Summary
Burada, kullanıcının eIF4F karmaşık dinamiklerinin ilaç kaynaklı pertürbasyonunu tarama formatlarında değerlendirmesini sağlayacak canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşimini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
eIF4F kompleksinin oluşumu, insanlarda sıklıkla onkojenik aktivasyona uğrayan sinyal yollarının yakınsaması için anahtar aşağı akış düğümü olarak gösterilmiştir. eIF4F, çeviri başlatmanın mRNA-ribozom işe alım aşamasında yer alan bir kapak bağlama kompleksidir. Birçok hücresel ve klinik öncesi kanser modelinde, eIF4F'nin deregülasyonu, kanserin çoğalması ve sağkalımında rol oynayan spesifik mRNA alt kümelerinin çevirisinin artmasına yol açar. eIF4F, kapak bağlama alt birliği eIF4E, helicase eIF4A ve iskele alt birliği eIF4G'den inşa edilmiş hetero-trimerik bir komplekstir. Aktif eIF4F komplekslerinin montajı için kritik olan eIF4E ve eIF4G proteinleri arasındaki protein-protein etkileşimidir. Bu makalede, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin durumunu izleyen eIF4F derlemesini ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. eIF4e:4G hücre bazlı protein-protein etkileşimi tahlili, eIF4F karmaşık bütünlüğündeki ilaç kaynaklı değişikliklerin doğru ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini de sağlar. Bu yöntemin ticari olarak mevcut bileşiklerin aktivitesini doğrulamak veya eIF4F kompleksinin oluşumunu verimli bir şekilde bozan yeni bileşiklerin veya modalitelerin daha fazla taranması için uygulanabileceğini öngörüyoruz.
Introduction
Gen ekspresyonunun kontrolü, büyüme çoğalması ve farklılaşma gibi hücresel programların doğru yürütülmesinde önemli bir rol oynar. Gen transkripsiyonu düzeyinde veya mRNA çevirisi düzeyinde bir düzenleyici kontrol mekanizması uygulanabilir. Son on yılda, daha sonraki uzama ve sonlandırma adımları yerine başlatma sürecinin modülasyonu ile çeviri kontrolünün, çok çeşitli biyolojik işlevleri oynayan belirli protein alt kümelerinin sentezini ince bir şekilde düzenleyebileceği giderek daha belirgin hale gelmiştir.
Sağkalım, anti-otofajik ve anti-apoptotik yanıtlarda yer alan mRNA'ların artan çevirisi birkaç kansere karışmıştır ve ayrıca sapkın aktivasyon veya çeviri başlatma faktörlerinin aşırı ekspresyonu ile nedensel olarak bağlantılıdır1.
eIF4F kompleksi, çeviri başlatmanın ana düzenleyicisidir. mRNA'ların 5' ucundaki kapak yapısını bağlayarak, eIF4F ilk mRNA-ribozom alımını yönlendiriyor ve buna karşılık zayıf çevrilmiş ökaryotikmRNA'larınmRNA çeviri verimliliğini artırıyor 2 . Kansere bağlı mRNA'ların eIF4F aracılı çevirisi, RAS / MAPK veya AKT / TOR yollarının anormal aktivasyonunu barındıran birçok kanser modeli için bildirilmiştir, bu da kanser hücrelerinin kendi neoplastik aktivitelerini artırmak için eIF4F'yi yükselttiğini göstermektedir. EIF4F karmaşık oluşumunu engelleyerek bu ilerleme döngüsünün bozulması, böylece çok umut verici bir terapötik stratejidir3,4.
eIF4F kompleksi (i) eIF4E, mRNA, (ii) eIF4A, RNA helicase ve (iii) eIF4G'nin 5' UTR'sinde bulunan kapak yapısıyla etkileşime giren eIF4F'nin kapak bağlama alt birliği, hem eIF4A hem de eIF4E ile etkileşime giren ve sonunda 40S ribozomal alt birliği5'iişe alan iskele proteini. eIF4E ile eIF4G ilişkisi fonksiyonel eIF4F komplekslerinin montajı için hız sınırlayıcı adımdır ve eIF4E bağlayıcı proteinler (4EBP'ler, üyeler 1, 2 ve 3)) tarafından olumsuz düzenlenir6. 4EBP, kurallı ve kurallı olmayan eIF4E bağlama dizileri7, 8,9'dan (insan eIF4E'de aa 604-646'yı kapsayan bölge) oluşan bir arayüz aracılığıyla eIF4E'ye eIF4G bağlama ile rekabet ederek, çeviride aktif olarak yer alan eIF4E havuzunu azaltır ve eIF4F karmaşık oluşumunu önler. Bu protein-protein etkileşimlerinin etkileşimi esas olarak 4EBP'nin rapamycin (mTOR) aracılı fosforilasyonunun memeli hedefi tarafından düzenlenir. Mitojenik uyaranlar üzerine, mTOR doğrudan 4E-BP protein ailesinin üyelerini fosforilize eder, eIF4E ile ilişkilerini azaltır ve böylece eIF4E-eIF4G etkileşimini ve fonksiyonel eIF4F komplekslerinin oluşumunu teşvikeder 10.
EIF4F karmaşık bütünlüğünü hedefleyen bileşikler geliştirmedeki büyük çabaya rağmen, canlı hücrelerde eIF4E-eIF4G etkileşiminin doğrudan bozulmasını ölçen tahlillerin olmaması hücresel aktif isabet bileşiklerinin aranmasını sınırlamıştır. EIF4E-eIF4G etkileşimi yoluyla eIF4F bütünlüğünün durumunu gerçek zamanlı olarak izlemek için bir koelenterazin analoga (örneğin, Nanolüc tabanlı kompleasyon tahlili) dayanan bir luciferaz tahlil uyguladık. Luciferaz kompleasyon protein sistemi, minimum kendi kendine ilişki ve stabilite için optimize edilmiş 18 kDa protein parçası (SubA) ve 11 amino asit peptit parçasından (SubB) oluşur11. Bir kez insan tam uzunlukta eIF4E ve insan eiF4G1 (aa 604-646) eIF4E etkileşim etki alanı ile bir füzyon ürünü olarak ifade edildikten sonra, iki etkileşim proteini SubA ve SubB parçasını birbirlerinin yakınına getirecek ve aktif luciferaz oluşumunu teşvik edecektir, bir hücre geçirgen substratı varlığında, sonunda parlak bir parlaklık sinyali üretecektir (Şekil 1). EIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin16.
Burada, canlı hücrelerde 4EBP1 aracılı eIF4E-eIF4G bozulmasını doğru bir şekilde ölçmek için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı sisteminin (istek üzerine kullanılabilir) nasıl uygulanabileceğini açıklıyoruz. Ek olarak, şu anda klinik çalışmalar altında olan birkaç mTOR inhibitörünün etkilerini potansiyel kanser terapötik ilaçlar olarak ölçerek faydasını gösteriyoruz12. Hedef dışı etkiler genellikle ilaca özgü aktiviteyi maskelediğinden, eIF4E:eIF4G604-646 sistem ölçümünün çok yönlülüğünün, bunları dikkate almak için hücresel canlılığın ortogonal ölçümleriyle nasıl genişletilebileceğini de açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
HEK293 hücre hattı protokol için kullanıldı ve Dulbecco'nun %10 Fetal Sığır Serumu, 2 mM L-glutamin ve 100 U/mL penisilin/streptomisin ile desteklenmiş Modifiye Kartal Orta'sında kültürlendi. Hücreler nemlendirilmiş bir ortamda %5 CO2 ile 37 °C'de kültürlendi.
1. eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı test yoluyla eIF4F karmaşık bozulmanın nicel değerlendirmesi
- Hücre kültürü ve eIF4E geçici transfeksiyon:eIF4G604-646 tamamlayıcı test
- Tüm deneyler için 20'den az pasajlı yeni çözülmüş hücreler kullanın. 1. günde, standart bir hücre sayacı kullanarak hücre numarasını belirleyin ve Trypan mavi dışlama yöntemi13'ü kullanarak toplam uygulanabilir hücreleri sayın.
- 2 mL standart büyüme ortamında kuyu başına 0,9 - 1,2 x 10 6 HEK 293 hücreli tohum6 kuyu plakaları.
NOT: Yukarıda belirtilen hücre hatları içinde en iyi transfeksiyon verimliliğini elde etmek için, kaplamalı hücrelerin tohumlamadan sonraki gün% 70-90 birleştiğinden emin olun. - 2. günün sabahında, suba-eIF4E ve eIF4G604-646-SubB plazmid ile birlikte lipid bazlı transfeksiyon reaktifi kullanarak hücrelerin eş transfectleri (bkz. Malzeme Tablosu).
- 9 μL lipozom bazlı çözeltiyi fenol kırmızısı olmadan 125 μL azaltılmış serum ortamı içeren bir tüpte seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu)her transfeksiyon için ve oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- Her transfeksiyon tüpü için 125 μL azaltılmış serum ortamında her plazmidden 3 μg seyrelterek DNA'nın ana karışımını hazırlayın.
- DNA ana karışım tüpüne 12 μL arttırıcı reaktif ekleyin, iyice karıştırın ve hemen DNA'yı ekleyin: seyreltilmiş lipozomların her tüpüne 1:1 oranında arttırıcı ana karışımı. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.
- DNA lipid kompleksini her kuyuya ekleyin ve hücreleri 24 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatörde kuluçkaya yatırın.
- 3. günün sabahında, her birini 1 mL PBS ile iyice durulayın.
- PBS'yi çıkarın ve her kuyudaki hücreleri 37 °C'de 5 dakika boyunca 0,3 mL tripsin ile kuluçkaya yatırın.
- Her kuyuya % 0 FCS içeren fenol kırmızısı içermeyen azaltılmış serum ortamının 2 mL'sini ekleyerek trypsin'i nötralize edin ve transfected hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
NOT: Fenol kırmızısı luciferaz aktivitesini engelleyebilir; bu nedenle, hücreler bu adımdan itibaren fenol kırmızısı olmadan ortamda ele alınmalıdır. - Hücreleri 290 x g'da 5 dakika döndürün ve ortamı aspire edin. Hücreleri% 0 FCS içeren fenol kırmızısı olmadan azaltılmış serum ortamının 2 mL'sinde yeniden kullanın. Adım 1.1'de açıklandığı gibi sayın.
- Tohum, %0 FCS içeren fenol kırmızısı olmayan 90 μL orta alanda kuyu başına 30.000 hücre yoğunluğunda 96 kuyu opak plakada HEK 293 hücrelerini trans enfekte etti. 3 farklı bileşik için aynı deneyde 3 teknik çoğaltma elde etmek için, kenarlardaki kuyular hariç hücrelere sahip plakaların tohum 60 kuyusu.
- Transfected hücreleri tohumlamadan hemen sonra, % 10 DMSO bileşik çözeltisinin 10 μL'sini ekleyin (bkz. adım 1.2).
- Bileşik hazırlama
- Faiz bileşiği %100 DMSO 'da (v/v) eriterek 1 mM bileşik stok çözümleri hazırlayın. Her bileşik titrasyon için 3 çoğaltmaya sahip olmak için, 1 mM bileşik stok çözeltisinin 8 μL'sini kullanın.
NOT: Kullanılan 1 mM stok bileşiği hacmi ihtiyaç duyulandan daha fazladır. Bu, varsa pipetleme hatalarını dikkate almak için yapılır. - Stok bileşik çözeltisinin 2 kat seri seyreltilmesini, 1 mM'lik stoğun 4 μL'si ile her titrasyon noktası için % 100 DMSO'nun 4 μL'sine gerçekleştirin.
NOT: Tam bir bileşik titrasyon için başlangıç stoğundan %100 DMSO'da 9 seri seyreltme gerçekleştirin. Birden fazla bileşiğin test edilmesi gerekiyorsa, bu adımı ve sonraki seyreltmeleri kolaylaştırmak için bir 96 kuyu plakası ve çok kanallı bir pipet kullanın. - %10 DMSO (v/v) (v/v) içinde 40 μL 10x çalışma çözümleri hazırlamak için 2 kat seri seyreltmenin her noktası için 36 μL HPLC sınıfı steril su ekleyin. 100 μM ila 0,39 μM %10 DMSO stok serisi, hücrelere eklendiğinde %1 DMSO'da 10 μM ila 0,039 μM arasında nihai bir çözüme yol açacaktır. Arıtma kontrolüne gelince, HPLC sınıfı steril suda% 10 DMSO sadece stok çözeltisi hazırlayın.
- Toplam 100 μL hacimde% 1 (v / v) kalıntı DMSO konsantrasyonu ile hedeflenen son konsantrasyonu elde etmek için 96 kuyu opak plakasındaki hücrelere 10 μL 10x çalışma çözeltisi ekleyin ve% 5 v / v atmosferik CO2ile 37 ° C'de 3 saat kuluçkaya yatırın.
- Faiz bileşiği %100 DMSO 'da (v/v) eriterek 1 mM bileşik stok çözümleri hazırlayın. Her bileşik titrasyon için 3 çoğaltmaya sahip olmak için, 1 mM bileşik stok çözeltisinin 8 μL'sini kullanın.
- Luciferaz kompleasyonu ve uygulanabilirlik tahlilleri
- 3 saat ilaçlamadan sonra, 1 hacimli substratı seyreltme reaktifinin 19 hacmiyle birleştirerek luciferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın (üreticinin talimatlarına bakın).
NOT: Luciferaz tahlili, piyasada bulunan bir kit kullanılarak gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). - Hemen 25 μL substrat reaktif eklemek için çok kanallı bir pipet kullanın.
- Plakayı oda sıcaklığında yörüngesel bir çalkalayıcıda 50 dakika boyunca 350 rpm'de sallayın.
- Plaka okuyucu kullanarak lüminesansı değerlendirin. Bunu yapmak için ayna okuyucuyu lüminesansa ve emisyon filtresini 455'e ayarlayın. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın.
- Hücre canlılığını yok etmek için, 33 μL canlılık tahlil reaktifi ekleyin ve plaka okuyucuyu kullanarak oda sıcaklığında 15 dakika sonra lüminesansı tekrar ölçün.
- Ayna okuyucuyu Lüminesans'a ve emisyon filtresini 600 nm'ye ayarlayarak plaka okuyucu ile lüminesansı değerlendirin. Ölçüm süresi 1 s olan 6,5 mm ölçüm yüksekliği kullanın.
NOT: Uygulanabilirlik, üretici talimatlarına göre hücre içi ATP seviyesi hücre içi liziz üzerinde ölçülerek değerlendirilir. Bu durumda çoklama mümkündür, çünkü canlı test farklı bir emisyon dalga boyunda farklı bir luciferaz kullanır. - Verileri 4 parametreli sığdırma eğrisi denklemine sığdırarak her bileşiğin IC50 değerlerini belirlemek için verileri kullanın:
Y = ((A-D)/(1+((x/C)^B))) + D
D ve A sayısal değerleri eğri sığdırma işleminde kısıtlanmalıdır:
D = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen minimum eğri asemptot veya minimum teorik yanıt seviyesi için Y eksenindeki parlak değer.
A = eIF4E:4G tamamlama testinden beklenen maksimal eğri asemptot veya maksimal teorik seviye yanıtı için Y ekseninde parlaklık değeri.
NOT: Minimum yanıtın değeri %1 DMSO (v/v) kontrol tedavisinden, maksimum yanıtın değeri ise hücre canlılığı üzerinde hiçbir etkisi olmayan yüksek benzeşimli mTOR inhibitörünün maksimum tepkisinden elde edilir.
- 3 saat ilaçlamadan sonra, 1 hacimli substratı seyreltme reaktifinin 19 hacmiyle birleştirerek luciferaz substrat reaktifini hazırlamaya başlayın (üreticinin talimatlarına bakın).
2. eIF4E:eIF4G604-646 tahlil inhibisyonunu hücrelerde eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilendiren
- Test tarafından ölçülen sinyalin, 1.1 adımında açıklandığı gibi, bileşik, tohum hücreleri tarafından eIF4E-eIF4G etkileşiminin fiziksel bozulmasına karşılık geldiğini onaylamak için.
- Ertesi gün, ortamı fenol kırmızısı içermeyen 1 mL azaltılmış serum ortamı ile değiştirin ve ilgi bileşiği ile 4 saat kuluçkaya yatırın. Toplam 1 mL hacimde %1 (v/v) kalıntı DMSO konsantrasyonu sağlayın.
NOT: Sonuçla kolayca bir korelasyona izin vermek için, ölçülen tamamlayıcı test titrasyon eğrisinin başında, orta noktasında ve uç noktasında bileşik konsantrasyonlar kullanın. - EIF4F ve eIF4E:4EBP1 komplekslerini izole etmek için Lyse hücreleri ve gerçekleştirilen m7GTP aşağı çekme. m7GTP aşağı çekme deneyinin nasıl gerçekleştirileceğine dair ayrıntılı prosedürler başka bir yerde bulunabilir14.
- Batı blot analizi ile m7GTP bağlı eIF4G, eIF4E ve 4EBP1 protein seviyelerini tespit edin ve ardından tamamlayıcı test sinyali inhibisyonu ile eIF4F karmaşık bozulması ile ilişkilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sisteminin hassasiyetini doğrulamak için mTOR inhibitörleri kullanılarak eIF4F kompleks montajının 4EBP1 aracılı inhibisyonu değerlendirildi. 4EBP protein ailesinin mTORC1 kinaz bağımlı fosforilasyonunu inhibe ederek, mTOR inhibisyonu eIF4E'ye 4EBP1 ilişkisini geliştirir ve bu nedenle eIF4F sökme15. MTOR kinazlarının mekanistik olarak farklı inhibitörünün iki sınıfı test edilmiştir: mTORC1'in allosterik inhibitörleri olan ancak mTORC2 ve ATP rekabetçi tabanlı inhibitörler (örneğin, PP242) hem mTORC1 hem de mTORC2 kinaz katalitik aktivitesini inhibe etmek için tasarlanmış rapaloglar (örneğin, Rapamycin).
HEK293 hücreleri, adım 1'de açıklandığı gibi eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemi ile transkred edildi. 24 saatlik transfeksiyondan sonra hücreler mTOR inhibitörleri PP242 ve rapamycin ile yeniden tohumlandı ve tedavi edildi (adım 1.2'de açıklandığı gibi). Tedaviden dört saat sonra, daha önce açıklandığı gibi lüminesans değerlendirildi ve ardından hücre canlılığı yapıldı. Şekil 2'degösterildiği gibi, PP242, 0,72 ± 0,04 μM'lik hesaplanmış bir IC50 ile sinyalin doza bağımlı bir inhibisyonunu üretirken, rapamycin için 6,88 ± 0,88 μM'lik bir IC50 türetilir (Şekil 2A). Plakalar daha sonra hücresel canlılık tahlilleri için çoklanmıştır(Şekil 2D). Bu analiz, ne PP242'nin ne de rapamycin'in hücre canlılığında önemli bir azalma yaratmadığını ve eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemindeki lüminesanstaki azalmanın spesifik olmayan hücre ölümünden değil, eIF4E:4G etkileşiminin bozulmasından kaynaklandığını göstermektedir.
Bir m7GTP çekme deneyi, ilkeye karşılık gelen bileşik konsantrasyonlarla enfekte olmayan hücreleri inkübe ederek gerçekleştirilir, Şekil2'de ölçülen titrasyon eğrisinin orta ve uç noktaları,endojen eIF4E-eIF4G etkileşiminin 4EBP1 aracılı bozulmasının ölçülen eIF4E:eIF4G604-646 tahlil sinyaliyle ilişkili olduğunu göstermektedir (Şekil 2B, 2C). Bu sonuçlarla tutarlı olarak, PP242'nin HEK 293 hücrelerinde test edilen deneysel koşullar altında toplam 4EBP1 fosforilasyonun rapamycin'den daha güçlü bir inhibitörü olduğu gösterilmiştir (Şekil 3A), her iki inhibitör de mTOR sinyaline normal etki gösterirken, rapamycin mTORC1 substratlarına ve PP242'ye karşı daha aktif olmasıyla hem mTORC1 hem de mTORC2'yi hedef alan ( Şekil3B).
Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar PP242'nin HEK293 hücrelerindeki rapamycin'den daha fazla eIF4F karmaşık oluşumunu bozmada daha etkili olduğunu ve eIF4E:eIF4G604-646 sisteminin canlı hücrelerde eIF4F karmaşık montajını doğru bir şekilde ölçebileceğini göstermiştir.
Şekil 1: eIF4E:eIF4G604-646 kompleasyon sistemi. X (eIF4E) ve protein Y (eIF4G604-646)etkileşiminin SubA ve SubB füzyonlarının birbirleriyle yakınlaşmasını ve aktif luciferazı yeniden oluşturmasını nasıl sağladığını gösteren şematik gösterim. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: eIF4F kompleksinin 4EBP1 aracılı bozulması. (A) PP242 ve rapamycin eIF4E:eIF4G604-646 tahlil titrasyonu transfected HEK 293 hücrelerinde eIF4E ve eIF4G arasındaki etkileşimi modeller. (B,C) HEK 293 ekstraktlarında ve m7GTP'de sırasıyla pp242 veya Rapamycin konsantrasyonu farklı olan kültürlü hücrelerin inkübasyonundan sonra aşağı çekmekte olan endojen eIF4E, eIF4G ve 4EBP1 seviyesini gösteren Batı blot analizi. (D) Hücre canlılığı ve lüminesans için çoklanmış hücrelerin değerlendirildiği A'da tedavi edildi. Tüm değerler ortalama ± SD'± temsil eder (n=3). Bu rakam16'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: mTOR inhibisyonunun 4EBP1 fosforilasyon üzerindeki diferansiyel etkisi. (A) PP242 ve rapamycin konsantrasyonu ile tedavi edilen trans enfekte olmayan HEK293 hücrelerinde 4EBP1 fosforilasyon durumunun Batı blot analizi. (B) Çift MTORC1/2 aktif saha inhibitörü PP242 veya mTORC1 Rapamycin allosterik inhibitörü ile tedavi edilen transktasyonsuz HEK293 hücrelerinde AKT ve S6 fosforilasyon durumunun Batı blot analizi. Beta actin, toplam 4EBP1, AKT ve S6'nın yanı sıra yükleme kontrolü için görselleştirildi. Bu rakam16'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan yöntem, canlı hücrelerde eIF4G-eIF4E etkileşiminin doğrudan ölçümü yoluyla eIF4F karmaşık montajını nicel olarak izlemek için luciferaz tabanlı bir tamamlayıcılık tahlili kullanır. EIF4E-eIF4G kompleasyon sisteminin kullanımı için ayrıntıları sağladık ve ayrıca sistemin eIF4E-eIF4G etkileşiminin ilaç kaynaklı 4EBP1 aracılı ayrışması ölçümlemede son derece doğru olduğunu gösterdik16. Bu tahlilin verimini kolaylaştırmak için, bu makalede açıklanan deneysel kurulum 96 kuyu mikro plaka formatı kullanımı için tasarlanmıştır.
En iyi sonuçlar için, tahlil yapılırken iki kritik adım göz önünde bulundurulmalıdır. İlk olarak, deneyler arasındaki transfeksiyon verimliliği benzer kalmalıdır. Bu, düşük geçişli sayı hücrelerinin kullanılması ve tohumlama gününde hücrelerin titizlikle sayılmasıyla sağlanabilir. Hücre konfeksiyoni% 70-90'dan azsa lipid bazlı transfeksiyon reaktifi olan hücrelerin transfection yapılması önerilmediğinden, DNA transfeksiyon yapılmadan önce hücre konfeksiyonları da değerlendirilmelidir. İkinci olarak, tamamlayıcı testini bir hücre canlılık tahliliyle çoklamak önemlidir. Bazı bileşikler öncelikle zararlı etkiler yoluyla canlı hücrelerin sayısını azaltarak luciferaz sinyalini etkileyebilir. Bu nedenle, hedef dışı ve spesifik olmayan etkileri ele almak için eIF4E:eIF4G604-646 tamamlayıcı testten hemen sonra hücrenin canlılığını ölçmek önemlidir.
EIF4E ve eIF4G arasındaki gibi, hidrofobik yarıklardan yoksun, nispeten büyük ve düzlemci olan protein-protein arayüzleri, genellikle geleneksel küçük molekül terapötikleri (<500 MW)17tarafından "ilaçlanamaz" olarak kabul edilir. Bu nedenle, bu tür yüzeylerle (örneğin makrosiklik ve peptidomimetik bileşikler) verimli bir şekilde etkileşime giren yeni modalitelerin gelişimine artan bir ilgi vardır. Bununla birlikte, bu yeni modalitelerin çoğu doğuştan hücre zarını geçemez ve hedeflerine saldıramaz. Bu sorunları atlatmak için, birçok araştırma grubu yeni kimyasal optimizasyon ve hücresel teslimat stratejileri üzerine araştırmalar yürütmektedir. eIF4E:eIF4G604-646 canlı hücre PPI tahlili ve diğer benzer ÜFE türevli tahlillerin bu stratejilerin geliştirilmesinde ve doğrulandırılmasında önemli bir rol oynayacağını öngörüyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma p53lab (BMSI, A*STAR) ve JCO VIP hibesinden (A*STAR) çekirdek bütçe ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT cells | Thermo Fisher Scientific | R70007 | |
| Cell culture microplate 96 well, F-Bottom | greiner bio-one | 655083 | |
| Cell titer Glo 2.0 | PROMEGA | G9241 | |
| Envision Multilabel Reader | PerkinElmer | not applcable | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 30-300 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662070 | |
| Finnpipette F2 Multichannel Pipettes 12-channels 5-50 ml | Thermo Fisher Scientific | 4662050 | |
| FUGENE6 | PROMEGA | E2692 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | |
| NanoBiT PPI Starter Systems | PROMEGA | N2014 | |
| Optimem I Reduced Serum Mediun, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | |
| Orbital shaker | Eppendorf | not appicable | |
| γ-Aminophenyl-m7GTP (C10-spacer)-Agarose | Jena Bioscience | AC-155S |
References
- Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 254-266 (2010).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular Mechanism of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 827-835 (2004).
- Bhat, M., et al. Targeting the translation machinery in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (4), 261-278 (2015).
- Pelletier, J., Graff, J., Ruggero, D., Sonenberg, N. Targeting the eIF4F translation initiation complex: a critical nexus for cancer development. Cancer Research. 75 (2), 250-263 (2015).
- Montanaro, L., Pandolfi, P. P. Initiation of mRNA translation in oncogenesis: the role of eIF4E. Cell Cycle. 11, 1387-1389 (2004).
- Merrick, W. C. eIF4E: A retrospective. Journal of Biological Chemistry. 290 (40), 24091-24099 (2015).
- Marcotrigiano, J., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Burley, S. K. Cap-dependent translation initiation in eukaryotes is regulated by a molecular mimic of eIF4G. Molecular Cell. 3 (6), 707-716 (1999).
- Umenaga, Y., Paku, K. S., In, Y., Ishida, T., Tomoo, K. Identification and function of the second eIF4E-binding region in N-terminal domain of eIF4G: comparison with eIF4E-binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communication. 414 (3), 462-467 (2011).
- Grüner, S., et al. The Structures of eIF4E-eIF4G Complexes Reveal an Extended Interface to Regulate Translation Initiation. Molecular Cell. 64 (3), 467-479 (2016).
- Gingras, A. C., et al. Hierarchical phosphorylation of the translation inhibitor 4E-BP1. Genes and Development. 15 (21), 2852-2864 (2001).
- Dixon, A. S., et al. NanoLuc Complementation Reporter Optimized for Accurate Measurement of Protein Interactions in Cells. ACS Chemical Biology. 11 (2), 400-408 (2016).
- Sun, S. Y. mTOR kinase inhibitors as potential cancer therapeutic drugs. Cancer Letters. 340 (1), 1-8 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. , Appendix 3: Appendix 3B (2001).
- Sekiyama, N., et al. Molecular mechanism of the dual activity of 4EGI-1: Dissociating eIF4G from eIF4E but stabilizing the binding of unphosphorylated 4E-BP1. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (30), e4036-e4045 (2015).
- Muller, D., et al. 4E-BP restrains eIF4E phosphorylation. Translation. 1 (2), e25819 (2013).
- Frosi, Y., Usher, R., Lian, D. T. G., Lane, D. P., Brown, C. J. Monitoring flux in signalling pathways through measurements of 4EBP1-mediated eIF4F complex assembly. BMC Biology. (1), 40 (2019).
- Ran, X., Gestwicki, J. E. Inhibitors of protein-protein interactions (PPIs): An analysis of scaffold choices and buried surface area. Current Opinion in Chemical Biology. 44, 75-86 (2018).
