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Chemistry

Préparation d’échantillons biologiques pour la spéciation à température cryogénique à l’aide de la spectroscopie d’absorption de rayons X à haute résolution

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/60849
Automatic Translation
1, 2, 3, 4,5, 4,5, 4,5, 1,6
1University Grenoble Alpes, INSERM UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), 2CNRS, UMR 5254, Université Pau & Pays Adour, E2S UPPA, Institut des Sciences Analytiques et de Physicochimie pour l'Environnement et les Matériaux, 3Institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRS, Université Paris Diderot, 4OSUG, UMS 832 CNRS, Université Grenoble Alpes, 5FAME and FAME-UHD beamlines, ESRF, the European Synchrotron, 6ID16A beamline, ESRF, the European Synchrotron

Summary

Ce protocole présente une procédure détaillée pour préparer des cryoéchantillons biologiques pour des expériences de spectroscopie d’absorption de rayons X basées sur le synchrotron. Nous décrivons toutes les étapes nécessaires pour optimiser la préparation des échantillons et la cryoconservation avec des exemples du protocole avec les cellules cancéreuses et phytoplanctoniques. Cette méthode fournit une norme universelle de cryo-préparation des échantillons.

Abstract

L’étude des éléments avec spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS) est particulièrement intéressante lors de l’étude du rôle des métaux dans les systèmes biologiques. La préparation des échantillons est une procédure clé et souvent complexe, en particulier pour les échantillons biologiques. Bien que les techniques de spéciation aux rayons X soient largement utilisées, aucun protocole détaillé n’a encore été diffusé pour les utilisateurs de la technique. En outre, la modification de l’état chimique est préoccupante et des techniques cryogéniques sont recommandées pour analyser les échantillons biologiques dans leur état hydraté quasi natif afin de préserver au maximum l’intégrité chimique des cellules ou des tissus. Nous proposons ici un protocole de préparation cellulaire basé sur des échantillons cryo-conservés. Il est démontré dans une étude par spectroscopie d’absorption des rayons X à haute résolution d’énergie détectée par fluorescence du sélénium dans les cellules cancéreuses et une étude du fer dans le phytoplancton. Ce protocole peut être utilisé avec d’autres échantillons biologiques et d’autres techniques de rayons X qui peuvent être endommagés par l’irradiation.

Introduction

L’étude des biotransformations cellulaires d’éléments essentiels ou toxiques nécessite des techniques de spéciation à haute sensibilité et devrait minimiser les étapes de préparation des échantillons qui sont souvent sujettes à la modification des espèces chimiques.

Les éléments physiologiques tels que le sélénium et le fer sont connus pour être particulièrement difficiles à spécifier en raison de leur chimie complexe, de diverses stabilités des espèces de sélénium ou de fer et de leur faible concentration dans la gamme ppm (mg / kg) ou même inférieure au ppm. Ainsi, l’étude de la spéciation de ces éléments par XAS peut être extrêmement difficile. Le synchrotron XAS et en particulier le XAS à haute résolution de fluorescence d’énergie détecté (HERFD-XAS), qui permet un rapport signal/fondtrès faible 1, sont disponibles dans les sources synchrotron pour spécier des éléments hautement dilués dans des matrices biologiques complexes 2,3. Les mesures conventionnelles de fluorescence-XAS peuvent être effectuées à l’aide d’un détecteur à semi-conducteurs (SSD) à résolution d’énergie avec une largeur de bande d’énergie d’environ 150 à 250 eV, sur la ligne de faisceau CRG-FAME de l’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)4, tandis que les mesures HERFD-XAS nécessitent un spectromètre à analyseur de cristaux (CAS), avec une largeur de bande d’énergie d’environ 1 à 3 eV, sur la ligne de faisceau CRG-FAME-UHD à l’ESRF2 . Les photons de fluorescence sont discriminés par rapport à leur énergie avec des processus électroniques ou optiques respectivement.

La cryo-préparation de l’échantillon est essentielle pour préserver les structures et maintenir l’intégrité chimique de la composition, permettant ainsi une analyse proche de l’état biologique natif5. De plus, les analyses effectuées à des températures cryogéniques aussi basses que 10 K à l’aide d’un refroidissement cryogénique à l’hélium liquide (LN2) permettent aux dommages causés par le rayonnement de ralentir et de préserver la spéciation élémentaire pour XAS. Bien que certaines revues sur les techniques XAS appliquées aux échantillons biologiques signalent la nécessité de préparer et d’analyser des échantillons dans des conditions cryogéniques (par exemple, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), aucune d’entre elles ne décrit clairement le protocole détaillé connexe. Dans cette publication, une méthode de cryo-préparation de cellules cancéreuses et de micro-organismes planctoniques est décrite pour la spéciation HERFD-XAS de Se8 et Fe9 à température cryogénique.

Les bonnes pratiques pour la préparation des échantillons et l’environnement lors des mesures spectroscopiques XAS de pointe nécessitent 1) une configuration; 2) une procédure d’analyse qui limite autant que possible les effets des dommages causés par les rayonnements; et 3) un échantillon (ou une référence de composé modèle) aussi homogène que possible en ce qui concerne la taille du faisceau de photons X. Le premier élément est pris en compte en effectuant l’acquisition à basse température, à l’aide d’un cryostat d’hélium liquide. Le deuxième élément est traité en effectuant chaque acquisition sur une zone fraîche de l’échantillon en la déplaçant par rapport au faisceau. Enfin, compte tenu de la troisième condition, les échantillons (granulés) et les références (poudres) sont conditionnés dans des granulés en vrac pressés afin de limiter autant que possible les porosités et les inhomogénéités et d’éviter la rugosité par rapport à la taille du faisceau sur la surface de l’échantillon sondé aux rayons X. Nous expliquons comment le protocole traite tous ces points.

Nous avons utilisé la lignée cellulaire de la prostate humaine PC-3 (potentiel métastatique élevé) et la lignée cellulaire ovarienne OVCAR-3 (qui représente jusqu’à 70% de tous les cas de cancer de l’ovaire) pour étudier les propriétés antiprolifératives des cellules cancéreuses des nanoparticules de sélénium (Se-NP), et phaeodactylum tricornutum diatomée comme espèce modèle pour étudier la séquestration du fer dans le phytoplancton.

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Protocol

1. Préparation des granulés de cellules cancéreuses PC-3 et OVCAR-3 humaines pour la spéciation du sélénium

REMARQUE : Le protocole suivant est adapté de Weekley et al.10. Toutes les étapes doivent être effectuées sous une hotte de culture cellulaire dans des conditions et des restrictions de niveau de biosécurité 2, en utilisant des techniques aseptiques.

  1. Comptez les cellules à l’aide d’une chambre de comptage de cellules Malassez. Ensemencez 150 000 à 200 000 cellules par flacon pour la lignée cellulaire PC-3 et 300 000 cellules pour la lignée cellulaire OVCAR-3.
  2. Cellules de semence dans des flacons T-75 (trois flacons par condition afin d’avoir des triples) dans le milieu de culture cellulaire adéquat (tableau 1) sous la hotte à écoulement laminaire.
  3. Laissez les cultures cellulaires se développer dans un incubateur à 37 °C et une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% de confluence. Habituellement, les lignées cellulaires du cancer de la prostate PC-3 doublent après 24 h, tandis que les lignées cellulaires du cancer de l’ovaire OVCAR-3 prennent 72 h. Les flacons doivent être laissés dans l’incubateur.
  4. Pendant ce temps, diluer les Se-NP utilisés pour le traitement à une concentration finale qui correspond à la CI20 (concentration inhibitrice pour atteindre 20% de mort cellulaire) qui a été prédéterminée par le test MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) pour l’évaluation de la cytotoxicité. Ces concentrations sont spécifiques à chaque type de Se-NP mais aussi spécifiques à la lignée cellulaire étudiée.
    1. Placer la solution mère de nanoparticules (2 mg/mL d’albumine sérique bovine [BSA] ou de Se-NP enrobé de chitosane) dans un bain-marie à ultrasons pendant 30 min à température ambiante (RT).
    2. Diluer la solution de Se-NP par dilutions en série dans un milieu de culture cellulaire complet pour atteindre des concentrations de travail. Entre chaque dilution, vortex pendant 1 min.
  5. Préparez un témoin positif au sélénium avec du sel de sélénium dilué pour le traitement.
    1. Préparer une solution mère aqueuse de sélénite de sodium (1 mg/mL) dans un tube en polypropylène de 15 mL. Mélanger 1 mg de poudre de sélénite de sodium avec 1 mL d’eau ultrapure.
    2. Vortex la solution mère pendant 1 min.
    3. Diluer la solution mère de sélénite de sodium par dilutions en série dans un milieu de culture cellulaire complet pour atteindre des concentrations de travail.
      REMARQUE: N’oubliez pas de pipeter plusieurs fois avant chaque dilution afin d’homogénéiser la solution.
  6. Exposer les cellules cancéreuses aux traitements au sélénium.
    REMARQUE: Cette partie du protocole doit être répétée pour chaque nanoparticule (NP) testée. Ici, les NP sont de deux types, BSA et Se-NP enduits de chitosane, plus les contrôles. La solution de sélénite de sodium est le témoin positif et aucun traitement n’est le témoin négatif.
    1. Ouvrez les trois flacons T-75 contenant les cellules de la hotte à écoulement laminaire.
    2. Retirez le milieu et lavez doucement les cellules 2x avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) chauffée (37 °C).
    3. Doucement, sur le fond de la fiole et non directement sur la couche cellulaire, ajouter 15 mL du traitement dans chaque fiole à l’aide d’une pipette automatique équipée de pipettes en plastique stériles de 25 mL. Placez les couvercles sur les flacons. Ne fermez pas hermétiquement les couvercles.
      REMARQUE : Comme décrit aux étapes 1.3 et 1.4, les solutions de traitement doivent avoir été remises en suspension au préalable pour être homogénéisées.
    4. Laisser les trois flacons horizontalement dans un incubateur à 37 °C et une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 24 h.
  7. Préparation des granulés de cellules
    1. Lavez doucement les cellules 2x avec 5 mL de PBS chauffé (37 °C) directement dans les flacons T75.
    2. Ajouter 6 mL de milieu de culture cellulaire chauffé (37 °C) sur la couche cellulaire dans la fiole T-75 à l’aide d’une pipette équipée de pipettes en plastique stérile de 10 mL.
    3. Collectez les cellules en les raclant doucement à l’aide d’un grattoir à cellules. Utilisez un grattoir à cellules par flacon.
    4. À l’aide d’un garçon pipette et d’une pipette de 10 mL, aspirez le liquide et rincez la cellule / le milieu sur la surface de la fiole afin de recueillir toutes les cellules. Répétez cette étape plusieurs fois pour dissocier et individualiser les cellules. Recueillir le milieu contenant les cellules dans un tube en polypropylène de 15 mL.
    5. Tourner vers le bas à 250 x g pendant 5 min à RT. Aspirer le surnageant.
    6. Rincez les cellules en les resusmettant dans 5 mL de PBS.
    7. Tournez vers le bas à 250 x g pendant 5 min à RT. Aspirez le surnageant et répétez les étapes 1.6.5 et 1.6.6 2x pour vous débarrasser de toutes les traces restantes du traitement.
    8. Remettez les cellules en suspension dans 1 mL de PBS et transférez-les dans un tube en polypropylène de 1,5 mL. Enfin, faites-les tourner à 250 x g pendant 5 min à TA. La figure 1 représente la pastille cellulaire obtenue après centrifugation et élimination du surnageant.
    9. Retirez délicatement tout le surnageant PBS à l’aide d’une pipette de 200 μL.
      REMARQUE: Veillez à ne pas toucher et endommager la pastille de cellule. Idéalement, la pastille doit avoir une hauteur ou une épaisseur de 2 à 3 mm et un diamètre de 3 à 6 mm. Pour la lignée cellulaire PC-3, 9 x 106–10 x 106 cellules sont nécessaires pour le test. Pour la lignée cellulaire OVCAR-3, 8 x 106–9 x 106 cellules sont nécessaires (Figure 1). Certaines cellules seront probablement perdues lors des étapes de rinçage tampon suivantes. Plus le nombre de cellules est élevé, meilleure sera la pastille.
  8. Congélation éclair des pastilles cellulaires
    1. Plongez la partie inférieure du tube de 1,5 mL contenant la pastille dans de l’azote liquide (LN2) au niveau de la pastille cellulaire.
    2. Dans une boîte à gants entièrement purgée avec une atmosphère inerte telle que l’azote gazeux, collectez la pastille cellulaire en tapotant doucement le tube de 1,5 mL sur la surface plane d’un bloc de cuivre refroidi LN2 (Figure 2). La pastille est ensuite collectée sans perte de cellule.
      REMARQUE: Utilisez un équipement de cryoprotection, une blouse de laboratoire, des chaussures fermées, des gants cryogéniques et un écran facial ou des lunettes de sécurité pour la manipulation LN2 .
    3. Si nécessaire, une aiguille refroidie LN2 peut être utilisée pour aider à retirer la pastille.
      REMARQUE: La pastille de cellule congelée résultante peut se fragmenter. Ces étapes doivent être effectuées en l’espace de quelques minutes et s’appuyer sur la dextérité et la vitesse du chercheur.
    4. Les dimensions des granulés congelés doivent s’adapter au porte-échantillon de cryostat. En utilisant l’équipement décrit, si la pastille de cellule est plus grande que 2 mm de hauteur et légèrement plus petite que le trou du porte-échantillon utilisé pour XAS, l’échantillon peut être utilisé directement. Si ce n’est pas le cas, ou si une surface plane pour l’analyse est souhaitée, une pastille cylindrique en vrac doit être préparée, tout en maintenant la pastille à l’état congelé. Si la pastille de cellule est fragmentée, les étapes suivantes peuvent être utilisées idéalement dans une boîte à gants entièrement purgée dans une atmosphère inerte.
  9. Préparation des granulés cylindriques congelés en vrac
    1. Immergez toutes les pièces d’une presse hydraulique manuelle qui seront en contact avec l’échantillon dans LN2 (Figure 3A; matrices à granulés de 3 ou 5 mm de diamètre, moule, tirage à piston/fil).
    2. Transférer les fragments de granulés rapidement congelés dans le moule chargé des matrices de granulés appropriées (Figure 3B).
    3. Granulation rapide avec la presse hydraulique. L’utilisation de 1,5 tonne pour une pastille de 5 mm de diamètre ou de 0,5 tonne pour une pastille de 3 mm de diamètre est suffisante (figure 3C).
      REMARQUE: Après chaque préparation de granulés avec la presse hydraulique, tous les matériaux doivent être décongelés et séchés correctement à l’aide d’azote gazeux pour éviter tout problème avec le gel et l’humidité restants.
    4. Collectez rapidement les granulés en vrac de cellules congelées et placez-les dans un cryotube adéquat pour le stockage.
    5. Stockez-le dans le réservoir LN2 pour un stockage à long terme.
    6. Transférer et monter les cryo-pastilles pour analyse. La pastille stockée dans un cryotube refroidi LN2 est transférée dans un porte-échantillon de cryostat prérefroidi de 77 K dans un liquide N2 (Figure 4, tel qu’utilisé pour une ligne de faisceau CRG-FAME-UHD). Cette étape doit être effectuée le plus rapidement possible, mais peut prendre quelques minutes. Transférez ensuite le porte-échantillon dans le cryostat et maintenez-le à 10 K pendant toute la durée de l’analyse XAS.
      REMARQUE: Les étapes 1.9.3 et 1.9.6 sont difficiles car elles doivent être effectuées rapidement afin d’éviter toute formation de givre qui bloquera le piston et le moule. Une alternative consiste à effectuer ces étapes sous une tente en plastique entièrement purgée avec de l’azote gazeux. La masse de cuivre LN2-cool permet de conserver la pastille congelée.

2. Préparation des cellules planctoniques pour la spéciation du fer

REMARQUE : L’eau de mer synthétique utilisée pour ce protocole a été préparée en ajoutant des sels de mer d’eau ultrapure, de l’acide morpholino propanesulfonique, du nitrate d’ammonium, du nitrate de sodium, du métasilicat pentahydraté de sodium, du phosphate monobasique de sodium, du stock de vitamines, du stock de métaux traces, du stock d’antibiotiques et du tampon HEPES à pH = 7,9. Les concentrations de chaque composant sont indiquées dans le tableau des matériaux. Des détails sur la culture peuvent être trouvés dans Sutak et al.11

  1. Centrifuger une culture de diatomées P. tricornutum dans un tube de polypropylène de 50 mL à 1 100 x g pendant 6 min et transférer la pastille dans une fiole avec un milieu frais.
  2. Laissez la culture pousser dans de l’eau de mer synthétique dans une chambre de croissance pendant 24 h.
  3. Centrifuger la culture de plancton pendant 6 min à 1 100 x g et transférer la pastille dans un milieu frais contenant du citrate de Fe (1 μM dans la culture finale). Incuber pendant 72 h.
  4. Préparer les cellules planctoniques
    1. Centrifuger les cellules pendant 3 min à 1 100 x g et rincer avec un milieu sans fer.
    2. Transférer la pastille dans un tube en polypropylène de 1,5 mL, laver à l’eau ultrapure et centrifuger 2x pendant 3 min à 1 100 x g. Retirez le surnageant.
    3. Plongez la partie inférieure du tube en polypropylène de 1,5 mL contenant la pastille dans LN2 comme décrit à l’étape 1.8.
    4. Transférez les cellules congelées dans une mouleuse congelée LN2 et pressez rapidement à l’aide d’une presse à granulés XRF (Figure 3 et Figure 7) comme décrit à l’étape 1.9.
    5. Retirez le granulé et conservez-le dans un réservoir LN2 pour un stockage à long terme.
    6. Suivez l’étape 1.9.6 (voir la figure 4 pour le transfert dans le porte-échantillon de cryostat).

3. Préparation et mesure des composés de référence

NOTE: Les composés de référence (solides ou liquides) représentatifs de l’espèce et susceptibles d’être trouvés dans le système biologique doivent être préparés et analysés par XAS pour comparaison avec des échantillons biologiques expérimentaux. Les spectres de référence peuvent également être trouvés dans les bases de données 12,13,14 et peuvent être utilisés à condition que les conditions de mesure (par exemple, la résolution spectrale) soient similaires aux échantillons expérimentaux.

  1. Pour les références en solution aqueuse, peser les composés initiaux sous forme de poudre ou de liquide sous condition anaérobie ou sous atmosphère inerte. Préparer des références sensibles à l’oxydoréduction dans une atmosphère inerte (c.-à-d. dans une boîte à gants anaérobie ou dans une ligne de Schlenk, voir les figures 5 et 6) afin d’éviter toute réaction oxydo-réductrice et de préserver l’intégrité chimique du composé, qui peut être très réactif et instable dans l’air ambiant). Ici, toutes les références au sélénium ont été préparées à l’aide d’une ligne Schlenk et d’eau ultrapure dégazée (Figure 6). Le malate liquide de FeIII et la ferritine ont été préparés à l’air ambiant.
  2. Mélanger avec la solution appropriée afin d’atteindre une concentration finale de 1 % en poids de l’élément étudié (c.-à-d. le sélénium ou le fer) pour la collecte en mode fluorescence.
    REMARQUE: L’eau ultrapure est la solution la plus fréquemment utilisée pour préparer les références XAS. L’ajout de glycérol (15% à 20%) est nécessaire pour les liquides mesurés à l’aide de la fluorescence XAS standard afin d’éviter les artefacts résultant de la diffraction des rayons X par les cristaux de glace et de préserver la qualité du signal XAS collecté avec le détecteur à semi-conducteurs. Cependant, pour HERFD-XAS, le glycérol n’est pas obligatoire. En utilisant un spectromètre analyseur de cristaux au lieu d’un détecteur à semi-conducteurs, l’énergie est sélectionnée avec une résolution extrêmement élevée et la diffraction induite par les cristaux de glace n’a pas d’impact sur la collecte de données de l’élément1 étudié.
  3. Conserver et conserver la solution préparée dans un ballon Schlenk scellé (Figure 5) ou dans un tube en polypropylène de 1,5 mL jusqu’à mesure dans les mêmes conditions que les échantillons.
  4. Pour les références solides, peser les poudres de composés modèles de sélénium ou de fer à l’air ambiant ou dans une boîte à gants si les espèces sont sensibles à l’oxydoréduction. Ici, les références solides feII (acétate de FeII et vivianite) ont été préparées dans une boîte à gants gazeuse N2 tandis que FeIII (Fe(OH)3 et FeIII-phosphate) ont été préparées à l’air ambiant.
  5. Peser la poudre de nitrure de bore de haute pureté et mélanger avec les poudres de composés modèles afin d’atteindre une concentration finale de 1 % en poids de l’élément étudié (figure 7A).
  6. Broyer en une poudre fine à l’aide d’un mortier pendant au moins 15 min.
  7. Placez le mélange de poudre dans le mouleur pour préparer les granulés avec la presse hydraulique (Figure 7B, semblable à la Figure 3A pour la pastille d’échantillon).
  8. Fermez le mouleur avec le piston (Figure 7C, semblable à la Figure 3B pour la pastille d’échantillon).
  9. Appuyez pour obtenir la pastille en vrac (Figure 7D, semblable à la Figure 3C pour la pastille d’échantillon).
  10. Conservez les granulés en vrac préparés dans la boîte à gants jusqu’à ce qu’ils soient analysés dans les mêmes conditions que les échantillons.
    REMARQUE: La pastille en vrac colle parfois aux pistons, en fonction de la compacité de la poudre, par exemple. L’enlever doucement sans le casser peut alors être difficile. Dans ce cas, la procédure suivante utilisant des disques en polyimide (par exemple, Kapton) doit être utilisée.
  11. Placez une goutte d’éthanol de chaque côté des pistons qui sera en contact avec la poudre (Figure 8A).
  12. Préparez deux disques de polyimide d’un diamètre légèrement inférieur à celui des pistons. L’épaisseur du polyimide doit être de 10 à 25 μm (plus mince sera difficile à manipuler, plus épais absorbera trop de photons X pendant l’analyse).
  13. Placez les disques sur les pistons. Ils colleront par l’action capillaire (Figure 8B).
  14. Montez la mouleuse avec le piston, ajoutez la poudre et insérez le deuxième piston (Figure 8C).
  15. Appuyez (voir étape 3.11) et retirez la pastille en vrac comprimée des pistons.
    REMARQUE: Les références solides peuvent être montées sur le porte-échantillon spécifique au cryostat comme les échantillons (voir étape 1.8.6). Les références liquides peuvent être montées sur le porte-échantillon spécifique au cryostat. Voir la figure 9A pour un porte-échantillon de cryostat CRG-FAME. La même procédure peut être appliquée à l’aide d’un porte-échantillon CRG-FAME-UHD, illustré à la figure 4D, en utilisant la procédure suivante.
  16. Montage de la référence liquide sur le porte-échantillon de cryostat.
    1. Réglez le ruban de polyimide (p. ex. Kapton) (25 μm d’épaisseur) afin de sceller un côté du trou sur le porte-échantillon à TA (figure 9B).
    2. À l’aide d’une seringue, remplissez lentement la cavité avec la solution jusqu’à ce qu’elle atteigne le sommet. Évitez les bulles. Le réservoir doit être rempli (figure 9C, à gauche).
    3. Scellez l’autre côté de la cavité avec le ruban adhésif (Figure 9C, à droite).
    4. Plongez le porte-échantillon scellé dans LN2 (Figure 9D, T0–T3).
    5. Une réaction thermique induit le bouillonnement de LN2 . Attendez que le bouillonnement s’arrête, signalant la fin de la réaction (Figure 9D, T3–T5).
    6. Transférer le porte-échantillon à 77 K dans le cryostat de la ligne de faisceau avant de commencer la collecte des données (Figure 9D, T6) ou de les stocker dans le LN2 Dewar.
      REMARQUE: La solution congelée est bien étalée dans la cavité et forme une pastille uniforme et homogène (Figure 9D, T7).

4. HERFD-XAS: procédure de mesure

  1. Optimisez tous les cristaux du CAS dans des conditions de Bragg par rapport à l’énergie de la ligne de fluorescence d’intérêt. Cette procédure peut être effectuée avec un composé de référence concentré.
  2. Calibrer l’énergie du faisceau monochromatique incident à l’aide d’une référence pour laquelle la position énergétique du bord d’absorption est connue (généralement une feuille métallique pure). Cette référence peut être positionnée dans un second temps après l’échantillon, en mode double transmission, afin de pouvoir vérifier l’étalonnage de chaque spectre obtenu et éventuellement les aligner après le traitement.
  3. Placer l’échantillon dans un cryostat d’hélium liquide pour les échantillons biologiques en suivant la procédure appropriée décrite à l’étape 1.9.6.
  4. Fermez le clapier expérimental en suivant les règles de sécurité du synchrotron.
  5. Effectuez l’acquisition XAS sur une plage d’énergie qui couvre le bord d’absorption sélectionné.
  6. Après chaque acquisition spectrale, déplacez l’échantillon au moins deux fois la taille du faisceau dans la direction du mouvement avant de commencer une nouvelle acquisition.
    REMARQUE: Dans ce cas, les mesures ont été effectuées à l’aide de cristaux Ge(440) pour sélectionner la ligne Fe Ka1 et à l’aide de cristaux Ge(844) pour sélectionner la ligne Se Ka1. La taille du faisceau sur l’échantillon était de 200 x 100 μm² (H x V pleine largeur demi-maximum). Le mouvement de l’échantillon entre chaque acquisition était de 500 μm dans les deux sens, afin de sonder l’homogénéité structurelle et d’analyser une nouvelle zone exempte de dommages radiologiques possibles à chaque fois. Les spectres individuels sont comparés et fusionnés s’ils se superposent au bruit. La mesure est arrêtée pour un échantillon donné lorsque la qualité du spectre fusionné est correcte. Ensuite, l’analyse des données peut être effectuée à l’aide de n’importe quel logiciel dédié à l’analyse XAS, en particulier ceux qui permettent un ajustement de combinaison linéaire de spectres normalisés, par exemple Athena et Artemis (groupe de logiciels Demeter)15, SixPack16 ou Viper17. Des explications complètes et détaillées de l’analyse XAS ne relèvent pas du champ d’application de ce protocole et peuvent être trouvées dans des articles récents18,19, dont certains plus spécifiquement consacrés aux échantillons biologiques20. Les spectres de référence de Selenium XANES sont déjà rassemblés dans la base de données des spectres SSHADE21.

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Representative Results

Les principaux objectifs de ces préparations étaient d’étudier l’interaction entre les nanoparticules de sélénium (Se-NP) et les cellules cancéreuses, ainsi que la liaison et la séquestration du fer dans le phytoplancton.

Les spectres HERFD-XANES du sélénium à l’état initial (BSA Se-NP) et dans les cellules incubées en milieu nutritif (BSA Se-NP après 24 h d’incubation) sont représentés à la figure 10. Les résultats ont montré que le sélénium dans les Se-NP initiaux était présent à la fois sous forme de Se(0) et de sélénite, alors qu’après des interactions avec les cellules PC-3, le sélénium dans les cellules était principalement présent sous forme de Se(0), démontrant ainsi un changement d’espèce de sélénium dans les cellules. Pour le fer, les spectres de référence HERFD-XANES ont montré des positions de bord distinctes en fonction de l’état d’oxydation du fer, avec des espèces réduites de fer déplacées vers des valeurs de faible énergie (Figure 11). Deux spectres successifs collectés sur la même position d’une pastille de diatomée étaient similaires, ce qui indique que les dommages au faisceau étaient limités entre deux acquisitions lors de l’utilisation d’un He-cryostat à 10 K. De plus, les spectres de différentes positions de la pastille de diatomée (ici trois positions) étaient identiques, démontrant que la pastille de l’échantillon était homogène et que les spectres pouvaient être moyennés pour obtenir un meilleur rapport signal/bruit (spectre moyenné). Le spectre moyenné des diatomées montre des caractéristiques de bord correspondant principalement à Fe(III). Un ajustement combiné linéaire des spectres de référence a ensuite été effectué pour quantifier la proportion des espèces de fer décrites dans Sarret et al.6.

Figure 1
Figure 1 : Granulés de cellules typiques. Les tubes en polypropylène de 1,5 mL (cellules OVCAR-3 à gauche, cellules PC-3 à droite) contenant respectivement 8 x 106 cellules et 1 x 107 cellules. Crédit : Caroline Bissardon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Préparation dans une boîte à gants anaérobie. (A) Boîte à gants anaérobie contenant un (B) rack à tubes en polypropylène de 1,5 mL (bleu) entièrement immergé dans un liquide LN2. Le liquide LN2 n’est pas présenté dans l’image pour plus de clarté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Schéma de granulation des cellules. (A) Échantillon de granulés dans la presse avant le chargement. (B) Échantillon pendant le chargement. (C) Échantillonner des granulés en vrac après le chargement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Montage du ou des cryo-échantillons. Montage dans le porte-échantillon spécifique à la ligne de faisceau BM16 XAS à l’ESRF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Préparation anoxique de la solution de référence. Exemples de préparations de référence au sélénium stockées dans des ballons Schlenk. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Configuration pour la préparation anoxique des solutions de référence. Installation de la rampe Schlenk avec de l’eau ultrapure dégazée dans la bouteille à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Préparation en pastille de référence solide. Préparation de granulés cylindriques pressés pour les composés en poudre soit dans l’air ambiant, soit sous la boîte à gants. (A) Poids de la poudre de référence. (B) La poudre dans le trou cylindrique du support de presse. (C) Support de presse fermé. (D) Pressage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Préparation d’une pastille de référence solide à l’aide de disques de polyimide. Préparation de granulés cylindriques pressés pour des composés de poudre collants ou cassants. (A) Une goutte d’éthanol de chaque côté des pistons qui sera en contact avec la poudre permettra aux disques de polyimide sur les pistons de s’y coller (B). Le mouleur est monté avec le piston. Ensuite, la poudre peut être déposée et le mouleur peut être fermé avec le deuxième piston (C). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Étapes de préparation du porte-échantillon de cryostat pour une référence ou un échantillon liquide. Pour plus de clarté, des photos ont été prises à l’extérieur de la boîte à gants et sans substances dangereuses. Ici, nous avons utilisé de l’eau ddH2O. Si nécessaire, cette préparation peut être faite sous une boîte à gants ou une tente en plastique sous atmosphère inerte (N2). (A) Porte-échantillon. (B) Placer du ruban de polyimide sur la surface incurvée pour sceller le trou. (C) Injecter lentement les solutions de référence goutte à goutte à l’aide d’une seringue jusqu’à ce que la cavité soit remplie. Aucune bulle d’air ne doit subsister. Scellez l’autre trou avec du ruban de polyimide. (D) Plongeon dans LN2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : Analyse HERFD-XANES typique de Se K-edge. Se K-edge HERFD-XANES de Se-NP enduits de BSA, tels que reçus et laissés 24 heures dans un milieu de culture cellulaire, et cellules PC-3 exposées à des Se-NP enduits de BSA. Les spectres sont décalés pour plus de clarté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : Analyse TYPIQUE DE FE K-edge HERFD-XANES. Exemple des spectres recueillis lors de notre expérience sur la spéciation du fer dans le plancton. Les six spectres supérieurs correspondent aux références/étalons. Les spectres superposés (en rouge et en noir) correspondent à deux spectres collectés sur la même position de la pastille. Les spectres étiquetés pos#1, pos#2 et pos#3 ont été collectés sur trois positions différentes de la pastille d’échantillon. Le spectre appelé Diatomées Moyenne correspond aux spectres moyens collectés sur différentes positions de la pastille et est l’échantillon pour lequel la spéciation doit être déterminée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Produits Lignée cellulaire PC3 Lignée cellulaire OVCAR3
Support RPMI 1640 modifié ATCC 445 mL 394,5 mL
Sérum fœtal bovin 50 mL 100 mL
Pénicilline-Streptomycine 5 mL 5 mL
Insuline bovine - 500 μL

Tableau 1. Préparation des milieux de culture cellulaire. Les cellules sont cultivées dans un milieu RPMI 1640 modifié par l’American Type Culture Collection (ATCC) complété par 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% de pénicilline-streptomycine (PS) pour les cellules cancéreuses de la prostate PC-3 et avec 20% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine et 0,01 mg / mL d’insuline bovine pour les cellules cancéreuses de l’ovaire OVCAR-3.

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Discussion

Ce protocole a été utilisé pour étudier la forme chimique du sélénium et du fer dans des échantillons biologiques par spectroscopie d’absorption de rayons X. Il se concentre sur la cryo-préparation et le stockage d’échantillons biologiques et de composés de référence, ainsi que sur les mesures HERFD-XAS.

Cryo-préparation et stockage
La cryo-préparation des granulés d’échantillons biologiques en vrac permet de préserver l’intégrité chimique des espèces présentes dans les échantillons. Ceci est crucial, car des changements de spéciation ont été observés lors de l’utilisation de la lyophilisation ou du séchage à l’air pour la préparation6. Ce protocole doit être utilisé dès que la ligne de faisceau sélectionnée pour les mesures est équipée d’un cryostat à l’hélium.

Pour les composés de référence, il est nécessaire de travailler dans une atmosphère anoxique lors de l’utilisation d’éléments sensibles à l’oxydoréduction pour préserver l’état d’oxydation. Cela peut ensuite être vérifié avec des variations de position spectrale des bords, comme indiqué pour les composés de référence ferreux et ferriques (figure 11).

Cette préparation de l’échantillon peut être effectuée avant le synchrotron ou l’analyse en laboratoire. Dans ce cas, la pastille ou la référence congelée doit être transférée dans un cryotube et stockée dans un réservoir LN2 . Ce stockage LN2 est obligatoire pour fournir un environnement inerte protecteur et éviter les changements dans les espèces chimiques, en particulier pour le fer réactif ou les composés séléno-composés. De préférence, les échantillons doivent être préparés juste avant la mesure ou stockés quelques jours avant l’analyse. Il est préférable de ne pas conserver les échantillons pendant une longue période (c.-à-d. des mois).

Cryo-analyse
L’analyse à basse température, idéalement à 10 K, est fortement préconisée afin de ralentir les dommages induits par le faisceau de rayons X intense, en particulier la formation de radicaux libres à partir de l’hydrolyse de l’eau, qui peuvent endommager la matrice protéique et créer une photoréduction des ions des métaux de transition ou une photoréduction d’éléments tels que le soufre22. Il est préférable de prendre en compte ces changements possibles dans les espèces chimiques grâce à l’acquisition rapide du spectre XAS. L’échantillon doit également être scanné pour exposer une zone non irradiée pour chaque spectre. Comme le démontrent les spectres collectés sur les trois positions différentes de la pastille de phytoplancton (Figure 11), une telle stratégie révèle des spectres puissants, qui peuvent ensuite être moyennés pour obtenir un meilleur rapport signal/bruit.

Applications futures
Dans notre travail, nous avons utilisé une ligne de faisceau dédiée aux mesures HERFD-XAS (FAME-UHD, ESRF, France) mais ce protocole de préparation d’échantillons biologiques peut être appliqué sur n’importe quelle ligne de faisceau XAS standard équipée d’un cryostat tout en utilisant d’autres types de détecteurs tels que le détecteur à semi-conducteurs Ge multi-éléments ou le détecteur à dérive de silicium. Le flux de travail proposé peut également être appliqué à tout autre élément chimique ou à tout matériel biologique qui devrait être étudié par spectroscopie d’absorption des rayons X.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants pour les contributions financières au développement de la ligne de faisceau par CEMHTI (Orléans, France, ANR-13-BS08-0012-01) et Labex OSUG@2020 (Grenoble, France, ANR-10-LABX-0056). Le projet FAME-UHD est soutenu financièrement par le Français « grand emprunt » EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), le consortium CRG CEA-CNRS et l’institut INSU CNRS. Nous sommes reconnaissants de toutes les contributions au cours des expériences, en particulier de toutes les personnes travaillant sur BM30B et BM16. Les auteurs reconnaissent l’European Synchrotron Radiation Facility pour la fourniture de temps de faisceau de rayonnement synchrotron. Nous reconnaissons également le projet PHYTOMET ANR pour le soutien financier (ANR-16-CE01-0008) et le projet SEDMAC pour le soutien financier (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ammonium nitrate Sigma-Aldrich A3795 NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber Coy Laboratory, USA equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock Sigma-Aldrich A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder Sigma-Aldrich 255475
Cell counting chamber Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO 14190-094 Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes 0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes 15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 Sigma-Aldrich F3388 aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum GIBCO A31604-02 Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks Sigma-Aldrich Z707503 TPP 150 cm2 area
Growth chamber Sanyo Sanyo MLR-352 at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer Sigma-Aldrich H4034 1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3 ATCC, Rockville, MD HTB-161 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas Sigma-Aldrich I0516 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum Roscoff culture collection RCC69 http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid Sigma-Aldrich M3183 MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3 ECCAC, Salisbury, UK 90112714 Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333 Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts Sigma-Aldrich S9883 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers Oxford Instrument AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) GIBCO A10491-01 Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA Se50-BS-1 BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL NANOCS Company, USA 11. Se50-CS-1 Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate Sigma-Aldrich 71746 Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate Sigma-Aldrich S5022 NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich S5011 NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock Sigma-Aldrich M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%) GIBCO 15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red GIBCO 25300-054
Vitamin stock Sigma-Aldrich T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C

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References

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Chimie numéro 183 spectroscopie d’absorption des rayons X spéciation sélénium fer cellules cancéreuses phytoplancton synchrotron spectroscopie d’absorption de rayons X à haute résolution de fluorescence détectée cryo-préparation
Préparation d’échantillons biologiques pour la spéciation à température cryogénique à l’aide de la spectroscopie d’absorption de rayons X à haute résolution
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Bissardon, C., Isaure, M. P., Lesuisse, E., Rovezzi, M., Lahera, E., Proux, O., Bohic, S. Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution X-Ray Absorption Spectroscopy. J. Vis. Exp. (183), e60849, doi:10.3791/60849 (2022).

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