Summary
Этот протокол представляет собой подробную процедуру подготовки биологических криосамплей для экспериментов с рентгеновской абсорбционной спектроскопией на основе синхротронов. Мы описываем все шаги, необходимые для оптимизации пробоподготовки и криоконсервации, с примерами протокола с раковыми и фитопланктонными клетками. Этот метод обеспечивает универсальный стандарт криоподготовки образцов.
Abstract
Изучение элементов с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии (ХАС) представляет особый интерес при изучении роли металлов в биологических системах. Пробоподготовка является ключевой и часто сложной процедурой, особенно для биологических образцов. Хотя методы рентгеновского видообразования широко используются, подробный протокол еще не был распространен среди пользователей этого метода. Кроме того, модификация химического состояния вызывает беспокойство, и криотехнологии рекомендуются для анализа биологических образцов в их почти нативном гидратированном состоянии, чтобы обеспечить максимальное сохранение химической целостности клеток или тканей. Здесь мы предлагаем протокол клеточной подготовки, основанный на крио-сохраненных образцах. Это проявляется в флуоресцентном рентгеновском спектроскопическом исследовании селена в раковых клетках с высоким разрешением флуоресценции и исследовании железа в фитопланктоне. Этот протокол может быть использован с другими биологическими образцами и другими рентгеновскими методами, которые могут быть повреждены облучением.
Introduction
Изучение клеточных биотрансформаций эссенциальных или токсичных элементов требует методов видообразования с высокой чувствительностью и должно свести к минимуму этапы подготовки образцов, которые часто склонны к модификации химических веществ.
Физиологические элементы, такие как селен и железо, как известно, особенно трудно видообразование из-за их сложного химического состава, различных стабильностей видов селена или железа и их низкой концентрации в диапазоне ppm (мг / кг) или даже ниже ppm. Таким образом, изучение видообразования этих элементов С помощью XAS может быть чрезвычайно сложным. Синхротронный XAS и особенно флуоресцентный XAS с высоким энергетическим разрешением (HERFD-XAS), который допускает очень низкое отношение сигнал/фон1, доступны на синхротронных источниках для видообразования сильно разбавленных элементов в сложных биологических матрицах 2,3. Обычные измерения флуоресценции-XAS могут быть выполнены с использованием твердотельного детектора с энергетическим разрешением (SSD) с полосой пропускания энергии ~ 150-250 эВ, на лучевой линии CRG-FAME в Европейской установке синхротронного излучения (ESRF)4, в то время как для измерений HERFD-XAS требуется спектрометр кристаллического анализатора (CAS) с полосой пропускания энергии ~ 1-3 эВ, на лучевой линии CRG-FAME-UHD на ESRF2 . Флуоресцентные фотоны различаются по отношению к их энергии с помощью электронных или оптических процессов соответственно.
Криоподготовка образца необходима для сохранения структур и поддержания композиционной химической целостности, что позволяет проводить анализ вблизи биологического нативного состояния5. Кроме того, анализы, выполняемые при криогенных температурах до 10 К с использованием криогенного охлаждения жидкого гелия (LN2), позволяют радиационному повреждению замедлить и сохранить элементарное видообразование для XAS. Хотя в некоторых обзорах методов XAS, применяемых к биологическим образцам, сообщается о необходимости подготовки и анализа образцов в криогенных условиях (например, Sarret et al.6, Porcaro et al.7), ни один из них четко не описывает соответствующий подробный протокол. В данной публикации описан способ криопрепарации раковых клеток и планктонных микроорганизмов для HERFD-XAS видообразования Se8 и Fe9 при криогенной температуре.
Надлежащая практика подготовки образцов и окружающей среды во время современных измерений XAS-спектроскопии требует 1) настройки; 2) процедура анализа, максимально ограничивающая последствия радиационного повреждения; и 3) образец (или эталонное соединение модели) как можно более однородный по отношению к размеру пучка рентгеновских фотонов. Первый пункт учитывается при выполнении сбора при низкой температуре, с использованием жидкого криостата гелия. Второй пункт решается путем выполнения каждого захвата на свежем участке образца путем перемещения его относительно луча. Наконец, учитывая третье условие, образцы (гранулы) и референции (порошки) кондиционируются в прессованных объемных гранулах, чтобы максимально ограничить пористость и неоднородность и избежать шероховатости по отношению к размеру пучка на поверхности исследуемого рентгеновского образца. Мы объясняем, как протокол решает все эти вопросы.
Мы использовали клеточную линию предстательной железы человека PC-3 (высокий метастатический потенциал) и клеточную линию яичников OVCAR-3 (на которую приходится до 70% всех случаев рака яичников) для исследования антипролиферативных свойств по отношению к раковым клеткам наночастиц селена (Se-NPs) и Phaeodactylum tricornutum diatom в качестве модельного вида для исследования секвестрации железа в фитопланктоне.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка гранул раковых клеток PC-3 и OVCAR-3 человека к видообразованию селена
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол адаптирован из Weekley et al.10. Все этапы должны проводиться под колпаком клеточной культуры в условиях и ограничениях уровня биобезопасности 2, с использованием асептических методов.
- Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры Malassez. Посейте 150 000–200 000 клеток на колбу для клеточной линии PC-3 и 300 000 клеток для клеточной линии OVCAR-3.
- Семенные клетки в колбах Т-75 (по три колбы на условие для того, чтобы иметь трипликаты) в адекватной среде клеточного культивирования (таблица 1) под ламинарным проточным колпаком.
- Оставьте клеточные культуры расти в инкубаторе при 37 °C и увлажненной атмосфере с 5% CO2 , пока они не достигнут 80% слияния. Обычно клеточные линии рака предстательной железы PC-3 удваиваются через 24 ч, в то время как клеточные линии рака яичников OVCAR-3 занимают 72 ч. Колбы необходимо оставить в инкубаторе.
- Между тем, разбавляют Se-NP, используемые для лечения, до конечной концентрации, соответствующей IC20 (ингибирующая концентрация для достижения 20% гибели клеток), которая была предопределена анализом МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) для оценки цитотоксичности. Эти концентрации специфичны для каждого типа Se-NPs, но также специфичны для исследуемой клеточной линии.
- Поместите раствор наночастиц (2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина [BSA] или покрытых хитозаном Se-NPs) на ультразвуковую водяную баню в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
- Разбавляют раствор Se-NPs путем последовательных разведений в полноценной клеточной культуральной среде до достижения рабочих концентраций. Между каждым разведением вихрь в течение 1 мин.
- Подготовьте селен-положительный контроль с разбавленной солью селена для обработки.
- Приготовьте водный раствор селенита натрия (1 мг/мл) в полипропиленовой трубке объемом 15 мл. Смешайте 1 мг порошка селенита натрия с 1 мл сверхчистой воды.
- Вихрь стокового раствора в течение 1 мин.
- Раствор селенита натрия разбавляют серийными разбавлениями в полноценной клеточной культуральной среде до достижения рабочих концентраций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте пипетировать несколько раз перед каждым разбавлением, чтобы гомогенизировать раствор.
- Подвергайте раковые клетки лечению селеном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола должна быть повторена для каждой тестируемой наночастицы (NP). Здесь NP бывают двух типов, BSA и Хитозано покрытые Se-NP, плюс элементы управления. Раствор селенита натрия является положительным контролем, и никакое лечение не является отрицательным контролем.- Откройте три колбы Т-75, содержащие ячейки в ламинарной вытяжке.
- Удалите среду и тщательно промойте клетки в 2 раза 5 мл подогретого (37 °C) фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
- Осторожно, на нижней стороне колбы, а не непосредственно на клеточном слое, добавьте 15 мл обработки в каждую колбу с помощью автоматической пипетки, оснащенной 25 мл стерильных пластиковых пипеток. Поместите крышки на колбы. Не закрывайте крышки плотно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано на этапах 1.3 и 1.4, растворы для обработки должны быть предварительно повторно суспендированы для гомогенизации. - Оставьте три колбы горизонтально в инкубаторе при 37 °C и атмосферу, увлажненную 5% CO2 в течение 24 часов.
- Приготовление клеточных гранул
- Аккуратно промыть ячейки 2x с 5 мл нагретого PBS (37 °C) непосредственно в колбах T75.
- Добавьте 6 мл нагретой питательной среды клеток (37 °C) на клеточный слой в колбе Т-75 с помощью пипетки, оснащенной 10 мл стерильных пластиковых пипеток.
- Соберите ячейки путем мягкого соскабливания с помощью скребка для клеток. Используйте по одной ячейке скребка на колбу.
- Используя пипетку и пипетку 10 мл, аспирируйте жидкость и смывайте обратно клетку / среду на поверхность колбы, чтобы собрать все клетки. Повторите этот шаг несколько раз, чтобы диссоциировать и индивидуализировать клетки. Соберите среду, содержащую клетки, в полипропиленовую трубку объемом 15 мл.
- Открутите при 250 х г в течение 5 мин при RT. Аспирируйте супернатант.
- Промыть клетки, повторно разместив их в 5 мл PBS.
- Раскрутите при 250 х г в течение 5 мин при RT. Аспирируйте супернатант и повторите шаги 1,6,5 и 1,6,6 2 раза, чтобы избавиться от всех оставшихся следов обработки.
- Повторно суспендируйте клетки в 1 мл PBS и перенесите их в полипропиленовую трубку объемом 1,5 мл. Наконец, раскрутите их вниз при 250 х г в течение 5 мин при РТ. Рисунок 1 представляет собой гранулу ячейки, полученную после центрифугирования и выброса супернатанта.
- Аккуратно удалите все супернатанты PBS с помощью пипетки объемом 200 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не коснуться и не повредить гранулу клетки. В идеале гранула должна быть высотой 2–3 мм или толщиной, диаметром 3–6 мм. Для клеточной линии PC-3 для анализа требуется 9 x 106–10 x 106 ячеек. Для клеточной линии OVCAR-3 требуется 8 x 106–9 x 106 ячеек (рисунок 1). Некоторые клетки, вероятно, будут потеряны во время последующих этапов промывки буфера. Чем выше число ячейки, тем лучше будет гранула.
- Мгновенная заморозка гранул клеток
- Опустите нижнюю часть трубки объемом 1,5 мл, содержащей гранулу в жидком азоте (LN2), до уровня гранулы ячейки.
- В бардачке, полностью очищенном инертной атмосферой, такой как газообразный азот, соберите гранулу ячейки, осторожно постукивая трубкой объемом 1,5 мл по плоской поверхности LN 2-охлаждаемого медного блока (рисунок 2). Затем гранула собирается без потери клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте криозащитное оборудование, лабораторное пальто, закрытую обувь, криоперчатки и лицевой щиток или защитные очки для обработки LN2 . - При необходимости можно использовать охлажденную иглу LN2 , чтобы помочь вынуть гранулу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полученная замороженная гранула ячейки может фрагментироваться. Эти шаги должны быть выполнены в течение нескольких минут и полагаться на ловкость и скорость исследователя. - Размеры замороженных гранул должны соответствовать держателю образца криостата. Используя описанное оборудование, если гранула ячейки больше 2 мм в высоту и немного меньше отверстия держателя образца, используемого для XAS, образец может быть использован непосредственно. Если нет, или если требуется плоская поверхность для анализа, необходимо подготовить объемную цилиндрическую гранулу, сохраняя гранулу в замороженном состоянии. Если ячейка гранулы фрагментирована, следующие этапы могут быть использованы в идеале в перчаточном ящике, полностью очищенном инертной атмосферой.
- Приготовление насыпных замороженных цилиндрических гранул
- Погрузите все части ручного гидравлического пресса, которые будут контактировать с образцом, в LN2 (рисунок 3A; грануляционные матрицы диаметром 3 или 5 мм, пресс-форма, вытягивание поршня / проволоки).
- Переложите быстрозамороженные фрагменты гранул в форму, загруженную соответствующими грануляционными матрицами (рисунок 3B).
- Быстрое гранулирование с помощью гидравлического пресса. Достаточно использовать 1,5 тонны для гранул диаметром 5 мм или 0,5 тонны для гранул диаметром 3 мм (рисунок 3C).
ПРИМЕЧАНИЕ: После каждой подготовки гранул с помощью гидравлического пресса все материалы должны быть разморожены и высушены должным образом с использованием газообразного азота, чтобы избежать каких-либо проблем с оставшимся морозом и влажностью. - Быстро соберите объемную гранулу замороженных клеток и поместите ее в адекватную криотрубку для хранения.
- Храните его обратно в резервуар LN2 для длительного хранения.
- Перенесите и смонтируйте криопеллеты для анализа. Гранула, хранящаяся в охлаждаемой криотрубе LN2 , переносится в держатель для предварительно охлажденного криостата 77 К в жидкостиN2 (рисунок 4, используемый для лучевой линии CRG-FAME-UHD). Этот шаг должен быть выполнен как можно быстрее, но может занять несколько минут. Затем перенесите держатель образца в криостат и поддерживайте его на уровне 10 К в течение всего анализа XAS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.9.3 и 1.9.6 являются сложными, поскольку их необходимо выполнить быстро, чтобы избежать образования мороза, который заблокирует поршень и пресс-форму. Альтернативой является выполнение этих шагов под пластиковой палаткой, полностью продуваемой газообразным азотом. LN 2-холодная медная масса позволяет хранить гранулы замороженными.
2. Подготовка планктонных ячеек к видообразованию железа
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтетическая морская вода, используемая для этого протокола, была получена путем добавления морских солей ультрачистой воды, морфолинопропансульфоновой кислоты, нитрата аммония, нитрата натрия, пентагидрата метасиликата натрия, моноосновного фосфата натрия, витаминного сырья, запаса следовых металлов, запаса антибиотиков и буфера HEPES при рН = 7,9. Концентрации каждого компонента указаны в Таблице материалов. Подробную информацию о культуре можно найти в Sutak et al.11
- Центрифугируйте культуру диатомовых водорослей P. tricornutum в полипропиленовой трубке объемом 50 мл при 1 100 х г в течение 6 мин и переложите гранулу в колбу со свежей средой.
- Дайте культуре расти в синтетической морской воде в камере роста в течение 24 ч.
- Центрифугируют культуру планктона в течение 6 мин при 1,100 х г и переносят гранулу в свежую среду, содержащую Fe-цитрат (1 мкМ в конечной культуре). Инкубировать в течение 72 ч.
- Подготовка планктонных ячеек
- Центрифугировать ячейки в течение 3 мин при 1 100 х г и промыть средой без железа.
- Переложите гранулу в полипропиленовую трубку объемом 1,5 мл, промыть сверхчистой водой и центрифугу 2x в течение 3 мин при 1 100 х г. Удалите супернатант.
- Погружают нижнюю часть полипропиленовой трубки объемом 1,5 мл, содержащей гранулу в LN2 , как описано на этапе 1.8.
- Переместите замороженные ячейки в замороженный формовочный станок LN2 и быстро прессуйте с помощью пресса для гранул XRF (рисунок 3 и рисунок 7), как описано на этапе 1.9.
- Извлеките гранулу и храните ее в резервуаре LN2 для длительного хранения.
- Выполните шаг 1.9.6 (см. рисунок 4 для переноса в держатель для образцов криостата).
3. Получение и измерение эталонных соединений
ПРИМЕЧАНИЕ: Эталонные соединения (твердые или жидкие), представляющие вид и ожидаемые для обнаружения в биологической системе, должны быть подготовлены и проанализированы XAS для сравнения с экспериментальными биологическими образцами. Эталонные спектры также могут быть найдены в базах данных 12,13,14 и могут быть использованы при условии, что условия измерения (например, спектральное разрешение) были аналогичны экспериментальным образцам.
- Для ссылок в водном растворе взвешивают исходные соединения в виде порошка или жидкости в анаэробном состоянии или инертной атмосфере. Подготавливайте окислительно-чувствительные референции в инертной атмосфере (т.е. в анаэробном перчаточном ящике или в линии Шленка, см. Фиг.5 и Фиг.6), чтобы избежать любой оксидоредуктивной реакции и сохранить химическую целостность соединения, которое может быть высокореакционноспособным и нестабильным в окружающем воздухе). Здесь все ссылки на селен были подготовлены с использованием линии Шленка и дегазированной сверхчистой воды (рисунок 6). Жидкий FeIII-малат и ферритин получали на окружающем воздухе.
- Смешивают с соответствующим раствором для достижения конечной концентрации 1% масс. исследуемого элемента (т.е. селена или железа) для сбора в режиме флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сверхчистая вода является наиболее часто используемым раствором для приготовления ссылок XAS. Добавление глицерина (15%-20%) требуется для жидкостей, измеренных с использованием стандартной флуоресценции XAS, для предотвращения артефактов, возникающих в результате дифракции рентгеновских лучей кристаллами льда и сохранения качества сигнала XAS, собранного с помощью твердотельного детектора. Однако для HERFD-XAS глицерин не является обязательным. Используя спектрометр кристаллического анализатора вместо твердотельного детектора, энергия выбирается с чрезвычайно высоким разрешением и дифракция, индуцированная кристаллами льда, не влияет на сбор данных исследуемого элемента1. - Сохраняют и хранят приготовленный раствор в герметичном баллоне Шленка (рисунок 5) или в полипропиленовой трубке объемом 1,5 мл до измерения в тех же условиях, что и образцы.
- Для твердых ссылок взвешивайте порошки селена или железа на окружающем воздухе или в бардачке, если эти виды чувствительны к окислительно-восстановительным воздействиям. Здесь твердые ссылки на FeII (Fe II-ацетат и вивианит) были получены в газообразном перчаточном ящикеN2, в то время как FeIII (Fe(OH)3 и FeIII-фосфат) были получены на окружающем воздухе.
- Взвешивают порошок нитрида бора высокой чистоты и смешивают с модельными соединениями порошки для достижения конечной концентрации исследуемого элемента в 1% мас.масс. (рис. 7А).
- Измельчите до мелкого порошка с помощью раствора в течение не менее 15 минут.
- Поместите порошковую смесь в формовочную машину для приготовления гранул с помощью гидравлического пресса (рисунок 7B, аналогичный рисунку 3A для образца гранулы).
- Закройте формовщик поршнем (рисунок 7C, аналогичный рисунку 3B для гранул образца).
- Пресс для получения объемной гранулы (рисунок 7D, аналогичный рисунку 3C для образца гранулы).
- Храните подготовленные объемные гранулы в бардачке до тех пор, пока они не будут проанализированы в тех же условиях, что и образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объемная гранула иногда прилипает к поршням, например, в зависимости от количества порошка. Удалить его мягко, не сломав его, тогда может быть сложно. В этом случае необходимо использовать следующую процедуру с использованием полиимидных (например, каптонных) дисков. - Положите каплю этанола на каждую сторону поршней, которые будут контактировать с порошком (рисунок 8А).
- Подготовьте два полиимидных диска диаметром чуть меньше поршней. Толщина полиимида должна составлять 10–25 мкм (тоньше будет трудно манипулировать, толще будет поглощать слишком много рентгеновских фотонов во время анализа).
- Положите диски на поршни. Они будут прилипать капиллярным действием (рисунок 8B).
- Установите формовщик с поршнем, добавьте порошок и вставьте второй поршень (рисунок 8C).
- Нажмите (см. шаг 3.11) и извлеките из поршней сжатую насыпную гранулу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Твердые исходные данные могут быть установлены на держателе для образцов для криостата, как и образцы (см. этап 1.8.6). Ссылки на жидкость могут быть установлены на держателе для образцов криостата. См. рисунок 9A для держателя образца криостата CRG-FAME. Та же процедура может быть применена с помощью держателя образца CRG-FAME-UHD, показанного на рисунке 4D, с использованием следующей процедуры. - Установка жидкого эталона на держатель для образцов криостата.
- Установите полиимидную (например, каптонную) ленту (толщиной 25 мкм), чтобы запечатать одну сторону отверстия на держателе образца на RT (рисунок 9B).
- Используя шприц, медленно заполняйте полость раствором, пока он не достигнет вершины. Избегайте пузырьков. Резервуар должен быть заполнен (рисунок 9C, слева).
- Запечатайте другую сторону полости лентой (рисунок 9C, справа).
- Погрузите герметичный держатель образца в LN2 (рисунок 9D, T0–T3).
- Термическая реакция вызывает пузырьки LN2 . Подождите, пока пузырьки не прекратятся, сигнализируя об окончании реакции (рисунок 9D, T3–T5).
- Перенесите держатель образца при 77 К в криостат линии луча перед началом сбора данных (рисунок 9D, T6) или хранения в LN2 Dewar.
ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженный раствор хорошо распределяется в полости и образует однородную и однородную гранулу (рис. 9D, Т7).
4. HERFD-XAS: процедура измерения
- Оптимизируйте все кристаллы из CAS в условиях Брэгга относительно интересующей энергии флуоресцентной линии. Эта процедура может быть выполнена с концентрированным эталонным соединением.
- Откалибруйте падающую монохроматическую энергию пучка, используя эталон, для которого известно энергетическое положение края поглощения (обычно это чистая металлическая фольга). Этот эталон может быть размещен на втором этапе после образца, в режиме двойной передачи, чтобы иметь возможность проверить калибровку для каждого полученного спектра и в конечном итоге выровнять их после обработки.
- Поместите образец в жидкий криостат гелия для биологических образцов в соответствии с соответствующей процедурой, описанной на этапе 1.9.6.
- Закройте экспериментальную хижину, следуя правилам синхротронной безопасности.
- Выполните сбор XAS в диапазоне энергии, охватывающем выбранное периферийное поглощение.
- После каждого спектрального захвата перемещайте образец по крайней мере в два раза больше размера пучка в направлении движения, прежде чем начинать новое приобретение.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае измерения проводились с использованием кристаллов Ge(440) для выбора ЛинииFe Ka 1 и с использованием кристаллов Ge(844) для выбора Se Ka1 линии. Размер луча на образце составлял 200 x 100 мкм² (H x V Full Width Half Maximum). Движение образца между каждым приобретением составляло 500 мкм в обоих направлениях, чтобы исследовать структурную однородность и каждый раз анализировать новую область, свободную от предыдущих возможных радиационных повреждений. Отдельные спектры сравниваются и объединяются, если они накладываются на шум. Измерение останавливается для данного образца, когда качество объединенного спектра является правильным. Затем анализ данных может быть выполнен с использованием любого программного обеспечения, предназначенного для анализа XAS, особенно тех, которые позволяют линейное комбинированное подгонка нормализованных спектров, например Athena и Artemis (группа программного обеспечения Demeter)15, SixPack16 или Viper17. Полные и подробные объяснения анализа XAS выходят за рамки этого протокола и могут быть найдены в последних работах18,19, некоторые из которых более конкретно посвящены биологическим образцам20. Эталонные спектры селена XANES уже собраны в базе данных спектров SSHADE21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основными целями этих препаратов были исследование взаимодействия между наночастицами селена (Se-NPs) и раковыми клетками, а также связывания и связывания железа в фитопланктоне.
Спектры HERFD-XANES селена в исходном состоянии (BSA Se-NPs) и в клетках, инкубированных в питательной среде (BSA Se-NPs после 24-часовой инкубации), показаны на рисунке 10. Результаты показали, что селен в исходных Se-NP присутствовал как в виде Se(0), так и в виде селенитоподобных форм, тогда как после взаимодействия с клетками PC-3 селен в клетках в основном присутствовал в виде Se(0), тем самым демонстрируя изменение видов селена в клетках. Для железа спектры эталонов HERFD-XANES показали различные положения краев в зависимости от степени окисления железа, при этом восстановленные виды железа сместились к низким энергетическим значениям (рисунок 11). Два последовательных спектра, собранных в одном и том же положении гранулы диатомовых водорослей, были похожи, что указывает на то, что повреждение пучка было ограничено между двумя приобретениями при использовании He-криостата при 10 К. Кроме того, спектры из разных положений гранулы диатомовых водорослей (здесь три положения) были идентичными, демонстрируя, что гранула образца была однородной и что спектры можно было усреднить для получения лучшего спектра отношения сигнал/шум (усредненный спектр). Усредненный спектр для диатомовых водорослей показывает особенности края, в основном соответствующие Fe(III). Затем была выполнена линейная комбинированная подгонка эталонных спектров для количественной оценки доли видов железа, как описано в Sarret et al.6.
Рисунок 1: Типичные клеточные гранулы. Полипропиленовые трубки объемом 1,5 мл (ячейки OVCAR-3 слева, ячейки PC-3 справа), содержащие 8 x 106 ячеек и 1 x 107 ячеек соответственно. Фото: Кэролайн Биссардон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Препарат в анаэробном перчаточном ящике. (А) Анаэробный перчаточный ящик, содержащий (В) 1,5 мл полипропиленовую трубку стойку (синий), полностью погруженный в жидкость LN2. Жидкость LN2 не представлена на рисунке для наглядности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Схема гранулирования клеток. (A) Образец гранулы в прессе перед загрузкой. (B) Образец во время загрузки. (C) Отбор проб насыпных гранул после погрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Монтаж криоблика (криообразцов). Монтаж в держателе образца, специфичном для линии луча BM16 XAS на ESRF. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Бескислородный препарат эталонного раствора. Примеры эталонных препаратов селена, хранящихся в баллонах Schlenk. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Установка для бескислородной подготовки эталонных растворов. Установка рампы Schlenk с дегазированной сверхчистой водой в бутылке справа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 7: Приготовление в твердых эталонных гранулах. Приготовление прессованных цилиндрических гранул для порошковых соединений либо в окружающем воздухе, либо под бардачком. А) Вес эталонного порошка. (B) Порошок в цилиндрическом отверстии прессовой опоры. (C) Закрытая пресс-поддержка. (D) Прессование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Приготовление твердой эталонной гранулы с использованием полиимидных дисков. Приготовление прессованных цилиндрических гранул для липких или хрупких порошковых соединений. (A) Капля этанола с каждой стороны поршней, которые будут контактировать с порошком, позволит полиимидным дискам на поршнях прилипнуть к ним (B). Молдер монтируется вместе с поршнем. Затем порошок может быть нанесен, и формовщик может быть закрыт вторым поршнем (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 9: Этапы подготовки держателя образца криостата для жидкого эталона или образца. Для четкости снимка фотографии были сделаны вне бардачка и без опасных веществ. Здесь мы использовали воду ddH2O. При необходимости эта подготовка может быть изготовлена под бардачком или в инертной атмосфере (N2) пластиковой палаткой. (А) Держатель образца. (B) Поместите полиимидную ленту на изогнутую поверхность для герметизации отверстия. (C) Медленно вводить эталонные растворы капля за каплей с помощью шприца до тех пор, пока полость не будет заполнена. Пузырьки воздуха не должны оставаться. Закройте другое отверстие полиимидной лентой. (D) Погружение в LN2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 10: Se K-edge типичный анализ HERFD-XANES. Se K-edge HERFD-XANES из покрытых BSA Se-NP, полученных и оставленных 24 ч в клеточной культуральной среде, и PC-3 клетки, подвергшейся воздействию BSA-покрытых Se-NPs. Спектры смещены для ясности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 11: Fe K-edge типичный анализ HERFD-XANES. Пример спектров, собранных во время нашего эксперимента по видообразованию железа в планктоне. Шесть верхних спектров соответствуют ссылкам/стандартам. Наложенные спектры (красного и черного цвета) соответствуют двум спектрам, собранным на одном и том же положении гранулы. Спектры, помеченные pos#1, pos#2 и pos#3, были собраны на трех различных позициях гранулы образца. Спектр, называемый diatoms Average, соответствует усредненным спектрам, собранным на различных позициях гранулы, и является образцом, для которого необходимо определить видообразование. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Продукция | Клеточная линия PC3 | Клеточная линия OVCAR3 |
| Модифицированный ATCC RPMI 1640 средний | 445 мл | 394.5 мл |
| Фетальная бычья сыворотка | 50 мл | 100 мл |
| Пенициллин-Стрептомицин | 5 мл | 5 мл |
| Бычий инсулин | - | 500 мкл |
Таблица 1. Подготовка среды клеточной культуры. Клетки культивируют в модифицированной среде RPMI 1640 Американской коллекции культур типа (ATCC), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином (PS) для клеток рака предстательной железы PC-3 и 20% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина и 0,01 мг / мл бычьего инсулина для клеток рака яичников OVCAR-3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол использовался для изучения химической формы селена и железа в биологических образцах с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии. Основное внимание уделяется криоподготовке и хранению биологических образцов и эталонных соединений, а также измерениям HERFD-XAS.
Криоподготовка и хранение
Криоподготовка объемных гранул биологического образца позволяет сохранить химическую целостность видов, присутствующих в образцах. Это имеет решающее значение, поскольку изменения видообразования наблюдались при использовании сублимационной сушки или воздушной сушки для приготовления6. Этот протокол следует использовать, как только линия луча, выбранная для измерений, оснащена криостатом гелия.
Для эталонных соединений необходимо работать в бескислородной атмосфере при использовании окислительно-восстановительных чувствительных элементов для сохранения степени окисления. Затем это может быть проверено с помощью изменений в спектральном положении кромки, как показано для соединений железа и железа (рисунок 11).
Эта пробоподготовка может быть выполнена перед синхротронным или лабораторным анализом. В этом случае замороженная гранула или эталон должны быть перенесены в криотрубу и храниться в резервуаре LN2 . Это хранение LN2 является обязательным для обеспечения защитной инертной среды и предотвращения изменений в химических видах, особенно для реакционноспособного железа или селеносоединений. Предпочтительно, образцы должны быть подготовлены непосредственно перед измерением или храниться за несколько дней до анализа. Лучше всего не хранить образцы в течение длительного периода времени (т.е. месяцев).
Криоанализ
Анализ при низких температурах, в идеале при 10 К, широко пропагандируется для того, чтобы замедлить повреждения, вызванные интенсивным рентгеновским пучком, особенно образование свободных радикалов от гидролиза воды, которые могут повредить белковую матрицу и создать фоторедукцию ионов переходных металлов или фоторедукцию таких элементов, как сера22. Лучше всего учитывать эти возможные изменения в химических видах путем быстрого приобретения спектра XAS. Образец также должен быть отсканирован, чтобы обнажить неизлучаемую область для каждого спектра. Как показывают спектры, собранные на трех различных позициях гранулы фитопланктона (рисунок 11), такая стратегия показывает мощные спектры, которые затем могут быть усреднены для получения лучшего отношения сигнал/шум.
Будущие приложения
В нашей работе мы использовали лучевую линию, предназначенную для измерений HERFD-XAS (FAME-UHD, ESRF, Франция), но этот протокол для биологической пробоподготовки может быть применен на любой стандартной лучевой линии XAS, оснащенной криостатом, при использовании других типов детекторов, таких как многоэлементный твердотельный детектор Ge или кремниево-дрейфовый детектор. Предлагаемый рабочий процесс может быть также применен к любым другим химическим элементам или любому биологическому материалу, который, как ожидается, будет изучен с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарны за финансовый вклад в разработку линии луча CEMHTI (Орлеан, Франция, ANR-13-BS08-0012-01) и Labex OSUG@2020 (Гренобль, Франция, ANR-10-LABX-0056). Проект FAME-UHD финансово поддерживается французским «grand emprunt» EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), консорциумом CEA-CNRS CRG и институтом INSU CNRS. Мы благодарны за все вклады во время экспериментов, особенно всех людей, работающих над BM30B и BM16. Авторы признают Европейскую установку синхротронного излучения для обеспечения времени пучка синхротронного излучения. Мы также признаем проект PHYTOMET ANR для финансовой поддержки (ANR-16-CE01-0008) и проект SEDMAC для финансовой поддержки (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium nitrate | Sigma-Aldrich | A3795 | NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water |
| Anaerobic chamber | Coy Laboratory, USA | equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12) | |
| Antibiotic stock | Sigma-Aldrich | A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate | 1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL) |
| Boron nitride powder | Sigma-Aldrich | 255475 | |
| Cell counting chamber | Neubauer or Malassez | ||
| Cell scraper | |||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | GIBCO | 14190-094 | Without Calcium, Magnesium, Phenol Red |
| Eppendorf tubes | 0.5 mL and 1.5 mL | ||
| Falcon tubes | 15 mL and 50 mL | ||
| Ferric citrate Fe/citrate = 1/20 | Sigma-Aldrich | F3388 | aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5 |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A31604-02 | Performance Plus, certified One Shot format, US origin |
| Flasks | Sigma-Aldrich | Z707503 | TPP 150 cm2 area |
| Growth chamber | Sanyo | Sanyo MLR-352 | at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime |
| HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H4034 | 1 g/L of milliQ water HEPES |
| High grade serous, OVCAR-3 | ATCC, Rockville, MD | HTB-161 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Incubator | Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2 | ||
| Insulin solution from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I0516 | 10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture |
| Manual hydraulic press | Specac, USA | ||
| Marine diatom Phaeodactylum tricornutum | Roscoff culture collection | RCC69 | http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69 |
| Morpholinepropanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | M3183 | MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3) |
| Optical microscope | |||
| PC-3 | ECCAC, Salisbury, UK | 90112714 | Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Pipette-boy | 25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes | ||
| Plankton culture products, Mf medium: Sea salts | Sigma-Aldrich | S9883 | 40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg |
| Plastic tweezers | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification) | GIBCO | A10491-01 | Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | Se50-BS-1 | BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL | NANOCS Company, USA | 11. Se50-CS-1 | Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light. |
| Sodium metasilicate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 71746 | Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water |
| Sodium nitrate | Sigma-Aldrich | S5022 | NaNO3, 75 mg/L of milliQ water |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S5011 | NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water |
| T-75 flasks | |||
| Tissue culture hood | |||
| Trace metal stock | Sigma-Aldrich | M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857 | 1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L) |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | GIBCO | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | GIBCO | 25300-054 | |
| Vitamin stock | Sigma-Aldrich | T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12 | 1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L) |
| Water bath 37°C |
References
- Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104 (2012).
- Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
- Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
- Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
- Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
- Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
- Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
- Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
- Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
- Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
- Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
- Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
- Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011 (2005).
- Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
- Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
- Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
- Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
- Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
- George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).
