Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים

Published: May 1, 2020 doi: 10.3791/60850
Automatic Translation
, ,
1p53 Laboratory, Neuros/Immunos, A*STAR (Agency for Science, Technology and Research)

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים שיאפשר למשתמש להעריך הפרעה הנגרמת על ידי סמים של דינמיקה מורכבת eIF4F בפורמטי סינון.

Abstract

היווצרות של קומפלקס eIF4F הוכח להיות צומת במורד הזרם מפתח להתכנסות של מסלולי איתות כי לעתים קרובות לעבור הפעלה oncogenic בבני אדם. eIF4F הוא קומפלקס מחייב כובע מעורב בשלב גיוס mRNA-ריבוזום של ייזום תרגום. במודלים תאיים ופרה-קליניים רבים של סרטן, הסרת הפיקוח על eIF4F מובילה לתרגום מוגבר של תת-קבוצות mRNA ספציפיות המעורבות בהתפשטות סרטן ובהישרדות. eIF4F הוא קומפלקס הטרו-טרימרי שנבנה מתוך eIF4E subunit מחייב כובע, eIF4A הליקאז ואת eIF4G subunit פיגומים. קריטי להרכבה של קומפלקסים פעילים של eIF4F היא אינטראקציית החלבון-חלבון בין חלבוני eIF4E ו- eIF4G. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול למדידת הרכבה eIF4F המפקח על המצב של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים. eIF4e:4G תא מבוסס חלבון חלבון אינטראקציה assay גם מאפשר שינויים המושרה על ידי התרופה בשלמות מורכבת eIF4F להיות מוערך במדויק ואמין. אנו צופים כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת לאימות הפעילות של תרכובות זמינות מסחרית או להקרנה נוספת של תרכובות חדשניות או אופנים כי ביעילות לשבש היווצרות של קומפלקס eIF4F.

Introduction

שליטה בביטוי גנים ממלאת תפקיד מרכזי בביצוע נכון של תוכניות תאיות כגון התפשטות צמיחה ובידול. מנגנון בקרה רגולטורי יכול להיות מופעל או ברמה של שעתוק גנים או ברמה של תרגום mRNA. בעשור האחרון, זה הפך להיות יותר ויותר ברור כי שליטה תרגום על ידי אפנון של תהליך החניכה ולא את הצעדים המאוחרים יותר של התארכות וסיום יכול לווסת דק סינתזה של תת קבוצות ספציפיות של חלבונים לשחק מגוון רחב של פונקציות ביולוגיות.

תרגום מוגבר של mRNAs המעורבים בהישרדות, תגובות אנטי אוטופגיות ואנטי אפופטוטיות היו מעורבות במספר סוגי סרטן וגם נקשרו באופן סיבתי להפעלה חריגה או לביטוי של גורמי ייזום תרגום1.

קומפלקס eIF4F הוא וסת ראשי של ייזום תרגום. על ידי איגוד מבנה הכובע בקצה 5 'של mRNAs, eIF4F הוא נהיגה גיוס mRNA-ריבוזום הראשונית בתורו הגדלת יעילות תרגום mRNA של mRNAs eukaryotic מתורגם חלש2. eIF4F מתווך תרגום של mRNAs הקשורות לסרטן דווחה עבור מודלים סרטניים רבים מחסה הפעלה חריגה של RAS / MAPK או AKT / TOR מסלולים, מה שמרמז כי תאים סרטניים upregulate eIF4F כדי להגביר את הפעילות שלהם פרו-neoplastic. שיבוש של לולאה זו להאכיל קדימה על ידי עיכוב היווצרות מורכבת eIF4F היא ובכך אסטרטגיה טיפולית מבטיחה מאוד3,4.

קומפלקס eIF4F מורכב (i) eIF4E, יחידת המשנה מחייבת הכובע של eIF4F המקיימת אינטראקציה עם מבנה הכובע שנמצא ב- UTR 5 ' של mRNA, (ii) eIF4A, הליקאז RNA ו- (iii) eIF4G, חלבון הפיגום המקיים אינטראקציה הן עם eIF4A והן עם eIF4E ואשר בסופו של דבר מגייס את תת-יחידת ה- 40S ריבוזומלית5. eIF4G שיוך עם eIF4E הוא צעד הגבלת קצב להרכבה של קומפלקסים eIF4F פונקציונלי והוא מוסדר באופן שלילי על ידי חלבוני מחייב eIF4E (4EBPs, חברים 1, 2 ו 3))6. על ידי מתחרה עם eIF4G מחייב eIF4E באמצעות ממשק המורכב רצפי איגוד eIF4E קנוני ולאקנוני 7,8,9 (אזור פורש aa 604-646 על eIF4E אנושי), 4EBP מפחית את המאגר של eIF4E מעורב באופן פעיל בתרגום ומניעת היווצרות מורכבת eIF4F. יחסי הגומלין של אינטראקציות חלבון חלבון אלה מוסדר בעיקר על ידי היעד היונקים של rapamycin (mTOR)בתיווך זרחון של 4EBP. על גירויים מיטוגניים, mTOR ישירות phosphorylates בני משפחת החלבון 4E-BP, הפחתת הקשר שלהם עם eIF4E ובכך, קידום אינטראקציה eIF4E-eIF4G והיווצרות של קומפלקסים eIF4Fפונקציונלי 10.

למרות המאמץ הגדול בפיתוח תרכובות מיקוד שלמות מורכבת eIF4F, חוסר מבחנים מדידת שיבוש ישיר של אינטראקציה eIF4E-eIF4G בתאים חיים הגביל את החיפוש אחר תרכובות פגע פעיל הסלולר. יישמנו מבחני לוציפראז המבוססים על אנלוגי coelenterazine (למשל, Nanoluc מבוסס משלים assay) כדי לפקח בזמן אמת את המצב של שלמות eIF4F באמצעות האינטראקציה eIF4E-eIF4G. מערכת החלבון המשלים של לוציפראז מורכבת מרסיס חלבון 18 kDa (SubA) ו-11 שברי פפטיד של חומצות אמינו (SubB) המותאמים למינימום שיוך עצמי ויציבות11. לאחר שהתבטא כמוצר היתוך עם eIF4E באורך מלא אנושי ותחום האינטראקציה eIF4E מ eiF4G1 האנושי (aa 604-646), שני חלבוני אינטראקציה יביא את שבר SubA ו SubB לקרבה של זה יגרום להיווצרות של לוציפראז פעיל כי, בנוכחות מצע חדיר לתא, בסופו של דבר יפיק אות זוהר בהיר(איור 1). דיווחנו במקום אחר על הבנייה והאימות של מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 16.

כאן, אנו מתארים כיצד ניתן להחיל את מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 (זמינה על פי בקשה) כדי למדוד במדויק הפרעות eIF4E-eIF4G בתיווך 4EBP1 בתאים חיים. בנוסף, אנו מדגימים את התועלת שלה על ידי מדידת ההשפעות של מספר מעכבי mTOR כי הם כיום תחת ניסויים קליניים כמו תרופות טיפוליות לסרטןפוטנציאליים 12. בגלל השפעות מחוץ ליעד לעתים קרובות להסוות פעילות ספציפית לסמים, אנו מתארים גם כיצד צדדיות של eIF4E:eIF4G604-646 מדידת המערכת ניתן להרחיב עם מדידות אורתוגונליות של הכדאיות הסלולר לקחת את אלה בחשבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

קו התא HEK293 שימש לפרוטוקול והיה מתורבת בינוני הנשר שונה של Dulbecco בתוספת 10% סרום שור עוברי, 2 מ"מ L-גלוטמין, ו 100 U/mL פניצילין/סטרפטומיצין. התאים היו תרבית ב 37 °C (69 °F) עם 5% CO2 בסביבה לחה.

1. הערכה כמותית של הפרעה מורכבת eIF4F באמצעות eIF4E:eIF4G604-646 השלמה

  1. תרבות תאים והעברה ארעית של eIF4E:eIF4G604-646 השלמה
    1. השתמש בתאים מופשרים טריים עם פחות מ -20 קטעים לכל הניסויים. ביום הראשון, קבע את מספר התא באמצעות מונה תאים רגיל וספור את התאים בני קיימא הכולל באמצעות שיטת אי-הכללה כחולהTrypan 13.
    2. זרעים 6-באר צלחות עם 0.9 - 1.2 x 106 של HEK 293 תאים לבאר ב 2 מ"ל של מדיום צמיחה סטנדרטי.
      הערה: על מנת להשיג את היעילות הטובה ביותר transfection בתוך קווי התא המצוין לעיל, ודא כי התאים המצולפים הם 70-90% confluent יום לאחר הזריעה.
    3. בבוקר היום השני, תאים שותף עם SubA-eIF4E ו- eIF4G604-646-SubB פלסמיד באמצעות מגיב transfection מבוסס שומנים (ראה טבלה של חומרים) כמתואר להלן.
      1. לדלל 9 μL של פתרון מבוסס ליפוזום בצינור המכיל 125 μL של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום (ראה טבלה של חומרים)עבור כל transfection ו דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
      2. הכן תערובת הורים של DNA על ידי דילול 3 מיקרוגרם של כל פלסמיד ב 125 μL של מדיום סרום מופחת עבור כל צינור transfection.
      3. הוסף 12 μL של ריאגנטים משפר לצינור לערבב DNA מאסטר, לערבב היטב ומיד להוסיף את ה- DNA: תערובת מאסטר משפר לכל צינור של ליפוזומים מדוללים ביחס 1:1. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
      4. מוסיפים את קומפלקס הדנ"א-שומנים לכל באר ומדגירה את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ל-24 שעות.
    4. בבוקר יום 3, לשטוף כל באר עם 1 מ"ל של PBS.
    5. הסר את PBS ואת תאי הדגירה בכל באר עם 0.3 מ"ל של טריפסין במשך 5 דקות ב 37 °C (69 °F).
    6. לנטרל טריפסין על ידי הוספת 2 מ"ל של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום המכיל 0% FCS בכל באר ולהעביר תאים transfected לתוך צינור 15 מ"ל.
      הערה: פנול אדום יכול להפריע לפעילות לוציפראז; לכן, יש לטפל בתאים משלב זה ואילך במדיום ללא פנול אדום.
    7. לסובב את התאים במשך 5 דקות ב 290 x g ולשואף את המדיום. Resuspend התאים ב 2 מ"ל של מדיום סרום מופחת ללא פנול אדום המכיל 0% FCS. ספור כמתואר בשלב 1.1.
    8. זרעים חצץ HEK 293 תאים ב 96 לוחות אטומים היטב בצפיפות של 30,000 תאים לבאר ב 90 μL של בינוני ללא פנול אדום המכיל 0% FCS. על מנת להשיג 3 משכפלים טכניים בתוך אותו ניסוי עבור 3 תרכובות שונות, זרע 60 בארות של הצלחות עם תאים למעט בארות בקצוות.
    9. מיד לאחר זריעת התאים החצויים, להוסיף 10 μL של 10% פתרון תרכובת DMSO (ראה שלב 1.2).
  2. הכנה מורכבת
    1. הכן פתרונות מלאי מורכבים של 1 מ"מ על ידי המסת תרכובת הריבית ב- 100% DMSO (v/v). על מנת לקבל 3 משכפלים עבור כל טיטרציה מורכבת, להשתמש 8 μL של פתרון 1 מ"מ מורכבים מלאי.
      הערה: נפח של תרכובת מלאי 1 mM בשימוש הוא יותר ממה שהוא נחוץ. פעולה זו נעשית כדי לקחת בחשבון שגיאות pipetting אם בכלל.
    2. בצע דילול סדרתי פי 2 של פתרון תרכובת המניה עם 4 μL של מניית 1 מ"מ לתוך 4 μL של 100% DMSO עבור כל נקודת טיטרציה.
      הערה: לקבלת טיטרציה מורכבת מלאה, בצע 9 דילולים סדרתיים מהמניה ההתחלתית ב- DMSO של 100%. אם תרכובות מרובות צריך להיבדק, להשתמש צלחת 96 גם פיפטה רב ערוצית כדי להקל על צעד זה ואת הדילולים הבאים.
    3. הוסף 36 μL של מים סטריליים ברמת HPLC עבור כל נקודה של הדילול הטורי פי 2 כדי להכין 40 μL של פתרונות עבודה 10x ב- 10% DMSO (v/v) (כלומר. 100 מיקרומטר עד 0.39 μM 10% סדרת מניות DMSO יוביל לפתרון סופי של 10 מיקרומטר עד 0.039 מיקרומטר, ב 1% DMSO כאשר הוסיף לתאים). באשר לבקרת טיפול, גם להכין 10% DMSO רק פתרון מלאי במים סטריליים כיתה HPLC.
    4. הוסף 10 μL של פתרונות עבודה 10x לתאים בצלחת 96 אטום היטב על מנת להניב את הריכוז הסופי המיועד עם ריכוז DMSO שיורית של 1% (v / v) בנפח כולל של 100 μL ודגרת עבור 3 שעות ב 37 °C (70 °F) עם 5% v / v אטמוספרי CO2.
  3. מבחני השלמה ותכנון של לוציפראז
    1. לאחר 3 שעות של סימום, להתחיל להכין את ריאגנט מצע לוציפראז על ידי שילוב 1 נפח של מצע עם 19 כרכים של מגיב דילול (ראה הוראות היצרן).
      הערה: מבחני לוציפראז מבוצעים באמצעות ערכה מסחרית זמינה (ראה טבלת חומרים).
    2. השתמש פיפטה רב ערוצית להוסיף מיד 25 μL של מגיב מצע.
    3. לנער את הצלחת ב 350 סל"ד במשך 50 דקות על שייקר מסלולית בטמפרטורת החדר.
    4. להעריך את הזוהר באמצעות קורא צלחת. כדי לעשות זאת, הגדר את קורא המראה על זוהר ואת מסנן הפליטה על 455. השתמש בגובה מדידה של 6.5 מ"מ עם זמן מדידה של 1 s.
    5. על מנת לתחת את הכדאיות של התא, להוסיף 33 μL של ריאגנט בדיקת הכדאיות ולאחר מכן למדוד מחדש את הזוהר שוב לאחר 15 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות קורא הצלחת.
    6. להעריך את הזוהר עם קורא הלוחות על ידי הגדרת קורא המראה על Luminescence ואת מסנן הפליטה על 600 ננומטר. השתמש בגובה מדידה של 6.5 מ"מ עם זמן מדידה של 1 s.
      הערה: הכדאיות מוערכת על ידי מדידת הרמה התאית של ATP על תמוגת התא לפי הוראות היצרן. Multiplexing אפשרי במקרה זה מאז מבחני הכדאיות משתמש לוציפראז שונה עם אורך גל פליטה שונה.
    7. השתמש בנתונים כדי לקבוע את ערכי ה- IC50 של כל תרכובת לפי עקומה המתאימה את הנתונים למשוואה עקומה תואמת 4 פרמטרים:
      Y = ((A-D)/(1+(x/C))) + D
      הערכים המספריים D ו- A חייבים להיות מוגבלים בתהליך התאמת העקומה:
      D = ערך זוהר על ציר Y עבור אסימפטוט עקומה מינימלי או רמת תגובה תיאורטית מינימלית הצפויה ממחיצת ההשלמה eIF4E:4G.
      A = ערך זוהר על ציר Y עבור אסימפטוט עקומה מקסימלית או תגובה ברמה תיאורטית מקסימלית הצפויה ממחיצת ההשלמה eIF4E:4G.
      הערה: הערך עבור התגובה המינימלית נגזר 1% DMSO (v / v) טיפול בקרה ואת הערך עבור התגובה המקסימלית נגזר התגובה המקסימלית של מעכב mTOR זיקה גבוהה כי יש מישור ללא השפעה על הכדאיות של התא.

2. מתאם eIF4E:eIF4G604-646 עיכוב מבחנים עם הפרעה מורכבת eIF4F בתאים

  1. כדי לאשר כי האות הנמדד על ידי ההסתעפות תואם את ההפרעה הפיזית של אינטראקציה eIF4E-eIF4G על ידי המתחם, תאי זרע כמתואר בשלב 1.1.
  2. ביום שאחרי, להחליף את המדיום עם 1 מ"ל של מדיום סרום מופחת לא מכיל פנול אדום דגירה במשך 4 שעות עם תרכובת של עניין. להבטיח ריכוז DMSO שיורית של 1% (v / v) בנפח כולל של 1 מ"ל.
    הערה: על מנת לאפשר בקלות מתאם עם התוצאה, השתמש בריכוזים מורכבים בהתחלה, בנקודת האמצע ונקודת הקצה של עקומת ההשלמה הנמדדת.
  3. תאי Lyse וביצע m7GTP למשוך למטה כדי לבודד eIF4F ו eIF4E:4EBP1 קומפלקסים. נהלים מפורטים על איך לבצע את הניסוי m7GTP למשוך למטה ניתן למצוא במקום אחר14.
  4. לזהות m7GTP מאוגד eIF4G, eIF4E ו 4EBP1 רמות החלבון על ידי ניתוח כתם מערבי, ולאחר מכן לתאם הפרעה מורכבת eIF4F עם עיכוב אות בדיקת משלים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

על מנת לאמת את הרגישות של מערכת השלמה eIF4E:eIF4G604-646, עיכוב בתיווך 4EBP1 של הרכבה מורכבת eIF4F הוערך באמצעות מעכבי mTOR. על ידי עיכוב mTORC1 זרחון תלוי קינאז של משפחת החלבון 4EBP, עיכוב mTOR משפר את הקשר 4EBP1 ל- eIF4E, ולכן, פירוק eIF4F15. נבדקו שני סוגים של מעכבים שונים מבחינה מכנית של mTOR kinases: rapalogs (למשל, Rapamycin) כי הם מעכבי allosteric של mTORC1 אבל לא mTORC2 ו ATP מעכבים מבוססי תחרותי (למשל, PP242) שנועדו במיוחד מעכב הן mTORC1 ו mTORC2 קינאז קטליטי פעילות.

תאי HEK293 הוחתמו עם מערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 כמתואר בשלב 1. לאחר 24 שעות של transfection, התאים נזרעו מחדש וטופלו עם מעכבי mTOR PP242 ו rapamycin (כמתואר בשלב 1.2). ארבע שעות לאחר הטיפול, הוערך הזוהר, כפי שתואר קודם לכן, ואחריו הכדאיות של התא. כפי שמוצג באיור 2, PP242 מייצר עיכוב תלוי מינון של האות עם IC50 מחושב של 0.72 ± 0.04 מיקרומטר, בעוד IC50 של 6.88 ± 0.88 מיקרומטר נגזר rapamycin (איור 2A). צלחות היו אז מולטיפלקסים לבדיקת הכדאיות הסלולרית (איור 2D). ניתוח זה מראה כי לא PP242 ולא rapamycin מייצרת ירידה משמעותית בכדאיות התא, המוכיח כי הירידה בהאצה במערכת ההשלמה eIF4E:eIF4G604-646 אינה נובעת ממוות תאי לא ספציפי אלא באמצעות שיבוש האינטראקציה eIF4E:4G.

ניסוי משיכה למטה M7GTP המבוצע על ידי דגירה תאים לא מודבקים עם ריכוזים מורכבים התואמים להתחלה, נקודות האמצע והסיום של עקומת הטיטרציה הנמדדת באיור 2A מראות שהפרעה בתיווך 4EBP1 של אינטראקציית eIF4E-eIF4G אנדוגנית תואמת ל- eIF4E:eIF4G604-646 האות הנמדד(איור 2B, 2C). בהתאם לתוצאות אלה, PP242 מוצג כמעכב חזק יותר של זרחן 4EBP1 הכולל מאשר rapamycin בתנאים הניסיוניים שנבדקו בתאי HEK 293(איור 3A),בעוד שני המעכבים הראו השפעה על איתות mTOR בדרך כלל, עם rapamycin להיות פעיל יותר נגד מצעים mTORC1 ו PP242 מיקוד הן mTORC1 ו mTORC2 (איור 3B).

יחד, תוצאות אלה הראו כי PP242 יעיל יותר בשיבוש היווצרות מורכבת eIF4F מאשר rapamycin בתאי HEK293 ולהוכיח עוד כי מערכת eIF4E:eIF4G604-646 יכול למדוד במדויק הרכבה מורכבת eIF4F בתאים חיים.

Figure 1
איור 1: eIF4E:eIF4G604-646 מערכת משלימה. ייצוג סכמטי המראה כיצד האינטראקציה של חלבונים X (eIF4E) וחלבונים Y (eIF4G604-646)מאפשרת לנתיכי SubA ו- SubB להתקרב זה לזה ולבסס מחדש את הלוציפראז הפעיל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: שיבוש בתיווך 4EBP1 של קומפלקס eIF4F. (A) PP242 ו rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 מבחני טיטרציה מידול האינטראקציה בין eIF4E ו eIF4G בתאי HEK 293 transfected. (B,C) ניתוח כתם מערבי מראה רמה אנדוגני של eIF4E, eIF4G ו 4EBP1 ב HEK 293 תמציות ב m7GTP למשוך למטה לאחר הדגירה של תאים תרבותיים עם ריכוז שונה של PP242 או Rapamycin בהתאמה. (D) תאים שטופלו ב- A שבו מולטיפלקסים עבור הכדאיות של התא ואת הזוהר העריכו. כל הערכים מייצגים ממוצע ± SD (n = 3). נתון זה השתנהמ- 16. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: השפעה דיפרנציאלית של עיכוב mTOR על פושורילציה 4EBP1. (A)ניתוח כתם מערבי של מצב זרחון של 4EBP1 בתאי HEK293 שאינם מודבקים שטופלו בריכוז מצוין של PP242 ו rapamycin. (B)ניתוח כתם מערבי של מצב זרחן AKT ו- S6 בתאי HEK293 שאינם מודבקים שטופלו במעכבי האתר הפעילים MTORC1/2 הכפולים PP242, או המעכב האלוסטרי של mTORC1 Rapamycin. בטא אקטין היה חזותי עבור בקרת טעינה, כמו גם סך הכל 4EBP1, AKT ו S6. נתון זה השתנהמ- 16. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטה המתוארת במאמר זה משתמשת בהשלמה מבוססת לוציפראז כדי לפקח כמותית על הרכבה מורכבת של eIF4F באמצעות מדידה ישירה של אינטראקציית eIF4G-eIF4E בתאים חיים. סיפקנו פרטים לשימוש במערכת השלמה eIF4E-eIF4G והראינו גם כי המערכת מדויקת ביותר במדידת ניתוק 4EBP1 בתיווך תרופות של אינטראקציה eIF4E-eIF4G16. על מנת להקל על התפוקה של מבחנים אלה, ההתקנה הניסיונית המתוארת במאמר זה תוכננה לשימוש בפורמט microplate 96 היטב.

לקבלת תוצאות מיטביות, יש לשקול שני שלבים קריטיים בעת ביצוע הבדיקה. ראשית, יעילות ההעתקה בין הניסויים צריכה להישאר דומה. זה יכול להיות מובטח באמצעות שימוש בתאי מספר מעבר נמוך, ועל ידי ספירה קפדנית של תאים ביום הזריעה. יש להעריך גם את קונדיטוריית התא לפני ביצוע transfection DNA, שכן לא מומלץ להניף תאים עם ריאגנט transfection מבוסס שומנים אם קונדיטוריה התא הוא פחות מ 70-90%. שנית, חשוב מולטיפלקס מבחני ההשלמה עם מבחני הכדאיות של התא. תרכובות מסוימות עשויות להשפיע על אות לוציפראז בעיקר על ידי הפחתת מספר התאים קיימא באמצעות השפעות מזיקות. לכן, חשוב למדוד את הכדאיות של התא מיד לאחר eIF4E:eIF4G604-646 השלמה בדיקה כדי לטפל מחוץ ליעד ואפקטים לא ספציפיים.

ממשקי חלבון חלבון, כגון זה שבין eIF4E ו- eIF4G, נטולי שסועים הידרופוביים והם גדולים ומישוריים יחסית, נחשבים בדרך כלל ל"בלתי ניתנים לתרופות " על ידי טיפולי מולקולות קטנות קונבנציונליות (<500 MW)17. לכן, יש עניין גובר בפיתוח של אופנים חדשניים כי ביעילות אינטראקציה עם סוג זה של משטחים (למשל, תרכובות מקרוציקליות פפטידומטיות). עם זאת, רבים מאמצעים חדשניים אלה אינם מסוגלים מולדת לחצות את קרום התא ולעסוק במטרה שלהם. כדי לעקוף נושאים אלה, קבוצות מחקר רבות עורכות מחקר על אופטימיזציה כימית חדשה ואסטרטגיות אספקה סלולרית. אנו צופים כי eIF4E:eIF4G604-646 תא חי PPI assay ו PPI דומים אחרים נגזר מבחנים ישחק תפקיד מרכזי בטיפוח אסטרטגיות אלה ואימות אותם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי תקציב הליבה של p53lab (BMSI, A * STAR) ומענק JCO VIP (A * STAR).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT cells Thermo Fisher Scientific R70007
Cell culture microplate 96 well, F-Bottom greiner bio-one 655083
Cell titer Glo 2.0 PROMEGA G9241
Envision Multilabel Reader PerkinElmer not applcable
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml Thermo Fisher Scientific 4662070
Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml Thermo Fisher Scientific 4662050
FUGENE6 PROMEGA E2692
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000015
NanoBiT PPI Starter Systems PROMEGA N2014
Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red Thermo Fisher Scientific 11058021
Orbital shaker Eppendorf not appicable
γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose Jena Bioscience AC-155S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
  3. Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
  4. Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).
  5. Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
  6. Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
  7. Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
  8. Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
  9. Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
  10. Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
  11. Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
  12. Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
  13. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).
  14. Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
  15. Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819 (2013).
  16. Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
  17. Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).

Tags

חקר הסרטן גיליון 159 ביולוגיה תאית קומפלקס eIF4F בקרת תרגום בדיקת השלמה לוציפראז איתות mTOR אינטראקציות חלבון-חלבון
ניטור הרכבת eIF4F על-ידי מדידת אינטראקציית eIF4E-eIF4G בתאים חיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Frosi, Y., Ramlan, S. R., Brown, C.… More

Frosi, Y., Ramlan, S. R., Brown, C. J. Monitoring eIF4F Assembly by Measuring eIF4E-eIF4G Interaction in Live Cells. J. Vis. Exp. (159), e60850, doi:10.3791/60850 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter