPMI 1640 medium | 445 ml | 394,5 ml |
| Foetaal runderserum | 50 ml | 100 ml |
| Penicilline-Streptomycine | 5 ml | 5 ml |
| Runderinsuline | - | 500 μL |
Tabel 1. Celkweek mediavoorbereiding. De cellen worden gekweekt in American Type Culture Collection (ATCC) gemodificeerd RPMI 1640 medium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (PS) voor PC-3 prostaatkankercellen en met 20% FBS en 1% penicilline-streptomycine en 0,01 mg / ml runderinsuline voor OVCAR-3 eierstokkankercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol werd gebruikt om de chemische vorm van selenium en ijzer in biologische monsters te bestuderen door middel van röntgenabsorptiespectroscopie. Het richt zich op de cryo-voorbereiding en opslag van biologische monsters en referentieverbindingen, evenals op de HERFD-XAS-metingen.
Cryo-voorbereiding en opslag
De cryo-voorbereiding van de bulk biologische monsterkorrels maakt het mogelijk om de chemische integriteit van de in de monsters aanwezige soorten te behouden. Dit is van cruciaal belang, omdat er soortveranderingen zijn waargenomen bij het gebruik van vriesdrogen of luchtdrogen voor bereiding6. Dit protocol moet worden gebruikt zodra de voor metingen geselecteerde bundellijn is uitgerust met een helium cryostaat.
Voor referentieverbindingen is het noodzakelijk om in een anoxische atmosfeer te werken bij het gebruik van redoxgevoelige elementen om de oxidatietoestand te behouden. Dit kan vervolgens worden gecontroleerd met variaties in spectrale randpositie zoals weergegeven voor ferro- en ijzerreferentieverbindingen (figuur 11).
Deze monstervoorbereiding kan worden uitgevoerd vóór de synchrotron- of laboratoriumanalyse. In dit geval moet de bevroren pellet of referentie worden overgebracht in een cryobuis en worden opgeslagen in een LN2-tank . Deze LN2-opslag is verplicht om een beschermende inerte omgeving te bieden en veranderingen in de chemische soorten te voorkomen, met name voor reactief ijzer of seleno-verbindingen. Bij voorkeur moeten monsters vlak voor de meting worden voorbereid of een paar dagen voor de analyse worden opgeslagen. Het is het beste om monsters niet voor een lange periode (d.w.z. maanden) op te slaan.
Cryo-analyse
Analyse bij lage temperaturen, idealiter bij 10 K, wordt sterk aanbevolen om schade veroorzaakt door de intense röntgenstraal te vertragen, met name de vorming van vrije radicalen uit de hydrolyse van water, die de eiwitmatrix kunnen beschadigen en fotoreductie van overgangsmetaalionen of fotoreductie van elementen zoals zwavel22 kunnen creëren. Het is het beste om rekening te houden met deze mogelijke veranderingen in de chemische soort door snelle verwerving van het XAS-spectrum. Het monster moet ook worden gescand om voor elk spectrum een niet-bestraald gebied bloot te leggen. Zoals blijkt uit de spectra die zijn verzameld op de drie verschillende posities van de fytoplanktonkorrel (figuur 11), onthult een dergelijke strategie krachtige spectra, die vervolgens kunnen worden gemiddeld om een betere signaal-ruisverhouding te verkrijgen.
Toekomstige toepassingen
In ons werk gebruikten we een beamline gewijd aan HERFD-XAS-metingen (FAME-UHD, ESRF, Frankrijk), maar dit protocol voor biologische monstervoorbereiding kan worden toegepast op elke standaard XAS-beamline uitgerust met een cryostaat terwijl andere soorten detectoren worden gebruikt, zoals multielement Ge Solid-State-Detector of Silicon-Drift Detector. De voorgestelde workflow kan ook worden toegepast op andere chemische elementen of elk biologisch materiaal dat naar verwachting zal worden bestudeerd door röntgenabsorptiespectroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de financiële bijdragen aan de ontwikkeling van de beamline door CEMHTI (Orleans, Frankrijk, ANR-13-BS08-0012-01) en Labex OSUG@2020 (Grenoble, Frankrijk, ANR-10-LABX-0056). Het FAME-UHD-project wordt financieel ondersteund door het Franse "grand emprunt" EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), het CEA-CNRS CRG-consortium en het INSU CNRS-instituut. We zijn dankbaar voor alle bijdragen tijdens de experimenten, vooral alle personen die aan BM30B en BM16 werken. De auteurs erkennen de European Synchrotron Radiation Facility voor het leveren van synchrotron stralingsbundeltijd. We erkennen ook het PHYTOMET ANR-project voor financiële steun (ANR-16-CE01-0008) en het SEDMAC-project voor financiële steun (INCA-Plan kanker-ASC16019CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
- Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
- Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
