Summary
פרוטוקול זה מציג הליך מפורט להכנת קריאוסמפלים ביולוגיים לניסויים ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן מבוססי סינכרוטרון. אנו מתארים את כל השלבים הנדרשים כדי לייעל את הכנת הדגימה ואת שימור ההקפאה באמצעות דוגמאות של הפרוטוקול עם תאי סרטן ופיטופלנקטון. שיטה זו מספקת תקן אוניברסלי של הכנת קריו לדוגמה.
Abstract
חקר היסודות עם ספקטרוסקופיית קליטת קרני רנטגן (XAS) מעניין במיוחד כאשר חוקרים את תפקידן של מתכות במערכות ביולוגיות. הכנת דגימות היא הליך מפתח ולעתים קרובות מורכב, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות. למרות שטכניקות צפייה ברנטגן נמצאות בשימוש נרחב, עדיין לא הופץ פרוטוקול מפורט למשתמשים בטכניקה. יתר על כן, שינוי מצב כימי הוא מדאיג, וטכניקות מבוססות cryo מומלץ לנתח את הדגימות הביולוגיות במצב הידרציה כמעט ילידי שלהן כדי לספק את השימור המרבי של שלמות כימית של התאים או הרקמות. כאן אנו מציעים פרוטוקול הכנה תאית המבוסס על דגימות שהשתמרו ב-cryo. הוא מודגם במחקר ספקטרוסקופיית ספיגת קרני רנטגן של סלניום בתאים סרטניים ברזולוציה גבוהה ברזולוציה גבוהה של אנרגיה, ובמחקר של ברזל בפיטופלנקטון. פרוטוקול זה יכול לשמש עם דגימות ביולוגיות אחרות וטכניקות רנטגן אחרות שעלולות להיפגע על ידי הקרנה.
Introduction
המחקר של ביו-טרנספורמציות תאיות של יסודות חיוניים או רעילים דורש טכניקות ספקולציה עם רגישות גבוהה ואמור למזער את שלבי הכנת הדגימה שלעתים קרובות נוטים לשינוי של מינים כימיים.
יסודות פיזיולוגיים כמו סלניום וברזל ידועים כקשים במיוחד לחיזוי בשל הכימיה המורכבת שלהם, תנוחות שונות של מיני הסלניום או הברזל, והריכוז הנמוך שלהם ב-ppm (mg/kg) או אפילו בתת-ppm. לפיכך, המחקר של speciation של אלמנטים אלה על ידי XAS יכול להיות מאתגר ביותר. סינכרוטרון XAS ובמיוחד פלואורסצנציה ברזולוציה אנרגטית גבוהה שזוהתה XAS (HERFD-XAS), המאפשרת יחס אות-לרקע נמוך מאוד1, זמינים במקורות סינכרוטרון כדי לחזות אלמנטים מדוללים מאוד במטריצות ביולוגיות מורכבות 2,3. מדידות פלואורסצנציה-XAS קונבנציונליות יכולות להתבצע באמצעות גלאי מצב מוצק (SSD) עם רוחב פס אנרגיה ~150-250 eV, על קו הקרן CRG-FAME במתקן הקרינה האירופי סינכרוטרון (ESRF)4, בעוד שמדידות HERFD-XAS זקוקות לספקטרומטר מנתח גבישים (CAS), עם רוחב פס אנרגיה ~1-3 eV, על קו הקרן CRG-FAME-UHD ב- ESRF2 . פוטונים פלואורסצנטיים מופלים ביחס לאנרגיה שלהם באמצעות תהליכים אלקטרוניים או אופטיים בהתאמה.
הכנת הקריו-דגימה חיונית כדי לשמר מבנים ולשמור על שלמות כימית קומפוזיציונית, ובכך לאפשר ניתוח קרוב למצב הטבעי הביולוגי5. יתר על כן, ניתוחים שבוצעו בטמפרטורות קריוגניות נמוכות עד כדי 10 K באמצעות קירור קריוגני הליום נוזלי (LN2), מאפשרים לנזקי קרינה להאט ולשמר את הספקולציה היסודית עבור XAS. למרות שסקירות מסוימות על טכניקות XAS המיושמות על דגימות ביולוגיות מדווחות על הצורך להכין ולנתח דגימות בתנאים קריוגניים (למשל, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), אף אחת מהן אינה מתארת בבירור את הפרוטוקול המפורט הקשור. בפרסום זה, שיטה להכנת קריו של תאים סרטניים ומיקרואורגניזמים פלנקטון מתוארת עבור HERFD-XAS speciation של Se8 ו- Fe9 בטמפרטורה קריוגנית.
תרגול טוב להכנת דגימה וסביבה במהלך מדידות ספקטרוסקופיה XAS חדישות דורשות 1) התקנה; 2) הליך ניתוח המגביל ככל האפשר את השפעות נזקי הקרינה; ו-3) מדגם (או ייחוס תרכובת מודל) הומוגני ככל האפשר ביחס לגודל קרן הפוטונים של קרני הרנטגן. הפריט הראשון נלקח בחשבון על ידי ביצוע הרכישה בטמפרטורה נמוכה, באמצעות קריוסטאט הליום נוזלי. הפריט השני מטופל על ידי ביצוע כל רכישה על שטח טרי של הדגימה על ידי הזזתו ביחס לקורה. לבסוף, בהתחשב במצב השלישי, דגימות (גלולות) והפניות (אבקות) מותנות בכדורי תפזורת לחוצים על מנת להגביל את הנקבוביות ואת אי-ההומוגניות ככל האפשר, וכדי למנוע חספוס ביחס לגודל הקרן על משטח הדגימה הנבדק בקרן רנטגן. אנו מסבירים כיצד הפרוטוקול מתמודד עם כל הנקודות הללו.
השתמשנו בקו תאי הערמונית האנושיים PC-3 (פוטנציאל גרורתי גבוה) ובקו תאי השחלות OVCAR-3 (המהווה עד 70% מכלל מקרי סרטן השחלות) כדי לחקור את התכונות האנטי-פרוליפרטיביות כלפי תאים סרטניים של ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs), ו-Phaeodactylum tricornutum diatom כמין מודל לחקר רצף הברזל בפיטופלנקטון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת כדוריות התאים הסרטניים האנושיים PC-3 ו- OVCAR-3 עבור דגימת סלניום
הערה: הפרוטוקול הבא מותאם מ- Weekley et al.10. כל הצעדים צריכים להתבצע תחת מכסה מנוע תרבית תאים תחת תנאים והגבלות של בטיחות ביולוגית ברמה 2, תוך שימוש בטכניקות אספטיות.
- ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאים של Malassez. זרעו 150,000-200,000 תאים לכל בקבוקון עבור קו התאים PC-3 ו-300,000 תאים עבור קו התאים OVCAR-3.
- תאי זרעים בצלוחיות T-75 (שלושה צלוחיות לכל מצב כדי שיהיו להם טריפליקטים) במדיית תרביות התאים המתאימה (טבלה 1) מתחת למכסה הזרימה הלמינרית.
- השאירו את תרביות התאים לגדול באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואטמוספרה לחה עם 5% CO2 עד שהן מגיעות למפגש של 80%. בדרך כלל, קווי תאי סרטן הערמונית PC-3 מכפילים את עצמם לאחר 24 שעות בעוד שקווי תאי סרטן השחלות של OVCAR-3 נמשכים 72 שעות. את הצלוחיות יש להשאיר באינקובטור.
- בינתיים, דיללו את ה-Se-NPs המשמשים לטיפול לריכוז סופי התואם את ה-IC20 (ריכוז מעכב כדי להשיג 20% מוות תאי) שנקבע מראש על ידי בדיקת ה-MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטרזוליום ברומיד) שנקבעה מראש על ידי בדיקת ה-MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטרזוליום ברומיד) להערכת ציטוטוקסיות. ריכוזים אלה הם ספציפיים לכל סוג Se-NPs אך גם ספציפיים לקו התאים הנחקר.
- הניחו את תמיסת מלאי הננו-חלקיקים (2 מ"ג/מ"ל של אלבומין בסרום בקר [BSA] או Se-NPs מצופה צ'יטוזן) באמבט מים באולטרסאונד למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- דיללו את תמיסת ה-Se-NPs על ידי דילולים סדרתיים במדיום תרבית תאים שלם כדי להגיע לריכוזי עבודה. בין כל דילול, מערבולת במשך דקה אחת.
- להכין שליטה חיובית סלניום עם מלח סלניום מדולל לטיפול.
- הכינו תמיסת מלאי נתרן סלניט מימית (1 מ"ג/מ"ל) בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל. יש לערבב 1 מ"ג של אבקת נתרן סלניט עם 1 מ"ל של מים אולטרה-פורים.
- וורטקס פתרון המניה למשך דקה אחת.
- דיללו את תמיסת מלאי הנתרן סלניט על ידי דילולים סדרתיים במדיום תרבית תאים שלם כדי להגיע לריכוזי עבודה.
הערה: אל תשכחו לטפטף מספר פעמים לפני כל דילול על מנת ליצור הומוגניזציה של התמיסה.
- לחשוף את התאים הסרטניים לטיפולי סלניום.
הערה: יש לחזור על חלק זה של הפרוטוקול עבור כל ננו-חלקיק (NP) שנבדק. כאן, NPs הם משני סוגים, BSA ו chitosan מצופה Se-NPs, בתוספת הפקדים. תמיסת הנתרן סלניט היא השליטה החיובית ואין טיפול בשליטה השלילית.- פתחו את שלושת הצלוחיות T-75 המכילות את התאים במכסה הזרימה הלמינרי.
- הסר את המדיום ושטף את התאים בעדינות 2x עם 5 מ"ל של מי מלח מחוממים (37 מעלות צלזיוס) ביציאת פוספט (PBS).
- בעדינות, בצד התחתון של הבקבוקון ולא ישירות על שכבת התא, מוסיפים 15 מ"ל מהטיפול בכל בקבוקון באמצעות פיפטה אוטומטית המצוידת בפיפטות פלסטיק סטריליות 25 מ"ל. מניחים את המכסים על הצלוחיות. אין לסגור את המכסים בחוזקה.
הערה: כפי שמתואר בשלבים 1.3 ו-1.4, פתרונות הטיפול חייבים לעבור החייאה מראש כדי להיות הומוגניים. - השאירו את שלושת הצלוחיות אופקית באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ואטמוספרה עם 5% CO2 למשך 24 שעות.
- הכנת כדורי התא
- לשטוף בעדינות את התאים 2x עם 5 מ"ל של PBS מחומם (37 °C) ישירות בבקבוקי T75.
- הוסיפו 6 מ"ל של מדיום תרבית תאים מחומם (37 מעלות צלזיוס) על שכבת התא בבקבוקון T-75 באמצעות נער פיפטה המצויד בפיפטות פלסטיק סטריליות של 10 מ"ל.
- אספו את התאים על ידי גירוד עדין באמצעות מגרד תאים. השתמש במגרד תא אחד לכל בקבוקון.
- באמצעות פיפטה בוי ופיפטה של 10 מ"ל, שאפו לנוזל ושטפו בחזרה את התא/המדיום על פני הבקבוקון על מנת לאסוף את כל התאים. חזור על שלב זה מספר פעמים כדי לנתק ולהתאים אישית את התאים. לאסוף את המדיום המכיל את התאים בצינור פוליפרופילן 15 מ"ל.
- סובבו כלפי מטה ב-250 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאפו לסופר-נטנט.
- יש לשטוף את התאים על ידי החייאה שלהם ב-5 מ"ל של PBS.
- סובבו כלפי מטה ב-250 x g למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את ה-supernatant ושחקו על שלבים 1.6.5 ו-1.6.6 2x כדי להיפטר מכל העקבות הנותרים של הטיפול.
- בצעו החייאה של התאים ב-1 מ"ל של PBS והעבירו אותם לצינור פוליפרופילן של 1.5 מ"ל. לבסוף, סובבו אותם כלפי מטה במהירות של 250 x g למשך 5 דקות ב-RT. איור 1 מייצג את גלולת התא המתקבלת לאחר צנטריפוגה והששלכת הסופרנאטנט.
- הסר בעדינות את כל חומר העל PBS באמצעות פיפטה של 200 μL.
הערה: היזהרו שלא לגעת בכדור התא ולפגוע בו. באופן אידיאלי, הכדור צריך להיות 2-3 מ"מ גבוה או עבה, עם קוטר של 3-6 מ"מ. עבור שורת התאים PC-3, נדרשים 9 x 106-10 x 106 תאים עבור הבדיקה. עבור קו התאים OVCAR-3, נדרשים 8 x 106-9 x 106 תאים (איור 1). סביר להניח שתאים מסוימים יאבדו במהלך שלבי שטיפת החיץ הבאים. ככל שמספר התא גבוה יותר, כך הכדור יהיה טוב יותר.
- הקפאת הבזק של כדורי התא
- צללו את החלק התחתון של צינור ה-1.5 מ"ל המכיל את הכדור בחנקן נוזלי (LN2) לרמה של גלולת התא.
- בתא כפפות המטוהר במלואו עם אטמוספירה אינרטית כגון גז חנקן, אספו את גלולת התא על ידי הקשה עדינה על צינור 1.5 מ"ל על פני השטח השטוחים של בלוק נחושת מקוררLN 2-מקורר (איור 2). לאחר מכן הכדור נאסף ללא אובדן תאים.
הערה: השתמש בציוד להגנת ההקפאה, מעיל מעבדה, נעליים סגורות, כפפות קריו ומגן פנים או משקפי בטיחות לטיפול ב-LN2 . - במידת הצורך, ניתן להשתמש במחט מקוררת LN2 כדי לעזור להוציא את הכדור.
הערה: גלולת התא הקפוא שנוצרה יכולה להתפצל. צעדים אלה חייבים להתבצע בתוך כמה דקות ולהסתמך על המיומנות והמהירות של החוקר. - מידות הכדור הקפוא חייבות להתאים למחזיק הדגימה cryostat. באמצעות הציוד המתואר, אם גלולת התא גדולה מ-2 מ"מ בגובהה ומעט קטנה יותר מהחור של מחזיק הדגימה המשמש ל-XAS, ניתן להשתמש בדגימה ישירות. אם לא, או אם רצוי משטח שטוח לניתוח, יש להכין כדור גלילי בתפזורת, שעדיין שומר על הכדור במצבו הקפוא. אם גלולת התא מקוטעת, ניתן להשתמש בשלבים הבאים באופן אידיאלי בתא כפפות המטוהר במלואו עם אטמוספירה אינרטית.
- הכנת הכדורים הגליליים הקפואים בתפזורת
- טבלו את כל החלקים של מכבש הידראולי ידני שיהיו במגע עם הדגימה ב-LN2 (איור 3A; מבלט בקוטר 3 או 5 מ"מ מת, עובש, בוכנה/משיכת חוטים).
- העבירו את שברי הכדורים הקפואים במהירות לתבנית העמוסה במות הכדורים המתאימים (איור 3B).
- גלולה מהירה עם מכבש הידראולי. מספיק שימוש ב-1.5 טון לכדור בקוטר 5 מ"מ או 0.5 טון לכדור בקוטר 3 מ"מ (איור 3C).
הערה: לאחר כל הכנת גלולה עם מכבש הידראולי, יש להפשיר ולייבש את כל החומרים כראוי באמצעות גז חנקן כדי למנוע בעיות עם הכפור והלחות הנותרים. - אספו את הכדור הגדול של תאים קפואים במהירות והניחו אותו בקריו-טיוב מתאים לאחסון.
- אחסן אותו בחזרה במיכל LN2 לאחסון לטווח ארוך.
- מעבירים ומעלים את כדורי הקריו לניתוח. הכדור המאוחסן בקריו-טוב מקורר LN2 מועבר למחזיק דגימת קריוסטאט 77 K מצופה מראש בנוזל N2 (איור 4, כפי שמשמש לקו קרן CRG-FAME-UHD). שלב זה צריך להתבצע מהר ככל האפשר, אך יכול להימשך מספר דקות. לאחר מכן העבירו את בעל המדגם לקריוסטט ושמרו אותו על 10 K במהלך כל ניתוח ה-XAS.
הערה: שלבים 1.9.3 ו- 1.9.6 קשים מכיוון שהם צריכים להיעשות במהירות על מנת למנוע היווצרות כפור שתחסום את הבוכנה ואת התבנית. חלופה אחרת היא לבצע את הצעדים הללו תחת אוהל פלסטיק המטוהר במלואו בגז חנקן. מסת הנחושת הקרירה LN2 מאפשרת לכדור להישמר קפוא.
2. הכנת תאי הפלנקטון לצורך דגימת ברזל
הערה: מי ים סינתטיים המשמשים לפרוטוקול זה הוכנו על ידי הוספת מלחי ים מים אולטרה-פוריים, חומצה מורפולינו פרופנסולפונית, אמוניום חנקתי, נתרן חנקתי, נתרן מטאסיליקט פנטהידרט, נתרן פוספט מונובאסיק, מלאי ויטמינים, מלאי מתכות עקבות, מלאי אנטיביוטיקה וחיץ HEPES ב- pH = 7.9. הריכוזים של כל רכיב מצוינים בטבלת החומרים. פרטים על התרבות ניתן למצוא בכתובת Sutak et al.11
- צנטריפוגה בתרבית דיאטום P. tricornutum בצינור פוליפרופילן 50 מ"ל ב-1,100 x g למשך 6 דקות והעברת הכדור לבקבוקון עם מדיום רענן.
- תנו לתרבות לגדול במי ים סינתטיים בתא גידול למשך 24 שעות.
- צנטריפוגה של תרבית הפלנקטון במשך 6 דקות ב-1,100 x גרם והעבירה את הכדור לתוך מדיום טרי המכיל Fe-citrate (1 μM בתרבית הסופית). דגירה למשך 72 שעות.
- הכן את תאי הפלנקטון
- צנטריפוגה של התאים במשך 3 דקות ב 1,100 x גרם ולשטוף עם בינוני ללא ברזל.
- מעבירים את הכדור לצינור פוליפרופילן 1.5 מ"ל, שוטפים במים אולטרה-פורים וצנטריפוגה 2x למשך 3 דקות ב-1,100 x גרם. הסר את ה-supernatant.
- צללו את החלק התחתון של צינור הפוליפרופילן 1.5 מ"ל המכיל את הכדור ב-LN2 כמתואר בשלב 1.8.
- העבירו את התאים הקפואים בעובש הקפוא LN2 ולחצו במהירות באמצעות מכבש כדורי XRF (איור 3 ואיור 7) כמתואר בשלב 1.9.
- הסר את הכדור ואחסן אותו במיכל LN2 לאחסון לטווח ארוך.
- עקוב אחר שלב 1.9.6 (ראה איור 4 עבור ההעברה למחזיק הדגימה של cryostat).
3. הכנה ומדידה של תרכובת ייחוס
הערה: תרכובות ייחוס (מוצקות או נוזליות) המייצגות את המין וצפויות להימצא במערכת הביולוגית חייבות להיות מוכנות ומנותחות על ידי XAS לצורך השוואה עם דגימות ביולוגיות ניסיוניות. ניתן למצוא ספקטרום ייחוס גם במאגרי מידע 12,13,14 וניתן להשתמש בה בתנאי שתנאי המדידה (למשל, רזולוציה ספקטרלית) היו דומים לדגימות הניסוי.
- להפניות בתמיסה מימית, שקלו תרכובות ראשוניות בצורת אבקה או נוזל במצב אנאירובי או באטמוספרה אינרטית. הכינו רפרנסים רגישים לחמצון חוזר באטמוספרה אינרטית (כלומר, בתא כפפות אנאירובי או בקו שלנק, ראו איור 5 ואיור 6) כדי למנוע כל תגובה אוקסידו-רדוקטיבית ולשמור על השלמות הכימית של התרכובת, שיכולה להיות תגובתית מאוד ולא יציבה באוויר הסביבה). כאן, כל ההתייחסויות לסלניום הוכנו באמצעות קו שלנק ומים אולטרה-פורים שעברו דה-גז (איור 6). נוזל FeIII-מלאט ופריטין הוכנו באוויר הסביבה.
- ערבבו עם תמיסה מתאימה על מנת להגיע לריכוז סופי של 1% wt של היסוד הנחקר (כלומר, סלניום או ברזל) לאיסוף במצב פלואורסצנטי.
הערה: מים Ultrapure הם הפתרון הנפוץ ביותר להכנת הפניות XAS. תוספת של גליצרול (15%-20%) נדרשת לנוזלים הנמדדים באמצעות פלואורסצנציה סטנדרטית של XAS כדי למנוע ממצאים הנובעים מעיפור קרני רנטגן על ידי גבישי קרח ואיכות משופרת של אות ה-XAS שנאסף באמצעות גלאי מצב מוצק. עם זאת, עבור HERFD-XAS, גליצרול אינו חובה. באמצעות ספקטרומטר מנתח גבישים במקום גלאי מצב מוצק, האנרגיה נבחרת ברזולוציה גבוהה במיוחד והדיפרקציה המושרה על ידי גבישי קרח אינה משפיעה על איסוף הנתונים של היסוד הנחקר1. - שמרו ואחסנו את התמיסה המוכנה בבלון שלנק אטום (איור 5) או בצינור פוליפרופילן של 1.5 מ"ל עד למדידה באותם תנאים כמו הדגימות.
- עבור ייחוס מוצק, שקלו אבקות סלניום או אבקות תרכובת מדגם ברזל באוויר הסביבה או בתא כפפות אם המינים רגישים למחזר. כאן, הפניות FeII מוצקות (FeII-אצטט וויוויניט) הוכנו בתא כפפות גזי N2 בעוד FeIII (Fe(OH)3, ו- FeIII-פוספט) הוכנו באוויר הסביבה.
- שוקלים אבקת בורון ניטריד בטוהר גבוה ומערבבים עם אבקות התרכובות לדוגמה כדי להגיע לריכוז סופי של 1% wt של היסוד הנחקר (איור 7A).
- טוחנים לאבקה דקה באמצעות טיט למשך 15 דקות לפחות.
- הניחו את תערובת האבקה בתבנית כדי להכין כדורים עם המכבש ההידראולי (איור 7B, בדומה לאיור 3A עבור גלולת הדגימה).
- סגור את התבנית עם הבוכנה (איור 7C, בדומה לאיור 3B עבור גלולת הדגימה).
- לחץ כדי לקבל את הכדור בתפזורת (איור 7D, בדומה לאיור 3C עבור גלולת הדגימה).
- אחסן את הכדורים המוכנים בתפזורת בתא הכפפות עד שהם ינותחו באותם תנאים כמו הדגימות.
הערה: הכדור בתפזורת נדבק לפעמים לבוכנות, בהתאם לקיבולת האבקה, למשל. הסרתו ברכות מבלי לשבור אותו אז יכול להיות קשה. במקרה כזה, יש להשתמש בהליך הבא באמצעות דיסקים של פולימיד (לדוגמה, Kapton). - שים טיפה של אתנול על כל צד של הבוכנות שיהיה במגע עם האבקה (איור 8A).
- הכן שני דיסקים פולימידים בקוטר מעט קטן יותר מהבוכנות. עובי הפולימיד צריך להיות 10-25 מיקרומטר (דק יותר יהיה קשה לתמרן, עבה יותר יספוג יותר מדי פוטונים של קרני רנטגן במהלך הניתוח).
- שים את הדיסקים על הבוכנות. הם יידבקו על ידי פעולה נימית (איור 8B).
- הרכיבו את התבנית עם הבוכנה, הוסיפו את האבקה והכניסו את הבוכנה השנייה (איור 8C).
- לחץ (ראה שלב 3.11) והסר את הכדור הדחוס בתפזורת מהבוכנות.
הערה: ניתן להרכיב את ההפניות המוצקות על מחזיק הדגימה הספציפי לקריוסטט כמו הדגימות (ראה שלב 1.8.6). ניתן להרכיב את הפניות הנוזליות על מחזיק הדגימה הספציפי לקריוסטט. ראו איור 9A עבור מחזיק מדגם קריוסטאט CRG-FAME. ניתן ליישם את אותו הליך באמצעות מחזיק דגימת CRG-FAME-UHD, המוצג באיור 4D, באמצעות ההליך הבא. - הרכבה של הפניה נוזלית על מחזיק הדגימה cryostat.
- הגדר את סרט הפולימיד (לדוגמה, Kapton) (בעובי של 25 מיקרומטר) כדי לאטום צד אחד של החור במחזיק הדגימה ב-RT (איור 9B).
- באמצעות מזרק, למלא את החלל לאט עם הפתרון עד שהוא מגיע למעלה. הימנעו מבועות. יש למלא את המאגר (איור 9C, משמאל).
- אטמו את הצד השני של החלל באמצעות הקלטת (איור 9C, מימין).
- צללו את מחזיק הדגימה החתום לתוך LN2 (איור 9D, T0–T3).
- תגובה תרמית גורמת ל-LN2 לבעבע. המתן עד שהבעבע ייפסק, ויסמן את סוף התגובה (איור 9D, T3–T5).
- העבר את מחזיק הדגימה ב-77 K לתוך הקריוסטט של קו הקרן לפני שתתחיל באיסוף הנתונים (איור 9D, T6) או תשמור ב-LN2 Dewar.
הערה: התמיסה הקפואה מתפשטת היטב בחלל ויוצרת כדור אחיד והומוגני (איור 9D, T7).
4. HERFD-XAS: הליך מדידה
- מטב את כל הגבישים מה- CAS בתנאי בראג ביחס לאנרגיית קו הפלואורסצנציה המעניינת. הליך זה יכול להיעשות עם תרכובת התייחסות מרוכזת.
- כייל את אנרגיית הקרן המונוכרומטית של האירוע באמצעות ייחוס שעבורו ידוע מיקום האנרגיה של קצה הקליטה (בדרך כלל רדיד מתכתי טהור). הפניה זו יכולה להיות ממוקמת בשלב שני לאחר הדגימה, במצב שידור כפול, על מנת להיות מסוגלים לבדוק את הכיול עבור כל ספקטרום שהתקבל ובסופו של דבר ליישר אותם לאחר הטיפול.
- מקם את הדגימה בקריוסטאט הליום נוזלי עבור דגימות ביולוגיות בהתאם להליך המתאים המתואר בשלב 1.9.6.
- סגור את הצריף הניסיוני בהתאם לכללי הבטיחות של סינכרוטרון.
- בצע את רכישת XAS בטווח אנרגיה המכסה את קצה הספיגה שנבחר.
- לאחר כל רכישה ספקטרלית, הזיזו את הדגימה לפחות פי שניים מגודל הקרן בכיוון התנועה לפני שתתחילו ברכישה חדשה.
הערה: במקרה זה, המדידות בוצעו באמצעות גבישי Ge(440) כדי לבחור את קו Fe Ka1 ובאמצעות גבישי Ge(844) כדי לבחור אתSe K קו1. גודל הקרן בדגימה היה 200 x 100 מיקרומ"ר (H x V רוחב מלא חצי מקסימום). תנועת הדגימה בין כל רכישה הייתה 500 מיקרומטר בשני הכיוונים, על מנת לחקור הומוגניות מבנית ולנתח אזור חדש נקי מנזקי קרינה אפשריים קודמים בכל פעם. ספקטרום בודד משווים וממוזגים אם הם ניתנים להחלפה בתוך הרעש. המדידה נעצרת עבור מדגם נתון כאשר איכות הספקטרום הממוזג נכונה. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח נתונים באמצעות כל תוכנה המוקדשת לניתוח XAS, במיוחד אלה המאפשרים התאמה משולבת ליניארית של ספקטרום מנורמל, למשל אתנה וארטמיס (קבוצת התוכנה של דמטר)15, SixPack16, או Viper17. הסברים מלאים ומפורטים של ניתוח XAS נופלים מחוץ לתחום פרוטוקול זה וניתן למצוא אותם במאמרים אחרונים 18,19, חלקם מוקדשים באופן ספציפי יותר לדגימות ביולוגיות20. ספקטרום הייחוס של סלניום XANES כבר נאסף במסד הנתונים ספקטרום SSHADE21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המטרות העיקריות של תכשירים אלה היו לחקור את האינטראקציה בין ננו-חלקיקי סלניום (Se-NPs) ותאים סרטניים, לבין קשירת ברזל וריצוף בפיטופלנקטון.
ספקטרום HERFD-XANES של הסלניום במצב ההתחלתי (BSA Se-NPs) ובתאים דגירה במדיום תזונתי (BSA Se-NPs לאחר דגירה של 24 שעות) מוצגים באיור 10. התוצאות הראו כי סלניום ב-Se-NPs הראשוניים היה קיים הן כצורות Se(0) והן כצורות דמויות סלניט, בעוד שלאחר אינטראקציות עם תאי PC-3 הסלניום בתאים היה קיים בעיקר כ-Se(0), ובכך הדגים שינוי של מיני סלניום בתאים. עבור ברזל, ספקטרום HERFD-XANES של הפניות הראה מיקומי קצה ברורים בהתאם למצב חמצון הברזל, כאשר מינים מופחתים של ברזל הועברו לערכי אנרגיה נמוכים (איור 11). שני ספקטרום רצופים שנאספו באותו מיקום של כדור דיאטום היו דומים, מה שמצביע על כך שנזק הקרן היה מוגבל בין שתי רכישות בעת שימוש ב- He-cryostat ב- 10 K. יתר על כן, ספקטרום ממיקומים שונים של גלולת הדיאטום (כאן שלושה מיקומים) היו זהים, והוכיחו כי גלולת הדגימה הייתה הומוגנית, וכי ניתן לממוצע את הספקטרום כדי לקבל ספקטרום יחס אות לרעש טוב יותר (ספקטרום ממוצע). הספקטרום הממוצע עבור דיאטומים מציג תכונות קצה המתאימות בעיקר ל-Fe(III). לאחר מכן בוצעה התאמת צירוף ליניארי של ספקטרום הייחוס כדי לכמת את שיעור מיני הברזל כפי שתואר ב-Sarret et al.6.
איור 1: כדורי תאים טיפוסיים. צינורות הפוליפרופילן בגודל 1.5 מ"ל (תאי OVCAR-3 שמאלה, תאי PC-3 מימין) המכילים 8 x 10 תאים6 ותאים 1 x 107 , בהתאמה. קרדיט: קרוליין ביסארדון. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הכנה בתא כפפות אנאירובי. (A) תא כפפות אנאירובי המכיל מתלה צינור פוליפרופילן (B) 1.5 מ"ל (כחול) שקוע כולו בנוזל LN2. הנוזל LN2 אינו מוצג בתמונה לבהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: סכימה של כדוריות תאים. (A) דוגמה לכדור בלחיצה לפני הטעינה. (ב) דגימה במהלך הטעינה. (C) דגימת גלולה בתפזורת לאחר הטעינה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: הרכבה של דגימת הקריו.ים. הרכבה במחזיק הדגימה הספציפי לקו הקרן BM16 XAS ב- ESRF. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: הכנה אנוקסית של תמיסת ייחוס. דוגמאות לתכשירי ייחוס סלניום המאוחסנים בבלוני שלנק. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: התקנה להכנה אנוקסית של פתרונות ייחוס. התקנה של רמפת שלנק עם מי אולטרה-פור מפורזים בבקבוק מימין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: הכנה בכדור ייחוס מוצק. הכנת כדורים גליליים לחוצים לתרכובות אבקה באוויר הסביבה או מתחת לתא הכפפות. (A) משקל אבקת הייחוס. (B) האבקה בחור הגלילי של תמיכת העיתונות. (C) תמיכה בעיתונות סגורה. (ד) לחיצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: הכנת כדור ייחוס מוצק באמצעות דיסקים פולימידיים. הכנת גלולה גלילית לחוצה לתרכובות אבקה דביקות או שבירות. (A) טיפת אתנול בכל צד של הבוכנות שיהיו במגע עם האבקה תאפשר לדיסקים הפולימידים שעל הבוכנות להידבק אליהם (B). התבנית מורכבת עם הבוכנה. לאחר מכן, ניתן להפקיד את האבקה, ואת התבנית ניתן לסגור עם הבוכנה השנייה (C). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: שלבי הכנה למחזיק דגימת ה-cryostat עבור הפניה נוזלית או דגימה. לבהירות התמונה, התמונות צולמו מחוץ לתא הכפפות וללא חומרים מסוכנים. כאן, השתמשנו במים ddH2O. במידת הצורך, הכנה זו יכולה להיעשות תחת תא כפפות או אטמוספירה אינרטית (N2) אוהל פלסטיק. (B) הניחו סרט פולימיד על המשטח המעוקל כדי לאטום את החור. (C) להזריק באיטיות את תמיסות הייחוס טיפה אחר טיפה באמצעות מזרק עד למילוי החלל. לא חייבים להישאר בועות אוויר. אוטמים את החור השני בנייר דבק פולימידי. (ד) צלילה ב-LN2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 10: ניתוח Se K-edge אופייני של HERFD-XANES. Se K-edge HERFD-XANES של Se-NPs מצופה BSA, כפי שהתקבל והותיר 24 שעות במדיום תרביות תאים, ותאי PC-3 שנחשף ל-Se-NPs מצופה BSA. הספקטרום מוסט לשם הבהירות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 11: ניתוח FE K-edge טיפוסי של HERFD-XANES. דוגמה לספקטרום שנאסף במהלך הניסוי שלנו על ספקולציית הברזל בפלנקטון. ששת הספקטרום העליון תואם את ההפניות / תקנים. הספקטרה העל-גבית (באדום ובשחור) מתאימה לשני ספקטרום שנאסף על אותו מיקום של הכדור. הספקטרום שכותרתו pos#1, pos#2 ו-pos#3 נאספו בשלושה מיקומים שונים של גלולת הדגימה. הספקטרום הנקרא Diatoms Average מתאים לספקטרום הממוצע שנאסף במיקומים שונים של הכדור והוא המדגם שעבורו יש לקבוע את הספקולציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מוצרים | קו תא PC3 | קו התאים OVCAR3 |
| ATCC שונה RPMI 1640 בינוני | 445 מ"ל | 394.5 מ"ל |
| סרום בקר עוברי | 50 מ"ל | 100 מ"ל |
| פניצילין-סטרפטומיצין | 5 מ"ל | 5 מ"ל |
| אינסולין בקר | - | 500 μL |
טבלה 1. הכנת מדיה לתרביות תאים. התאים מתורבתים במדיום RPMI 1640 שעבר RPMI 1640 מתוקן ב-10% מסרום בקר עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS) עבור תאי סרטן ערמונית PC-3 ועם 20% מה-FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-0.01 מ"ג/מ"ל אינסולין בקר עבור תאי סרטן השחלות OVCAR-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה שימש לחקר הצורה הכימית של סלניום וברזל בדגימות ביולוגיות על ידי ספקטרוסקופיה של ספיגת קרני רנטגן. הוא מתמקד בהכנת קריו ואחסון של דגימות ביולוגיות ותרכובות ייחוס, כמו גם במדידות HERFD-XAS.
הכנת קריו ואחסון
הכנת הקריו של כדורי הדגימה הביולוגית בתפזורת מאפשרת שימור השלמות הכימית של המינים הנמצאים בדגימות. זה חיוני, מכיוון ששינויים בספקולציה נצפו בעת שימוש בייבוש בהקפאה או ייבוש אוויר לצורך הכנה6. יש להשתמש בפרוטוקול זה ברגע שקו הקרן שנבחר למדידות מצויד בקריוסטאט הליום.
עבור תרכובות ייחוס, יש צורך לעבוד באטמוספירה אנוקסית בעת שימוש באלמנטים רגישים לחמצון כדי לשמר את מצב החמצון. לאחר מכן ניתן לבדוק זאת באמצעות וריאציות במיקום הקצה הספקטרלי כפי שמוצג עבור תרכובות ייחוס ברזליות וחירוסיות (איור 11).
הכנת דגימה זו יכולה להתבצע לפני סינכרוטרון או ניתוח מעבדה. במקרה זה, יש להעביר את הכדור הקפוא או את ההתייחסות לתוך cryotube ולאחסן במיכל LN2 . אחסון LN2 זה מחויב לספק סביבה אינרטית מגינה ולמנוע שינויים במינים הכימיים, במיוחד עבור ברזל תגובתי או תרכובות סלנו. רצוי, דגימות צריך להיות מוכן רגע לפני המדידה או מאוחסן כמה ימים לפני הניתוח. עדיף לא לאחסן דוגמאות במשך תקופה ארוכה של זמן (כלומר, חודשים).
קריו-אנליזה
ניתוח בטמפרטורות נמוכות, באופן אידיאלי ב 10 K, הוא מאוד דוגל על מנת להאט את הנזק שנגרם על ידי קרן רנטגן אינטנסיבית, במיוחד היווצרות של רדיקלים חופשיים מן הידרוליזה של מים, אשר יכול לפגוע במטריצת החלבון וליצור photoreduction של יוני מתכת מעבר או photoreduction של אלמנטים כגון גופרית22. עדיף לקחת בחשבון את השינויים האפשריים האלה במינים הכימיים באמצעות רכישה מהירה של ספקטרום ה-XAS. כמו כן, יש לסרוק את המדגם כדי לחשוף אזור לא מעוות עבור כל ספקטרום. כפי שמודגם על ידי הספקטרום שנאסף בשלושת המיקומים השונים של גלולת הפיטופלנקטון (איור 11), אסטרטגיה כזו חושפת ספקטרום רב עוצמה, אשר לאחר מכן ניתן לממוצע כדי לקבל יחס אות לרעש טוב יותר.
יישומים עתידיים
בעבודתנו, השתמשנו בקו קרן המוקדש למדידות HERFD-XAS (FAME-UHD, ESRF, צרפת) אך פרוטוקול זה להכנת דגימות ביולוגיות יכול להיות מיושם על כל קו קרן XAS סטנדרטי המצויד בקריוסטאט תוך שימוש בסוגים אחרים של גלאים כגון גלאי מצב מוצק Ge רב-תחומי או גלאי סיליקון-סחף. ניתן ליישם את זרימת העבודה המוצעת גם על כל יסוד כימי אחר או על כל חומר ביולוגי שצפוי להיחקר על ידי ספקטרוסקופיית ספיגת קרני רנטגן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
אנו אסירי תודה על התרומות הכספיות לפיתוח קו הקרן על ידי CEMHTI (אורלינס, צרפת, ANR-13-BS08-0012-01) ו- Labex OSUG@2020 (גרנובל, צרפת, ANR-10-LABX-0056). פרויקט FAME-UHD נתמך כספית על ידי "האמפרנט הגדול" הצרפתי EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), קונסורציום CEA-CNRS CRG ומכון INSU CNRS. אנו אסירי תודה על כל התרומות במהלך הניסויים ובמיוחד על כל האנשים שעבדו על BM30B ו- BM16. המחברים מכירים במתקן הקרינה האירופי של סינכרוטרון למתן זמן קרן קרינה של קרינת סינכרוטרון. אנו מכירים גם בפרויקט PHYTOMET ANR לתמיכה כספית (ANR-16-CE01-0008) ובפרויקט SEDMAC לתמיכה כספית (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
- Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
- Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
